Summary
我们提出了一个协议, 以获得蛋白质组的特征的人类巨噬细胞, 并应用于确定低氧环境对巨噬细胞极化的影响。
Abstract
巨噬细胞是先天免疫细胞, 涉及许多生理功能, 从反应到传染性病原体, 再到组织稳态。这些细胞的各种功能与它们的激活状态有关, 这也被称为极化。这些不同极化的精确分子描述是巨噬细胞生物学领域的一个优先事项。目前人们认识到, 有必要采取多层面的办法来描述环境信号如何控制两极分化。在本报告中, 我们描述了一个协议, 旨在获得各种极化的蛋白质组学签名的人类巨噬细胞。该协议是基于无标签定量的巨噬细胞蛋白表达获得在凝胶分馏和赖西 cl 消化细胞裂解的内容。我们还提供了一个基于溶液中消化和等电聚焦分馏的协议, 作为一种替代方案。由于氧浓度是组织中的一个相关环境参数, 我们使用该协议来探讨大气成分或低氧环境如何影响巨噬细胞极化的分类。
Introduction
巨噬细胞是一种先天免疫细胞, 涉及许多生理功能, 从反应到传染性病原体, 再到组织稳态, 包括切除凋亡细胞和重塑细胞外基质 1。这些细胞的特点是具有强大的表型可塑性2 , 转化为许多可能的激活状态, 这也被称为极化。这些不同极化的精确分子描述是巨噬细胞生物学领域的一个优先事项3。有人建议使用所谓的 mém2 二分法对这些极化进行分类, 其中 m1 代表促炎, m2 代表抗炎巨噬细胞。这种模型很适合各种病理情况, 如急性感染, 过敏, 和肥胖4。然而, 在长期发炎的组织和癌症中, 已经证明, 这种分类无法掌握巨噬细胞存在于某些细胞环境5,6,7. 目前的共识是, 使用多层面模型更好地描述巨噬细胞极化, 以整合具体的微环境信号8。通过对人类巨噬细胞的转录分析证实了这一结论, 表明 m好久亚模型在描述所获得的极化方面效率低下9。
该研究旨在提供一种协议, 以获得人类巨噬细胞中各种极化的蛋白质组特征。我们描述了如何区分人类巨噬细胞在不同的氧水平的环境中, 并从整个巨噬细胞蛋白质组中获得肽, 以执行无标签的定量。这种量化允许比较各种蛋白质的表达水平。由于对干细胞的研究揭示了氧作为环境关键参数10的重要性, 我们试图了解这种组织参数如何影响人类巨噬细胞的极化。研究发现, 人体的氧分压在 3% 至 2 0% (大气总压力中) 之间, 其中 2 0% 大致相当于细胞培养孵化器中常用的压力 (在取水的同时, 确切值在 1 8. 6% 左右)考虑到)。
先前的研究表明, 肺泡不同于间质巨噬细胞的功能和形态观点 11 , 这些差异的一部分可能是由于不同的氧气水平, 他们暴露 12.此外, 骨髓衍生的巨噬细胞在接触低氧环境时显示出更强的吞噬细菌能力。相反的影响已经发现 thp1 分化人类巨噬细胞 13, 但这些结果支持的观点, 氧气是一个调节巨噬细胞生物学, 有必要澄清这一作用, 在分子水平上的人类巨噬细胞。在之前的一项研究中, 我们应用了蛋白质组学方法来解决这些问题。通过同时测量数千种蛋白质的表达水平, 我们强调了氧气对极化的影响, 并提供了一个新的分子标记列表。我们还能够将这些发现与一些巨噬细胞功能联系起来。值得注意的是, 我们发现 ilni-il13 极化巨噬细胞的凋亡率提高, 这与 alox15 的上升有关, 结果通过蛋白质组分析14显示.在本研究中, 我们描述了如何进行这样的分析。
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Protocol
作为授权协议 (codeceh dc-3114年) 的一部分, 从法国国家血液服务机构 (efs) 获得了健康、被取消鉴定的捐献者的人体血液样本 (lrsc)。捐献者签署了使用血液的同意。
1. 介质和缓冲液准备
- 制备巨噬细胞培养基 [rpmi 谷氨酰亚胺 + 10 mm hepes + 1x 非必需氨基酸 (neaa)], 并将其加热至37°c。
- 从 ab 血浆 (sab) 制备巨噬细胞培养基 + 10% 的人血清, 过滤 (0.22μm 过滤器), 然后将其加热至 37°c (以下简称巨噬细胞培养基 + 10% sab)。
