Summary
نقدم بروتوكول للحصول على توقيعات البروتين الضامة البشرية وتطبيق هذا على تحديد أثر بيئة منخفضة الأكسجين في الاستقطاب بلعم.
Abstract
الضامة هي الخلايا المناعية الفطرية تشارك في عدد من الوظائف الفسيولوجية التي تتراوح من الردود على مسببات الأمراض المعدية إلى التوازن الأنسجة. وظائف مختلفة من هذه الخلايا تتصل بدولهم التنشيط، الذي يسمى أيضا الاستقطاب. الوصف الجزيئي الدقيق لهذه الاستقطابات المختلفة أولويات في مجال البيولوجيا بلعم. من المسلم به حاليا أن اتباع نهج متعدد الأبعاد ضروري لوصف كيفية التحكم في استقطاب الإشارات البيئية. وفي هذا التقرير، يصف لنا بروتوكول مصمم للحصول على توقيع البروتين استقطابات مختلفة في الضامة البشرية. ويستند هذا البروتوكول إجراء تقييم كمي للتعبير البروتين بلعم الحصول عليها من مجزأ بهلام ومحتوى تحلل الخلوية Lys ج/التربسين-يهضم خالية من التسمية. نحن نقدم أيضا بروتوكول استناداً إلى الهضم بالحل و isoelectric تركز تجزئة لاستخدامه كبديل لذلك. نظراً لأن تركيز الأكسجين معلمة بيئية ذات صلة في الأنسجة، يمكننا استخدام هذا البروتوكول لاستكشاف تركيبة الغلاف الجوي كيف أو بيئة منخفضة أكسجين يؤثر على تصنيف بلعم الاستقطاب.
Introduction
الضامة هي الخلايا المناعية الفطرية تشارك في عدد من الوظائف الفسيولوجية التي تتراوح من الردود على مسببات الأمراض المعدية إلى التوازن الأنسجة، بما في ذلك إزالة الخلايا أبوبتوتيك وتجديد المصفوفة خارج الخلية1. تتميز هذه الخلايا اللدونة المظهرية قوية2 أن يترجم إلى إمكانية تنشيط العديد من دول، التي تسمى أيضا الاستقطابات. الوصف الجزيئي الدقيق لهذه الاستقطابات المختلفة أولويات في مجال علم الأحياء بلعم3. اقترح تصنيف هذه الاستقطابات استخدام ما يسمى الانقسام M1/M2، الذي يمثل M1 برو التحريضية و M2 يمثل الضامة للالتهابات. يناسب هذا النموذج جيدا في مختلف الحالات المرضية مثل الالتهابات الحادة والحساسية والسمنة4. ومع ذلك، في الأنسجة الملتهبة المزمن والسرطان، وقد ثبت أن هذا التصنيف غير قادر على فهم مرجع المظهرية الواسعة التي الضامة الموجودة في بعض البيئات الخلوية5،6، 7-توافق الآراء الحالي أن بلعم الاستقطاب أفضل وصف باستخدام نموذج متعدد الأبعاد لدمج إشارات محددة ميكرونفيرونمينتال8. وقد أكد هذا الاستنتاج من خلال تحليل ترانسكريبتوميك الضامة البشرية تبين أن طراز M1/M2 غير فعال في وصف الاستقطابات حصل على9.
قدمت الدراسة يهدف إلى توفير بروتوكول للحصول على توقيعات البروتين من استقطابات مختلفة في الضامة البشرية. ونحن تصف كيفية التفريق الضامة البشرية في بيئات لمختلف مستويات الأوكسجين والحصول على الببتيدات من البروتين بلعم كاملة القيام بإجراء تقييم كمي خالية من التسمية. ويسمح هذا التحديد الكمي مقارنة مستويات التعبير من البروتينات المختلفة. كما كشفت الأبحاث حول الخلايا الجذعية أهمية الأوكسجين معلمة رئيسية بيئية10، نحن نسعى إلى فهم كيف يمكن أن تؤثر هذه المعلمة الأنسجة بلعم الاستقطاب في البشر. الضغط الجزئي للأكسجين قد وجد أن تتراوح من 3 إلى 20% (من مجموع الضغط الجوي) في جسم الإنسان، حيث يقابل 20% تقريبا لما يستخدم عادة في حاضنة ثقافة خلية (القيمة الصحيحة هي حوالي 18.6 في المائة مع مراعاة وجود الماء في الاعتبار).
وقد أظهرت الأعمال السابقة أن السنخية تختلف عن الضامة فراغي من الوظيفية والمورفولوجية نقطة المشاهدات11 وأن هذه الاختلافات على الأرجح جزئيا نظراً لمستويات مختلفة من الأكسجين التي هي عرضه12. وعلاوة على ذلك، تظهر المشتقة من نخاع العظم الضامة زيادة قدرة على فاجوسيتيزي البكتيريا عند تعرضها ل بيئة منخفضة أكسجين12. تم العثور على تأثير معاكس الضامة البشرية المتباينة THP113، ولكن هذه النتائج تدعم الفكرة القائلة بأن الأكسجين منظم للبيولوجيا بلعم وأن من الضروري توضيح هذا الدور على المستوى الجزيئي في الضامة البشرية. وفي دراسة سابقة، المطبقة لدينا نهج البروتيوميات لمعالجة هذه القضايا. عن طريق قياس مستويات التعبير لآلاف بروتينات في نفس الوقت، سلطت الضوء على تأثير الأكسجين على الاستقطاب، وقدمت قائمة بالمؤشرات الجزيئية الجديدة. تمكنا أيضا من ربط هذه النتائج ببعض وظائف الضامة. جدير بالذكر أن وجدنا أن معدل البلعمه لخلايا apoptotic قد زيدت في الضامة IL4/IL13-الاستقطاب، التي ترتبط ب upregulation ALOX15 كما يتبين من تحليل البروتين14. في هذه الدراسة، ونحن تصف كيفية إجراء هذا تحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتم الحصول على عينات الدم البشري (لرسك) من الجهات المانحة صحية، وإزالة الألغام التي تم تحديدها من EFS (خدمة الدم الوطنية الفرنسية) كجزء من وضع بروتوكول معتمد (DC كوديكوه-2018-3114). وقدم المانحون موافقة موقعة لاستخدام الدم.
1-وسائل الإعلام وإعداد المخزن المؤقت
- إعداد متوسطة بلعم [جلوتاماكس ربمي + 10 مم حبيس + 1 x الأحماض الأمينية غير الأساسية (نيا)] والحارة إلى 37 درجة مئوية.
