Summary
وهنا يقدم نهجاً تسلسل عميق الذي يوفر تصميم غير متحيزة الوليدة 3 '-تيرميني وكذلك الملامح حيث جزيئات الحامض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل. التطبيق الرئيسي هو توصيف المعينة الوليدة مكملة للفيروسات الرجعية (كدناس)، المواد الوسيطة التي تم إنشاؤها أثناء عملية النسخ العكسي للفيروس.
Abstract
رصد الحمض النووي وسيطة أثناء النسخ المتماثل الفيروس يوفر نظرة ثاقبة على آثار وآليات العمل من المركبات المضادة للفيروسات وبروتينات الخلية المضيفة في تركيب الدنا الفيروسي. هنا يمكننا معالجة النقص في التحليل يستند إلى الخلية وتغطية عالية وعالية الدقة قادرة على تحديد وسيطة النسخ العكسي للفيروس في سياق الفسيولوجية للإصابة بالفيروسات. يلتقط الأسلوب المبين في 3 '-تيرميني لجزيئات الحمض النووي (كدنا) تكميلية الوليدة داخل خلايا المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية-1 في القرار النوكليوتيدات واحدة. ينطوي البروتوكول حصاد خلية كله الحمض النووي، وتخصيب المستهدفة من الحمض النووي الفيروسي عن طريق القبض على الهجين، وربط محول، تجزئة المساحة بتنقية جل بكر التضخيم وتسلسل عميق، وتحليل البيانات. خطوة رئيسية هي ربط فعالة وغير منحازة لجزيئات محول لفتح تيرميني 3 '--الحمض النووي. تطبيق طريقة وصف يحدد وفرة النصوص عكس كل مدة معينة في نموذج معين. كما يوفر معلومات حول تسلسل (الداخلية) الاختلاف في النسخ العكسي وبالتالي أي طفرات محتملة. وبصفة عامة، التحليل مناسبة لأي أسئلة تتعلق بالحمض النووي 3 '-التمديد، شريطة أن يعرف تسلسل قالب.
Introduction
وسيطة مطلوبة من أجل تشريح وفهم النسخ المتماثل الفيروسية تماما، وبصورة متزايدة صقل التقنيات التي التقاط النسخ المتماثل. على وجه الخصوص، التعريف الدقيق لأنواع الحمض النووي الفيروسي في سياق الخلايا المصابة يمكن أن توفر أفكاراً جديدة، نظراً للعديد من النسخ المتماثل الفيروسية الآليات حتى الآن تم النظر في ردود أفعال معزولة في المختبر . هو مثال على عملية النسخ العكسي في الفيروسات القهقرية، مثل فيروس نقص المناعة البشرية (فيروس نقص المناعة البشرية-1) 1. الخطوات المختلفة لفيروس نقص المناعة البشرية-1 النسخ العكسي، خلالها نسخ المنتسخة العكسية إنزيم فيروسي (RT) جينوم الحمض النووي الريبي المفرد-الذين تقطعت بهم السبل في الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل، وقد درس في المقام الأول التمهيدي التمديد معبراً مع البروتينات المنقاة والنووية الأحماض1،2،3،،من45. بينما وضعت مبادئ أساسية، مثل فحوصات لا تتضمن كافة المكونات الخلوية والفيروسية وقد لا تعكس ستويتشيوميتريس بيولوجيا ذات الصلة من العوامل المشتركة. ولذلك، قمنا بتصميم تقنية قوية لتحديد أطياف وسيطة النسخ العكسي مع كدنا دقيقة 3 '-تيرميني (أي تحديد أطوال الضبط)، وتسلسل النوكليوتيدات في سياق العدوى للمعيشة 6من الخلايا. جمع البيانات من الوقت يمكن الاستفادة من التجارب بالطبع لمقارنة الشخصية النصوص تحت ظروف مختلفة، مثل وجود الجزيئات المضادة للفيروسات أو البروتينات، والتي قد تؤثر على كفاءة و [بروسسيفيتي] لتركيب الدنا و تراكم. وهذا ما يسمح فهم أكثر تفصيلاً لدورة الحياة الطبيعية الممرض، والذي غالباً ما يكون أساسا لتصميم الأدوية المستهدفة والتدخل العلاجي الناجح.
فيروس نقص المناعة البشرية-1 النسخ العكسي وتضم سلسلة من الأحداث المتعاقبة التي بدأتها الصلب من التمهيدي الحمض الريبي النووي النقال إلى قالب الحمض النووي الريبي الجينوم، الذي تم تمديده بعد ذلك قبل RT لإنتاج نسخة قصيرة واحدة-الذين تقطعت بهم السبل كدنا يسمى حبلا ناقص قوية-وقف (-نظام الضمان الاجتماعي) (انظر الشكل 1). في وقت لاحق، كدنا-نظام الضمان الاجتماعي نقل إلى المحطة 5 'دام تكرار (لتر) 3'-لتر من الجيش الملكي النيبالي الجينوم، حيث أنها أنيالس ويخدم التمهيدي ل RT استمرار وساطة استطالة الناقص حبلا الحمض النووي (انظر ملاحظات على النسخ العكسي1 , 2 , 3 , 4)-هذا النقل حبلا الأولى واحدة من الخطوات التي تحد من معدل للنسخ العكسي؛ ومن ثم فهو معروف كدنا-نظام الضمان الاجتماعي تتراكم. ويرد في الشكل 2aتصميم سير العمل والمكتبة الأساسية لالتقاط المنتجات النسخ العكسي في الخلايا المصابة. كبسولة تفجير محددة وتحليل الإعدادات التي يتم استخدامها في البروتوكول والمدرجة في الجدول 1 استهداف جميع أوائل عكس النسخ كدنا وسيطة داخل نطاق طول من 23 إلى 650 ~ nt, التي تضم 180-182 nt-نظام الضمان الاجتماعي الحمض النووي. بيد تسمح تعديلات طفيفة المناسبة للاستراتيجية التطبيق إلى أواخر النسخ العكسي المنتجات ليس فقط ولكن أيضا الفيروسات الأخرى والنظم، حيث يتمثل الهدف في الكشف عن 3 '--أوه تحتوي على الحمض النووي ينتهي. تشمل القيود الهامة للنظر في نطاق طول للمنتج النهائي ببكر في المكتبة؛ على وجه الخصوص، القوالب التي تتجاوز المسافة بين محول على فتح 3 '-المحطة والموقع التمهيدي المنبع nt ~ 1000 سوف يرجح أن تكون أقل كفاءة متسلسلة، إدخال يحتمل أن تكون مضللة التحيزات القائمة على التقنية خلال (إعداد المكتبة انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل والاقتراحات التكيف).
سابقا قد ركزت تقنيات الإبلاغ عنها لتحديد منهجية 3 '-تيرميني خيوط الحمض النووي في الجيش الملكي النيبالي، وليس الحمض النووي، والجزيئات. مثال واحد هو 3 ' سباق (التضخيم السريع ينتهي كدنا)7، الذي يعتمد على بوليادينيليشن مرناً. وباﻹضافة إلى ذلك، وضعت محول المستندة إلى ربط استراتيجيات توظيف ligases الجيش الملكي النيبالي، التي شملت RLM-سباق (سباق ليجاسى بوساطة الرنا)8 أو الرباط (التضخيم القائم على ربط الغايات كدنا)9. من المهم التأكيد على أن تستند إلى عملية ربط إيضاحات مسهبة حساسة لأي تحيز الأخذ برد فعل ربط نفسها. على سبيل المثال، يمكن ربط كفاءة أكثر أو أقل اعتماداً النوكليوتيدات خاص في موقف 3 '، وتسلسل، الطول الكلي جزيء أو الهيكل المحلي. هذه التفضيلات ليجاسى يؤدي إلى التقاط غير مكتملة من الجزيئات وتحريف في قراءات، التي لاحظت نحن وآخرون9،10. لتقليل التحيز ربط أثناء خطوات إضافة محول في البروتوكول الموضحة هنا، لقد اختبرنا عددا من استراتيجيات عملية ربط والعثور على استخدام الحمض النووي T4 ليجاسى مع محول الحمض النووي دبوس واحد-الذين تقطعت بهم السبل (كما وصفها كوك et al. 11) أن يكون الإجراء الوحيد بالقرب من ربط الكمية التي لم تسفر عن وجود اختلافات كبيرة في كفاءة عملية ربط عند تقييم مع مجموعة مختارة خصيصا لمراقبة النوكليوتيد6. اختيار استراتيجية ربط هذا، لذلك، سمة رئيسية في نجاح هذا البروتوكول.
وحتى الآن، رصد تطور فيروس نقص المناعة البشرية-1 RT في الخلايا المصابة أساسا تم إنجازه عن طريق قياس منتجات النسخ العكسي من طول مختلف مع PCR الكمي (qPCR) باستخدام مجموعات التحقيق التمهيدي بشكل فريد قياس أقصر أو أطول (المبكر و وقت متأخر، على التوالي) كدنا منتجات12،،من1314. بينما هذا النهج qPCR المناسب لتحديد الكفاءات الجوهرية لعملية النسخ العكسي في الأنظمة الخلوية، الإخراج من دقة منخفضة نسبيا، مع أية معلومات تسلسل مستمدة. نهجنا الجديد، استناداً إلى ربط محول محسن، وتوليد المكتبة بكر بوساطة، وعناوين تسلسل عميق الهوة التكنولوجية ويوفر فرصة لرصد النسخ العكسي أثناء الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 كمياً وفي النوكليوتيدات واحدة القرار.
أننا قد أثبتت فائدة هذا الأسلوب في دراسة التي ميزت بين المقترح نموذجين لقدرة عامل تقييد فيروس نقص المناعة البشرية-1 APOBEC3G (الابوليبوبروتين ب مرناً تحرير إنزيم الحفازة مثل ببتيد 3 ز) للتدخل مع إنتاج المستنسخات عكس الفيروسي6.
Protocol
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى الجدول للمواد المحددة الكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.
1-فيروس الإنتاج وعدوى الخلية
تنبيه: المعدية فيروس نقص المناعة البشرية-1 ينبغي إلا التعامل معها في مختبرات الاحتواء السلامة المعتمدة.
ملاحظة: إنتاج جزيئات فيروس نقص المناعة البشرية-1 من تعداء عابرة للكلى الجنينية البشرية (HEK) 293T الخلايا، كما هو موضح في الخطوة 1، 1، وهو إجراء قياسي وقد تم وصف سابقا15،16. ثقافة الخلية العامة الإجراءات الموصوفة سابقا17.
- إنتاج فيروس فيروس نقص المناعة البشرية-1.
- الحفاظ على خلايا 293T في دولبيكو لتعديل النسر المتوسطة (دميم) وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) و 1% البنسلين/ستربتوميسين (كامل دميم) في حاضنة ثقافة خلية قياسية في 37 درجة مئوية و 5% CO2 كما هو موضح سابقا17.
