Summary
Vi præsenterer en protokol for at opnå proteom signaturer af menneskelige makrofager og anvende dette til bestemmelse af virkningerne af en lav ilt miljø på makrofag polarisering.
Abstract
Makrofager er medfødte immun celler involveret i en række fysiologiske funktioner lige fra svar til smittefarlige patogener til væv homøostase. De forskellige funktioner i disse celler er relateret til deres aktivering stater, som også kaldes polarisering. Den præcise molekylære beskrivelse af disse forskellige polariseringer er en prioritet inden for makrofag biologi. Det er i øjeblikket erkendt, at en flerdimensional tilgang er nødvendig for at beskrive, hvordan polarisering er kontrolleret af miljømæssige signaler. I denne rapport beskriver vi en protokol, der er designet til at opnå forskellige polariseringer i menneskelige makrofager proteom underskrift. Denne protokol er baseret på en label-fri kvantificering af makrofag protein udtryk fra in-gel fraktioneret og Lys C/trypsin-fordøjet cellulære lysis indhold. Vi tilbyder også en protokol baseret på-løsning fordøjelse og isoelektrisk fokusering fraktionering at bruge som et alternativ. Fordi iltkoncentrationen er relevante miljømæssige parameter i væv, vi bruge denne protokol til at udforske hvordan atmosfærens sammensætning eller en lav ilt miljø påvirker tariferingen af makrofag polarisering.
Introduction
Makrofager er medfødte immun celler involveret i en række fysiologiske funktioner lige fra svar til smittefarlige patogener til væv homøostase, herunder fjernelse af apoptotiske celler og ombygning af ekstracellulære matrix1. Disse celler er karakteriseret ved en stærk fænotypisk plasticitet2 , der giver sig udslag i en mange mulige aktivering stater, der også kaldes polarisationer. Den præcise molekylære beskrivelse af disse forskellige polariseringer er en prioritet inden for makrofag biologi3. Det har været foreslået at klassificere disse polariseringer, ved hjælp af den såkaldte M1/M2 dikotomi, hvor M1 repræsenterer pro-inflammatoriske og M2 repræsenterer anti-inflammatoriske makrofager. Denne model passer godt i forskellige patologiske situationer som akutte infektioner, allergi og fedme4. Men i kronisk betændte væv og kræft, det er blevet påvist, denne klassificering er i stand til at forstå de brede fænotypiske repertoire, der makrofager til stede i visse cellulære miljøer5,6, 7. den nuværende konsensus er at makrofag polarisering bedre er beskrevet ved hjælp af en multidimensional model for at integrere specifikke microenvironmental signaler8. Denne konklusion er blevet bekræftet gennem transkriptom analyse af menneskers makrofager viser, at modellen M1/M2 er ineffektive i beskrivelsen af de fremkomne polariseringer9.
Undersøgelsen præsenteret sigter på at give en protokol for at opnå proteom underskrifter fra forskellige polariseringer i menneskelige makrofager. Vi beskriver, hvordan du skelne menneskelige makrofager i miljøer forskellige ilt niveauer og få peptider fra hele makrofag proteomet til at udføre en etiket-fri kvantificering. Denne kvantificering tillader sammenligning af udtryk niveauer af forskellige proteiner. Som forskning i stamceller har afsløret betydningen af ilt som en miljømæssig vigtigste parameter10, søger vi at forstå, hvordan dette væv parameter kan påvirke makrofag polarisering i mennesker. Partialtrykket af ilt er blevet fundet at vifte fra 3 til 20% (af samlede atmosfæretryk) i den menneskelige krop, hvor 20% svarer nogenlunde til hvad er almindeligt anvendt i en celle kultur inkubator (den nøjagtige værdi er omkring 18,6% mens du nyder tilstedeværelsen af vand i betragtning).
Tidligere arbejde har vist, at alveolaris afviger fra interstitiel makrofager fra funktionelle og morfologiske punkt udsigt11 , og at disse forskelle er formentlig delvis på grund af de forskellige ilt niveauer, de er udsatte12. Desuden viser knoglemarv-afledte makrofager en øget evne til at phagocytize bakterier, når de udsættes for en lav ilt miljø12. Den modsatte effekt er blevet fundet for THP1-opdelte menneskelige makrofager13, men disse resultater støtter tanken om, at ilt er en regulator af makrofag biologi og at det er nødvendigt at tydeliggøre denne rolle på det molekylære niveau i menneskelige makrofager. I en tidligere undersøgelse, har vi anvendt en proteomics tilgang for at løse disse problemer. Ved at måle udtryk niveauer for tusindvis af proteiner samtidig, vi fremhævet virkningen af ilt på polarisering og forelagt en liste over nye molekylære markører. Vi var også i stand til at relatere disse resultater til nogle makrofager funktioner. Vi fandt navnlig, at satsen for fagocytose af apoptotiske celler var steget i IL4/IL13-polariseret makrofager, som var knyttet til opregulering af ALOX15, som det fremgår af proteom analyse14. I den foreliggende undersøgelse beskriver vi, hvordan til at udføre en sådan analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menneskelige blodprøver (LRSC) fra sunde, de identificerede donorer blev indhentet fra EFS (franske nationale blod Service) som en del af en autoriseret protokol (CODECOH DC-2018-3114). Donorer gav underskrevet samtykke til brug af blod.
1. medier og Buffer forberedelse
- Forberede makrofag medium [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1 x ikke-essentielle aminosyrer (NEAA)] og varm det til 37 ° C.