- إعداد متوسطة بلعم + 10% مصل البشرية من بلازما AB (SAB)، وتصفية (0.22 ميكرون فلتر)، ثم الحارة إلى 37 درجة مئوية (المشار إليها كالمتوسطة بلعم + 10% صاب الآخرة).
- إعداد المخزن المؤقت الفرز [1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) + 0.5% ألبومين المصل البقري (BSA) + حمض 2 مم الإيثيلين (يدتا)]، وتصفية (0.22 ميكرون فلتر)، والحفاظ عليه في 4 درجات مئوية.
2-عزل خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) من دائرة نظام ليوكوريدوكشن (لرسك)
- وضع 15 مل من كثافة الخلية التدرج الانفصال الحل (انظر الجدول للمواد) في 50 مل أنبوب الطرد المركزي حيث أنها يمكن أن الحارة إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الحصول لرسك.
ملاحظة: تعتمد كثافة في درجة الحرارة. كما يتم تخزين هذا المنتج عند 4 درجة مئوية، هذه الخطوة يجب أن يتم في وقت مبكر حيث أنه يمكن أن حجته إلى الرايت - فارغة في لرسك في أنبوب الطرد المركزي 50 مل، إضافة تصل إلى 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني، ومزيج. ببطء شديد، إضافة 25 مل المزيج أعدت أثناء الخطوة 2، 2 على رأس 15 مل حل متدرج الكثافة استعد أثناء الخطوة 2، 1.
ملاحظة: ينبغي الحرص على عدم خلط في المراحل أثناء هذه الخطوة. يجب إضافة الدم على حل متدرج الكثافة دون أي اضطراب في هذه المرحلة. - الطرد المركزي سواء أنابيب الطرد المركزي لمدة 25 دقيقة في 700 x ز دون فواصل.
ملاحظة: في نهاية استخدام الطرد المركزي التدرج في كثافة، الطبقات من الأسفل إلى الأعلى: الكريات الحمراء والمحببة تشكيل بيليه، مرحلة الحل متدرج الكثافة، طبقة ببمكس، والبلازما. - مع بيبيت، اجتياز المرحلة البلازما دون يسفط عليه وجمع طبقة ببمك في أنبوب 50 مل الطرد المركزي جديدة. إضافة تصل إلى 50 مل من 1 x PBS ببمكس كخطوة الغسيل والطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 300 x ز.
- نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 40 مل من بلعم المتوسطة.
3-العلامات المغناطيسية وعزل CD14 الخلايا+ (وحيدات)
- عد ببمكس في دائرة مالاسيز. سحب مبلغ ببمكس اللازمة لإجراء التجربة (عادة 100 إلى 300 × 106 خلايا)، ووضعها في أنبوب الطرد المركزي، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 300 x ز.
- نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 80 ميليلتر من المخزن المؤقت الفرز الذي أعد خلال الخطوة 1.3 كل 107 ببمكس-إضافة 20 ميليلتر من ميكروبيدس CD14 كل 107 ببمكس-مزيج جيد واحتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية تحت التحريض المستمر.
- أضف 1 مل من الفرز العازلة الواحدة 107 ببمكس خطوة الغسيل والطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في غ. س 300 نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 500 ميليلتر من الفرز العازلة الواحدة 108 ببمكس.
- ضع عمود في المجال المغناطيسي للفاصل. إعداد العمود قبل الشطف مع 3 مل من الفرز المخزن المؤقت.
- تطبيق تعليق خلية على العمود. العمود يعتمد على عدد الخلايا لتكون معزولة (هنا، تستخدم الأعمدة ليرة سورية ليصل إلى 109 ببمكس). جمع من خلال تدفق تحتوي على خلايا غير مسمى.
ملاحظة: تبدأ في هذه الخطوة، يتم الاحتفاظ جميع الأنابيب (تحديدات سلبية وإيجابية) للتدقيق في وقت لاحق من الخطوات المختلفة بالتدفق الخلوي. - أغسل العمود مع 3 × 3 مل من الفرز المخزن المؤقت. جمع الخلايا غير مسمى تمر عبر الأنبوب نفسه من الخطوة 3، 12. تنفيذ خطوات الغسيل بإضافة المخزن المؤقت الفرز، ويجب الحرص على عدم الجاف للعمود الخاص بك. ضع أنبوب جمع تحت العمود وإزالته من الفاصل.
- "الماصة؛" 5 مل من فرز المخزن المؤقت في العمود. فورا طرد الخلايا المسماة مغناطيسيا بدفع المكبس بقوة إلى العمود. لزيادة نقاء CD14+ الخلايا، والكسر التيد أثري فوق عمود ثاني.
- كرر الخطوات من 3.4 إلى 3.7 مع عمود جديد.
4-طلاء وحيدات
- عد وحيدات في دائرة مالاسيز. فحص نقاء CD14 الخلايا+ بالتدفق الخلوي. سحب مبلغ وحيدات اللازمة للتجربة ووضعها في أنبوب الطرد المركزي.
- الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 300 x زاي Aspirate المادة طافية وريسوسبيند بيليه الوحيدات في المتوسط بلعم. لوحة الخلايا والسماح لهم بتسوية 50 دقيقة إلى حاء 1 نضح المتوسطة واستبدله مع بلعم المتوسطة + 10% صاب + تحفيز مستعمرة بلعم نانوغرام/مل 25 عاملاً (م-CSF) للحث على التفرقة.
5-استقطاب الضامة في يوم 6
- نضح المتوسطة. استبدالها بالمتوسطة بلعم + 10% صاب مع المحفزات المختلفة. على سبيل المثال، قم بإضافة 10 نانوغرام/مل انترفيرون غاما (INFγ) + 1 نانوغرام/مليلتر lipopolysaccharide (LPS) للحصول على M1 الاستقطاب، أو 20 نانوغرام/مليلتر انترلوكين 4 (IL4) + 20 نانوغرام/مليلتر انترلوكين 13 (IL13) لاستقطاب M2.
ملاحظة: يمكن أن يؤديها التحفيز بين 24 و 48 ح قبل الشروع في الاختبارات الأخرى. - حصاد الخلايا باستخدام حل ديتاتشينج أو مكشطة خلية.
6-خلية ثقافة تحت الظروف منخفضة الأكسجين
- وبدءا من الخطوة 4، الحفاظ على وحيدات وثم الضامة في بيئة تسيطر عليها الأكسجين إلى القيام بتحليل حالة التاكسج. استخدام محطة عمل نقص بغية الحفاظ على الخلايا تحت ضغط جزئي الأكسجين المطلوب أثناء التجربة.