- في غطاء زراعة الأنسجة الاندفاق الصفحي قياسية قم بإزالة وسائط النمو وأضف 3 مل التربسين المعالجون مسبقاً (37 درجة مئوية) بالقرب من روافد 10 سم خلية ثقافة طبق (~1.2 x 107 خلايا) من الخلايا 293T. وضع الطبق في الحاضنة لمدة 2-3 دقائق.
- تأخذ الطبق من الحاضنة إلى الوراء في هود زراعة الأنسجة وإضافة 7 مل متوسطة كاملة. "الماصة؛" صعودا وهبوطاً ضمن الطبق عدة مرات ريسوسبيند الخلايا. تقسيم الخلايا 1:4 بإضافة 2.5 مل تعليق خلية لطبق 10 سم جديدة وملء مع 7.5 مل متوسطة كاملة.
- في اليوم التالي، مزيج 10 ميكروغرام لفيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيرال بلازميد الحمض النووي (مثل pNL4.3) مع 1 مل متوسطة أساسية خالية من المصل الحد الأدنى وإضافة حل بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد) (25,000 ميغاواط، 1 ملغ/مل الأس الهيدروجيني 7) في ميليلتر 4.5 الواحدة 1 ميكروغرام الحمض النووي. احتضان لمدة 10 دقائق في الرايت وإضافة دروبويسي إلى خلايا 293T.
- 24 ساعة بعد تعداء، إزالة المتوسطة واستبدله مع 6 مل دميم الكاملة التي تحتوي على الدناز رناسي خالية في 20 يو/مليلتر المتوسطة. بعد ح 6، يستعاض عن المتوسط مع 10 مل دميم كامل.
- ح 48 بعد تعداء، حصاد المادة طافية وتصفيته من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر، باستخدام حقنه 10 مل، في أنبوب البولي بروبلين 15 مل.
- إضافة 2 مل العقيمة السكروز 20% في 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى أنبوب ultracentrifuge رقيقة الجدران مكشوفة. تراكب السكروز مع الخلية التي تم تصفيتها طافية ببطء.
- أجهزة الطرد المركزي ح 1 و 15 دقيقة في 134,000 س ز عند 4 درجة مئوية باستخدام أولتراسينتريفوجي.
- إزالة الأنابيب من أولتراسينتريفوجي بعناية. ببطء الإقلاع كلا من المادة طافية والسكروز استخدام شفط أو ماصة. استخدام ماصة أصغر وآماله الأنبوب عند إخراج آخر الحلول السكروز. ترك الفيروس الأعلاف في الجزء السفلي من الأنبوب.
ملاحظة: بيليه لن تكون مرئية. - إضافة 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x وتترك في الثلاجة على 4 إلى 12 ساعة، ريسوسبيند، وتجميد في 20 ميليلتر مختبرين في-80 درجة مئوية.
- تحديد p24اسكت المحتوى باستخدام مستضد p24 فيروس نقص المناعة البشرية-1 أليسا كيت (إرشادات الشركة المصنعة التالية).
- تي خلية خط العدوى.
- الثقافة على خط تي خلية مخلدة (مثلاً.، الخلايا جيم-SS) في المتوسط روزويل بارك التذكاري المعهد (ربمي) 1640 تستكمل مع 10% FBS و 1% البنسلين/ستربتوميسين (ربمي كامل). عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير18 والبذور 1 جيدا كل عينة مع 1 مل ربمي كامل مع 2 x 106 خلايا/مل في صفيحة ثقافة خلية تنسيق 12-جيدا.
- إضافة جسيمات فيروس نقص المناعة البشرية-1 أي ما يعادل 150 نانوغرام p24هفوة ومكان اللوحة إلى يتأرجح الطرد المركزي دلو مع أغطية الاحتواء الأحيائي لتصيب تدور بالطرد المركزي في أجهزة الطرد مركزي benchtop ح 2 في س 2,000 ز في 30 درجة مئوية.
- إزالة لوحة من أجهزة الطرد المركزي والسماح لها الراحة ح 1 في حاضنة استنبات الأنسجة قياسية في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
- ليغسل الفيروس الإدخال، جمع الخلايا بنقل تعليق خلية لأنابيب ميكروسينتريفوجي وسينتريفوجينج في ميكروسينتريفوجي في الرايت (RT) في 500 غ س ل 2 دقيقة. خلع المادة طافية دون إزعاج بيليه الخلية.
- ريسوسبيند الكريات الخلية في 1 مل المعالجون مسبقاً (37 درجة مئوية)، برنامج تلفزيوني x 1 العقيمة. كرر الطرد المركزي، وإزالة طافية، واستثارة الخطوات مرتين أخريين.
- الطرد المركزي مرة أخرى وإزالة المادة طافية وريسوسبيند الكريات الخلية في 1 مل ربمي كامل. إضافة تعليق كل بئر واحدة في صفيحة جيدا 12 جديدة.
- في ح 6 الأولى بعد إضافة الفيروس (ح 4 بعد الطرد المركزي)، حصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي كما فعلت في الخطوة 1.2.4. إزالة وتجاهل المادة طافية. يمكن تجميدها في-80 درجة مئوية الكريات الخلية أو معالجة مباشرة لاستخراج الحمض النووي.
2. استخراج الحمض النووي وفيروس نقص المناعة البشرية-1 الحمض النووي القياس الكمي، والإثراء "القبض على الهجين"
- استخراج الحمض النووي خلية كاملة مع الحمض النووي مجموع الدم والأنسجة واستخلاص عدة باتباع دليل عدة خلايا استنبات الأنسجة. التغيير الوحيد شطف في 200 ميليلتر من خالية نوكلاس ح2س بدلاً من المخزن المؤقت المتوفر شطف.
ملاحظة: بعد إضافة تشاوتروبيك تحلل المخزن المؤقت ("ال المخزن المؤقت أن مجموعة") وبروتيناز، عينات يمكن إزالتها من المختبر الاحتواء السلامة الأحيائية والتعامل معها في مختبر مستوى سلامة قياسية لبقية البروتوكول. - تحديد عدد النسخ كدنا فيروس نقص المناعة البشرية-1 من قبكر.
- 17 ميليلتر من النذرة من الخطوة 2، 1 وإضافة 2 ميليلتر من المخزن المؤقت لأنزيم التقييد x 10 جنبا إلى جنب مع 1 ميليلتر من إنزيم التقييد دبني. احتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية لإزالة أي احتمال الإدخال المتبقية بلازميد الحمض النووي من تعداء.
- القيام qPCR لكدنا قوية توقف حبلا ناقص باستخدام مجموعة التحقيق التمهيدي التالية: oHC64 (5-تاكتاججاكككاكتجك-3) و oHC65 (5-جكتاجاجاتتتككاكاكتج-3) والتحقيق oHC66 (5-الاتحاد الماليزي-أكاكاكاجاكججكاكاكاكتا-طمره-3). ويمكن الاطلاع على الإعداد قبكر والظروف الدقيقة في6،المراجع13. حمل على طول العينات مع إضعاف بلازميد بروفيرال pNL4.3 تسلسلي كمنحنى قياسي لتحديد إعداد نسخة من جزيئات كدنا.
ملاحظة: انظر المناقشة للكميات المتوقعة.
- فيروس نقص المناعة البشرية-1 "الحمض النووي" تخصيب اليورانيوم قبل القبض على الهجين.
ملاحظة: هذه خطوة إلى الأمام، فإنه من الأفضل استخدام أنابيب ميكروسينتريفوجي مع خصائص ربط منخفضا الحمض النووي، فضلا عن تصفية الهباء الجوي الماصة نصائح لجميع عينات من الحمض النووي. إذا كان ذلك ممكناً، ويعمل في محطة عمل PCR. جميع الخطوات والمواد الكاشفة في الرايت (RT) ما لم يذكر خلاف ذلك.- لتحضير مزيج رئيسي من حبات ستريبتافيدين المغناطيسي، "الماصة؛" 100 ميليلتر الخرز كل عينة في أنبوب ميكروسينتريفوجي واحد. ضع الأنبوبة في مغناطيس مناسبة لأنابيب ميكروسينتريفوجي.
- بعد أن استقرت الخرز نحو الجانب المغناطيس للأنبوب (~ 1 دقيقة)، تقلع في المخزن المؤقت لتخزين وإزالة الأنبوب من المغناطيس وريسوسبيند الخرز في 500 ميليلتر لربط ويغسل المخزن المؤقت (المخزن المؤقت للأسلحة البيولوجية، 5 ملم تريس-HCL درجة الحموضة 7.5، 0.5 مم يدتا ، 1 م كلوريد الصوديوم) لغسل.
- ضع الأنبوب مرة أخرى على المغناطيس وإزالة المادة طافية وإضافة 500 ميليلتر الكازين الحل. تتخذ من المغناطيس، ريسوسبيند واحتضان لمدة 10 دقائق في الرايت، ثم يغسل مع المخزن المؤقت للأسلحة البيولوجية.
ملاحظة: يغسل يشير إلى وضع الأنبوب في المغناطيس، تقلع المادة طافية، أخذ الأنبوب قبالة المغناطيس، مشيراً إلى المخزن المؤقت، وريسوسبيندينج. - ضع الأنبوب مرة أخرى على المغناطيس وتقلع المادة طافية وريسوسبيند الخرز في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للأسلحة البيولوجية. إضافة pmol 50 من كل النوكليوتيد بيوتينيلاتيد الالتقاط (انظر الجدول 1، أوليجوس الثلاثة في هذه الحالة) لكل عينة. (على سبيل المثال، إذا كانت 5 عينات من الحمض النووي معالجتها، استخدم 500 ميليلتر من حبات المغناطيسي من الخطوة pmol 2.3.1 و 250 لكل اليغنوكليوتيد).
- احتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت بينما هزاز في خلاط نهاية أكثر.
- أغسل حبات مع النوكليوتيد المعطل تداولها مرتين مع 500 ميليلتر من 1 x المخزن المؤقت العشرة (10 ملم HCl تريس pH 8.0، 1 مم يدتا، 100 ملم كلوريد الصوديوم).
- ريسوسبيند الخرز في 10 ميليلتر من المخزن المؤقت عشر 1 x لكل عينة.
- لكل نموذج تسمية أنبوب ميكروسينتريفوجي واحد وإضافة 10 ميليلتر من تعليق الخرز، 170 ميليلتر من الحمض النووي (من الخطوة 2، 1) وميليلتر 90 3 × عشرة المخزن المؤقت. احتضان في كتلة حرارة جافة في 92 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة تؤذي الحمض النووي.
- نقل الأنابيب إلى كتلة مختلفة حرارة جافة، التي تم تعيينها إلى 52 درجة مئوية، واحتضان حاء 1 عكس للمزيج بانتظام (~ كل 10 دقائق) أثناء هذه الحضانة.