- Forberede makrofag medium + 10% humant serum fra AB plasma (SAB), filtrere det (0,22 µm filter) og derefter varme det til 37 ° C (kaldet makrofag medium + 10% SAB herefter).
- Forberede den sortering buffer [1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) + 0,5% bovint serumalbumin (BSA) + 2 mM ethylendiamintetra syre (EDTA)], filtrere det (0,22 µm filter) og vedligeholde det ved 4 ° C.
2. isolering af perifert blod mononukleære celler (PBMC) fra Leukoreduction System kammer (LRSC)
- Sætte 15 mL af tæthed gradient celle adskillelse løsning (Se Tabel af materialer) i en 50 mL tube centrifugering så det kan varme til stuetemperatur (RT) før modtagelse af LRSC.
Bemærk: Massefylde afhænger af temperaturen. Da dette produkt er opbevares ved 4 ° C, skal dette trin gøres på forhånd, så det kan reagensglasset RT. - Tømme LRSC ind i en 50 mL centrifugering rør, tilføje op til 50 mL af 1 x PBS og bland. Meget langsomt, tilsættes 25 mL blanding forberedt under trin 2.2 oven på 15 mL af tæthed gradient løsning varmes op under trin 2.1.
Bemærk: Pas på ikke at blande faserne under dette trin. Blodet skal tilføjes på den tæthed gradient løsning uden forstyrrelser i denne fase. - Der centrifugeres begge centrifugering rør til 25 min på 700 x g uden pauser.
Bemærk: For enden af tæthed gradient centrifugering lag fra bund til top er: erytrocytter og granulocytter danner pellet, tæthed gradient løsning fase, lag af PBMC og plasma. - Med en pipette, passere gennem plasma fase uden sugning det og indsamle PBMC lag ind i en ny 50 mL centrifugering rør. Tilføje op til 50 mL af 1 x PBS til PBMC som en vask trin og centrifugeres i 10 min. ved 300 x g.
- Opsug supernatanten og resuspenderes i 40 mL af makrofag medium.
3. magnetiske mærkning og Isolation af CD14+ celler (monocytter)
- Tælle PBMC i en Malassez kammer. Trække beløbet for PBMC nødvendige for at gennemføre eksperiment (typisk 100 til 300 x 106 celler), skal du placere dem i en centrifugering røret, og der centrifugeres i 10 minutter ved 300 x g.
- Opsug supernatanten og resuspenderes i 80 µL af den sortering buffer udarbejdet under trin 1,3 pr. 107 PBMC. Tilføj 20 µL af CD14 microbeads pr. 107 PBMC. Mix godt og Inkuber i 15 min. ved 4 ° C under konstant omrøring.
- Der tilsættes 1 mL af sortering buffer pr. 107 PBMC som en vask trin og centrifugeres i 10 min. ved 300 x g. Aspirér supernatanten og resuspenderes i 500 µL af sortering buffer pr. 108 PBMC.
- Sted en kolonne i det magnetiske felt for separatoren. Forberede kolonnen skylles det med 3 mL sortering buffer.
- Anvende cellesuspension til kolonnen. Kolonnen afhænger af antallet af celler til at være isoleret (her, LS kolonner for op til 109 PBMC bruges). Indsamle gennemstrømnings-indeholdende umærkede celler.
Bemærk: Start på dette trin, holdes alle rør (negative og positive valg) til senere kontrol af de forskellige skridt ved flowcytometri. - Kolonnen udvaskes med 3 x 3 mL sortering buffer. Indsamle umærkede celler passerer gennem det samme rør fra trin 3.12. Udføre vask trin ved at tilføje sortering buffer, være omhyggelig med ikke at tørre din kolonne. Placer en collection tube under kolonnen og fjerne det fra separatoren.
- Der afpipetteres 5 mL sortering buffer i kolonnen. Straks skylle ud de magnetisk mærket celler ved fast at skubbe stemplet i kolonnen. At øge renhed af CD14+ celler, den eluted fraktion er beriget over en anden kolonne.
- Gentag trin 3.4 til 3.7 med en ny kolonne.
4. plating af monocytter
- Tælle monocytter i en Malassez kammer. Tjekke renheden af CD14+ celler ved flowcytometri. Trække beløbet for monocytter nødvendige for eksperimentet og placere dem i en centrifugering tube.
- Der centrifugeres i 10 min. ved 300 x g. aspirat supernatanten og resuspenderes monocyt i makrofag medium. Plade cellerne og lad dem bosætte sig for 50 min. til 1 h. Aspirér medium og erstatte det med makrofag medium + 10% SAB + 25 ng/mL makrofag koloni stimulerende faktor (M-CSF) for at inducere differentiering.
5. polarisering af makrofager på dag 6
- Opsug mediet. Erstatte det med makrofag medium + 10% SAB med forskellige stimuli. For eksempel, tilføje 10 ng/mL interferon gamma (INFγ) + 1 ng/mL LPS (LPS) at opnå M1 polarisering, eller 20 ng/mL interleukin 4 (IL4) + 20 ng/mL interleukin 13 (IL13) for M2 polarisering.
Bemærk: Stimulering kan udføres mellem 24 og 48 h før man går videre til andre tests. - Høst celler ved hjælp af en fjernelse løsning eller en celle skraber.
6. cellekultur lav ilt betingelser
- Udgangspunkt i trin 4, opretholde monocytter og makrofager i en ilt-kontrolleret miljø til at udføre hypoksiske betingelse analyse. Bruge en hypoxi arbejde station for at opretholde celler under den ønskede oxygen partialtrykket under eksperimentet.