- 制备分选缓冲液 [1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs) + 0.5% 的牛血清白蛋白 (bsa) + 2 mm 乙二胺四乙酸 (edta)], 过滤 (0.22μm 过滤器), 并将其保持在4°c。
2. 从白血病系统室 (lrsc) 中分离外周血单个核细胞 (pbmc)
- 将15毫升密度梯度电池分离溶液 (见材料表) 放入50毫升离心管中, 使其在接收 lrsc 之前能够加热到室温 (rt)。
注: 密度取决于温度。由于此产品存储在 4°c, 因此必须提前完成此步骤, 以便与 rt 进行平衡。 - 将 lrsc 清空到一个50毫升的离心管中, 最多添加50毫升的 1x pbs, 然后混合。慢慢地, 在步骤2.1 中加热的15毫升密度梯度溶液的顶部添加步骤2.2 中制备的混合物的25毫升。
注: 在此步骤中, 请注意不要混合各个阶段。必须在密度梯度溶液中添加血液, 而不会受到这一阶段的任何干扰。 - 离心两个离心管 25分钟, 在 700 x g 没有断裂。
注: 在密度梯度离心结束时, 从下到上的层是: 形成颗粒的红细胞和粒细胞、密度梯度溶液相、pbmc 层和血浆。 - 用一个管道, 通过等离子体相, 而不吸气, 并收集 pbmc 层到一个新的50毫升离心管。将高达50毫升的 1x pbs 添加到 pbmc 中作为洗涤步骤, 并在 300 x g 处为10分钟离心机。
- 在巨噬细胞培养基中吸收上清液并重新悬浮颗粒。
3. cd14+细胞 (单核细胞) 的磁标记和分离
- 数一数马拉色塞兹室中的 pbmc。提取进行实验所需的 pbmc 量 (通常为100至 300 x10 6个电池), 将其放入离心管中, 离心 10分钟, 在 300 x g 处。
- 将上清液吸吸, 并将颗粒重新悬浮在步骤1.3 期间制备的分选缓冲液中, 每 107 bmc 中加入 20μl cd14 微珠, 在持续搅拌的情况下, 在4°c 下混合并孵育 15分钟.
- 每 10个7 bmc 添加1毫升分选缓冲液作为洗涤步骤, 离心剂在 300 x g 处 10分钟, 在每 10个 8个 pbmc 中吸收上清液, 并在500μl 分选缓冲液中重新悬浮颗粒。
- 在分离器的磁场中放置一个柱。用3毫升的排序缓冲区冲洗列, 准备列。
- 将单元格悬浮液应用到列上。该列取决于要隔离的单元格数 (此处使用最多 10 9 bmc 的 ls列)。收集包含未标记单元格的流通。
注: 从这一步开始, 所有的管 (负和正的选择) 保留, 以便以后通过流式细胞术检查不同的步骤。 - 用 3 x 3 毫升的分选缓冲液清洗列。从步骤3.12 开始收集通过同一管的未标记细胞。通过添加排序缓冲区来执行清洗步骤, 请注意不要擦干您的列。将收集管放置在色谱柱下, 并将其从分离器中取出。
- 将移液器5毫升的排序缓冲区进入列中。立即将磁贴的细胞冲洗干净, 将柱塞牢固地推入柱内。为了提高 cd14+细胞的纯度, 在第二列中浓缩了洗脱的组分。
- 使用新列重复步骤3.4 至3.7。
4. 单核细胞的电镀
- 数一数马拉色氏室中的单核细胞。流式细胞仪检查 cd14+细胞的纯度。提取实验所需的单核细胞量, 并将其放入离心管中。
- 在 300 x g. 下清液下离心 10分钟, 并在巨噬细胞培养基中重新悬浮单核细胞颗粒。将细胞固定在50分钟至1小时后, 使其沉淀培养基, 并以巨噬细胞培养基 + 10% sab + 25 ng/ml 巨噬细胞集落刺激因子 (m-csf) 取代, 诱导分化。
5. 第6天巨噬细胞的极化
- 吸气的介质。用各种刺激剂取代巨噬细胞培养基 + 10% sab。例如, 添加 10 ng/ml 干扰素伽玛 (infγ) + 1 ngml 脂多糖 (lps) 以获得 m1 极化, 或添加 20 ngml 白细胞介素 4 (il4) + 20 ng/ml 白细胞介体 13 (il13)。
注: 刺激可以在24至48小时之间进行, 然后再进行其他测试。 - 使用分离溶液或细胞刮刀的收获细胞。
6. 低氧条件下的细胞培养
- 从第4步开始, 在氧控制环境中保持单核细胞, 然后维持巨噬细胞, 进行缺氧条件分析。在实验过程中, 使用缺氧工作站以保持细胞在所需的氧气分压下。
