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Biochemistry

एक कम ऑक्सीजन पर्यावरण के तहत मानव मैक्रोफेज ध्रुवीकरण का Proteomic विश्लेषण

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58727
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3
1Team Mechanobiology, Immunity and Cancer, Institute for Advanced Biosciences, INSERM U1209, CNRS UMR5309, 2Université Grenoble Alpes, 3Pôle Recherche, Centre Hospitalier Universitaire des Alpes

Summary

हम मानव मैक्रोफेज के proteomic हस्ताक्षर प्राप्त करने और मैक्रोफेज ध्रुवीकरण पर एक कम ऑक्सीजन पर्यावरण के प्रभाव के निर्धारण के लिए इस लागू करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं ।

Abstract

मैक्रोफेज जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं को ऊतक homeostasis के लिए संक्रामक रोगजनकों प्रतिक्रियाओं से लेकर शारीरिक कार्यों की एक संख्या में शामिल हैं । इन कोशिकाओं के विभिंन कार्यों उनके सक्रियण राज्यों से संबंधित हैं, जो भी ध्रुवीकरण कहा जाता है । इन विभिन्न ध्रुवीकरण का सटीक आणविक वर्णन मैक्रोफेज जीव विज्ञान के क्षेत्र में एक प्राथमिकता है । यह वर्तमान में स्वीकार किया है कि एक बहुआयामी दृष्टिकोण का वर्णन कैसे ध्रुवीकरण पर्यावरण संकेतों से नियंत्रित है आवश्यक है । इस रिपोर्ट में, हम मानव मैक्रोफेज में विभिन्न ध्रुवीकरण के proteomic हस्ताक्षर प्राप्त करने के लिए डिज़ाइन किए गए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं । इस प्रोटोकॉल में जेल fractionated और Lys सी/trypsin-डाइजेस्ट सेलुलर lysis सामग्री से प्राप्त मैक्रोफेज प्रोटीन अभिव्यक्ति की एक लेबल मुक्त ठहराव पर आधारित है । हम भी एक विकल्प के रूप में उपयोग करने के लिए में समाधान पाचन और isoelectric ध्यान केंद्रित भिन्नीकरण पर आधारित एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । क्योंकि ऑक्सीजन एकाग्रता ऊतकों में एक प्रासंगिक पर्यावरण पैरामीटर है, हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग कैसे वायुमंडलीय संरचना या एक कम ऑक्सीजन पर्यावरण मैक्रोफेज ध्रुवीकरण के वर्गीकरण को प्रभावित करता है का पता लगाने के लिए ।

Introduction

मैक्रोफेज जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं को संक्रामक रोगजनकों के लिए प्रतिक्रियाओं से ऊतक homeostasis को लेकर शारीरिक कार्यों की एक संख्या में शामिल हैं, अपोप्तोटिक कोशिकाओं को हटाने और extracellular मैट्रिक्स1के पुननिर्माण सहित । इन कोशिकाओं को एक मजबूत phenotypic प्लास्टिक2 कि एक बहुत संभव सक्रियण राज्यों, जो भी ध्रुवीकरण कहा जाता है में तब्दील द्वारा विशेषता है । इन विभिंन ध्रुवीकरण का सटीक आणविक वर्णन मैक्रोफेज जीव विज्ञान के क्षेत्र में एक प्राथमिकता है3। यह तथाकथित m1/m2 विरोधाभास का उपयोग कर इन ध्रुवीकरण को वर्गीकृत करने का प्रस्ताव किया गया है, जिसमें m1 समर्थक भड़काऊ का प्रतिनिधित्व करता है और m2 विरोधी भड़काऊ मैक्रोफेज का प्रतिनिधित्व करता है । यह मॉडल तीव्र संक्रमण, एलर्जी, और मोटापा4जैसे विभिन्न रोग स्थितियों में अच्छी तरह से फिट बैठता है । हालांकि, जीर्ण सूजन के ऊतकों और कैंसर में, यह प्रदर्शित किया गया है कि इस वर्गीकरण के लिए व्यापक phenotypic प्रदर्शनों कि मैक्रोफेज कुछ सेलुलर वातावरण में मौजूद5,6समझ में असमर्थ है, 7. वर्तमान आम सहमति है कि मैक्रोफेज ध्रुवीकरण बेहतर एक बहुआयामी मॉडल का उपयोग करने के लिए एकीकृत विशिष्ट microenvironmental संकेतों8वर्णित है । इस निष्कर्ष में मानव मैक्रोफेज के transcriptomic विश्लेषण के माध्यम से पुष्टि की गई है कि एम1/M2 मॉडल प्राप्त ध्रुवीकरण9का वर्णन करने में असक्षम है ।