Bemærk: Når du arbejder under lav ilt pres, det er vigtigt at forberede alle medier og vask buffere under station og vente tilstrækkeligt til at opnå den korrekte partialtrykket i væsken. For eksempel, kræver 10 mL PBS i en 60 mm petriskål cirka 2 timer at nå 25 mmHg for O2 partialtrykket startende fra atmosfærisk pres (som vi har målt den ved hjælp af en fiber-optisk ilt sensor). I mange hypoksiske stationer eller væksthuse, er ilt-trykket angivet som en procentdel af det atmosfæriske tryk. Hvis præcise målinger er nødvendigt, er det bedre at bruge en station tilladelse til direkte sat ilt pres i mmHg.
7. lysis og i-Gel fordøjelsen (protokol 1)
Bemærk: I dette og de følgende afsnit, er to protokoller, der bruges til at opnå peptider og udføre LC-MS/MS analyse beskrevet. Protokol 1 beskriver celle lysis og i-gel fraktionering og fordøjelse, og protokol 2 beskriver i løsning celle lysis efterfulgt af i-løsning fordøjelse og fraktionering ved hjælp af en isoelektrisk fokusering metode.
- Udføre celle lysis i Laemmli buffer [234 mM Tris-HCL (pH 6,8), 7,5% SDS, 37% glycerol, 33,3% (v/v) β-mercaptoethanol, bromophenol blå 0,2% w/v]. Indlæse protein svarende til 300.000 celler for hver prøve på 4-12% bis-Tris acrylamid geler.
- Kontrol varigheden af elektroforese migration tillade hver protein prøve at være opdelt i 6 gel bands som eksemplificeret i figur 3.
- Løse gel med en fastsættelse løsning (30% ethanol + 7,5% eddikesyre i 20 min.), derefter tilføje Farvningsopløsningen (R-250 Coomassie blå for 45 min). Tilføj den destaining løsning (30% ethanol + 7.5% eddikesyre indtil bands vises) før udtagelse protein bands med en ren skalpel.
- Terning hver skåret band før indførelse i 500 µL rør. En ren glasoverfladen er berettiget til at undgå forurening med keratiner (5% SDS løsning i ionbyttet vand kan bruges til at rengøre overflader).
- Vaske gel skiver 3 gange i 200 µL af 25 mM ammoniumbicarbonat i 20 min. ved 37 ° C, efterfulgt af en vask i 25 mM ammoniumbicarbonat og acetonitril (50% v/v). Dehydrere gel stykkerne med 200 µL af 100% acetonitril i 10 min.
- Inkuber hver gel stykke med 10 mM DTT (dithiothreitol) i 25 mM ammoniumbicarbonat for 45 min ved 56 ° C (200 µL), efterfulgt af 55 mM iodoacetamide i 25 mM ammoniumbicarbonat (200 µL) i 35 min. i mørke ved RT.
- At stoppe alkylering, inkuberes hver gel stykke med 200 µL af 10 mM DTT i 25 mM ammoniumbicarbonat i 10 min på RT. Wash gel stykker i 200 µL af 25 mM ammoniumbicarbonat, så dehydrere med 200 µL af 100% acetonitril i 10 min.
- Fordøje proteiner natten over ved 37 ° C med Trypsin/Lys-C mix ifølge producentens anvisninger.
- Uddrag de resulterende peptider fra gel stykker ved at tilføje 50 μL af 50% acetonitril for 15 min, så 50 μL af 5% myresyre i 15 min., og endelig 50 μL 100% acetonitril i 15 min. Pool og tørre hver fraktion i lav-absorption rør til at begrænse adsorption af peptider og prøven tab. Gemme prøver på-80 ° C indtil videre analyse.
8. protein udvinding og i løsning fordøjelsen (protokol 2)
- Udføre celle lysis (2 x 106 celler) med 150 µL af den følgende lysisbuffer:
- 7 M urinstof, 2 M thiourinstof, 40 mM Tris og 4% CHAPS, suppleret med proteasehæmmere (komplet mini, EDTA-fri protease hæmmer cocktail).
- Homogeniseres løsninger for 30 min på RT med en thermoshaker. Der centrifugeres ved 13,800 x g i 20 min. RT og holde supernatanten.
- Fjerne forurenende stoffer med en 2D oprydning kit:
- Sættet indeholder fældningsmiddel løsning, co fældningsmiddel løsning, wash buffer og vask tilsætningsstof.
- Tilsæt 300 µL af fældningsmiddel løsning og bland godt. Der inkuberes i isbad i 15 min. tilføje 300 µL af co fældningsmiddel løsning. Der centrifugeres rør (mindst) på 12.000 x g i 5 min. En lille pellet skal være synlige. Gå hurtigt til det næste trin at undgå ophvirvling eller spredning af toerstoffet. Fjern supernatanten uden at forstyrre pelleten.
- Der centrifugeres rør igen med den fælles landbrugspolitik-hængsel og pellet vender udad for at bringe enhver resterende væske i bunden af røret. En kort puls er tilstrækkelig. Der bør være nogen synlige flydende tilbage i rørene.
- Uden at forstyrre pelleten, tilføje 40 µL af co fældningsmiddel løsning. Lad tube sidde på is i 5 min. der centrifugeres i 5 min, derefter fjerne og kassere vask. Tilsæt 25 µL afioniseret vand. Vortex hvert rør for 5-10 s. Pellet bør sprede men ikke opløses i vandet.