注: 在低氧压力下工作时, 重要的是要准备好站下的所有介质和洗涤缓冲液, 并充分等待, 以获得正确的液中的分压。例如, 60 毫米 petri 盘中10毫升的 pbs 需要大约2小时才能达到从大气压力开始的 o2分压的25毫米汞柱 (正如我们使用光纤氧传感器测量的那样)。在许多缺氧站或孵化器中, 氧气压力被设定为大气压力的百分比。如果需要精确的测量, 最好使用授权直接设置 mmhg 氧气压力的站。
7. 裂解和内凝胶消化 (第1号议定书)
请注意:在本节和以下部分中, 描述了用于获取多肽和进行 lc-msams 分析的两个协议。协议1描述细胞裂解和凝胶中的分馏和消化, 协议2描述溶液中的细胞裂解, 然后使用等电聚焦方法进行溶液中的消化和分馏。
- 在 laemmli 缓冲液中进行细胞裂解 [234 mm Tris-HCL (ph 6.8)、7.5% sds、37% 甘油、33.3% (v2) β-硫醇、溴酚蓝 0.2% wv]。在4-12 的双-tris 丙烯酰胺凝胶上为每个样品加载相当于 300, 000个细胞的蛋白质当量。
- 控制电泳迁移的持续时间, 使每个蛋白质样本被分成6个凝胶带, 如图 3所示。
- 用固定溶液 (30% 乙醇 + 7.5% 醋酸 20分钟) 固定凝胶, 然后加入染色液 (r-250 coomassie 蓝色 45分钟)。加入去脱盐液 (30% 乙醇 + 7.5% 的醋酸, 直到带出现), 然后用干净的手术刀切除蛋白质带。
- 在500μl 管中引入之前, 先将每个切除带切好。为了避免使用角蛋白污染, 需要一个干净的玻璃表面 (可使用去离子水中5% 的 sds 溶液来清洁表面)。
- 在37°c 下, 用25mm 碳酸氢铵的200μl 清洗凝胶片 3次, 在37°c 下清洗 20分钟, 然后在 25 mm 碳酸氢铵和乙腈 (50% vv) 中清洗一次。用200μl 的100% 乙腈脱水10分钟。
- 在 56°c (200μl) 下, 用 10 mm dtt (二硫醇) 在 25 mm 碳酸氢铵中培养每块凝胶, 45分钟, 然后在25mm 碳酸氢铵 (200μl) 中使用 55 mm 的碘酸铵, 在 rt 黑暗中进行35分钟。
- 为了停止烷基化, 在 rt 中, 用25mm 碳酸氢铵中用200μl 的 10 mm 碳酸氢钠孵育每块凝胶, 在 rt 中孵育 10分钟, 用200μl 的25mm 碳酸氢铵清洗凝胶片, 然后用200μl 的100% 乙腈脱水10分钟。
- 根据制造商的说明, 在37°c 下使用 Trypsin/Lys-C 混合法将蛋白质消化一夜。
- 从凝胶片中提取产生的肽, 加入50μl 的50% 乙腈 15分钟, 然后50μl 的5% 甲酸 15分钟, 最后, 50μl 100% 乙腈 15分钟. 池和干燥的每一部分在低吸收管中的限制肽和肽的吸附样品损失。将样品存放在-80°c, 直至进一步分析。
8. 蛋白质提取和溶液中消化 (议定书 2)
- 用以下裂解缓冲液15μl 进行细胞裂解 (2 x10 6 细胞):
- 7 m 尿素、2m 硫脲、40mm tris 和 4% chaps, 辅以蛋白酶抑制剂 (完整的微型、无 edta 蛋白酶抑制剂鸡尾酒)。
- 将解决方案与热莫沙克在 rt 中进行30分钟的同质化。以 13 800 x 克离心, 20分钟 rt, 并保留上清液。
- 使用2d 清理套件去除污染物:
- 该试剂盒包含沉淀液、共沉淀液、洗涤缓冲液和洗涤添加剂。
- 加入300μl 的沉淀液, 搅拌均匀。在冰上培养 15分钟, 加入300μl 的共沉淀液。以 12, 000 x g 离心管 (至少) 5分钟。一个小颗粒应该是可见的。快速进入下一步, 以避免颗粒的重新悬浮或分散。在不干扰颗粒的情况下取出上清液。
- 再次离心管与盖帽铰链和颗粒朝外, 以带来任何剩余的液体到底部的管。一个简短的脉冲就足够了。管内不应有可见液体。
- 在不干扰颗粒的情况下, 加入40μl 的共沉淀液。让管子在冰上坐 5分钟, 离心 5分钟, 然后取出并丢弃洗。加入25μl 的去离子水。每个管5-10 的涡旋。颗粒应分散, 但不溶于水中。