- أغسل مرة واحدة مع 500 ميليلتر من 1 × عشرة المخزن المؤقت وريسوسبيند في 35 ميليلتر خالية من نوكلياسي ح2o.
- إلى الوت، احتضان هذه الأنابيب في 92 درجة مئوية في كتلة حرارة جافة لمدة 2 دقيقة. ثم بسرعة نقل الأنابيب على المغناطيس (أنبوب واحد في كل مرة). وبمجرد الخرز مرتبطة إلى جانب الأنبوب، نقل المادة طافية التي تحتوي على فيروس نقص المناعة البشرية-1 "الحمض النووي" لأنبوب جديد.
- اختياري: كرر qPCR (كما فعلت في الخطوة 2.2.2) لتحديد كدنا فيروس نقص المناعة البشرية-1 تم استردادها.
ملاحظة: انظر المناقشة للكميات المتوقعة.
3-محول ربط
- إعداد محول
- ريسوسبيند محول المجففة بالتبريد (انظر الجدول 1 "كامل كوك + مسك") في 100 ميكرومتر في خالية نوكلاس ح2o.
- كل عينة بالإضافة إلى نموذج عنصر تحكم واحد، تجمع بين 0.45 ميليلتر من 10 x T4 الحمض النووي ليجاسى المخزن المؤقت، 4 ميليلتر لمحول، و 0.05 ميليلتر من ح خالية من نوكلاس سين الحرارة من2إلى 92 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة واسمحوا تبرد ببطء.
ملاحظة: إذا كان يتوفر الخيار استخدام جهاز PCR مع قابل للتعديل معدل التبريد (استخدام معدل 2%). وهذا يستغرق حوالي 30 دقيقة من 92 درجة مئوية إلى 16 درجة مئوية. وبدلاً من ذلك، استخدم كتلة حرارة جافة في 92 درجة مئوية وإيقاف تشغيل. إخراج mastermix محول عند كتلة الحرارة مرة أخرى في الرايت هذا السماح لمحول تشكيل هيكل دبوس (انظر الشكل 2ب).
- إعداد رد فعل تحكم بمجموعة من النوكليوتيد المركب (انظر الجدول 2) بدلاً من الحمض النووي المستخرج من الخلايا.
- جعل الأرصدة من 100 ميكرون من كل اليغنوكليوتيد. مزيج 1 ميليلتر من كل من أوليجونوسيلوتيديس 17 وإضافة 8 ميليلتر من ح2س لنسبة اكويمولار بحجم نهائي في 25 ميليلتر.
- تمييع 1:2,500 ميكس في خالية نوكلاس ح2س في تمييع مسلسل. الجمع بين 1 ميليلتر من المزيج ميليلتر 17.3 خالية من نوكلياسي ح2س لاستخدامها في ربط نموذج التحكم في الخطوة 3.3.1 حيث كل اليغنوكليوتيد موجود في فمول 1.6 (يعادل 0.026 نانومتر في رد فعل 60 ميليلتر).
- إعداد ليجيشنز
- للجمع بين 60 ميليلتر الحجم النهائي من ردود الفعل في أنابيب PCR ميليلتر 6 من 10 × ليجاسى الحمض النووي T4 المخزن المؤقت، ميليلتر 24% 40 شماعة، ميليلتر 6 من 5 أمتار بروبيل بتائين، 4.5 ميليلتر (400 pmol) محول (تمهيدي-أنيلياد كما في الخطوة 3.1.2)، ميليلتر 1.2 من الحمض النووي T4 ليجاسى (2,000,000 وحدة/مل) و 18.3 ميليلتر من الحمض النووي (من الخطوة 2.3.11)
ملاحظة: عناية خاصة مع حلول لزج مثل 40% شماعة للحفاظ على كميات دقيقة. لا تجعل من mastermix. - قم بإعداد نفس رد الفعل كما يؤديها في خطوة 3.3.1 ولكن مع مزيج اليغنوكليوتيد مراقبة إعدادها في الخطوة 3.2.2.
- مزيج ردود فعل جيد واحتضان في جهاز PCR في 16 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- للجمع بين 60 ميليلتر الحجم النهائي من ردود الفعل في أنابيب PCR ميليلتر 6 من 10 × ليجاسى الحمض النووي T4 المخزن المؤقت، ميليلتر 24% 40 شماعة، ميليلتر 6 من 5 أمتار بروبيل بتائين، 4.5 ميليلتر (400 pmol) محول (تمهيدي-أنيلياد كما في الخطوة 3.1.2)، ميليلتر 1.2 من الحمض النووي T4 ليجاسى (2,000,000 وحدة/مل) و 18.3 ميليلتر من الحمض النووي (من الخطوة 2.3.11)
4-محول إزالة وحجم الفصل
- يشوه جل التفريد
- إضافة 30 ميليلتر من ميثلامين التي تحتوي على الحمض النووي جل تحميل المخزن المؤقت لكل رد فعل عملية ربط. مزيج جيد من قبل بيبيتينج.
- الحرارة لمدة 2 دقيقة في 94 درجة مئوية في آلة بكر، ثم يطرح الاقتراح فورا على الجليد.
- وضع الخرسانة 6% تريس/بورات/يدتا (TBE) يشوه يوريا polyacrylamide هلام (10-جيدا مشط) في دبابة جل مناسبة. إضافة 1 x TBE (مم 89 قاعدة تريس، 89 مم الماء المقطر يدتا مم 2) المخزن المؤقت قيد التشغيل وقبل تشغيل هلام لمدة 20 دقيقة على 250 V/ماكس ثابت.
- تغسل جيوب هلام مع تشغيل المخزن المؤقت باستخدام المحاقن والإبر ز 21.
- تحميل كل عينة ميليلتر 90 في ثلاثة آبار (30 ميليلتر كل بئر) وتشغيل لمدة 20 دقيقة (250 V/كحد أقصى) حتى الجبهة صبغ أزرق غامق على وشك في منتصف الطريق من خلال الجل.
- تلوين وقطع من الأحماض النووية من هلام
- إعداد أنابيب ميكروسينتريفوجي صغيرة 3 (0.5 مل) كل عينة بدس ثقوب في الجزء السفلي باستخدام إبرة حقنه ز 21 (أخذ الحذر أثناء العمل مع الأدوات الحادة). إدراج كل من الأنابيب المعدة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 2.0 وتسميتها باسم العينة زائد "منخفض"، "متوسط" أو "مرتفع".
- تأخذ بها ونقب فتح كاسيت هلام. قص هلام عمودياً مع شفرة الحلاقة سخاء المكوس في القطاع مع الآبار 3 عينات تم تحميلها. إضافة قطاع جل إلى حاوية مع 1 x TBE (حوالي 30 مل) و 5 ميليلتر من سينين الحمض النووي وصمة عار. احتضان لمدة 3-5 دقائق.
ملاحظة: هذه الخطوة استخراج جل حساس بشكل خاص للتلوث عبر. فمن المستحسن لتشغيل العينة 1 كل جل واستخدام حاوية منفصلة، وتنظيف لتلطيخ كل جل فقط. يجب تغيير القفازات إذا اتصل الجسيمات جل أصابع القفاز. - تنظيف سطح ترانسيلوميناتور الضوء الأزرق تماما مع ddH2o. تأخذ قطعة جل خارج الحاوية المصبوغة وإضافته إلى مربع الضوء.
- قم بتشغيل ضوء مربع وفحص الأحماض النووية الملون من خلال مرشح اللون البرتقالي.
ملاحظة: المحول عادة ما يظهر محمل بشكل زائد ويعمل ككبيرة "النقطة" مع الواصلة "دنا" فيروس نقص المناعة البشرية-1 قيد التشغيل أعلاه كخط. - استخدام شفرة حلاقة جديدة، قطع بعيداً من الجانبين من الجل إذا كانت هناك مجالات مع لا نموذج تحميل لا تزال موجودة. بعد ذلك، قص فقط فوق المحول إزالة المحول وجل أقل أجزاء. وأخيراً، قطع بعيداً أعلى جداً من جل، بما في ذلك حوالي 1 ملم الجل جيوب، الذي غالباً ما يكون إشارة مكثفة حادة من ارتفاع الوزن الجزيئي الحمض النووي.
- تقسيم قطعة جل المتبقية المحتوية على العينة، وهي عادة ~ 2 × 3 سم في الحجم، أفقياً إلى ثلاثة أجزاء حتى: "منخفض"، "منتصف" ومناطق "عالية" الوزن الجزيئي.
ملاحظة: كل قطعة سوف يكون التعامل معها الآن بشكل منفصل [أي.، سيكون هناك ثلاثة أنابيب (منخفض ومتوسط وعالية)] كل نموذج الأصلي. - قص كل من الأجزاء الثلاثة جل إلى أجزاء أصغر (~ 2 × 2 مم الجسيمات) وتحويلها إلى أنابيب هيأهم 0.5 مل ميكروسينتريفوجي (الخطوة 4.2.1).
- وتدور بسرعة أعلى مع أغطية مفتوحة لمدة 1 دقيقة للضغط على القطع جل من خلال الثقب في الأنبوب 2 مل لخلق من طين هلام. إذا بقيت أي جزيئات جل في الجزء السفلي من الأنبوب 0.5 مل، نقلها إلى أنبوب 2 مل يدوياً باستخدام تلميح إبرة أو ماصة.
- استخراج الحمض النووي
- أضف 1 مل من اليوريا جل استخراج المخزن المؤقت (0.5 M NH4CH3CO2، 1 مم يدتا، 0.2% SDS) إلى طين هلام. تدوير أنابيب للحد ني ح 3 (وهو مقبول بين عشية وضحاها) في الرايت مع خلاط نهاية أكثر.
- استخدم مجموعة نظيفة من ملاقط لإضافة عامل تصفية الألياف الزجاجية جولة صغيرة واحد إلى الأعمدة الطرد المركزي مع خلات السليولوز غشاء فلاتر (0.2 ميكرومتر)، الذي يتجنب انسداد غشاء. وضع عامل التصفية مع طرف ماصة مقلوب.
- باختصار تدور أنابيب 2 مل مع المخزن جل طين والاستخراج في ميكروسينتريفوجي ونقل 700 ميليلتر من المادة طافية على الأعمدة تصفية استعداد. الاحتفاظ بطين جل وتبقى المادة طافية.
- الطرد المركزي تصفية الأعمدة في ميكروسينتريفوجي في سرعة قصوى لدقيقة 1 نقل فلووثرو في أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 2.0 جديدة.
- تحديث الأعمدة مع المادة طافية المتبقية. في محاولة للحصول على سائل قدر ممكن من الاستخراج طين. نقل قطع جل ليست مصدر قلق. تدور مرة أخرى، والجمع بين فلووثروغس لاستخراج العينات نفسها.