- Tilsæt 1 mL af wash buffer (pre kølet i mindst 1 time ved-20 ° C) og 5 µL af vask tilsætningsstof. Vortex indtil pellet er fuldt spredt. Inkuber rør ved-20 ° C i mindst 30 min. Vortex for 20-30 s hver 10 min
Bemærk: Rør kan opbevares ved-20 ° C i op til 1 uge med minimal protein nedbrydning eller modifikation. - Der centrifugeres rør (mindst) på 12.000 × g for 5 min. forsigtigt fjerne og supernatanten. En hvid pellet skal være synlige. Tillad pellet til airdry for ikke mere end 5 min (hvis pelleten er for tør, vil det være vanskeligt at resuspend).
- Resuspenderes protein i 300 µL af 8 M urinstof og 0,1 M ammoniumbicarbonat. Vortex kraftigt i 1 min. bestemme proteinkoncentration ved hjælp af en kolorimetrisk assay.
9. i-løsning fordøjelsen (protokol 2)
- Reducere disulfidbroer ved at tilføje 5.1 µL af en 700 mM DTT vandig opløsning (slutkoncentration 12,5 mM) til de resuspenderede proteiner fra trin 8,4 og inkuberes ved 37 ° C i 30 min med en thermoshaker. Alkylatbenzin cystein restkoncentrationer ved at tilføje 20,3 µL af en 700 mM iodoacetamide vandig opløsning (slutkoncentration 40 mM) og inkubere ved 25° C i 30 min. i mørke med en thermoshaker.
- Tilføje 990 µL af 0,1 M ammoniumbicarbonat til prøven. Tilføje et tilsvarende volumen af Trypsin/Lys-C mix (enzym: substrat forholdet 1: 100 w/w). Der inkuberes ved 37° C natten over med en thermoshaker.
10. clean-up patron (protokol 2)
- Våd en patron med 1 kolonne-volumen (1 mL) af methanol. Rense patronen med 1 kolonne-volumen (1 mL) af 80% acetonitril/HPLC-grade vand og kassér gennemstrømnings. Reagensglasset patron med 4 kolonne-diskenheder (4 mL) 0,1% myresyre/HPLC-grade vand og kassér gennemstrømnings.
- Surt prøver med 90 µL af 10% myresyre eller vand til pH 2-3 (kontrollere pH med et pH indikator). Indlæse de syrnet prøver og indsamle gennemstrømnings. Genindlæse den gennemstrømning (der indeholder ikke-beholdt peptider). Vask patron med 6 kolonne-volumen (6 mL) 0,1% myresyre/HPLC-grade vand.
- Elueres peptider fra patronen med 1 kolonne-diskenheder (1 mL) 0,1% myresyre acid/50% acetonitril/HPLC-grade vand. Overførsel til en 1,5 mL microcentrifuge tube. Koncentrere sig prøven ved hjælp af et vakuum koncentrator (150 x g, vakuum på 160 mBar).
11. fraktionering af isoelektrisk fokusering (protokol 2)
Bemærk: Peptider er adskilt efter deres isoelektriske punkter ved hjælp af en off-gel fraktioneringskolonne på en 13 cm stribe dækker en pH spænder fra 3 til 10. Vi brugte følgende protokol leverandøren (opsummeret nedenfor):
- Forberede følgende løsninger: løsning en (600 µL af glycerol løsning, 60 µL OFFGEL buffer, 4.34 mL i ultrarent vand) og løsning B (1.776 mL af opløsning A) og 444 µL ultrarent vand.
- Samle IPG-strimler, rammer og elektroder ifølge producentens anvisninger.
- Resuspend prøve med 1,8 mL af opløsning B. tilføje 40 µL opløsning B i hver brønd. Indlæse 150 µL af prøven i hver brønd.
- Vælg standardmetoden for peptider: OG12PE00 (OFFGEL standardmetoden for peptider til brug med en 3100 OFFGEL lav Res Kit, pH 3-10, 12-godt rammer. Vent, indtil denne metode har været afsluttet (~ 20 h). Indsamle fraktioner i korrekt mærket rør.
12. clean-up Harvard apparater kolonne omvendt C18 Post-IEF (protokol 2)
- Gradvist tilføje et par μL ad gangen på 1% TFA i afioniseret vand til hver fraktion til at forsure prøven. Kontrol bruge pH papir, at pH er omkring 3 eller nedenfor.
- Forberede følgende løsninger: løsning 1 (5 mL acetonitril, 10 µL af myresyre, 4,99 mL i ultrarent vand) og løsning 2 (0,5 mL acetonitril, 10 µL af myresyre, 9.49 mL i ultrarent vand).
- Pre våd kolonnen spin med 150 µL opløsning 1. Der centrifugeres i 90 s på 750 x g og kassér gennemstrømnings-. Vaske kolonnen spin med 150 μl opløsning 2. Der centrifugeres i 90 s på 750 x g og kassér gennemstrømnings-.
- Passere brøkdel gennem kolonnen. Der centrifugeres i 90 s på 750 x g og kassér gennemstrømnings-. Vaskes med 150 μl opløsning 2. Der centrifugeres i 90 s på 750 x g og kassér gennemstrømnings-.
- Elueres brøkdel med 50 μL af løsning 1. Der centrifugeres i 90 s på 750 x g. Gentag disse trin igen.