ملاحظة: عند العمل تحت ضغط الأكسجين المنخفض، من المهم إعداد جميع وسائل الإعلام ومخازن الغسيل تحت المحطة والانتظار بما فيه الكفاية للحصول على الضغط الجزئي الصحيح في السائل. على سبيل المثال، يتطلب 10 مل من برنامج تلفزيوني في 60 مم طبق بيتري تقريبا 2 ح تصل إلى 25 مم زئبق للضغط الجزئي2 س بدءاً من الضغط الجوي (كما أننا قد يقاس عليه استخدام جهاز استشعار الأوكسجين الألياف البصرية). في العديد من مراكز التاكسج أو الحاضنات، يتم تعيين ضغط الأكسجين كنسبة مئوية من الضغط الجوي. إذا كانت القياسات الدقيقة ضرورية، فمن الأفضل لاستخدام محطة الإذن لمباشرة تعيين ضغط الأكسجين في ملم زئبق.
7-تحلل وهضم في جل (البروتوكول الأول)
ملاحظة: ويرد في هذا المجال والمقاطع التالية، اثنين من البروتوكولات المستخدمة للحصول على الببتيدات وإجراء تحليل LC-MS/MS. بروتوكول 1 يصف تحلل الخلية وتجزئة في جل والهضم، ويصف البروتوكول 2 تحلل الخلية في حل تليها الهضم في الحل وتجزئة باستخدام أسلوب تركيز إيسويليكتريك.
- إجراء تحلل الخلية في المخزن المؤقت لايملي [234 ملم تريس-HCL (6.8 درجة الحموضة)، 7.5% الحزب الديمقراطي الصربي، والغليسيرول 37%، 33.3% (v/v) β-ميركابتوثانول، بروموفينول الأزرق 0.2% w/v]. تحميل ما يعادل البروتين من الخلايا 300,000 لكل عينة على % 4-12 مكررا-تريس الاكريلاميد المواد الهلامية.
- التحكم في مدة الهجرة الغرواني الكهربي للسماح لكل عينة البروتين تقسيمها إلى نطاقات هلام 6 كما يتضح في الشكل 3.
- إصلاح الهلام مع تحديد حل (الإيثانول 30% + حمض الخليك 7.5% لمدة 20 دقيقة)، ثم إضافة الحل المصبوغة (R-250 أخذ 45 دقيقة باللون الأزرق). إضافة حل ديستاينينج (30% إيثانول + 7.5% الخليك حتى تظهر العصابات) قبل نسق نطاقات البروتين مع مشرط نظيف.
- الزهر كل الفرقة قصت قبل الأخذ في 500 ميليلتر الأنابيب. له ما يبرره على سطح زجاج نظيفة لتفادي التلوث مع كراتين (يمكن استخدام الحل مخزونات النشر الاستراتيجي 5% في المياه لتنظيف السطوح).
- تغسل شرائح جل 3 مرات في 200 ميليلتر من بيكربونات الأمونيوم 25 مم لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية، تليها غسل واحد في 25 مم بيكربونات الأمونيوم والاسيتو الانيتريل (50% v/v). يذوي قطع جل مع 200 ميليلتر الاسيتو الانيتريل 100% لمدة 10 دقائق.
- احتضان كل قطعة هلام مع 10 ملم DTT (ديثيوثريتول) في بيكربونات الأمونيوم 25 مم لمدة 45 دقيقة في 56 درجة مئوية (200 ميليلتر)، تليها إيودواسيتاميدي 55 ملم في بيكربونات الأمونيوم 25 مم (200 ميليلتر) لمدة 35 دقيقة في الظلام في الرايت
- لإيقاف الألكلة، واحتضان كل قطعة هلام مع 200 ميليلتر من 10 مم DTT في بيكربونات الأمونيوم 25 مم لمدة 10 دقائق في غسل الرايت قطعة جل في 200 ميليلتر من بيكربونات الأمونيوم 25 مم، ثم يذوي مع 200 ميليلتر من الاسيتو الانيتريل 100% لمدة 10 دقائق.
- هضم البروتينات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع مزيج التربسين/Lys-ج طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة.
- استخراج الببتيدات الناتجة من قطع جل بإضافة 50 ميكروليتر من الاسيتو الانيتريل 50% لمدة 15 دقيقة، ثم 50 ميكروليتر من حمض الفورميك 5% لمدة 15 دقيقة، وأخيراً، 50 ميكروليتر من الاسيتو الانيتريل 100% لتجمع 15 دقيقة والجاف لكل جزء في أنابيب امتصاص منخفضة للحد من امتزاز الببتيدات و فقدان عينة. تخزين العينات في-80 درجة مئوية إلى مزيد من التحليل.
8-البروتين الاستخراج والهضم في الحل (بروتوكول 2)
- إجراء تحلل الخلية (2 × 106 خلايا) مع 150 ميليلتر من المخزن المؤقت تحلل التالي:
- اليوريا 7 م وال م 2، 40 مم تريس والفصول 4%، وتستكمل مع مثبطات البروتياز (ميني كاملة، خالية من يدتا مثبط البروتياز كوكتيل).
- مجانسة الحلول مدة 30 دقيقة في الرايت مع ثيرموشاكير. الطرد المركزي في 13,800 س ز لمدة 20 دقيقة RT وإبقاء المادة طافية.
- إزالة الملوثات مع مجموعة أدوات تنظيف 2D:
- الطقم يحتوي على مرسب الحل والحل بريسيبيتانت المشارك والمخزن المؤقت للغسيل والغسيل المضافة.
- إضافة 300 ميليلتر من حل مرسب ومزيج جيد. تبني على الجليد ميليلتر 300 إضافة 15 دقيقة لحل بريسيبيتانت المشارك. الطرد المركزي في الأنابيب (على الأقل) في 12,000 س ز لمدة 5 دقائق. بيليه صغيرة يجب أن تكون مرئية. تمضي بسرعة إلى الخطوة التالية لتجنب استثارة أو تشتت بيليه. إزالة المادة طافية دون إزعاج بيليه.
- الطرد المركزي هذه الأنابيب مرة أخرى مع الغطاء المفصلي وبيليه يواجه إلى الخارج جلب أي سائل المتبقية إلى الجزء السفلي من الأنبوب. نبض قصيرة غير كافية. ينبغي أن يكون هناك لا سائل مرئية المتبقية في الأنابيب.