- ترسيب الحمض النووي
- إضافة 3 ميليلتر من بوليا الحمض النووي الريبي (1 ميكروغرام/ميليلتر؛ كناقل)، 1 ميليلتر من الجليكوجين، و 0.7 مل من الكحول فلووثرو من الخطوة 4.3.5. الدوامة بإيجاز والتجميد في-80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- أخذ عينات من الثلاجة-80 درجة مئوية والسماح لهم بذوبان الجليد بإيجاز. وضعها في ميكروسينتريفوجي تبريد (4 درجة مئوية) وتدور لمدة 30 دقيقة في سرعة قصوى.
- إزالة وتجاهل المادة طافية. كن حذراً جداً ليس لإزالة بيليه. ترك 30 إلى 50 ميليلتر من السائل إذا كان من غير المؤكد ستتم إزالة بيليه أن خلاف ذلك.
ملاحظة: جميع العينات "عالية" تظهر عادة بيليه أكثر وضوحاً من عينات "متوسط" و "منخفض". - إضافة 800 ميليلتر من الإيثانول 80%. عكس أنابيب وتدور مرة أخرى لمدة 1 دقيقة في سرعة قصوى. إزالة معظم الإيثانول مع ماصة، بإيجاز تدور الأنابيب مرة أخرى، وإزالة الإيثانول أكثر مع ماصة حجم أصغر.
- السماح لأي الإيثانول المتبقية تتبخر بوضع الأنابيب مع غطاء مفتوحة إلى كتلة جافة حرارة 55 درجة مئوية. عندما تكون عينات الجاف (2-4 دقيقة) إضافة 20 ميليلتر من ح خالية نوكلاس يذوب2س وانتشار حول الجزء السفلي من أنبوب لضمان بيليه الحمض النووي. ويمكن تخزين عينات الحمض النووي في-20 درجة مئوية.
5-[بكر] تضخيم وإعداد المكتبة
- إعداد فعل بكر ميليلتر 40 مع 20 ميليلتر من المزيج قبل بوليميريز الحمض النووي، 18 ميليلتر من عجل وريديسولفيد الحمض النووي من الخطوة 4.4.5، 1 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام "MP1.0 + 22HIV" (10 μm) (انظر الجدول 1)، و 1 ميليلتر اليغو متعدد كبسولة تفجير (الإشعال فهرس 1 إلى 24) (انظر الجدول Ma تيريالس).
ملاحظة: تشغيل فهرسة ردود فعل ثلاثة (منخفض، منتصف، عالية) كل عينة في ردود الفعل PCR منفصلة، ولكن مع نفس التمهيدي. استخدام فهرس مختلفة لكل من العينات الإصابة الأصلي.- تشغيل ردود فعل بكر تحت الظروف التالية: 2 دقيقة في تمسخ 94 درجة مئوية، ثم 18 دورات بكر 3-خطوة؛ 15 s في تمسخ 94 درجة مئوية، 15 s الصلب في 55 درجة مئوية، وتمديد s 30 في 68 درجة مئوية.
- كخيار لضبط الجودة، تحليل PCR التفاعلات مع نظام التفريد جل حساسية عالية الآلي. تأخذ 2 ميليلتر من عينة منخفضة، منتصف، وعالية تشغيلها وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
ملاحظة: يجب أن تكون كبسولة تفجير اثنين مرئية والتشغيل غالباً بطول محسوب عن nt 45 و 95 (تختلف المدة الفعلية). بالإضافة إلى ذلك، ينبغي الكشف عن الحمض النووي بين 150 إلى 500 nt. في حالة وجود أي إشارة، من المستصوب لإضافة دورات PCR إضافية، بين 2 و 10 دورات إضافية. لا تقم بإضافة دورات إضافية لمراقبة اليغنوكليوتيد العينات التي تم إنشاؤها في الخطوة 3.3.2. - لإزالة كبسولة تفجير استخدام نظام تنظيف PCR المستندة إلى حبة باراماجنيتيك.
- تأخذ 20 ميليلتر من كل تفاعل PCR وتجمع العينات معا (تخلط جميع العينات عند هذه النقطة). تجميد المتبقية 20 ميليلتر ردود فعل كالنسخ الاحتياطي عند-20 درجة مئوية.
- واسمحوا الخرز باراماجنيتيك RT، ومزيج التفاعلات PCR المجمعة مع 1.8 x حجم الحل حبة. مزيج من بيبيتينج واحتضان لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: كمثال، إذا تم إعداد العينات 4 ولكل منها ردود الفعل منخفضة، منتصف، وعالية، ستكون الحجم 4 × 3 × 20 ميليلتر = ميليلتر 240 PCR التفاعلات مع حل حبة ميليلتر 432. - وضع الأنابيب على مغناطيس أنبوب ميكروسينتريفوجي، اسمحوا الخرز ربط لدقيقة ~ 1، وخلع المادة طافية تجاهل. اترك هذه الأنابيب على المغناطيس وإضافة 500 ميليلتر من الإيثانول 80%.
- اترك الإيثانول لمدة 30 ثانية، ثم تقلع تماما والسماح أيردري الخرز ميليلتر إضافة 40 دقيقة ~ 5 من ح خالية من نوكلياسي2س، تتخذ الأنابيب إيقاف المغناطيس، و "الماصة؛" صعودا وهبوطاً عدة مرات.
- اترك التعليق لأدنى 5 وضع الأنبوب مرة أخرى على المغناطيس، اسمحوا الخرز تسوية إلى الجانب، ونقل المادة طافية إلى أنبوب جديد. هذه هي المكتبة. تأخذ 10 ميليلتر الكوة لضوابط الجودة وتجميد الباقي في-20 درجة مئوية.
6-تقييم المكتبة
- تحديد نوعية المكتبة وتركيز، ومولاريتي.
- استخدام أسلوب التقدير الكمي فلوروميتريك. قياس ميليلتر 1 و 3 ميليلتر من المكتبة مع مجموعة الإنزيم دسدنا حساسية عالية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
ملاحظة: تركيزات نموذجية بين 1 و 10 نانوغرام/ميليلتر. - قياس الطيف الوزن الجزيئي الدنا مكتبة بحساسية عالية الآلي جل التفريد كما هو موضح أعلاه (الخطوة 5، 2).
- استخدام هلام التحليل الكهربي لتحديد متوسط الوزن الجزيئي للمكتبة الآلي وحساب لتمييع المكتبة في خالية من نوكلياسي ح س من2إلى 4 نانومتر. ويمكن الجمع بين عدة مكتبات طالما أن جميع المؤشرات فريدة من نوعها.
- استخدام أسلوب التقدير الكمي فلوروميتريك. قياس ميليلتر 1 و 3 ميليلتر من المكتبة مع مجموعة الإنزيم دسدنا حساسية عالية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- مراقبة الجودة الإنتاجية المنخفضة اختيارية
- الموضوع المكتبة الحمض النووي إلى تا استنساخ19 لإدراج مكتبة الجزيئات في ناقلات للتضخيم. اتبع الإرشادات الطقم، تنمو من ~ 10-20 المستعمرات واستخراج الحمض النووي عن طريق مينيبريب البروتوكولات، كما هو موضح هنا من20.
- ناقل تسلسل استخدام الخدمات المحلية التسلسل والتحقق من أن تدرج تحتوي على فيروس نقص المناعة البشرية-1 المطلوب المستمدة متواليات والمحولات الخاصة بالمكتبة.
7 تشغيل تسلسل الفائق
- إنشاء ورقة نموذج تسلسل مع البرمجيات التجارية المقدمة مع منصة التسلسل.
- وتشير إلى مجموعة التسلسل المحدد. نموذجياً، اختر مجموعة 150-دورة، ولكن البعض الآخر مناسبة تبعاً لطول القراءة المطلوبة.
- حدد "فستق فقط" كتطبيق سير العمل. اختر أحد القوالب التي تحتوي على مؤشرات 24 الموجودة في مجموعات اليغنوكليوتيد متعدد (المشار إليها في الدليل kit).
- حدد "25 nt" ل Read1 و "125 nt" ل Read2. تبقى 6 nt لقراءة فهرس واحد.
ملاحظة: يستخدم فقط Read2 في التحليل الداخلي في التحليل. الحفاظ على Read1 على الأقل 25 nt لترتيب أغراض خوارزمية منصة.
- اتبع إرشادات الشركة المصنعة للتحديد لإعداد مكتبة قبل التشغيل والإعداد. اختيار 20 أقصى تركيز بعد الظهر واستخدام ارتفاع حاد في نسبة 15 في المائة، كالمكتبة من التعقيد منخفضة جداً.
8-بيانات التحليل
- معرفة ما إذا كان بتمرير تصفية النسبة المئوية ومتوسط نقاط الجودة Q30 مقبولة وفقا لتسلسلها إرشادات الشركة المصنعة للبرنامج.
ملاحظة: تمرير مرشح هو عادة > 90% وعادة ما تكون عشرات Q30 > 80%. - تحميل. fastq.gz الملفات من لوحة الوصل التسلسل الخاص بالشركة المصنعة.
- إعداد البرنامج النصي التسلسل
- إنشاء دليل جديد (مجلد) المسمى "أناليسيسكسيز" وانتقل إلى https://github.com/malimlab/seqparse بتحميل كافة ملفات التعليمات البرمجية المصدر (parse_sam.pl، rc_extract.pl، parse.sh) في هذا الدليل.
- تحميل قراءة قصيرة راصفة Bowtie، الإصدار 1.1.2، من http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml في نفس الدليل.
- التحميل يقوم بإنشاء دليل فرعي داخل "أناليسيسكسيز" المسمى "Bowtie-1-1-2". داخل هذا الدليل فتح الدليل الفرعي "فهارس" وتحميل القالب المتوفر التسلسلات المكونة من 6 ملفات ذات ملحقات.ebwt.
- تحميل فستق/A قصيرة ما يلي: تجهيز أدوات فاستكس-0.0.13 من http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/download.html مسبقاً في الدليل "أناليسيسكسيز".
- تحميل سامتولس (https://sourceforge.net/projects/samtools/files/) وأم-ريدكونت (https://github.com/genome/bam-readcount) إلى الدليل "المستندات".
- الانتقال. قراءة ملفات fastq.gz، وتحميلها في الخطوة 8، 2 لكل 2s (المنتهية في... _R2_001.fastq.gz) في الدليل "أناليسيسكسيز".
- افتح وحدة التحكم بالأوامر/المحطة الطرفية. الانتقال إلى "أناليسيسكسيز" كالدليل الحالي باستخدام الأوامر cd. اكتب "./parse.sh." لتشغيل البرامج النصية.
- العثور على ملفات.csv مع ملخصات لجميع العينات على مجموع قراءة التهم الموجهة إليه، وضبط طول قراءة التهم الموجهة إليه، وطبيعتها قراءة التهم الموجهة إليه،، فضلا عن الملفات مع الاختلاف الأساسي، لكل عينة في دليل يسمى parse_results ضمن الدليل "تحليل XYZ".