प्रस्तुत अध्ययन में मानव मैक्रोफेज में विभिन्न ध्रुवीकरण के proteomic हस्ताक्षर प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करना है । हम विभिंन ऑक्सीजन के स्तर के वातावरण में मानव मैक्रोफेज अंतर करने के लिए और एक लेबल मुक्त ठहराव प्रदर्शन करने के लिए पूरे मैक्रोफेज proteome से पेप्टाइड्स प्राप्त करने के लिए कैसे का वर्णन । यह ठहराव विभिन्न प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना की अनुमति देता है । के रूप में स्टेम सेल पर अनुसंधान एक पर्यावरणीय कुंजी पैरामीटर10के रूप में ऑक्सीजन के महत्व से पता चला है, हम समझ कैसे इस ऊतक पैरामीटर मानव में मैक्रोफेज ध्रुवीकरण को प्रभावित कर सकते है की तलाश । ऑक्सीजन का आंशिक दबाव मानव शरीर में 3 से 20% (कुल वायुमंडलीय दबाव) की सीमा को पाया गया है, जहां 20% मोटे तौर पर क्या आमतौर पर एक सेल संस्कृति मशीन में इस्तेमाल किया जाता है (सटीक मूल्य के आसपास है १८.६% जबकि पानी की उपस्थिति लेने खाते में) ।

पिछले काम से पता चला है कि वायुकोशीय मध्य मैक्रोफेज से कार्यात्मक और दृष्टिकोण11 के रूपात्मक बिंदु से अलग है और यह कि इन मतभेदों को शायद आंशिक रूप से विभिंन ऑक्सीजन का स्तर है जो वे12उजागर कर रहे है के कारण हैं । इसके अलावा, अस्थि मज्जा-व्युत्पंन मैक्रोफेज बैक्टीरिया phagocytize करने के लिए एक वृद्धि की क्षमता दिखाने के लिए जब एक कम ऑक्सीजन पर्यावरण12से अवगत कराया । THP1-विभेदित मानव मैक्रोफेज१३के लिए विपरीत प्रभाव पाया गया है, लेकिन ये परिणाम इस विचार का समर्थन करते हैं कि ऑक्सीजन मैक्रोफेज बायोलॉजी का एक नियामक है और यह मानव मैक्रोफेज में आणविक स्तर पर इस भूमिका को स्पष्ट करने के लिए आवश्यक है. पिछले एक अध्ययन में, हम इन मुद्दों को हल करने के लिए एक प्रोटियोमिक् दृष्टिकोण लागू किया है । एक साथ प्रोटीन के हजारों के लिए अभिव्यक्ति के स्तर को मापने के द्वारा, हम ध्रुवीकरण पर ऑक्सीजन के प्रभाव पर प्रकाश डाला और नए आणविक मार्करों की एक सूची प्रदान की । हम भी कुछ मैक्रोफेज कार्यों के लिए इन निष्कर्षों से संबंधित करने में सक्षम थे । विशेष रूप से, हमने पाया है कि अपोप्तोटिक कोशिकाओं के phagocytosis की दर IL4 में वृद्धि हुई थी/IL13-ध्रुवीकरण मैक्रोफेज, जो ALOX15 के विनियमन से जुड़ा हुआ था के रूप में proteomic विश्लेषण14द्वारा प्रगट । वर्तमान अध्ययन में, हम इस तरह के एक विश्लेषण करने के लिए कैसे का वर्णन ।