- دون الإخلال بيليه، إضافة 40 ميليلتر لحل بريسيبيتانت المشارك. واسمحوا الأنبوب الجلوس على الجليد لأدنى 5 أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق، ثم إزالة وتجاهل المياه والصرف الصحي. إضافة 25 ميليلتر من الماء المتأين الشطب. دوامة كل أنبوب ل s 5-10. يجب تفريق بيليه لكن لا تذوب في الماء.
- إضافة 1 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (مبردة مسبقاً على الأقل 1 ح في-20 درجة مئوية) و 5 ميليلتر من مضافات الغسيل. دوامة حتى بيليه ينتشر تماما. احتضان هذه الأنابيب في-20 درجة مئوية لمالا يقل عن 30 دقيقة دوامة ل 20-30 s كل 10 دقيقة
ملاحظة: يمكن تخزين الأنابيب في-20 درجة مئوية لتصل إلى 1 الأسبوع مع تدهور البروتين الحد الأدنى أو تعديله. - الطرد المركزي في الأنابيب (على الأقل) في 12,000 × ز 5 كحد أدنى بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية. بيليه أبيض يجب أن تكون مرئية. تسمح بيليه إلى أيردري لمدة لا تزيد عن 5 دقائق (إذا كان بيليه الجاف للغاية، فإنه سوف يكون من الصعب على ريسوسبيند).
- ريسوسبيند بيليه البروتين في 300 ميليلتر من بيكربونات الأمونيوم اليوريا و 0.1 م م 8. الدوامة بشدة للحد الأدنى 1 تحديد تركيز البروتين مقايسة اللونية باستخدام.
9-في حل الهضم (بروتوكول 2)
- تقليل الجسور ثنائي كبريتيد بإضافة ميليلتر 5.1 حل مائي DTT 700 مم (التركيز النهائي 12.5 ملم) للبروتينات ريسوسبينديد من الخطوة 8.4 واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع ثيرموشاكير. الكيلاتي بقايا السيستين بإضافة ميليلتر 20.3 حل مائي إيودواسيتاميدي 700 مم (التركيز النهائي 40 مم) وتفرخ عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام مع ثيرموشاكير.
- إضافة ميليلتر 990 من بيكربونات الأمونيوم 0.1 M للعينة. إضافة وحدة تخزين المطابقة من مزيج التربسين/Lys-ج (نسبة الإنزيم: الركيزة 1: 100 w/w). احتضان عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع ثيرموشاكير.
10-تنظيف خرطوشة (بروتوكول 2)
- ويت خرطوشة مع 1 حجم العمود (1 مل) من الميثانول. تنظيف الخرطوشة مع 1 حجم العمود (1 مل) من 80% من المياه الاسيتو الانيتريل/[هبلك]-الصف وتجاهل في التدفق من خلال. حجته الخرطوشة مع 4 أحجام العمود (4 مل) 0.1% حمض الفورميك/[هبلك]-الصف المياه وتجاهل في التدفق من خلال.
- أسيديفي العينات مع ميليلتر 90 من حمض الفورميك 10% أو المياه على درجة الحموضة 2-3 (التحقق من درجة الحموضة بمؤشر الرقم الهيدروجيني). تحميل عينات المحمضة، وجمع في التدفق من خلال. إعادة تحميل--التدفق عبر (يحتوي على الببتيدات الإبقاء على عدم). أغسل الخرطوشة مع 6 حجم العمود (6 مل) 0.1% حمض الفورميك/[هبلك]-الصف المياه.
- الوت الببتيدات من الخرطوشة مع العمود 1-المجلدات (1 مل) من 0.1% acid/50% الفورميك الاسيتو الانيتريل/[هبلك]-الصف المياه. نقل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. تركيز العينة باستخدام مركز فراغ (150 س ز، فراغ في 160 [مبر]).
11-وجود طريق Isoelectric التركيز (بروتوكول 2)
ملاحظة: يتم فصل الببتيدات وفقا لجهات إيسويليكتريك باستخدام فراكتيوناتور-جيل على شريط 13 سم تغطي نطاق درجة حموضة من 3 إلى 10. ونحن تستخدم البروتوكول التالية المقدمة من المورد (الملخصة أدناه):
- إعداد الحلول التالية: حل (600 ميليلتر والغليسيرول الحل، 60 ميليلتر من المخزن المؤقت أوفجيل، 4.34 مل من الماء عالي النقاوة) وحل ب (1.776 مل الحل (أ)) و 444 ميليلتر من الماء عالي النقاوة.
- قم بتجميع شرائط IPG، والإطارات، واقطاب وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- ريسوسبيند العينة مع 1.8 مل من حل ب إضافة 40 ميليلتر من حل ب في كل بئر. تحميل 150 ميليلتر من العينة في كل بئر.
- حدد الأسلوب الافتراضي الببتيدات: OG12PE00 (أوفجيل الأسلوب الافتراضي الببتيدات للاستخدام مع مجموعة 3100 أوفجيل منخفضة الدقة، الأس الهيدروجيني 3-10، 12-جيدا إطارات. الانتظار حتى هذا الأسلوب تم الانتهاء (ح ~ 20). جمع الكسور في أنابيب المسماة بشكل صحيح.
12-تنظيف جامعة هارفارد جهاز عمود C18 عكس وظيفة الضمنية (بروتوكول 2)
- إضافة ميكروليتر قليلة تدريجيا في وقت من 1% تفا في الماء المتأين الشطب لكل جزء أسيديفي العينة. التحقق من استخدام ورق الأس الهيدروجيني pH هي حوالي 3 أو أقل.
- إعداد الحلول التالية: 1 (5 مل من الاسيتو الانيتريل، 10 ميليلتر من حمض الفورميك، 4.99 مل من الماء عالي النقاوة) الحل والحل 2 (0.5 مل من الاسيتو الانيتريل، 10 ميليلتر من حمض الفورميك، 9.49 مل من الماء عالي النقاوة).
- قبل الرطب عمود الدوران مع 150 ميليلتر من الحل 1. أجهزة الطرد المركزي ل 90 s في 750 × ز وتجاهل التدفق من خلال. أغسل العمود تدور مع 150 ميكروليتر من الحل 2. أجهزة الطرد المركزي ل 90 s في 750 × ز وتجاهل التدفق من خلال.
- يمر الكسر من خلال العمود. أجهزة الطرد المركزي ل 90 s في 750 × ز وتجاهل التدفق من خلال. يغسل مع 150 ميكروليتر من الحل 2. أجهزة الطرد المركزي ل 90 s في 750 × ز وتجاهل التدفق من خلال.