ملاحظة: انظر مناقشة لمزيد من المعلومات حول عملية التحليل. إرجاع البرنامج النصي ملفات csv مع مجموع ما يلي: لكل النوكليوتيدات على طول سلاسل قوية وقف فيروس نقص المناعة البشرية-1NL4.3 وأول عملية نقل حبلا حتى النوكليوتيدات 635. كتوجيه، لوحظت 50,000 إلى 100,000 فريدة من نوعها ما يلي عادة في عينات من الإصابات مع أرقام الخلية المشار إليها ولقاح الفيروسية ودون البروتينات المضادة للفيروسات أو المركبات. عادة ما ينتج نموذج عنصر تحكم اليغنوكليوتيد 100,000 إلى 200,000 على ما يلي.
Representative Results
تم تطبيق الأسلوب الموصوفة في هذه المقالة إلى دراسة أوسع نطاقا للتصدي للآليات الأساسية لتثبيط فيروس نقص المناعة البشرية-1 النسخ العكسي بالبروتين البشري APOBEC3G المضاد للفيروسات الرجعية (A3G)6. ويبين الشكل 3 الممثل النتائج التي تم الحصول عليها بعد استخدام البروتوكول في عينات من جيم-تي إس إس-الخلايا المصابة مع vif-نقص فيروس نقص المناعة البشرية-1 في غياب أو وجود A3G. مجموع عدد القراءات فريدة من نوعها التي تم الحصول عليها من كل عينة بعد تصفية أي تكرارات PCR التي لها 6 نفس رسم الباركود nt ونفس الطول (يقوم بتحليل البرامج المتوفرة) في الشكل 3. مستويات متزايدة من A3G تقليل عدد القراءة التي تعكس أثر A3G المثبطة في توليف كدنا RT وساطة الموصوفة سابقا وتقاس قبكر6،13،،من2122. في الشكل 3ب، جزء صغير الجزيئات في كل طول ممكن داخل 182 الأولى ترد nt. الإصابة بعدوى فيروس نقص المناعة البشرية-1 في الغياب من A3G، هو أن الأنواع الأكثر وفرة 180 الرئيسي nt قوية توقف جزيء نفسها، مع تراكم بعض من يقرأ في النطاق أقصر (23 إلى 40 nt) (أعلى رسوم بيانية graph، الأزرق). إضافة التغييرات A3G هذه الشخصية كاقتطاع زيادة حادة من أقصر، كدنا الجزيئات في بضعة مواقع محددة للغاية، واستنساخه الكشف عن (الرسوم البيانية الوسطى والدنيا). منذ A3G ديامينان سيتيديني، السيتوزين إلى أوريديني (اعتبرت ج-إلى-T) تحدث الطفرات كدنا عندما A3G موجود في إصابة فيريونس21،،من2324. استخدام المعلومات التي حصلت على التسلسل، النسبة المئوية للطفرات ج-إلى تي كان المرسومة على نفس الرسم البياني (خط منقط أحمر). تجدر الإشارة إلى أن الشخصية حيث مشتق من القراءات كلها فريدة من نوعها جنبا إلى جنب، وسوف تختلف التغطية لكل النوكليوتيدات. ومع ذلك، إذا لزم الأمر يمكن المتعلقة بالعودة إلى كل جزيء تسلسل المعلومات ويرتبط بنقطة محددة 3 '-وصول. وقد أخذت البيانات المقدمة من بولبيتير et al. 6 والترابط بين حيث وتجلى كدنا طول التشكيلات الجانبية بسبب الكشف والانقسام من كدنا ديميناتيد الخلوية واسطة الحمض النووي إصلاح الآلات.
عنصر تحكم إيجابية للنهج 3 '--رسم خرائط يمكن أن تنتج بسهولة بتجهيز مجموعة النوكليوتيد الاصطناعية تسلسل المعروفة، وطول وتركيز. عنصر التحكم هذا هو إضافة في ربط محول في خطوة 3.3.2 ونصح لإدراجها في جميع المكتبات متعدد. ينبغي أن البيانات التي تم الحصول عليها من عينة مراقبة جميع النوكليوتيد في نسب المدخلات المتوقعة، مع خلفية طفيفة جداً على ما يلي. ويبين الشكل 4 نتائج مجموعة مراقبة إيجابية من النوكليوتيد مركباً كيميائيا 17 (لمتواليات، انظر الجدول 2)، التي كانت متفاوتة في نسب اكويمولار. كما هو متوقع، تظهر جميع الجزيئات في القرب من وفرة متساوية مع اختلافات صغيرة فقط (الرسم البياني العلوي). بينما غالبية المناصب داخل تسلسل الحمض النووي-نظام الضمان الاجتماعي التي لم تكن ممثلة اليغنوكليوتيد إرجاع صفر قراءة التهم الموجهة إليه، لاحظنا الأنواع البسيطة التي هي nt 1 أو 2 أقصر من النوكليوتيد السيطرة الفعلية. نحن لم تحقق زيادة هذه الأنواع البسيطة ولكن افترض أنها تمثل منتجات المتدهورة أو غير مكتملة يحتمل أن تكون موجودة في مخزون اليغنوكليوتيد المتوفر في الشراء (النوكليوتيد أمروا بتنقية [هبلك]، التي الشركة المصنعة ليشير إلى نقاوة > 80%). ويبين الشكل أسفل نموذج عنصر تحكم من مكتبة مختلفة تشغيل، حيث تباين أعلى قليلاً بين النوكليوتيد 17 ويرتبط مع طول العام في أن يتم الكشف عن أطول مراقبة جزيئات أكثر كفاءة ثم أقصر منها. وهذا قد يكون راجعا إلى وجود تحيز طفيفة في ردود الفعل بكر أو في تجميع أثناء تسلسل مسك، التي لديها إدراج حجم أمثل وقد تحدث مع المكتبات يحمل نطاقات واسعة لا سيما إدراج. وسيلة أساسية لمعالجة هذا التحيز هو تطبيق عامل تطبيع استناداً إلى المنحدر الذي يشير إلى تحيز ربط جزيء طول (الخط الوردي). العمليات الحسابية المطلوبة مدرجة في برنامج تحليل (راجع الخطوة 8.3 في البروتوكول).
الشكل 1: رسم تخطيطي يوضح الخطوات الأولى لفيروس نقص المناعة البشرية-1 عكس النسخ- تبدأ العملية بالصلب من tRNA(Lys,3) (برتقالي) إلى موقع الربط التمهيدي (PBS) في الجينوم الفيروسي الجيش الملكي النيبالي (الخطوة 1)، الذي يسمح ببدء واستطالة كدنا الفيروسية (الأزرق، الخطوة 2). في الوقت ذاته، قالب المجينية الحمض النووي الريبي المتدهورة بنشاط رناسيه RT (الخطوة 3). الوسيطة الأولى كامل عملية النسخ العكسي المحطة حبلا ناقص القوية-(-) كدنا نظام الضمان الاجتماعي، وكاملة عندما يصل البلمرة RT حفزت 5 '-محطة المنطقة (R) تكرار جرنة (الخطوة 3). الوسيطة نظام الضمان الاجتماعي (-) تنقل إلى 3 '-المحطة قالب الحمض النووي الريبي الجينوم من الصلب إلى المنطقة (لاتينية) R تكرار الطرفية 3' طويلة مكملة. ومن هنا، تواصل البلمرة (الخطوة 4). في وصف أسلوب يحدده تطور النسخ العكسي رسم الخرائط الدقيقة طول كدنا الفيروسية الوليدة (أزرق). باور بوينت، بوليبوريني المسالك؛ U5، فريدة من نوعها 5 '-تسلسل؛ U3، فريدة من نوعها 3 '-تسلسل. يتم إعادة نشر هذا الرقم من منشور سابق6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : مخطط سير العمل والخطط الاستراتيجية التضخيم بكر وربط محول. (أ) سير العمل تحدد الخطوات الرئيسية لوصف تقنية لتحديد 3 '-تيرميني لفيروس نقص المناعة البشرية-1 عكس النصوص في الخلايا المصابة. هذا الرقم مقتبس من منشور سابق6. (ب) التخطيطي لربط محول واستراتيجية التضخيم PCR. هي متصلة جزيئات كدنا الوليدة من متغيرة الطول الذي قد تم تنقيته في الخطوات السابقة إلى محول الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل باستخدام الحمض النووي T4 ليجاسى. محول دبوس (المسماة "كامل كوك + ميسيق"، انظر الجدول 1) تصميم مستوحى من كوك وآخرون. 11-المحول يحمل عشوائية nt 6 الباركود التسلسل، الذي يسمح لإقران قاعدة لتسهيل عملية ربط وفي نفس الوقت بمثابة معرفاً ليقرأ فريدة من نوعها. يحمل 3 '-تيرميني محول فاصل (SpC3) لمنع عملية ربط الذاتي. يتم فصل المنتجات الواصلة من محول الزائد يشوه التفريد جل polyacrylamide (صفحة). الأحماض النووية في الهلام الملون ومقطعة إلى ثلاث قطع جل منفصلة ومتساوية الحجم في المنطقة من فوق المحول إلى البئر كما فعل في25. بعد شطف، وهطول الأمطار، واستثارة، المنتجات هي بكر تضخيم مع الإشعال الصلب بالتسلسل المعروف محول (التمهيدي 1، كيت اليغنوكليوتيد متعدد، انظر الجدول للمواد)، وهو أول كتاب يحمل 22 الأولى nt من فيروس نقص المناعة البشرية-1 5-لتر تسلسل فور الحمض الريبي النووي النقال (التمهيدي 2، MP1.0 + 22HIV). 