- 加入1毫升的洗涤缓冲液 (预冷至少 1小时, 在-20°C) 和5μl 的洗涤添加剂。涡旋, 直到颗粒完全分散。以20°C 将管材中培养至少30分钟的涡流, 每 10分钟20至30秒
注: 这些管可以储存在-20°C 长达 1周, 蛋白质降解或修饰最少。 - 以 12, 000 x g 离心管 (至少) 5分钟, 小心地取出并丢弃上清液。白色的颗粒应该是可见的。让颗粒通风不超过 5分钟 (如果颗粒太干, 将很难重新悬浮)。
- 在8m 尿素300μl 和 0.1 m 碳酸氢铵中重新提取蛋白质颗粒。涡旋强烈 1分钟, 用比色法测定蛋白质浓度。
9. 解决方案内消化 (协议 2)
- 在步骤8.4 的再悬浮蛋白中加入5.1μl 的 700 mm dtt 水溶液 (最终浓度 12.5 mm), 并在37°c 时与热莫沙克孵育 30分钟, 从而减少二硫桥。烷基酸半胱氨酸残留物通过添加20.3 微米的 700 mm 碘乙酰胺水溶液 (最终浓度 40 mm) 和孵育在 25°C 30分钟在黑暗中与热固性。
- 在样品中加入 990μl 0.1 m 碳酸氢铵。加入相应体积的 Trypsin/Lys-C 混合物 (酶: 底物比 1:100 ww)。在37°C 与热甲者一起孵化过夜。
10. 清理墨盒 (第二议定书)
- 用1柱体积 (1 毫升) 甲醇湿一个墨盒。用80% 醋酸甲腈级水清洗墨盒1柱体积 (1 毫升), 并丢弃流动。将墨盒以0.1% 甲酸/hplc 级水的4柱体积 (4 毫升) 平衡, 并丢弃流动。
- 用90μl 的10% 甲酸或水固化样品到 ph 值 2-3 (用 ph 指示剂检查 ph 值)。装入酸化样品并收集流经。重新加载流经 (包含未保留的肽)。用0.1% 甲酸/hplc 级水的6柱体积 (6 毫升) 清洗墨盒。
- 1柱体积 (1 毫升) 的弹药筒中的富有槽肽, 为0.1% 的甲酸/50% 的乙腈/hplc 级水。转移到 1.5 ml 微离心管。使用真空集中器 (150 x g, 真空在160毫巴) 浓缩样品。
11. 等电聚焦分馏 (第2议定书)
注: 多肽是根据其等电点分离的, 使用13厘米条上的离凝胶分馏器, ph 值范围为3至10。我们使用了供应商提供的以下协议 (概述如下):
- 准备以下解决方案: 溶液 a (600μl 的甘油溶液、60μl 的 offgel 缓冲液、4.34 毫升的超纯水) 和溶液 b (1.776 毫升溶液 a 和444μl 超纯水)。
- 根据制造商的说明组装 ipg 条带、框架和电极。
- 用 1.8 ml 溶液 b 重新填充样品. 在每口井中加入40μl 溶液 b。将150μl 的样品装入每口井。
- 选择多肽的默认方法: og12pe00 (与 3100 bogel 低色套件、ph 值3-10、12孔框架一起使用的多肽的默认方法)。等待, 直到此方法已完成 (约 20小时)。在标记正确的管道中收集分数。
12. 清理哈佛仪器室反向 c18 后的 ief (礼宾 2)
- 在去离子水中一次添加少量μl, 将 1% tfa 添加到每个分数中, 以使样品酸化。使用 ph 纸检查 ph 值是否在3或以下。
- 准备以下溶液: 溶液 1 (乙腈5毫升, 甲酸 10μl, 超纯水4.99 毫升) 和溶液 2 (乙腈0.5 毫升, 甲酸 10μl, 超纯水 9.49 ml)。
- 用150μl 溶液1预湿自旋柱。以 750 x 克离心 90秒, 并丢弃流经。用150μl 溶液2清洗自旋柱。以 750 x 克离心 90秒, 并丢弃流经。
- 将分数通过列。以 750 x 克离心 90秒, 并丢弃流经。用150μl 溶液2清洗。以 750 x 克离心 90秒, 并丢弃流经。
- 用50μl 溶液1对分数进行洗脱。以 750 x g 离心 90秒, 再次重复这些步骤。
- 使用真空集中器 (150 x g, 真空 160 mbar) 的干分数, 并存储在-80°C
13. 蛋白质组数据和生物信息学分析18
- 利用 maxquant (1.5.2.8 版) 和仙女座数搜索引擎等定量软件分析了纳米 lc mmsms 质谱仪获得的数据。