- الوت الكسر مع 50 ميكروليتر من الحل 1. أجهزة الطرد المركزي ل 90 s في 750 x زاي كرر هذه الخطوات مرة أخرى.
- جاف-الكسر باستخدام مركز فراغ (150 س ز، فراغ 160 [مبر]) وتخزينها في-80 درجة مئوية
13-تحليل بيانات البروتين والمعلوماتية الحيوية18
- مرض التصلب العصبي المتعدد الشامل مطياف استخدام البرمجيات القياس الكمي مثل ماكسكوانت (الإصدار 1.5.2.8) ومحرك البحث أندروميدا/تحليل البيانات التي حصل عليها MS نانو-LC.
- تعيين معدل اكتشاف كاذبة (فرانكلين روزفلت) إلى 1% لكل من البروتينات والببتيدات وطول الحد أدنى من الأحماض الأمينية 7. تعيين خصوصية الإنزيم كمحطة ج إلى الأرجنتين و Lys. تسمح 2 الانشقاقات الضائعة في سندات برولين. حدد كارباميدوميثيليشن سيستئين كتعديل ثابت وأكسدة acetylation والميثيونين البروتين الطرفي ن كمتغير التعديلات.
- كذلك تحليل البيانات باستخدام برنامج التحليل الإحصائي. إجراء تحليل لإثراء وظيفي باستخدام برنامج فونريتش (www.funrich.org/). إجراء تحليل إثراء علم الوجود جينات باستخدام البرمجيات ديفيد (https://david.ncifcrf.gov/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بدءاً من خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) التي تم الحصول عليها باستخدام الطرد المركزي التفاضلي، يسمح البروتوكول الحصول على عدد سكانها CD14+ وحيدات مع نقاء المقررة أكثر من 98 في المائة من التدفق الخلوي (الشكل 1). هذه وحيدات تختلف بشكل ثانوي نحو استقطابات مختلفة (الشكل 2). عندما يتم اختياره تجزئة في جل والهجرة في الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المواد الهلامية تكييف للحصول على عدد الأشرطة المطلوب، والعصابات التي اقتطعت (الشكل 3). ثانوي يتم الهضم في نطاقات قصت جل، ثم يتم استخراج الببتيدات. الببتيدات يتم تحليلها باستخدام نانو-LC (كروماتوغرافيا سائلة)-كتلة MS/MS مطياف. مرض التصلب العصبي المتعدد/مرض التصلب العصبي المتعدد الأطياف إعطاء هوية البروتينات المختلفة وفقا لشروح الأطياف الحصول على الببتيدات المعروف (الشكل 4 أ). ثم يتم حساب التقدير الكمي للوفرة من البروتين فيما يتعلق بكمية محددة الببتيدات قادمة من البروتين باستخدام نشر البرمجيات وقواعد البيانات15،16. يعطي هذا البروتوكول مع الهضم-جيل حوالي 4000 من البروتينات التي تم تحديدها، وتم العثور على النطاق الديناميكي لتغطية 5 وحدات المقياس اللوغاريتمي (الشكل 4 باء). يمكن استخدام تحليل التعبير التفاضلية من هذه البروتينات المحددة لتحديد تجميع استقطابات مختلفة ضمن بيئات مختلفة من الأكسجين.
بهذه الطريقة، يمكن أن ندرك أيضا مجموعات من البروتينات التي تصل-ينظم عند التعرض لتركيز الأوكسجين منخفض من 3% (الشكل 5، الجدول 1). لتقييم كفاءة الهضم، وغير ممكن عندما يستخدم بروتوكولا في جل، اقترحنا طريقة هضم في الحل قد تم تكييفه للبشرية الضامة (الشكل 6A). بهذه الطريقة، يمكننا بسهولة الحصول على (بعد الهضم بالحل) تحديد البروتينات 3600 دون تجزئة، بمعنى أن وجود الإرادة الضمنية معقولة زيادة هذا العدد (الشكل 6B).
رقم 1: التدفق الخلوي تحليل التعبير CD14 من ببمك قبل الفرز (اللوحة اليمنى) وبعد الفرز (اللوحة اليمنى) تبين نقاء تم الحصول عليها بعد التحديد المغناطيسي الخرز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الصور المرحلة-على النقيض من الضامة البشرية المتباينة إظهار التباين في مورفولوجيس التي تم الحصول عليها لاثنين من استقطابات مختلفة. يمثل الشريط مقياس 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تصوير لأخذ الأزرق الملون جل عرض النطاقات المختلفة التي سوف تكون اقتطعت [هنا، والعصابات 6 في الضامة M(Ø)] لاستقطابات 5 من الضامة يتعرض لبيئة منخفضة أكسجين. IC = مأمن المجمعات، DXM = الديكساميتازون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الطيف MS/MS والقياس الكمي- (أ) مثال الطيف MS/MS. يظهر هنا هو الطيف CID (التفكك الناجم عن الاصطدام) من الببتيد وجدت في m/z 597.29 على طيف مرض التصلب العصبي المتعدد مع شحنة كهربائية من + 2. تم تحديد التسلسل المقابلة من هذا الطيف فالالاجلوليوجلواسنسيرجلوفيارج من البروتين CD58. (ب) رتبة أمرت خالية من تسمية التحديد الكمي لكل من البروتينات التي تم تحديدها (تسجيل10 لفق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: خريطة الحرارة يمثل تجميع التسلسل الهرمي لاستقطاب جميع الدول استخدام خلطات أعرب البروتينات. ويكشف تحليل مجموعة من البروتينات overexpressed في كل الاستقطابات في الشرط2 3% O (المستطيل الأحمر). مقياس اللون يمثل إحراز-z (كثافة log2). بروتين من كل صف وكل عمود عينة. وهذا الرقم قد نشأت من منشور سابق14. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: الحزب الديمقراطي الصربي صفحة و chromatogram. (أ) الملطخة بالفضة الجل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة مع البروتين من تحلل الخلية وبعد الهضم بالحل تبين عدم وجود تدهور خلال تحلل وكفاءة الهضم. (ب) تشروماتوجرام التي تم الحصول عليها من بعد الهضم بالحل دون تجزئة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الكتلة | بروتينيد | أسماء البروتين | أسماء الجينات | الببتيدات | أسلاك شائكة + الببتيدات فريدة من نوعها | الببتيدات فريدة من نوعها | معرفات البروتين | ||
| الأحمر | P0DMV9 | صدمة الحرارة 1B البروتين كاتشين 70 | HSPA1A | 40 | 37 | 4 | P0DMV9؛ P0DMV8؛ A8K5I0؛ Q59EJ3؛ B4DNT8؛ B4DWK5؛ B4DFN9؛ B4DI39؛ B4E1S9؛ B4DVU9؛ V9GZ37؛ B3KTT5؛ B4DNX1؛ B4E1T6؛ B4DNV4؛ Q9UQC1 | ||
| الأحمر | P54709 | الصوديوم/البوتاسيوم-نقل ATPase الوحيدات بيتا-3 | ATP1B3 | 8 | 8 | 8 | P54709؛ D3DNF9؛ C9JXZ1؛ C9JA36؛ H7C547؛ F8WBY4؛ Q58I18 | ||
| الأحمر | O00462 | مانوسيداسي بيتا | منبع | 14 | 13 | 13 | O00462؛ A7LFP5؛ A8K6D3؛ E9PFW2؛ B4DT18؛ Q59EG5 | ||
| الأحمر | Q8NAS7 | NADH نازعة [أوبيكوينوني] كبريت الحديد البروتين 7، الميتوكوندريا | NDUFS7 | 4 | 4 | 4 | Q8NAS7؛ Q6ZQU6؛ F5H5N1؛ B7Z1U1؛ A8K0V6؛ Q7LD69؛ F5GXJ1؛ O75251؛ B7Z4P1؛ Q9H3K5؛ A0A087WXF6؛ A0A087WTI3؛ Q6ZS38 | ||
| الأحمر | Q8WWQ0 | البروتين التفاعل PH | فب | 5 | 5 | 4 | Q8WWQ0؛ Q9NWP3 | ||
| الأحمر | E5RHK8 | دينامين-3 | DNM3 | 11 | 2 | 2 | E5RHK8؛ Q9UQ16؛ B3KPF2؛ E5RIK2 | ||
| الأحمر | A0A024QZ64 | سكر-bisphosphate الدلاس ج | المعلوم | 18 | 14 | 7 | A0A024QZ64؛ P09972؛ B7Z1Y2؛ B7Z3K9؛ B7Z1N6؛ B7Z3K7؛ A8MVZ9؛ J3KSV6؛ J3QKP5؛ B7Z1L5؛ C9J8F3؛ K7EKH5؛ J3QKK1؛ B7Z1H6 | ||
| الأحمر | O75489 | NADH نازعة [أوبيكوينوني] كبريت الحديد البروتين 3، الميتوكوندريا | NDUFS3 | 12 | 12 | 12 | O75489؛ Q9UF24؛ Q53FM7؛ E9PS48؛ E9PKL8؛ G3V194 | ||
| الأحمر | P21912 | Succinate نازعة [أوبيقوينوني] كبريت الحديد وحدة فرعية، الميتوكوندريا | سدهب | 11 | 11 | 11 | P21912؛ A0A087WXX8؛ A0A087WWT1 | ||
| الأحمر | A0A024R1Y7 | البروتين التي تحتوي على المجال GH3 | LGP1؛ غدك | 7 | 7 | 7 | A0A024R1Y7؛ Q8N2G8؛ B3KVB0؛ K7ESN3؛ K7EJT7؛ K7EQ41؛ K7EL54 | ||
| الأحمر | E5KRK5 | NADH-ubiquinone أوكسيدوريدوكتاز 75 كاتشين فرعية، الميتوكوندريا | NDUFS1 | 29 | 29 | 29 | E5KRK5؛ P28331؛ B4DJ81؛ Q9P1A0؛ C9JPQ5؛ F8WDL5 | ||
| الأحمر | A0A024QZ30 | Succinate نازعة [أوبيكوينوني] فلافوبروتين فرعية، الميتوكوندريا | سدهى | 17 | 17 | 17 | A0A024QZ30؛ P31040؛ D6RFM5؛ B3KT34؛ A0A087X1I3؛ Q0QF12؛ B4DYN5؛ B3KYA5؛ B4DNB2؛ H0Y8X1؛ B7Z6J5 | ||
| الأحمر | A0A024R2F9 | بروتين ترانسميمبراني 43 | TMEM43 | 16 | 16 | 16 | A0A024R2F9؛ Q9BTV4؛ Q8TEP9؛ V9GY05 | ||
| الأحمر | A0A024R5K3 | NADH نازعة [أوبيقوينوني] كبريت الحديد البروتين 8، الميتوكوندريا | NDUFS8 | 5 | 5 | 5 | A0A024R5K3؛ E9PPW7؛ O00217؛ E9PN51؛ F8W9K7؛ E9PKH6؛ B4DYI3؛ Q53G17 | ||
| الأحمر | O76003 | جلوتاريدوكسين-3 | GLRX3 | 13 | 13 | 13 | O76003 | ||
| الأحمر | Q1HBJ4 | Mitogen تنشيط بروتين كيناز؛ Mitogen تنشيط بروتين كيناز 1 | MAPK1 | 26 | 26 | 21 | Q1HBJ4؛ P28482؛ B4DHN0؛ Q499G7؛ K7ELV1؛ K7EN18؛ B4E104؛ P31152؛ Q16659 | ||
| الأحمر | Q13151 | غير المتجانسة النووية ribonucleoprotein A0 | HNRNPA0 | 8 | 8 | 8 | Q13151 | ||
| الأحمر | V9HWN7 | سكر بيسفوسفاتي الدولاسي أ | الدوة | 36 | 36 | 14 | V9HWN7؛ P04075؛ J3KPS3؛ H3BQN4؛ H3BUH7؛ H3BR04؛ H3BMQ8؛ H3BU78؛ H3BR68؛ A4UCS9؛ A4UCT0 | ||
| الأحمر | B4DVJ0 | الجلوكوز-6-فوسفات إيزوميراز | GPI | 32 | 32 | 23 | B4DVJ0؛ P06744؛ B4DE36؛ A0A0A0MTS2؛ K7EQ48؛ K7EP41؛ K7EPY4؛ K7ELR7؛ K7ERC6؛ K7ENA0؛ K7ESF4؛ K7EIL4؛ K7ERK8؛ Q59F85 | ||
| الأحمر | V9HWB9 | لام-لاكتات نازعة؛ لام-لاكتات نازعة سلسلة | لدها | 36 | 36 | 34 | V9HWB9؛ P00338؛ B4DJI1؛ F5GXY2؛ F5GYU2؛ F5GXH2؛ F5H5J4؛ F5H6W8؛ F5GZQ4؛ F5H8H6؛ F5GXC7؛ F5GWW2؛ F5GXU1؛ A0A087WUM2؛ Q96L19؛ Q6ZMR3 | ||