5 '-تيرميني كبسولة تفجير المختار تحمل محولات لمنصة التسلسل الذي تم اختياره (P5 و P7) فضلا عن تسلسل الرقم القياسي لتمييز العينات الفردية تعمل في نفس المكتبة. نقطة انطلاق للتسلسل قراءة مبينة الإشعال. يشير المربع الأزرق إلى منطقة الفائدة لتحديد الأصلي 3 '-تيرميني جزيء تم التقاطها. وهذا الرقم مقتبس من منشور سابق6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : نتائج الممثل. (أ) إجمالي عدد قراءة عينات تمثيلية معالجتها مع بروتوكول وصف. وهذا يشمل جميع التسلسلات التي تم تحديدها كقراءة فريدة من نوعها لجزيئات فيروس نقص المناعة البشرية-1 مع بهم 3 '-تيرميني داخل 635 الأولى nt للطرح حبلا كدنا (تصل إلى جزء لكل تريليون، انظر الشكل 1). الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 لا تحمل A3G غلة أعلى عدد من القراءات، بينما A3G يحول دون توليف كدنا، ومما يقلل من إجمالي عدد مرات القراءة. الخلايا مصابة بمثابة عنصر سلبي، بينما يوفر مجموعة من اصطناعية النوكليوتيد عنصر إيجابي. ب) الوفرة النسبية كدناس لكل طول بين المواقف nt 23 و 182 (كدنا طول-نظام الضمان الاجتماعي هو 180 إلى 182 nt) من فيروس نقص المناعة البشرية-1NL4.3 يبين تسلسل (س) رسوم بيانية الأزرق (مقياس على المحور ص الأيسر). وتم حساب الوفرة النسبية لكدنا من العدد المطلق لتسلسل إنهاء في النوكليوتيدات معين ضمن تسلسل كدنا-نظام الضمان الاجتماعي مقسوماً على مجموع كافة ما يلي: قياس 182nt أو أقل. يظهر في خطوط حمراء متقطعة هي النسب المئوية لتحمل طفرات ج-إلى-T/U في موقف كل منهما (مقياس على المحاور y الحق–) على ما يلي. الشكل 3 يتم إعادة نشر ب من منشور سابق6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : الممثل نتائج عينات مراقبة- يظهر هي اثنين التشكيلات الجانبية لحمامات السباحة التي تحتوي على كميات اكويمولار من 17 النوكليوتيد الاصطناعية طول مختلف. هذه النوكليوتيد قد تسلسل من فيروس نقص المناعة البشرية-1NL4.3 واختيرت لتغطية أطوال مختلفة وتقدم جميع القواعد 4 3 '-النوكليوتيدات (انظر الجدول 2). ويبين الشكل العلوي عينة مراقبة إيجابية من الشكل 3. تم الكشف عن لا تحيز كبير نحو طول جزيء أو فتح 3 '-تيرميني. يظهر الرسم البياني السفلي مكتبة مختلفة تشغيل، التي أنتجت تحيز طول طفيفة في التسلسل. في هذه الحالة، من المستحسن تطبيق عامل تطبيع، المستمد من المنحدر (يظهر باللون الوردي) الذي يمثل حجم التحيز. يتم إعادة نشر هذا الرقم من منشور سابق6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| اسم اليغو | طول في nt | التسلسل | والغرض | الشركة المصنعة (تنقية) | ||||||||||||||
| كامل كوك + مسك | 61 | 5-بو-تجاجاجككتاجتكجكتجتكانننننكتجكككاتاجاجاجاتكجاجاجكاكاكجتكت-SpC3-3 ' | محول | تقنيات "الحمض النووي الصندوق الاستئماني المستقل" ([هبلك]) | ||||||||||||||
| 2xBiotin SS الطعم | 40 | 5-البيوتين-كاجتجتجاااتكتكتاجكاجتجكجكككجاكاججاك-البيوتين-3 ' | القبض على الهجين | يوروفينس كاتانيا ([هبلك]) | ||||||||||||||
| Ss البيوتين 1-16 | 22 | 5-كاجتجتجاااتكتكتاجكاج-بيتيج-3 ' | القبض على الهجين | يوروفينس كاتانيا ([هبلك] | ||||||||||||||
| الحمض الريبي النووي النقال البيوتين + CTG | 16 | 5-كاجتجكجكككجاكا-بيتيج-3 ' | القبض على الهجين | يوروفينس كاتانيا ([هبلك]) | ||||||||||||||
| MP1.0 + 22HIV | 82 | --آتجاتاكجكجاككاككجاجاتكتاكاكتكتتكككتاكاكجاكجكتكتككجاتكتكاكتجكتاجاجاتتتككاكاكتج 5 '-3' | [بكر] تضخيم | يوروفينس كاتانيا ([هبلك] | ||||||||||||||
الجدول 1: جدول النوكليوتيد بما في ذلك طول، وتسلسل، والتعديلات التي تستخدم في وصف بروتوكول. الجدول مقتبس من منشور سابق6. اضغط هنا لتحميل هذا الجدول كملف excel-
| اسم اليغو | طول في nt | التسلسل | الشركة المصنعة (تنقية) | |||||||||||||
| يخدع بالمشاركة طويلة ج | 120 | --كتجكتاجاجاتتتككاكاكتجاكتاااججتكتجاججاتكتكتاجتاككاجاجتكاكاكاكاجاكججكاكاكاكتاكتتجاجكاكتكاجكاجكتتاتجاجكتاجك 5 '-3' | يوروفينس كاتانيا ([هبلك]) | |||||||||||||
| يخدع بالمشاركة طويلة ز | 119 | --كتجكتاجاجاتتتككاكاكتجاكتاااججتكتجاججاتكتكتاجتاككاجاجتكاكاكاكاجاكججكاكاكاكتاكتتجاجكاكتكاجكاجكتتاتجاجكتاج 5 '-3' | يوروفينس كاتانيا ([هبلك]) | |||||||||||||
| المشاركة يخدع تي طويلة | 116 | --كتجكتاجاجاتتتككاكاكتجاكتاااججتكتجاججاتكتكتاجتاككاجاجتكاكاكاكاجاكججكاكاكاكتاكتتجاجكاكتكاجكاجكتتاتجاجكت 5 '-3' | يوروفينس كاتانيا ([هبلك]) | |||||||||||||
| A طويلة يخدع بالمشاركة | 118 | --كتجكتاجاجاتتتككاكاكتجاكتاااججتكتجاججاتكتكتاجتاككاجاجتكاكاكاكاجاكججكاكاكاكتاكتتجاجكاكتكاجكاجكتتاتجاجكتا 5 '-3' | يوروفينس كاتانيا ([هبلك]) | |||||||||||||
| يخدع بالمشاركة منتصف ج | 76 | --كتجكتاجاجاتتتككاكاكتجاكتاااججتكتجاججاتكتكتاجتاككاجاجتكاكاكاكاجاكججكاك 5 '-3' | يوروفينس كاتانيا ([هبلك]) | |||||||||||||
| يخدع بالمشاركة منتصف ز (أ) | 71 | --كتجكتاجاجاتتتككاكاكتجاكتاااججتكتجاججاتكتكتاجتاككاجاجتكاكاكاكاجاكج 5 '-3' | يوروفينس كاتانيا ([هبلك]) | |||||||||||||
| يخدع بالمشاركة منتصف ز (ب) | 72 | --كتجكتاجاجاتتتككاكاكتجاكتاااججتكتجاججاتكتكتاجتاككاجاجتكاكاكاكاجاكج 5 '-3' | يوروفينس كاتانيا ([هبلك]) | |||||||||||||
| يخدع بالمشاركة منتصف A | 69 | --كتجكتاجاجاتتتككاكاكتجاكتاااججتكتجاججاتكتكتاجتاككاجاجتكاكاكاكاجا 5 '-3' | يوروفينس كاتانيا ([هبلك]) | |||||||||||||
| يخدع بالمشاركة منتصف T | 85 | --كتجكتاجاجاتتتككاكاكتجاكتاااججتكتجاججاتكتكتاجتاككاجاجتكاكاكاكاجاكججكاكاكاكتاكت 5 '-3' | يوروفينس كاتانيا ([هبلك]) | |||||||||||||
| A قصيرة يخدع بالمشاركة | 40 | --كتجكتاجاجاتتتككاكاكتجاكتاااججتكتجاججا 5 '-3' | يوروفينس كاتانيا ([هبلك]) | |||||||||||||
| المشاركة يخدع تي قصيرة | 33 | --كتجكتاجاجاتتتككاكاكتجاكتاااغغت 5 '-3' | يوروفينس كاتانيا ([هبلك]) | |||||||||||||
| المشاركة يخدع ز قصيرة | 41 | --كتجكتاجاجاتتتككاكاكتجاكتاااججتكتجاجج 5 '-3' | يوروفينس كاتانيا ([هبلك]) | |||||||||||||
| يخدع بالمشاركة قصيرة ج | 34 | --كتجكتاجاجاتتتككاكاكتجاكتاااججتك 5 '-3' | يوروفينس كاتانيا ([هبلك]) | |||||||||||||
| يخدع بالمشاركة 46 (T) | 46 | 5-كتجكتاجاجاتتتككاكاكتج أكتاااججتكتجاججاتكتكت-3 ' | يوروفينس كاتانيا ([هبلك]) | |||||||||||||
| Con 83 (C) بالمشاركة | 83 | 5-كتجكتاجاجاتتتككاكاكتج أكتاااججتكتجاججاتكتكتاجتاككاجاجتكاكاكاكاجاكججكاكاكاكتاك-3 ' | يوروفينس كاتانيا ([هبلك]) | |||||||||||||
| Con 103 (C) بالمشاركة | 103 | 5-كتجكتاجاجاتتتككاكاكتج أكتاااججتكتجاججاتكتكتاجتتاككاجاجتكاكاكاكاجاكججكاكاكاكتاكتتجاجكاكتكاجكاجك-3 ' | يوروفينس كاتانيا ([هبلك]) | |||||||||||||
| يخدع بالمشاركة 107 (أ) | 107 | 5-كتجكتاجاجاتتتككاكاكتج أكتاااججتكتجاججاتكتكتاجتتاككاجاجتكاكاكاكاجاكججكاكاكاكتاكتتجاجكاكتكاجكاجكتتا-3 ' | يوروفينس كاتانيا ([هبلك]) | |||||||||||||
الجدول 2: الجدول 17 النوكليوتيد التحكم الاصطناعية تستخدم كعينة مراقبة إيجابية. النوكليوتيد أعلى 13 تم اختيارها على أساس حجم [طويلة (116 إلى 120 nt)، متوسط (69 إلى 85 nt)، قصيرة (33 إلى 41 nt)] كذلك على 3 '-تيرميني. الجدول مقتبس من منشور سابق6. اضغط هنا لتحميل هذا الجدول كملف excel-
Discussion
توافر التسلسل العميق سريعة وموثوق بها وفعالة من حيث التكلفة قد أحدث ثورة في العديد من الجوانب في مجال علوم الحياة، والسماح بعمق كبير في التحليلات القائمة على التسلسل. تحدي المتبقي يكمن في التصميم المبتكر وخلق الممثل مكتبات التسلسل. هنا يصف لنا وضع بروتوكول لالتقاط جزيئات كدنا الفيروسية الوليدة، على وجه التحديد المواد الوسيطة لعملية النسخ العكسي فيروس نقص المناعة البشرية-1.