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Protocol

मानव रक्त के नमूनों (LRSC) से स्वस्थ, de-पहचान दाताओं EFS (फ्रेंच राष्ट्रीय रक्त सेवा) से एक अधिकृत प्रोटोकॉल के भाग के रूप में प्राप्त किए गए (CODECOH डीसी-2018-3114) । रक्तदाताओं ने रक्त के उपयोग के लिए हस्ताक्षरित सहमति दे दी ।

1. मीडिया और बफर तैयारी

  1. मैक्रोफेज मीडियम को तैयार करें [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1x गैर-जरूरी अमीनो एसिड्स (NEAA)] और इसे ३७ डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें ।
  2. मैक्रोफेज मध्यम तैयार करें + 10% मानव सीरम अब प्लाज्मा (सब) से, यह फिल्टर (०.२२ µm फ़िल्टर), तो यह ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म (मैक्रोफेज मध्यम के रूप में संदर्भित + 10% इसके बाद सब).
  3. छंटाई बफर तैयार [1x फास्फेट खारा (पंजाब) + ०.५% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) + 2 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA)], यह फिल्टर (०.२२ µm फिल्टर), और 4 डिग्री सेल्सियस पर इसे बनाए रखने ।

2. Leukoreduction सिस्टम चैंबर (LRSC) से परिधीय रक्त Mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) का अलगाव

  1. घनत्व ढाल सेल जुदाई समाधान के 15 मिलीलीटर रखो ( सामग्री की तालिकादेखें) एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में तो यह कमरे के तापमान को गर्म कर सकते है (RT) LRSC प्राप्त करने से पहले ।
    नोट: घनत्व तापमान पर निर्भर करता है । इस उत्पाद को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है के रूप में, इस कदम अग्रिम में तो यह आरटी करने के लिए equilibrate कर सकते होना चाहिए ।
  2. एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में LRSC खाली, 1x पंजाब के ५० मिलीलीटर को जोड़ने के लिए, और मिश्रण । बहुत धीरे, घनत्व ढाल समाधान के 15 मिलीलीटर के शीर्ष पर कदम २.२ के दौरान तैयार मिश्रण के 25 मिलीलीटर जोड़ें २.१ कदम के दौरान गरम ।
    नोट: इस कदम के दौरान चरणों मिश्रण करने के लिए नहीं सावधान रहना । रक्त इस चरण के किसी भी अशांति के बिना घनत्व ढाल समाधान पर जोड़ा जाना चाहिए ।
  3. ७०० एक्स जी में 25 मिनट के लिए दोनों केंद्रापसारक ट्यूब ब्रेक के बिना केंद्रापसारक ।
    नोट: घनत्व ढाल केंद्रापसारक के अंत में, नीचे से शीर्ष पर परतें हैं: एरिथ्रोसाइट्स और गोली, घनत्व ढाल समाधान चरण, PBMCs की परत, और प्लाज्मा बनाने granulocytes ।
  4. एक प्लास्टिक के साथ, यह aspirating बिना प्लाज्मा चरण के माध्यम से पारित और एक नया ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में PBMC परत इकट्ठा । एक धुलाई कदम के रूप में PBMCs को 1x पंजाबियों के ५० मिलीलीटर तक जोड़ें और ३०० एक्स जी में 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक
  5. महाप्राण supernatant और मैक्रोफेज मध्यम के ४० मिलीलीटर में गोली resuspend ।

3. चुंबकीय लेबलिंग और CD14 के अलगाव+ कोशिकाओं (Monocytes)