- Tør-fraktion ved hjælp af et vakuum koncentrator (150 x g, vakuum 160 mBar) og opbevares ved-80 ° C
13. analyse af proteom Data og bioinformatik18
- Analysere data opnået ved en nano-LC-MS/MS mass spectrometer bruger kvantificering software som MaxQuant (version 1.5.2.8) og Andromeda søgemaskine.
- Indstille falsk opdagelse sats (FDR) til 1% for både proteiner og peptider og en mindstelængde på 7 aminosyrer. Indstille enzym specificitet som C-terminal til Arg og Lys. Tillad 2 ubesvarede splittelser på prolin obligationer. Vælg carbamidomethylation af cystein som en fast ændring og N-terminale protein acetylation og methionin oxidation som variable ændringer.
- Yderligere analysere data med statistisk analyse software. Udfør en funktionel berigelse analyse ved hjælp af FunRich software (www.funrich.org/). Udføre en gen ontologi berigelse analyse ved hjælp af DAVID software (https://david.ncifcrf.gov/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Startende fra perifert blod mononukleære celler (PBMC) fremstillet ved differentieret centrifugering, protokollen tillader opnåelse af en population af CD14+ monocytter med en vurderet renhed af mere end 98% ved flowcytometri (figur 1). Disse monocytter er sekundært differentieret mod forskellige polariseringer (figur 2). Når en fraktionering på gel er valgt, migration på SDS-page geler er tilpasset til at få antallet af ønskede bands og bandene er skåret ud (figur 3). Fordøjelsen er sekundært udføres i de skåret bands af gelen, så peptider er udvundet. Peptider er analyseret ved hjælp af en nano-LC (liquid chromatography)-MS/MS masse spectrometer. MS/MS spectra give identitet af forskellige proteiner ifølge anmærkning af spektre opnået for kendte peptider (figur 4A). Kvantificering af overfloden af en protein beregnes derefter i forbindelse med mængden af identificerede peptider kommer fra protein ved hjælp af offentliggjorte software og databaser15,16. Denne protokol med-gel fordøjelse giver ca 4000 identificerede proteiner, og det dynamiske område er blevet fundet for at dække 5 logaritmisk skalaenheder (figur 4B). Analyse af det differentierede udtryk af disse identificerede proteiner kan bruges til at bestemme klynger af forskellige polariseringer under forskellige ilt miljøer.
Med denne metode, kan vi også genkende klynger af proteiner, der er op-regulerede når de udsættes for en koncentration af lav ilt på 3% (figur 5, tabel 1). For at vurdere effektiviteten i fordøjelsen, der er ikke muligt, når en i-gel-protokollen bruges, foreslog vi en i-løsning fordøjelsen metode, der er blevet tilpasset til menneskelige makrofager (figur 6A). Med denne metode, kan vi nemt få (efter-løsning fordøjelsen) identifikation af 3600 proteiner uden fraktionering, hvilket betyder at fraktionering med IEF vil fornuftigt øge dette nummer (fig. 6B).
Figur 1: Flow flowcytometri analyse af CD14 udtryk for PBMC før sortering (venstre panel) og efter sortering (højre panel) viser den opnåede renhed efter magnetiske perler udvalg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: fase-kontrast billeder af differentierede menneskelige makrofager viser heterogenitet af de opnåede morfologier for to forskellige polariseringer. Skalalinjen repræsenterer 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: billeddannelse af Coomassie blå farvet gel viser de forskellige bands, der vil blive skåret ud [her, 6 bands i M(Ø) makrofager] for 5 polariseringer af makrofager udsat for en lav ilt miljø. IC = immunkomplekser, DXM = dexamethason. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: MS/MS spektrum og kvantificering. (A) et eksempel på en MS/MS-spektrum. Vist her er et peptid fundet på m/z 597.29 på MS-spektrum med en elektrisk ladning af + 2 CID (kollision-induceret dissociation) spektrum. Tilsvarende sekvensen blev bestemt ud fra dette spektrum som Val-Ala-Glu-Leu-Glu-Asn-Ser-Glu-Phe-Arg fra protein CD58. B rang beordrede etiket-fri kvantificering for hver af de identificerede proteiner (log10 LFQ). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: zonekort repræsenterer den hierarkiske gruppering af alle polarisering hedder ved hjælp af varierende udtrykte proteiner. Analysen viser en klynge af proteiner overexpressed i alle polariseringer i 3% O2 tilstand (røde rektangel). Farveskalaen repræsenterer z-score (log2 intensitet). Hver række er et protein, og hver kolonne er en prøve. Dette tal stammer fra en tidligere publikation14. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: SDS-PAGE og kromatogrammet. (A) sølv-farvede SDS-PAGE geler med protein fra celle lysis og efter-løsning fordøjelsen viser manglen på nedbrydning under lysis og effektiviteten i fordøjelsen. B kromatogrammet fremstillet efter-løsning fordøjelsen uden fraktionering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Klynge | proteinID | Protein navne | Gen navne | Peptider | Razor + unikke peptider | Unikke peptider | Protein-id'er | ||
| Rød | P0DMV9 | Heat shock 70 kDa protein 1B | HSPA1A | 40 | 37 | 4 | P0DMV9; P0DMV8; A8K5I0; Q59EJ3; B4DNT8; B4DWK5; B4DFN9; B4DI39; B4E1S9; B4DVU9; V9GZ37; B3KTT5; B4DNX1; B4E1T6; B4DNV4; Q9UQC1 | ||
| Rød | P54709 | Natrium/kalium-transporterer ATPase subunit beta-3 | ATP1B3 | 8 | 8 | 8 | P54709; D3DNF9; C9JXZ1; C9JA36; H7C547; F8WBY4; Q58I18 | ||
| Rød | O00462 | Beta-mannosidase | MANBA | 14 | 13 | 13 | O00462; A7LFP5; A8K6D3; E9PFW2; B4DT18; Q59EG5 | ||
| Rød | Q8NAS7 | NADH dehydrogenase [ubikinon] jern-svovl protein 7, mitokondrie | NDUFS7 | 4 | 4 | 4 | Q8NAS7; Q6ZQU6; F5H5N1; B7Z1U1; A8K0V6; Q7LD69; F5GXJ1; O75251; B7Z4P1; Q9H3K5; A0A087WXF6; A0A087WTI3; Q6ZS38 | ||
| Rød | Q8WWQ0 | PH-interagere protein | PHIP | 5 | 5 | 4 | Q8WWQ0; Q9NWP3 | ||
| Rød | E5RHK8 | Dynamin-3 | DNM3 | 11 | 2 | 2 | E5RHK8; Q9UQ16; B3KPF2; E5RIK2 | ||
| Rød | A0A024QZ64 | Fruktose-bisfosfat aldolase C | ALDOC | 18 | 14 | 7 | A0A024QZ64; P09972; B7Z1Y2; B7Z3K9; B7Z1N6; B7Z3K7; A8MVZ9; J3KSV6; J3QKP5; B7Z1L5; C9J8F3; K7EKH5; J3QKK1; B7Z1H6 | ||
| Rød | O75489 | NADH dehydrogenase [ubikinon] jern-svovl protein 3, mitokondrie | NDUFS3 | 12 | 12 | 12 | O75489; Q9UF24; Q53FM7; E9PS48; E9PKL8; G3V194 | ||
| Rød | P21912 | Succinat dehydrogenase [ubikinon] jern-svovl underenheden, mitokondrie | SDHB | 11 | 11 | 11 | P21912; A0A087WXX8; A0A087WWT1 | ||
| Rød | A0A024R1Y7 | GH3 domæne indeholdende protein | LGP1; GHDC | 7 | 7 | 7 | A0A024R1Y7; Q8N2G8; B3KVB0; K7ESN3; K7EJT7; K7EQ41; K7EL54 | ||
| Rød | E5KRK5 | NADH-ubikinon oxidoreductase 75 kDa underenheden, mitokondrie | NDUFS1 | 29 | 29 | 29 | E5KRK5; P28331; B4DJ81; Q9P1A0; C9JPQ5; F8WDL5 | ||
| Rød | A0A024QZ30 | Succinat dehydrogenase [ubikinon] flavoprotein underenheden, mitokondrie | SDHA | 17 | 17 | 17 | A0A024QZ30; P31040; D6RFM5; B3KT34; A0A087X1I3; Q0QF12; B4DYN5; B3KYA5; B4DNB2; H0Y8X1; B7Z6J5 | ||
| Rød | A0A024R2F9 | Transmembrane protein 43 | TMEM43 | 16 | 16 | 16 | A0A024R2F9; Q9BTV4; Q8TEP9; V9GY05 | ||
| Rød | A0A024R5K3 | NADH dehydrogenase [ubikinon] jern-svovl protein 8, mitokondrie | NDUFS8 | 5 | 5 | 5 | A0A024R5K3; E9PPW7; O00217; E9PN51; F8W9K7; E9PKH6; B4DYI3; Q53G17 | ||
| Rød | O76003 | Glutaredoxin-3 | GLRX3 | 13 | 13 | 13 | O76003 | ||
| Rød | Q1HBJ4 | Mitogen-aktiveret protein kinase; Mitogen-aktiveret protein kinase 1 | MAPK1 | 26 | 26 | 21 | Q1HBJ4; P28482; B4DHN0; Q499G7; K7ELV1; K7EN18; B4E104; P31152; Q16659 | ||
| Rød | Q13151 | Heterogene nukleare ribonucleoprotein A0 | HNRNPA0 | 8 | 8 | 8 | Q13151 | ||
| Rød | V9HWN7 | Fruktose-bisfosfat aldolase A | ALDOA | 36 | 36 | 14 | V9HWN7; P04075; J3KPS3; H3BQN4; H3BUH7; H3BR04; H3BMQ8; H3BU78; H3BR68; A4UCS9; A4UCT0 | ||
| Rød | B4DVJ0 | Glucose-6-fosfat isomerase | GPI | 32 | 32 | 23 | B4DVJ0; P06744; B4DE36; A0A0A0MTS2; K7EQ48; K7EP41; K7EPY4; K7ELR7; K7ERC6; K7ENA0; K7ESF4; K7EIL4; K7ERK8; Q59F85 | ||
| Rød | V9HWB9 | L-lactat dehydrogenase; L-lactat dehydrogenase en kæde | LDHA | 36 | 36 | 34 | V9HWB9; P00338; B4DJI1; F5GXY2; F5GYU2; F5GXH2; F5H5J4; F5H6W8; F5GZQ4; F5H8H6; F5GXC7; F5GWW2; F5GXU1; A0A087WUM2; Q96L19; Q6ZMR3 | ||
| Rød | P13674 | Prolyl 4-hydroxylase subunit alfa-1 | P4HA1 | 26 | 26 | 26 | P13674; Q5VSQ6 | ||