- 将蛋白质和肽的假发现率 (fdr) 设置为 1%, 并将最低长度为7个氨基酸。将酶特异性设置为 arg 和 lys 的 c 末端。允许在前列腺键处漏掉2次裂痕。选择半胱氨酸的卡氨基甲基化作为固定修饰, 选择 n 端蛋白乙酰化和蛋氨酸氧化作为可变修饰。
- 使用统计分析软件进一步分析数据。使用 funrich 软件 (www.funrich.org/) 执行功能丰富分析。使用 david 软件 (https://david.ncifcrf.gov/) 执行基因本体丰富分析。
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Representative Results
该协议从差离心获得的外周血单个核细胞 (pbmc) 开始, 允许通过流式细胞术获得评估纯度超过98% 的 cd14+单核细胞种群 (图 1)。这些单核细胞被二次分化为各种极化 (图 2)。当选择凝胶上的分馏时, sds 页凝胶上的迁移被调整以获得所需的带数, 并对带进行切割 (图 3)。消化是在凝胶的切除带进行二次, 然后提取肽。利用纳米 lc (液相色谱)-mmsms 质谱仪对多肽进行了分析。mmsms 光谱根据已知肽获得的光谱注释给出了各种蛋白质的同一性 (图 4a)。然后, 利用已发布的软件和数据库 15, 16, 根据蛋白质中已确定的肽的数量来计算蛋白质丰度的定量。这种凝胶内消化的协议提供了大约4000蛋白质, 动态范围已被发现涵盖5个对数刻度单位 (图 4b)。对这些已鉴定蛋白质的差异表达的分析可用于确定不同氧环境下各种极化的聚类。
通过这种方法, 我们还可以识别在氧气浓度较低的3% 时调节向上调节的蛋白质簇 (图 5, 表 1)。为了评估消化的效率, 当使用凝胶内协议时是不可能的, 我们提出了一种适应人类巨噬细胞的内溶消化方法 (图 6a)。使用这种方法, 我们可以很容易地获得3600蛋白质的识别 (在溶液中消化) 没有分馏, 这意味着与 ief 的分馏将合理地增加这个数字 (图 6b)。
图 1: 在分类前 (左板) 和分选后 (右面板) 对 pbmc cd14 表达进行流式细胞仪分析, 显示磁珠选择后获得的纯度.请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 不同人类巨噬细胞的相对比图像, 显示两个不同极化的所获得形态的异质性.刻度条代表50微米. 请点击此处查看此图的较大版本.
图 3: 显示将被切除的各种带 [此处, m () 巨噬细胞的6个带] 的成像, 用于暴露在低氧环境中的巨噬细胞的5个极化.ic = 免疫复合物, dxm = 地塞米松。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: msms 频谱和定量.(a) mssms 频谱的一个示例。这里显示的是在 ms 光谱上发现的电荷为 + 2的 mss597.29 中发现的肽的 cid (碰撞诱导的离解) 谱。从这一光谱中确定了相应的序列, 即从蛋白质 cd58 中作为 val-ala-glu-leu-glu-sn-glu-phu-fhe-arg。(b) 对每个已识别的蛋白质进行有序无标签定量 (日志10 lfq)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 热图, 表示使用差异表达的蛋白质的所有极化状态的分层聚类.分析显示, 在 3% o2 条件下 (红色矩形), 所有极化中都有一组蛋白质过度表达。颜色刻度表示 z 分数 (log2 强度)。每一行都是蛋白质, 每一列都是一个样本。这一数字源于以前的一份出版物14。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: sds-page 和色谱图.(a) 银染 sds-page 凝胶, 含有细胞裂解和溶液消化后的蛋白质, 显示在裂解过程中没有降解和消化效率。(b) 在溶液消化后, 在没有分馏的情况下获得色谱图。请点击这里查看此图的较大版本.