| الأحمر | P13674 | 4-hydroxylase بروليل الوحيدات ألفا-1 | P4HA1 | 26 | 26 | 26 | P13674؛ Q5VSQ6 | ||
| الأحمر | Q6FHV6 | غاما-انولاسي؛ انولاسي | ENO2 | 18 | 15 | 14 | Q6FHV6؛ P09104؛ A8K3B0؛ F5H0C8؛ F5H1C3؛ U3KQP4؛ U3KQQ1؛ Q9NPL4 | ||
| الأحمر | Q99798 | هيدراتاسي أكونيتاتي، الميتوكوندريا | ACO2 | 40 | 40 | 40 | Q99798؛ B4DZ08؛ B2RBW5؛ A2A274؛ B4DJW1؛ B4DLY4؛ Q71UF1؛ B4DEC3؛ B4DW08؛ O75944 | ||
| الأحمر | P17858 | ATP-تعتمد على نوع 6-فوسفوفروكتوكيناسي، والكبد | بفكل | 32 | 29 | 28 | P17858؛ Q7L2M7؛ Q9BSP4؛ B3KNQ7؛ B4E108؛ Q59GI2؛ F8WEU2؛ Q7Z3R9؛ Q6MZK4 | ||
| الأحمر | A0A024R872 | نيبن مثل البروتين 1 | FAM129B | 32 | 32 | 32 | A0A024R872؛ Q96TA1؛ Q9H8K1؛ Q2YD88؛ Q9H6L6 | ||
| الأحمر | A0A024RC61 | أمينوبيبتيداسي ن | أنبيب | 58 | 58 | 25 | A0A024RC61؛ P15144؛ Q59E93؛ B4DV63؛ B4DP01؛ B4DP96؛ H0YKT6؛ H0YLZ8؛ Q71E46؛ H0YMC1؛ Q8IVL7 | ||
| الأحمر | V9HWF4 | كيناز فوسفوجليسيراتي؛ فوسفوجليسيراتي كيناز 1 | PGK1 | 41 | 41 | 35 | V9HWF4؛ P00558؛ B4E1H9؛ B4DHM5؛ B4DHB3؛ B4DWQ3؛ Q16444 | ||
| الأحمر | Q12882 | نازعة ديهيدروبيريميديني [NADP(+)] | دبيد | 44 | 44 | 44 | Q12882؛ B4DML1 | ||
| الأحمر | B4DEQ0 | نقل الإلكترون فلافوبروتين-أوبيكوينوني أوكسيدوريدوكتاز، الميتوكوندريا | اتفده | 9 | 9 | 9 | B4DEQ0؛ Q547S8؛ A7UNU5؛ Q16134؛ D6RAD5 | ||
| الأحمر | D9UAX9 | MHC الفئة الأولى مستضد | هلا-ب | 13 | 3 | 2 | D9UAX9 | ||
| الأحمر | V9HWK1 | تريوسيفوسفاتي إيزوميراز | TPI1 | 29 | 29 | 17 | V9HWK1؛ P60174؛ Q53HE2؛ B4DUI5؛ U3KPZ0؛ U3KQF3؛ U3KPS5 | ||
| الأحمر | Q96HE7 | ألفا بروتين مثل ERO1 | ERO1L | 28 | 28 | 28 | Q96HE7؛ G3V3E6؛ G3V5B3؛ G3V2H0؛ G3V503؛ Q5TAE8؛ B2RD00؛ Q86YB8 | ||
| الأحمر | P14868 | اسبارتاتي-ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال، هيولى | درس | 29 | 29 | 2 | P14868؛ Q53T60؛ Q53R85؛ H7BZ35؛ H7C278 | ||
| الأحمر | P36871 | فوسفوجلوكوموتاسي-1 | PGM1 | 24 | 24 | 5 | P36871؛ B4DFP1؛ Q9H1D2 | ||
الجدول 1: قائمة البروتينات المعلنة المفرط للبشرية الضامة الشائعة لكل الاستقطاب تحت توتر الأوكسجين منخفض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لأن البروتيوميات أداة قوية لدراسة التعبير عن البروتينات المختلفة من خلية كاملة أو مقصورات سوبسيلولار، الأمثل للبروتوكول تحلل الخلية وهضم البروتينات قد عولجت بعدد من الدراسات. وهناك ثلاث فئات رئيسية من الأساليب، التي تشمل في جل الهضم (هضم البروتينات في مصفوفة جل polyacrylamide)17، الهضم في حل18 والمدعومة بتصفية نموذج إعداد19. أبلغ هذا الأسلوب الأخير، في البداية وصفت العالمي، يحمل إمكانية تكرار نتائج منخفضة واحتمال فقدان البروتينات في تصفية20. الهضم في جل هو وسيلة قوية يمكن أن تكون مضيعة للوقت وغير ملائم في هذا تقييم كفاءة الهضم ليس من السهل، إذا كان ذلك ممكناً. يتيح هذا الإمكانية الهضم في حل لكن يتطلب تنظيف العينات بعد الهضم والضمنية. عند مقارنة هاتين الطريقتين بين نفس العينة، غلة الهضم في الحل مع الانبعاث تجزئة البروتوكول عدد أعلى من البروتينات المحددة (مع نفس العدد من الكسور) مما في جل الهضم21.
وعلى الرغم من هذه الميزة، من الضروري النظر في تدهور البروتين الممكنة خلال تحلل بالحل بسبب البروتياز داخل الخلايا (لا سيما في الخلايا النقوي). كما أنها هامة نضع في اعتبارنا أن هذه التقنيات تقوم على هضم البروتين وفقط قادرة على تحليل البروتينات تقديم التربسين مواقع محددة من الانقسام. من الممكن استخدام نهج من أعلى إلى أسفل البروتين أن يخفف من هذا القيد الهضم لكنه يضيف خطوات تحليل البيانات و الموارد المعلوماتية22. أيضا يمكن أن تكون سولوبيليزاتيون للبروتينات من المكونات الخلوية المختلفة يصعب الحصول عليها، لا سيما من أغشية البلازما، مما أدى إلى أخذ عينات غير المنضبط للبروتين الخلوي. من أجل المضي قدما في إجراء تحليل مطياف كتلة نانو-LC-MS/MS للعينات، من المهم الحصول على كمية كافية من الببتيدات، التي يمكن أن تعتمد على مطياف كتلة المستخدمة (عادة، ابتداء من البروتين الكلي يجب أن يكون على الأقل 1 ميكروغرام لشرط، و هو يعني ضمناً لزيادة هذه الكمية وفقا لعدد الكسر المستخدمة مع الضمنية). قد يكون هذا القيد عيب إذا كان السكان خلية يجري درس النادرة، الذي يميز البروتين من تقنيات الجينوم تضخيم مواد الخام التي من الممكن.