| Rød | Q6FHV6 | Gamma-enolase; Enolase | ENO2 | 18 | 15 | 14 | Q6FHV6; P09104; A8K3B0; F5H0C8; F5H1C3; U3KQP4; U3KQQ1; Q9NPL4 | ||
| Rød | Q99798 | Aconitate hydratase, mitokondrie | ACO2 | 40 | 40 | 40 | Q99798; B4DZ08; B2RBW5; A2A274; B4DJW1; B4DLY4; Q71UF1; B4DEC3; B4DW08; O75944 | ||
| Rød | P17858 | ATP-afhængige 6-phosphofructokinase, leveren type | PFKL | 32 | 29 | 28 | P17858; Q7L2M7; Q9BSP4; B3KNQ7; B4E108; Q59GI2; F8WEU2; Q7Z3R9; Q6MZK4 | ||
| Rød | A0A024R872 | Niban-lignende protein 1 | FAM129B | 32 | 32 | 32 | A0A024R872; Q96TA1; Q9H8K1; Q2YD88; Q9H6L6 | ||
| Rød | A0A024RC61 | Aminopeptidase N | ANPEP | 58 | 58 | 25 | A0A024RC61; P15144; Q59E93; B4DV63; B4DP01; B4DP96; H0YKT6; H0YLZ8; Q71E46; H0YMC1; Q8IVL7 | ||
| Rød | V9HWF4 | Fosfoglycerat kinase; Fosfoglycerat kinase 1 | PGK1 | 41 | 41 | 35 | V9HWF4; P00558; B4E1H9; B4DHM5; B4DHB3; B4DWQ3; Q16444 | ||
| Rød | Q12882 | Dihydropyrimidine dehydrogenase [NADP(+)] | DPYD | 44 | 44 | 44 | Q12882; B4DML1 | ||
| Rød | B4DEQ0 | Mitokondrie-elektron overførsel flavoprotein-ubikinon oxidoreductase | ETFDH | 9 | 9 | 9 | B4DEQ0; Q547S8; A7UNU5; Q16134; D6RAD5 | ||
| Rød | D9UAX9 | MHC klasse I antigener | HLA-B | 13 | 3 | 2 | D9UAX9 | ||
| Rød | V9HWK1 | Triosefosfatisomerase isomerase | TPI1 | 29 | 29 | 17 | V9HWK1; P60174; Q53HE2; B4DUI5; U3KPZ0; U3KQF3; U3KPS5 | ||
| Rød | Q96HE7 | ERO1-lignende protein alpha | ERO1L | 28 | 28 | 28 | Q96HE7; G3V3E6; G3V5B3; G3V2H0; G3V503; Q5TAE8; B2RD00; Q86YB8 | ||
| Rød | P14868 | Aspartat--tRNA ligase, cytoplasmatisk | DARS | 29 | 29 | 2 | P14868; Q53T60; Q53R85; H7BZ35; H7C278 | ||
| Rød | P36871 | Fosfoglukomutase-1 | PGM1 | 24 | 24 | 5 | P36871; B4DFP1; Q9H1D2 | ||
Tabel 1: Liste over udtrykte proteiner for menneskelige makrofager fælles for hver polarisering under lav ilt spænding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fordi proteomics er et kraftfuldt værktøj til at studere udtryk for forskellige proteiner fra en hel celle eller subcellulært segmenter, er optimering af celle lysis protokol og fordøjelse af proteiner blevet behandlet af en række undersøgelser. Der er tre vigtigste klasser af metoder, som omfatter i-gel fordøjelsen (fordøjelsen af proteiner i polyacrylamid gel matrix)17, fordøjelsen i løsning18 og filter-støttede prøve forberedelse19. Denne sidste metode først beskrevet som universelle, er blevet rapporteret at udstille lav reproducerbarhed og eventuelt tab af proteiner på filter20. I-gel fordøjelse er en robust metode, der kan være tidskrævende og ufordelagtige i at vurdere effektiviteten i fordøjelsen ikke er let, hvis det er muligt. I-løsning fordøjelsen tilbyder denne mulighed, men kræver rengøring af prøverne efter fordøjelse og IEF. Når disse to metoder sammenlignes mellem samme prøve, giver i løsning fordøjelse med IEF fraktionering protokol et højere antal identificerede proteiner (med det samme antal af fraktioner) end i-gel fordøjelsen21.
Trods denne fordel er det nødvendigt at overveje mulige protein nedbrydning under-løsning lysis på grund af intracellulære proteaser (især i myeloide celler). Det er også vigtigt at huske på, at disse teknikker er baseret på protein fordøjelse og kun i stand til at analysere proteiner præsenterer trypsin specifikke kavalergang websteder. Det er muligt at anvende en top-down proteom tilgang, der lindrer denne fordøjelsen begrænsning, men tilføjer data analyse trin og bioinformatik ressourcer22. Oploesning af proteiner fra forskellige cellulære rum kan også være vanskeligt at opnå, især fra plasma membraner, fører til en ukontrolleret prøvetagning af cellulære proteomet. For at fortsætte med en nano-LC-MS/MS massespektrometer analyse af prøverne, er det vigtigt at opnå en tilstrækkelig mængde af peptider, som kan afhænge af massespektrometer anvendes (normalt starter total protein bør være mindst 1 µg for en betingelse, og Det er underforstået for at øge dette antal afhænger af antallet af brøk, der anvendes med IEF). Denne betingelse kan være en ulempe hvis cellen befolkningen undersøgt er knappe, som adskiller proteom fra genomisk teknikker som forstærkning af råvaren er muligt.