أن الخطوة الأكثر أهمية في هذه الاستراتيجية هو ربط محول لفتح 3 '-تيرميني بطريقة كمية وغير متحيزة. فعالية ليجيشنز بين اثنين ssDNA تيرميني، سواء في جملة-وإينتراموليكولار، تم التحقيق فيها والأمثل لمختلف التطبيقات11،،من2627،،من2829. اختيار استخدام محول دبوس مع ليجاسى T4 الحمض النووي حسب الشروط الموضحة في الخطوة 3، 3 هو نتيجة للتحسين التجريبية التي نحن تقييم ligases مختلفة، محولات والمواد الكاشفة للربط النوكليوتيد الاصطناعية التي تمثل فيروس نقص المناعة البشرية-1 تسلسل (الجدول 2) (البيانات لا تظهر). في المختبر اختبار ردود الفعل هذه، أكدنا أن ليجاسى T4 الحمض النووي بوساطة ربط محول دبوس، كما وصفها كوك وآخرون. 11، قد تحيز منخفضة جداً، ويحقق القرب ربط كاملة من جزيئات يقبلون عند استخدام المحول في الزائدة. كفاءة عملية ربط لم تتأثر بإضافة النوكليوتيدات تسلسل تقديم المحول متوافق مع نظام متعدد التمهيدي (انظر الشكل 4). وفي المقابل، وجدنا أن من الحرارة 5 'الحمض النووي/رنا ليجاسى ("ليجاسى A"، انظر الجدول للمواد للضبط ligases مقارنة هنا)، الذي هو المهندسة رنا ليجاسى تم تطويره جزئيا لتحسين كفاءة عملية ربط مع ssDNA كما يقبلون 27، كان في الواقع أكثر فعالية في ليجاتينج اثنين ssDNA جزيئات من الحمض النووي الريبي ليجاسى ليجاسى ("B") ولكن لديها تحيز كبير، مع اختلافات قوية في كفاءة عملية ربط حتى بين النوكليوتيد مع اختلاف طول قاعدة واحد [الجدول 2 ; المشاركة يخدع منتصف ز (أ) و (ب)]. وعلاوة على ذلك، وجدنا تحيزاً الحد أدنى فقط في ردود الفعل مع "جيم ليجاسى" جنبا إلى جنب مع محول القيام تجارب معشاة 5 '-تيرميني (استراتيجية تستخدم للتعويض عن التحيز النوكليوتيدات المعروفة"ليجاسى ج"؛ انظر على سبيل المثال دينغ et al. 30). ومع ذلك، "جيم ليجاسى"-ليجيشنز الجزيئات وساطة كانت غير مكتملة، مما يجعل النظام ليجاسى الحمض النووي T4 اختيار متفوقة.
عدة خطوات مراقبة الجودة عبر مسار البروتوكول وإدراج عناصر إيجابية وسلبية، والسماح للكشف عن المشاكل المحتملة قبل مواصلة التحليل وتوفير التوجيه لجهود استكشاف الأخطاء وإصلاحها. كوانتيفيكيشنز قبكر في الخطوات 2.2.2 و 2.3.12 ضمان أن كمية المواد المدخلة غير كافية. كدنا نموذجي نسخ الأرقام في النطاق شطف (من الخطوة 2، 1) 200 ميليلتر من حوالي 10,000 إلى 300,000 كل ميليلتر. الخطوة القبض على الهجين يمكن أن يسفر عن بعض الخسائر الشاملة من فيروس نقص المناعة البشرية-1 كمية كدنا بل ينبغي أن يسفر إثراء خاصة فيروس نقص المناعة البشرية-1 كدنا قوية على الحمض الخلوي، الذي يمكن تحديده باستخدام أجهزة الإشعال المناسبة لقياس الحمض النووي قبل وبعد تخصيب اليورانيوم قبل قبكر أو عن طريق قياس مجموع تركيز الحمض النووي. كدنا فيروس نقص المناعة البشرية-1 تم استردادها بعد القبض على الهجين الخطوات ينبغي أن يكون على الأقل 10% المدخلات. منخفضة ابتداء من المواد قد يفسر خلاف عنصر تحكم اليغنوكليوتيد ناجحة إيجابية (راجع الخطوة 3.3.2) لكن ما يلي: تحقيق في العينات محدودة فقط. انخفاض قراءة الأرقام الإجمالية يمكن أن تفسر أيضا بالمبالغة في تقدير تركيز المكتبة نظراً للوجود غير صلة الأنواع الحمض النووي دون مسك محولات. وهذا سيؤدي إلى كتلة منخفضة الكثافة ويمكن تحسينه من خلال تحديد تركيز تسلسلات فيروس نقص المناعة البشرية-1 في المكتبة عن طريق قبكر بالإضافة إلى المبلغ الإجمالي الحمض النووي بفحوصات فلوروميتريك. نظراً للطبيعة الحساسة للغاية للأسلوب، ينبغي إيلاء عناية خاصة لتجنب التلوث حتى منخفض المستوى، سواء من عينات أخرى (على وجه الخصوص، من مخزون اليغنوكليوتيد عنصر التحكم التركيز العالي) كذلك من معدات المختبرات. تعمل بالأشعة فوق البنفسجية تعقيم PCR محطة عمل مفيد في هذا الصدد. التفريد جل الآلي للمكتبة النهائي (الخطوة 6.1.2) مقياس مراقبة الجودة مزيد. نطاق حجم الحمض النووي ولاحظ عادة بين 150 إلى 500 nt. الإشعال يمكن الكشف عنها في عنصر التحكم الاختياري بعد بكر وقبل تنقية (انظر الملاحظة في الخطوة 5، 2) الآن يجب أن تكون غائبة. في نتيجة ذلك ممثل، لقد منحنى كثافة العينة ذروتها حوالي 160 إلى 170 nt وأكثر وضوحاً بثانية ذروة حوالي 320 إلى 350 nt. المرجح أن هذا يعكس وفرة أعلى كثيرا ما ينظر في قصيرة نسبيا (طول إدراج nt 1 إلى 20) عكس النصوص وكامل طول قوية توقف (180 إلى 182 nt إدراج الطول) (الشكل 3ب).
بينما قدم البروتوكول والإشعال مختارة محددة لفيروس نقص المناعة البشرية-1 أوائل النسخ العكسي ثوابت، الأسلوب تنطبق بصورة عامة على أية دراسة تهدف إلى تحديد فتح 3 '-تيرميني للحمض النووي. التعديلات الرئيسية المطلوبة في سياقات أخرى ستكون طريقة للقبض على الهجين واستراتيجية التصميم التمهيدي. على سبيل المثال، إذا كان الهدف أن تتكيف أواخر فيروس نقص المناعة البشرية-1 النصوص، عددا أكبر من مختلف النوكليوتيد بيوتينيلاتيد الالتقاط الصلب عبر طول كدنا سيكون من المستصوب ويرجح أن تنخفض الخسارة في الخطوة القبض على الهجين. وكما ذكر في المقدمة، من المهم النظر في القيود عند تصميم النطاق أكثر مما 3 '-تيرميني ليتم اكتشافها لتجنب مصادر مختلفة من التحيز. أولاً، قد يكون هناك تحيز في ردود الفعل PCR إذا كانت القوالب مع المحول من طول متفاوتة إلى حد كبير. ثانيا، منصة التسلسل المستخدمة هنا (مثل مسك) نطاق طول إدراج مفضل للتكتل الأمثل، وإلى حد كبير قد لا تعيين تسلسل المنتجات أقصر وأطول بنفس الكفاءة. في جزء منه، وهذا يمكن معالجتها حسابياً، كما قامت بحساب عامل تصحيح للتحيز القائم على طول خطي (انظر الشكل 4، أسفل الرسم البياني). ومع ذلك، إذا كانت المنطقة من حيث هو المطلوب 3 '-تيرميني رسم الخرائط طويلة (nt > 1000)، فإنه من المستحسن أكثر تقسيم ردود الفعل مع النصوص الواصلة واستخدام كبسولة تفجير المنبع متعددة لتقييم 3'-تيرميني في الفروع.
تمت كتابة البرنامج التحليل داخليا لغرض محدد هو تحليل كلا النوكليوتيدات آخر فيروس نقص المناعة البشرية-1 تسلسل المتاخمة لتسلسل محول الثابتة وكذلك الاختلاف الأساسي من جميع القواعد لتحديد أي طفرات. الخطوات الفردية التي تشمل ما يلي: أولاً، يتم تقسيم في تسلسل محول استخدام أدوات فاستكس-0.0.13؛ بعد ذلك، تتم إزالة أي تسلسل لا تتكرر (بمعنى تسلسل مماثلة بما في ذلك الرمز الشريطي). ثم محاذاة كل القراءات فريدة المتبقية لفيروس نقص المناعة البشرية-1 التسلسل باستخدام Bowtie (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) مع عدم تطابق الحد الأقصى تعيين في ثلاث قواعد. يتكون تسلسل قالب من 635 الأولى nt لفيروس نقص المناعة البشرية-1 كدنا (سلالة NL4.3)، الذي يتضمن التسلسل-نظام الضمان الاجتماعي وأول منتج نقل حبلا يصل إلى المسار بوليبوريني (U5-R-U3-PPT) (انظر الشكل 1). وبالتالي، على البرامج المقدمة وقوالب فقط مباشرة مناسبة إذا استخدمت الطريقة لنفس التطبيق (الكشف عن النصوص عكس المبكر ل فيروس نقص المناعة البشرية-1NL4.3). سيتعين إجراء تعديلات لمتواليات مستهدفة أخرى. ومواقف 3 '-تيرميني لكل عملية قراءة يحددها الموقف في المحاذاة. يتم تسجيل المكالمات قاعدة لكل وظيفة، وتحسب معدلات الطفرة من تغطية مجموع كل قاعدة، ويختلف، كما يقرأ ذات أطوال مختلفة وإدراج طويلة لا يمكن تغطيتها بتسلسل 125-قاعدة في Read2 تماما.
وختاما، نعتقد الأسلوب وصف لتكون أداة قيمة للعديد من أنواع الدراسات. وتشمل التطبيقات واضحة تحقيقات الآليات الأساسية لتثبيط النسخ العكسي عن طريق العقاقير المضادة للفيروسات الرجعية أو عوامل تقييد الخلوية. ومع ذلك، ينبغي أن تكون تعديلات طفيفة نسبيا اللازمة للتكيف مع النظام إلى 3 '-تيرميني رسم الخرائط داخل أخرى وسيطة الفيروسي الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل التي موجودة، على سبيل المثال، في تكرار البارفو. وعلاوة على ذلك، يمكن أن توفر مبدأ الأسلوب، لا سيما خطوتها الربط الأمثل، جزءا أساسيا من تصميم إعداد المكتبة لتوصيف أي ملحقات 3 '--الحمض النووي، بما في ذلك الونجيشنز التي تحفزها الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل الخلوية [بولمرس].
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم أي شيء كشف.