حتى بعد الأشغال المنوي الأغنى والزملاء23 و باكر وفويهر24، اعترف غير كاف أهمية الأوكسجين في الثقافات الخلية. ونحن نعلم الآن أن استزراع الخلايا تحت تركيزات منخفضة الأكسجين تفضل الالتصاق وعمر وشعبة. المسلم به أن هذا الأمر يكتسي أهمية قصوى في بحوث الخلايا الجذعية25. المسألة التقنية الرئيسية للثقافات الخلية تحت ظروف الأوكسجين التي تسيطر عليها تتصل بالحفاظ على تركيز الأكسجين المطلوب خلال التجربة بأكملها. وهذا يتطلب ما قبل الحضانة لجميع وسائل الإعلام لمنع الإفراج عن الأوكسجين الذائب واستخدام محطات العمل التاكسج لتسمح بالتلاعب بالخلايا تحت الأوكسجين منخفض (تجهيز غرفة مع صندوق قفازات) ومنع المعرض عابرة للظروف الأكسجين المرتفعة .
وكان استخدام البروتوكول وصف الحصول على توقيعات الجزيئية الاستقطابات المختلفة للبشرية الضامة المشتقة من الوحيدات ودراسة آثار التحوير الأكسجين في هذه التوقيعات. هذه الدراسة قد أعطى فكرة عن وصف هذه الاستقطابات وقد كشفت عن بعض الآثار الفنية. على سبيل المثال، نجد أن العديد من البروتينات المشاركة في افيروسيتوسيس كانت عن طريق بيئة منخفضة أكسجين التضمين. ويقدم هذا النهج البروتين البشري، استناداً إلى بروتوكول وصف، فرصة لاستكشاف كيفية تعديل البارامترات البيئية وظائف بلعم وكيف يمكن استخدام هذه الإشارات تصميم جديد النهج العلاجي14.
البروتين والنهج الوارد وصفها في هذا العمل مكمل لنهج الجينومي التي استخدمت خلال السنوات الأخيرة في مجال الدراسات الاستقطاب بلعم البشرية. البروتيوميات توفر ميزة تحديد مقدار البروتين، الذي قد يقدم تعبير مختلفة مما بهم مرناس المقابلة بسبب التعديلات بوستترانسلاشونال وتؤدي إلى اكتشاف المؤشرات الحيوية الجديدة. وعلى الرغم من هذه الميزة، بيانات البروتين عادة ما يكون من الصعب تفسير، جزئيا بسبب حساسية عالية من الطيف الكتلي، مما يؤدي إلى معقدة جداً مرض التصلب العصبي المتعدد الأطياف والكشف إيجابية كاذبة من الببتيدات. في الآونة الأخيرة، اكتسب برمجيات تحليل الكفاءة بغية منع هذا. حتى لو كان وضع متغير، البروتيوميات أيضا تواجه إمكانية تكرار نتائج أقل من علم الجينوم26 ويترافق مع خطوات التحقق من الصحة باستخدام تقنيات أخرى (التدفق الخلوي، إيمونوبلوتينج) للتأكد من إجراء التعديلات الكمية من البروتين مستويات التعبير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
صباحا هو الممول من قبل "برنامج زعيم مجموعة الشباب" (ATIP/افينير Inserm-يزار)، بلوس أنجليس الرابطة الوطنية le مكافحة السرطان ولوس أنجليس "مؤسسة قوس" من أجل la بحوث sur le السرطان. ونحن نشكر مارييت ماتوندو من "قياس الطيف الكتلي" لمنهاج علم الأحياء (أوتيتشس مسبيو، ومعهد باستور، باريس). ونحن نشكر لورين أندرسون للقراءة لها من المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hypoxia Working Station | Oxford Optronix | Hypoxylab | |
| C6 Flow cytometer | BD | Accuri C6 | |
| Urea | Agilent Technologies | 5188-6435 | |
| Formic acid (FA) | ARISTAR | 450122M | |
| R-250 Coomassie blue | Biorad | 1,610,436 | |
| Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS) | Calbiochem | 437627 | |
| 2D clean-up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| RPMI 1640 medium, glutamax supplement | Gibco | 61870044 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X | Gibco | 11140-035 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column | Harvard Apparatus | 74-4601 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| NuPAGE Bis-Tris 4-12% | Life Technologies SAS | NP0321 BOX | |
| CD14 Microbeads human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| MACS separation column LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) | Miltenyi Biotec | 130-096-485 | |
| Interleukin 4 (IL4) | Miltenyi Biotec | 130-093-917 | |
| Interleukin 13 (IL13) | Miltenyi Biotec | 130-112-410 | |
| Interferon gamma (INFγ) | Miltenyi Biotec | 130-096-482 | |
| CD14-FITC (clone TÜK4) | Miltenyi Biotec | 130-080-701 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Pierce | 28904 | |
| Trypsin/Lys-C Mix | PROMEGA | V5073 | |
| Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Density Gradient Solution (Histopaque 1077) | Sigma Aldrich | 10771-100ML | |
| Accumax | Sigma Aldrich | A7089-100ML | |
| Human Serum from human male AB plasma (SAB) | Sigma Aldrich | H4522-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30% | Sigma Aldrich | A9576-50ML | |
| Trisma-base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | 49767 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 114405 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% | Sigma Aldrich | 5030 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34888 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | 57670 | |
| Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | |
| CHAPS | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Micro BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| 5 mL sterile plastic pipette | VWR | 612-1685 | |
| Thermomixer C Eppendorf | VWR | 460-0223 | |
| Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg | Waters | WAT036820 |
References
- Okabe, Y., Medzhitov, R. Tissue biology perspective on macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
- Murray, P. J. Macrophage Polarization. Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).
- Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation. Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).
- Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
- Xue, J., et al. Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).
- Csete, M. Oxygen in the cultivation of stem cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).
- Johansson, A., et al. Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).
- Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).
- Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line. PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).
- Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Court, M., et al. Toward a standardized urine proteome analysis methodology. Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).
- Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
- Liebler, D. C., Ham, A. -J. L. Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics. Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).
- Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis. Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells. Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
- Lengner, C. J., et al. Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations. Cell. 141 (5), 872-883 (2010).
- Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology. Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).