Selv efter den skelsættende værker af rigere og kolleger23 og pakker og Fuehr24, er betydningen af ilt i cellekulturer blevet tilstrækkeligt anerkendt. Vi ved nu, at dyrkning af celler under lav ilt koncentrationer favoriserer vedhæftning, levetid og division. Det erkendes, at dette er af allerstørste betydning i stem cell research25. Det vigtigste tekniske spørgsmål til cellekulturer kontrolleret iltkoncentration betingelser er relateret til vedligeholdelse af den ønskede iltkoncentrationen under hele forsøget. Dette kræver præ-inkubation af alle medier til at forhindre frigivelse af opløst ilt og brug af hypoksiske arbejds stationer til at tillade manipulation af celler under lav ilt (forarbejdning kammer med handske boks) og forhindre forbigående exposition høj iltkoncentration betingelser .
Den beskrevne protokol blev brugt til at opnå de molekylære signaturer af forskellige polariseringer af humane monocyt-afledte makrofager og studere virkningerne af ilt graduering på disse underskrifter. Denne undersøgelse har givet indsigt på beskrivelsen af disse polariseringer og har afsløret nogle funktionelle konsekvenser. For eksempel, fandt vi, at mange proteiner involveret i efferocytosis var moduleres af en lav ilt miljø. Denne proteom tilgang, baseret på den beskrevne protokol, præsenterer mulighed for at udforske miljømæssige parametre ændre makrofag funktioner og hvordan disse signaler kan bruges til at designe nye terapeutiske metoder14.
Proteom fremgangsmåden i dette arbejde er et supplement til genomforskningsmetoder, der har været brugt i løbet af de seneste år med hensyn til menneskelige makrofag polarisering undersøgelser. Proteomics tilbyder fordel af protein kvantificering, som kan præsentere et helt andet udtryk end deres tilsvarende mRNAs på grund af posttranslationelle modifikationer og føre til opdagelsen af nye biomarkører. Trods denne fordel er proteom data normalt vanskelige at fortolke, delvis på grund af den høje følsomhed af massespektrometri, fører til meget komplekse MS spectra og falsk positive påvisning af peptider. For nylig, analyse software har opnået effektivitet for at forhindre dette. Selv om det er en skiftende situation, proteomics også står over for lavere reproducerbarhed end genomforskning26 og er forbundet med validering trin ved hjælp af andre teknikker (flowcytometri, immunoblotting) for at bekræfte kvantitative ændringer af protein udtrykket niveauer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
AM er finansieret af den unge gruppe Leader Program (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), af la Ligue Nationale contre le Cancer og la Fondation ARC pour la recherche sur le kræft. Vi takker Mariette Matondo fra massespektrometri for biologi platform (UTECHS MSBIO, Institut Pasteur, Paris). Vi takker Lauren Anderson for hendes læsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hypoxia Working Station | Oxford Optronix | Hypoxylab | |
| C6 Flow cytometer | BD | Accuri C6 | |
| Urea | Agilent Technologies | 5188-6435 | |
| Formic acid (FA) | ARISTAR | 450122M | |
| R-250 Coomassie blue | Biorad | 1,610,436 | |
| Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS) | Calbiochem | 437627 | |
| 2D clean-up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| RPMI 1640 medium, glutamax supplement | Gibco | 61870044 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X | Gibco | 11140-035 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column | Harvard Apparatus | 74-4601 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| NuPAGE Bis-Tris 4-12% | Life Technologies SAS | NP0321 BOX | |
| CD14 Microbeads human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| MACS separation column LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) | Miltenyi Biotec | 130-096-485 | |
| Interleukin 4 (IL4) | Miltenyi Biotec | 130-093-917 | |
| Interleukin 13 (IL13) | Miltenyi Biotec | 130-112-410 | |
| Interferon gamma (INFγ) | Miltenyi Biotec | 130-096-482 | |
| CD14-FITC (clone TÜK4) | Miltenyi Biotec | 130-080-701 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Pierce | 28904 | |
| Trypsin/Lys-C Mix | PROMEGA | V5073 | |
| Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Density Gradient Solution (Histopaque 1077) | Sigma Aldrich | 10771-100ML | |
| Accumax | Sigma Aldrich | A7089-100ML | |
| Human Serum from human male AB plasma (SAB) | Sigma Aldrich | H4522-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30% | Sigma Aldrich | A9576-50ML | |
| Trisma-base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | 49767 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 114405 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% | Sigma Aldrich | 5030 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34888 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | 57670 | |
| Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | |
| CHAPS | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Micro BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| 5 mL sterile plastic pipette | VWR | 612-1685 | |
| Thermomixer C Eppendorf | VWR | 460-0223 | |
| Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg | Waters | WAT036820 |
References
- Okabe, Y., Medzhitov, R. Tissue biology perspective on macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
- Murray, P. J. Macrophage Polarization. Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).
- Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation. Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).
- Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
- Xue, J., et al. Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).
- Csete, M. Oxygen in the cultivation of stem cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).
- Johansson, A., et al. Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).
- Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).
- Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line. PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).
- Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Court, M., et al. Toward a standardized urine proteome analysis methodology. Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).
- Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
- Liebler, D. C., Ham, A. -J. L. Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics. Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).
- Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis. Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells. Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
- Lengner, C. J., et al. Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations. Cell. 141 (5), 872-883 (2010).
- Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology. Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).