Acknowledgments
الكتاب الاعتراف بالدعم من أعضاء المختبر ماليم ولويس Apolonia، الندبة جيرنيج، و Oakey ريبيكا. يشكر المؤلفون أرنو مات في كلية الملك "لندن مركز الجينوم" وديبي هيوز في جامعة كلية لندن (UCL)، يعمل معهد "طب الأعصاب القادم جيل مرفق التسلسل" للحصول على مساعدة مع تسلسل مسك. أيد المملكة المتحدة مجلس البحوث الطبية (G1000196 والسيد/M001199/1 إلى م. م.)، ومؤسسة ويلكوم ترست (106223/Z/14/ي إلى م. م.)، والمفوضية الأوروبية للبرنامج الإطاري السابع (FP7-2007-2013) العمل إطار المنحة لا. بييف-GA-2012-329679 (إلى موانئ دبي)، ووزارة الصحة عن طريق "المعاهد الوطنية" لجائزة مركز البحوث الطبية الحيوية الشامل للبحوث الصحة للرجل وسانت توماس مؤسسة دائرة الصحة الوطنية الثقة في شراكة مع كلية لندن للملك والملك مستشفى الكلية مؤسسة دائرة الصحة الوطنية الثقة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Gibco | 31966-021 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15150-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| HeraCell Vios 250i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030966 | |
| Laminar flow hood - CAS BioMAT2 | Wolflabs | CAS001-C2R-1800 | |
| 10mm TC-treated culture dish | Corning | 430167 | |
| TrypLE™ Express (1x), Stable Trypsin Replacement Enzyme | Gibco | 12605-010 | |
| OptiMEM® (Minimal Essential Medium) | Gibco | 31985-047 | |
| HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) | NIH Aids reagent program | 114 | |
| Polyethylenimine (PEI) - MW:25000 | PolySciences Inc | 23966-2 | dissolved at 1mg/ml and adjusted to pH7 |
| RQ1- Rnase free Dnase | Promega | M6101 | |
| Filter 0.22 μm | Triple Red Limited | FPE404025 | |
| 15 mL polypropylene tubes | Corning | CLS430791 | |
| Sucrose | Calbiochem | 573113 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 14190-094 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | |
| Ultracentrifuge | Sorval | WX Ultra Series | Th-641 Rotor |
| Alliance HIV-1 p24 antigen ELISA kit | Perkin Elmer | NEK050001KT | |
| CEM-SS cells | NIH Aids reagent program | 776 | |
| Roswell Park Memorial Institute Medium | Gibco | 31870-025 | |
| CoStar® TC treated multiple well plates | Corning | CLS3513-50EA | |
| Benchtop centrifuge: Heraus™ Multifuge™ X3 FR | Thermo Scientific | 75004536 | |
| TX-1000 Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003017 | |
| Microcentrifuge: 5424R | Eppendorf | 5404000060 | |
| Total DNA extraction kit (DNeasy Blood and Tissue kit) | Qiagen | 69504 | |
| Nuclease free H2O | Ambion | AM9937 | |
| Cutsmart buffer | New England Biolabs (part of DpnI enzyme) | R0176S | |
| DpnI restriction enzyme | New England Biolabs | R0176S | |
| Oligonucleotides for qPCR | MWG Eurofins | N/A | HPSF purification |
| TaqMan PCR Universal Mastermix | Thermo | 4304437 | |
| LoBind Eppendorf® tubes | Eppendorf | 30108078 | |
| Axygen™ aerosol filter pipette tips, 1000 μL | Fisher Scientific | TF-000-R-S | |
| Axygen™ aerosol filter pipette tips, 200 μL | Fisher Scientific | TF-200-R-S | |
| Axygen™ aerosol filter pipette tips, 20 μL | Fisher Scientific | TF-20-R-S | |
| Axygen™ aerosol filter pipette tips, 10 μL | Fisher Scientific | TF-10-R-S | |
| PCR clean hood | LabCaire | Model PCR-62 | |
| DynaMag™2-magnet | Thermo | 12321D | |
| Streptavidin MagneSphere® paramagnetic particles | Promega | Z5481 | |
| Casein | Thermo Scientific | 37582 | |
| End over end rotator, Revolver™ 360° | Labnet | H5600 | |
| Tris-Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma | H1758-100ML | |
| EDTA disodium salt dihydrate | Electran (VWR) | 443885J | |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
| Dri-Block® Analog Block Heater | Techne | UY-36620-13 | |
| PCR tubes and domed caps | Thermo Scientific | AB0266 | |
| PCR machine | Eppendorf | Mastercycler® series | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202M | |
| 40% Polyethylene glycol solution (PEG) in H2O, MW: 8000 | Sigma | P1458-25ML | |
| Betaine solution, 5M | Sigma | B0300-1VL | |
| Gel loading buffer II (formamide buffer) | Thermo Scientific | AM8546G | |
| Precast 6% TBE urea gels | Invitrogen | EC6865BOX | |
| Mini cell electrophoresis system | Invitrogen, Novex | XCell SureLock™ | |
| Tris/Borate/EDTA solution (10x) | Fisher Scientific | 10031223 | |
| Needle 21 G x1 1/2 | VWR | 613-2022 | |
| SYBR Gold nucleic acid stain (10000x) | Life Technologies | S11494 | |
| Dark Reader DR46B transilluminator | Fisher Scientific | NC9800797 | |
| Ammonium acetate | Merck | 101116 | |
| SDS solution 20% (w/v) | Biorad | 161-0418 | |
| Centrifuge tube filter | Appleton Woods | BC591 | |
| Filter Glass Fibre Gf/D 10mm | Whatman (VWR) | 512-0427 | |
| polyadenylic acid (polyA) RNA | Sigma | 10108626001 | |
| Glycogen, molecular biology grade | Thermo Scientific | R0561 | |
| Isopropanol (2-propanol) | Fisher Scientific | 15809665 | |
| Ethanol, molecular biology grade | Fisher Scientific | 10041814 | |
| Accuprime™ Supermix I (DNA polymerase premix) | Life Technologies | 12342-010 | |
| NEBNext® Multiplex Oligo for Illumina (Index Primer Set 1 and 2) | New England Biolabs | E7335S; E7500S | |
| Tapestation D1000 Screentape High sensitivity | Agilent Technologies | 5067- 5584 | |
| Tapestation D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067- 5585 | |
| 2200 Tapestation - automated gel electrophoresis system | Agilent Technologies | G2965AA | |
| Agencourt® AMPure® beads XP | Beckman Coulter | A63880 | |
| Qubit™ dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit™ 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Topo™ TA cloning Kit | Invitrogen | 450071 | |
| Sequencing platform: MiSeq System | Illumina | ||
| Experiment Manager (Sample sheet software) | Illumina | Note: Use TruSeq LT as a template | |
| Miseq™ Reagent kit V3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
| Sequencing hub: Basespace | Illumina | https://basespace.illumina.com | |
| Ligase A: Thermostable 5’ App DNA/RNA ligase | NEB | M0319S | Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion. |
| Ligase B: T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion. |
| Ligase C: CircLigase | Epicentre | CL4111K | Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion. |
References
- Herschhorn, A., Hizi, A. Retroviral reverse transcriptases. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (16), 2717-2747 (2010).
- Hu, W. S., Hughes, S. H. HIV-1 reverse transcription. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), (2012).
- Levin, J. G., Mitra, M., Mascarenhas, A., Musier-Forsyth, K. Role of HIV-1 nucleocapsid protein in HIV-1 reverse transcription. RNA Biology. 7 (6), 754-774 (2010).
- Menendez-Arias, L., Sebastian-Martin, A., Alvarez, M. Viral reverse transcriptases. Virus Research. , (2016).
- Telesnitsky, A., Goff, S. P. Retroviruses. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. , (1997).
- Pollpeter, D., et al. Deep sequencing of HIV-1 reverse transcripts reveals the multifaceted antiviral functions of APOBEC3G. Nature Microbiology. 3 (2), 220-233 (2018).
- Frohman, M. A., Dush, M. K., Martin, G. R. Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (23), 8998-9002 (1988).
- Liu, X., Gorovsky, M. A. Mapping the 5' and 3' ends of Tetrahymena thermophila mRNAs using RNA ligase mediated amplification of cDNA ends (RLM-RACE). Nucleic Acids Research. 21 (21), 4954-4960 (1993).
- Ince, I. A., Ozcan, K., Vlak, J. M., van Oers, M. M. Temporal classification and mapping of non-polyadenylated transcripts of an invertebrate iridovirus. Journal of General Virology. 94, Pt 1 187-192 (2013).
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).
- Kwok, C. K., Ding, Y., Sherlock, M. E., Assmann, S. M., Bevilacqua, P. C. A hybridization-based approach for quantitative and low-bias single-stranded DNA ligation. Analytical Biochemistry. 435 (2), 181-186 (2013).
- Abram, M. E., Tsiang, M., White, K. L., Callebaut, C., Miller, M. D. A cell-based strategy to assess intrinsic inhibition efficiencies of HIV-1 reverse transcriptase inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (2), 838-848 (2015).
- Bishop, K. N., Verma, M., Kim, E. Y., Wolinsky, S. M., Malim, M. H. APOBEC3G inhibits elongation of HIV-1 reverse transcripts. PLoS Pathogens. 4 (12), 1000231 (2008).
- Zack, J. A., Haislip, A. M., Krogstad, P., Chen, I. S. Incompletely reverse-transcribed human immunodeficiency virus type 1 genomes in quiescent cells can function as intermediates in the retroviral life cycle. Journal of Virology. 66 (3), 1717-1725 (1992).
- Adachi, A., et al. Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone. Journal of Virology. 59 (2), 284-291 (1986).
- Shah, V. B., Aiken, C. In vitro uncoating of HIV-1 cores. Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).
- JoVE Science Education Database. Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology: Passaging Cells. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- JoVE Science Education Database. JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology: Using a Hemocytometer to Count Cells. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. Universal TA cloning. Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Mangeat, B., et al. Broad antiretroviral defence by human APOBEC3G through lethal editing of nascent reverse transcripts. Nature. 424 (6944), 99-103 (2003).
- Gillick, K., et al. Suppression of HIV-1 infection by APOBEC3 proteins in primary human CD4(+) T cells is associated with inhibition of processive reverse transcription as well as excessive cytidine deamination. Journal of Virology. 87 (3), 1508-1517 (2013).
- Harris, R. S., et al. DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection. Cell. 113 (6), 803-809 (2003).
- Zhang, H., et al. The cytidine deaminase CEM15 induces hypermutation in newly synthesized HIV-1 DNA. Nature. 424 (6944), 94-98 (2003).
- Konig, J., et al. iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Troutt, A. B., McHeyzer-Williams, M. G., Pulendran, B., Nossal, G. J. Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (20), 9823-9825 (1992).
- Zhelkovsky, A. M., McReynolds, L. A. Structure-function analysis of Methanobacterium thermoautotrophicum RNA ligase - engineering a thermostable ATP independent enzyme. BMC Molecular Biology. 13 (24), (2012).
- Li, T. W., Weeks, K. M. Structure-independent and quantitative ligation of single-stranded DNA. Analytical Biochemistry. 349 (2), 242-246 (2006).
- Gansauge, M. T., et al. Single-stranded DNA library preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase. Nucleic Acids Research. 45 (10), 79 (2017).
- Ding, Y., Kwok, C. K., Tang, Y., Bevilacqua, P. C., Assmann, S. M. Genome-wide profiling of in vivo RNA structure at single-nucleotide resolution using structure-seq. Nature Protocols. 10 (7), 1050-1066 (2015).