| 集群 | 蛋白 id | 蛋白质名称 | 基因名称 | 肽 | 剃须刀 + 独特的肽 | 独特的肽 | 蛋白质 id | ||
| 红 | p0dmv9 | 热休克 70 kda 蛋白1b | hspa1a | 40 | 37。 | 4个 | p0dmv9;p0dmv8;a8k5i0;q59ej3;b4dnt8;b4dwk5;b4dfn9;b4di39;b4e1s9;b4dvu9;v9gz37;b3ktt5;b4dnx1;b4e1t6;b4dnv4;q9uqc1 | ||
| 红 | p54709 | β-3-3 | atp1b3 | 8 | 8 | 8 | p54709;d3dnf9;c9jxz1;c9ja36;h7c547;f8wby4;q58i18 | ||
| 红 | o00462 | β-曼诺西达酶 | 曼巴 | 14 | 13 | 13 | o00462;a7lfp5;a8k6d3;e9pfw2;b4dt18;q59eg5 | ||
| 红 | q8nas7 | nadh 脱氢酶 (泛喹酮) 铁硫蛋白 7, 线粒体 | ndufs7 | 4个 | 4个 | 4个 | q8nas7;q6zqu6;f5h5n1;b7z1u1;a8k0v6;q7ld69;f5gxj1;o75251;b7z4p1;q9h3k5;a0a087wxf6;a0a087wti3;q6zs38 | ||
| 红 | q8wwq0 | ph 相互作用蛋白 | phip | 5 | 5 | 4个 | q8wwq0;q9nwp3 | ||
| 红 | e5rhk8 | 动力-3 | dnm3 | 11 | 2 | 2 | e5rhk8;q9uq16;b3kpf2;E5RIK2 | ||
| 红 | a0024qz64 | 二硫化果糖酶 c | aldoc | 18 | 14 | 7。 | a0024qz64;p09972;b7z1y2;b7z3k9;b7z1n6;b7z3k7;a8mvz9;j3ksv6;j3qkp5;b7z1l5;c9j8f3;k7eh5;j3qkk1;b7z1h6 | ||
| 红 | o75489 | nadh 脱氢酶 (泛喹酮) 铁硫蛋白 3, 线粒体 | ndufs3 | 12 | 12 | 12 | o75489;q9uf24;q53fm7;E9PS48;e9pkl8;g3v194 | ||
| 红 | p21912 | 琥珀酸脱氢酶 (泛喹酮) 铁-硫亚基、线粒体 | sdhb | 11 | 11 | 11 | p21912;a0a087wxxx8;a0a087wwt1 | ||
| 红 | a0a024r1y7 | gh3 含域蛋白 | lgp1;ghdc | 7。 | 7。 | 7。 | a0a024r1y7;q8n2g8;b3kvb0;k7esn3;k7ejt7;k7eq41;k7el54 | ||
| 红 | e5krk5 | nadh-泛喹酮氧化还原酶 75 kda 亚基, 线粒体 | ndufs1 | 29 | 29 | 29 | e5krk5;p28331;b4dj81;q9p1a0;c9jpq5;f8wdl5 | ||
| 红 | a0a024qz30 | 琥珀酸脱氢酶 (泛喹酮) 外蛋白亚基、线粒体 | sdha | 17 | 17 | 17 | a0024qz30;p31040;d6rfm5;b3kt34;a0a087x1i3;q0qf12;b4dyn5;b3kya5;b4dnb2;h0y8x1;b7z6j5 | ||
| 红 | a0a024r2f9 | 跨膜蛋白43 | ttem43 | 16 | 16 | 16 | a0a024r2f9;q9btv4;q8tep9;v9gy05 | ||
| 红 | a0a024r5k3 | nadh 脱氢酶 (泛喹酮) 铁硫蛋白 8, 线粒体 | ndufs8 | 5 | 5 | 5 | a0a024r5k3;e9ppw7;o00217;e9pn51;f8w9k7;e9pkh6;b4dy3;q53g17 | ||
| 红 | o76003 | 谷胱甘肽-3 | glrx3 | 13 | 13 | 13 | o76003 | ||
| 红 | q1hbj4 | 丝裂原活化蛋白激酶;丝裂原活化蛋白激酶1 | mapk1 | 26 | 26 | 21 | q1hbj4;p28482;b4dhn0;q499g7;k7elv1;k7en18;b4e104;p31152;q16659 | ||
| 红 | q13151 | 异质核核糖核酸蛋白 a0 | hnrnpa0 0 | 8 | 8 | 8 | q13151 | ||
| 红 | v9hwn7 | 二硫化果糖 a | aldoa | 36 | 36 | 14 | v9hwn7;p04075;j3kps3;h3bqn4;h3buh7;h3br04;h3bmq8;h3bu78;h3br68;A4UCS9;a4uct0 | ||
| 红 | b4dvj0 | 葡萄糖-6-磷酸异构酶 | Gpi | 32 | 32 | 23 | b4dvj0;p06744;b4de36;a0a0mts2;k7q48;k7ep41;k7epy4;k7elr7;k7erc6;k7ena0;k7esf4;k7eil4;k7erk8;q59f85 | ||
| 红 | v9hwb9 | l-乳酸脱氢酶;l-乳酸脱氢酶 a 链 | ldha | 36 | 36 | 34 | v9hwb9;p00338;B4DJI1;f5gxy2;f5gyu2;f5gxh2;f5h5j4;f5h6w8;f5gzq4;f5h8h6;f5gxc7;F5GWW2;f5gxu1;A0A087WUM2;q96l19;q6zmr3 | ||
| 红 | p13674 | 丙基 4-羟化酶亚基α-1 | p4ha1 | 26 | 26 | 26 | p13674;q5vsq6 | ||
| 红 | Q6FHV6 | 伽玛-烯醇酶;烯 醇化 酶 | eno2 | 18 | 15 | 14 | Q6FHV6;p09104;a8k3b0;f5h0c8;f5h1c3;u3kqp4;u3kqq1;q9npl4 | ||
| 红 | q99798 | 芳香水化酶、线粒体 | 二氧化碳 | 40 | 40 | 40 | q99798;b4dz08;b2rbw5;a2a274;b4djw1;b4dy4;q71 uf1;b4dec3;b4dw08;o75944 | ||
| 红 | p17858 | atp 依赖性 6-磷酸果糖激酶, 肝脏型 | pfkl | 32 | 29 | 28 | p17858;q7l2m7;q9bsp4;b3knq7;b4e108;q59gi2;f8we2;q7z3r9;q6mzk4 | ||
| 红 | a0a024r872 | 镍类蛋白1 | fam129b | 32 | 32 | 32 | a0a024r872;q96ta1;q9h8k1;q2yd88;q9h6l6 | ||
| 红 | a0a024rc61 | 氨基肽酶 n | anpep | 58 | 58 | 25 | a0a024rc61;p15144;q59e93;b4dv63;b4dp01;b4dp96;h0ykt6;h0ylz8;q71e46;H0YMC1;q8ivl7 | ||
| 红 | v9hwf4 | 磷酸甘油激酶;磷酸甘油激酶1 | pgk1 | 41 | 41 | 35 | v9hwf4;p00558;b4e1h9;b4dhm5;b4dhb3;b4dwq3;q16444 | ||
| 红 | q12882 | 二氢吡啶脱氢酶 [nadp (+)] | dpyd | 44 | 44 | 44 | q12882;b4dml1 | ||
| 红 | b4deq0 | 电子转移氟蛋白-泛喹酮氧化还原酶, 线粒体 | etfdh | 9 | 9 | 9 | b4deq0;q547s8;a7unu5;q16134;d6rad5 | ||
| 红 | d9uax9 | mhc i 类抗原 | HLA-B | 13 | 3个 | 2 | d9uax9 | ||
| 红 | v9hwk1 | 磷酸三聚糖异构酶 | tpi1 | 29 | 29 | 17 | v9hwk1;p60174;q53he2;b4dui5;u3kpz0;u3kqf3;u3kps5 | ||
| 红 | q96he7 | ero1 类似蛋白α | ero1l | 28 | 28 | 28 | q96he7;g3v3e6;g3v5b3;g3v2h0;g3v503;q5tae8;b2rd00;q86yb8 | ||
| 红 | p14868 | 天冬氨酸-trna 连接酶, 细胞质 | dars | 29 | 29 | 2 | p14868;q53t60;q53r85;h7bz35;h7c278 | ||
| 红 | p36871 | 磷糖-1 | pgm1 | 24 | 24 | 5 | p36871;b4dfp1;q9h1d2 | ||
表 1: 低氧张力下每次极化共有的人类巨噬细胞过度表达的蛋白质列表。
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Discussion
由于蛋白质组学是研究来自整个细胞或亚细胞隔间的不同蛋白质表达的有力工具, 因此细胞裂解方案的优化和蛋白质的消化已被许多研究所解决。主要有三类方法, 包括凝胶内消化 (聚丙烯酰胺凝胶基质中蛋白质的消化)17、溶液18中的消化和过滤辅助样品制备19。最后一种方法, 最初被描述为通用的, 已被报告表现出低重现性和可能的蛋白质损失的过滤器20。在凝胶消化是一个强大的方法, 可以是耗时和不利的, 在评估消化效率是不容易的, 如果可能的话。在溶液中消化提供了这种可能性, 但需要在消化和 ief 后对样品进行清洁。当这两种方法在同一样本之间进行比较时, 使用 ief 分馏协议的溶液中消化产生的蛋白质数量 (分数相同) 高于凝胶内消化 21.
尽管有这一优势, 但仍有必要考虑细胞内蛋白酶 (尤其是骨髓细胞) 在溶液中裂解过程中可能导致的蛋白质降解。同样重要的是要记住, 这些技术是基于蛋白质消化, 只能分析蛋白质呈现胰蛋白酶特定的裂解部位。可以使用自上而下的蛋白质组学方法来缓解这种消化限制, 但增加数据分析步骤和生物信息学资源来源 22。从不同的细胞隔间的蛋白质的增溶也很难获得, 特别是从等离子体膜, 导致细胞蛋白质组的不受控制的取样。为了对样品进行纳米 lc-msms 质谱仪分析, 重要的是要获得足够数量的肽, 这可以依赖所使用的质谱仪 (通常情况下, 启动总蛋白质应至少为1μg 的条件,根据与 ief 一起使用的分数数增加此数量)。如果所研究的细胞群稀缺, 这可能是一个缺点, 它将蛋白质组学与可能扩增原料的基因组技术区分开来。
即使在 richer 和他的同事 23和 packer 和 fuehr24的开创性作品之后, 氧气在细胞培养中的重要性也没有得到充分的认识。我们现在知道, 在低氧浓度下培养细胞有利于粘附、寿命和分裂。人们认识到, 这在干细胞研究中至关重要。在控制氧气条件下培养细胞的主要技术问题与整个实验期间维持所需的氧气浓度有关。这就需要预先培养所有介质, 以防止溶解氧的释放, 并使用低氧工作站, 允许在低氧下操作细胞 (带手套箱的处理室), 并防止短暂地暴露在高氧气条件下.
所描述的协议被用来获得人类单核细胞衍生巨噬细胞的各种极化的分子特征, 并研究氧调制对这些特征的影响。这项研究提供了对这些极化的描述的见解, 并揭示了一些功能后果。例如, 我们发现许多参与泡泡的蛋白质都是由低氧环境调节的。这种基于所述协议的蛋白质组学方法为探讨环境参数如何改变巨噬细胞功能以及如何利用这些信号设计新的治疗方法提供了机会14。
本研究中描述的蛋白质组学方法是对近年来在人类巨噬细胞极化研究领域中使用的基因组方法的补充。蛋白质组学提供了蛋白质定量的优势, 这可能会呈现不同的表达与他们相应的 mrna 由于翻译后的修改, 并导致新的生物标志物的发现。尽管有这一优势, 蛋白质组学数据通常很难解释, 部分原因是质谱的高灵敏度, 导致非常复杂的 ms 光谱和对肽的假阳性检测。最近, 分析软件获得了效率, 以防止这种情况的发生。即使是一个不断变化的情况, 蛋白质组学也面临着较低的重现性比基因组学26, 并与验证步骤使用其他技术 (流式细胞术, 免疫印迹), 以确认蛋白质的定量修改表达式级别。
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Disclosures
提交人声明没有利益冲突。
Acknowledgments
am 由青年小组领导人方案 (ATIP/Avenir inserm-cnrs)、"癌症国家联盟" 和 "癌症研究基金会" 资助。我们感谢来自生物质谱的玛丽特·马松多 (巴黎巴斯德研究所, utecs msbio)。我们感谢劳伦·安德森对手稿的阅读。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hypoxia Working Station | Oxford Optronix | Hypoxylab | |
| C6 Flow cytometer | BD | Accuri C6 | |
| Urea | Agilent Technologies | 5188-6435 | |
| Formic acid (FA) | ARISTAR | 450122M | |
| R-250 Coomassie blue | Biorad | 1,610,436 | |
| Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS) | Calbiochem | 437627 | |
| 2D clean-up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| RPMI 1640 medium, glutamax supplement | Gibco | 61870044 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X | Gibco | 11140-035 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column | Harvard Apparatus | 74-4601 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| NuPAGE Bis-Tris 4-12% | Life Technologies SAS | NP0321 BOX | |
| CD14 Microbeads human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| MACS separation column LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) | Miltenyi Biotec | 130-096-485 | |
| Interleukin 4 (IL4) | Miltenyi Biotec | 130-093-917 | |
| Interleukin 13 (IL13) | Miltenyi Biotec | 130-112-410 | |
| Interferon gamma (INFγ) | Miltenyi Biotec | 130-096-482 | |
| CD14-FITC (clone TÜK4) | Miltenyi Biotec | 130-080-701 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Pierce | 28904 | |
| Trypsin/Lys-C Mix | PROMEGA | V5073 | |
| Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Density Gradient Solution (Histopaque 1077) | Sigma Aldrich | 10771-100ML | |
| Accumax | Sigma Aldrich | A7089-100ML | |
| Human Serum from human male AB plasma (SAB) | Sigma Aldrich | H4522-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30% | Sigma Aldrich | A9576-50ML | |
| Trisma-base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | 49767 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 114405 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% | Sigma Aldrich | 5030 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34888 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | 57670 | |
| Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | |
| CHAPS | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Micro BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| 5 mL sterile plastic pipette | VWR | 612-1685 | |
| Thermomixer C Eppendorf | VWR | 460-0223 | |
| Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg | Waters | WAT036820 |
References
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