  1. एक Malassez चैंबर में PBMCs गिनती । प्रयोग के संचालन के लिए आवश्यक PBMCs की राशि वापस लेने (आमतौर पर १०० के लिए ३०० x 106 कोशिकाओं), उंहें एक केंद्रापसारक ट्यूब में जगह है, और 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक पर ३०० x जी ।
  2. महाप्राण supernatant और ८० µ एल में गोली resuspend 107 PBMCs प्रति चरण १.३ के दौरान तैयार छंटाई बफर के l जोड़ें । µ CD14 के प्रति 107 microbeads में से 20 PBMCs l को मिलाएं । लगातार आंदोलन के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए अच्छी तरह से मिश्रण और गर्मी ।
  3. एक धुलाई कदम के रूप में 107 PBMCs प्रति छंटाई बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें और ३०० x जी महाप्राण पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक supernatant और 108 PBMCs प्रति बफर छंटाई के ५०० µ एल में गोली resuspend ।
  4. विभाजक के चुंबकीय क्षेत्र में एक कॉलम रखें । यह छंटाई बफर के 3 मिलीलीटर के साथ धोने के द्वारा स्तंभ तैयार करते हैं ।
  5. स्तंभ पर कक्ष निलंबन लागू करें । स्तंभ पृथक किए जाने वाले कक्षों की संख्या पर निर्भर करता है (यहाँ, LS स्तंभों को 109 PBMCs तक उपयोग किया जाता है). प्रवाह-माध्यम से अनलेबल्ड कक्षों को संग्रहीत करें ।
    नोट: इस कदम पर शुरू, सभी ट्यूबों (नकारात्मक और सकारात्मक चयन) प्रवाह cytometry द्वारा अलग कदम की जांच के लिए बाद में रखा जाता है ।
  6. छंटाई बफर के 3 x 3 मिलीलीटर के साथ कॉलम धो लें । ३.१२ कदम से एक ही ट्यूब के माध्यम से गुजर unlabel्ड कोशिकाओं को इकट्ठा । सॉर्टिंग बफ़र जोड़कर, अपने स्तंभ को सुखाने के लिए नहीं सावधान रहें द्वारा धुलाई चरण निष्पादित करें । कॉलम के तहत एक संग्रह ट्यूब रखें और इसे विभाजक से निकालें ।
  7. पिपेट कॉलम में छंटाई बफर के 5 मिलीलीटर । तुरंत मजबूती से कॉलम में गोताख़ोर धक्का द्वारा चुंबकीय लेबल कोशिकाओं को फ्लश । CD14+ कोशिकाओं की शुद्धता बढ़ाने के लिए, eluted अंश एक दूसरे स्तंभ पर समृद्ध है ।
  8. एक नए स्तंभ के साथ ३.७ करने के लिए ३.४ चरणों को दोहराएँ ।

4. Monocytes की चढ़ाना

  1. एक Malassez चैंबर में monocytes गिनती । प्रवाह cytometry द्वारा CD14+ कोशिकाओं की शुद्धता की जाँच करें । प्रयोग के लिए आवश्यक monocytes की राशि वापस लेने और उंहें एक केंद्रापसारक ट्यूब में जगह है ।
  2. ३०० x जी महाप्राण पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक supernatant और मैक्रोफेज माध्यम में monocyte गोली resuspend । प्लेट कोशिकाओं और उंहें 1 घंटे के लिए ५० मिनट के लिए बसने महाप्राण मध्यम और यह मैक्रोफेज मध्यम के साथ बदलें + 10% सब + 25 एनजी/एमएल मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक फैक्टर (एम सीएसएफ) विभेद पैदा करने के लिए ।

5.6 दिन में मैक्रोफेज का ध्रुवीकरण

  1. यम महाप्राण । यह मैक्रोफेज मध्यम के साथ बदलें + 10% विभिन्न उत्तेजनाओं के साथ सब । उदाहरण के लिए, एम1 ध्रुवीकरण को प्राप्त करने के लिए 10 एनजी/एमएल इंटरफेरॉन गामा (INFγ) + 1 एनजी/एमएल lipopolysaccharide (एलपीएस) जोड़ें या 20 एनजी/एमएल interleukin 4 (IL4) + 20 एनजी/एमएल interleukin 13 (IL13) M2 ध्रुवीकरण के लिए ।
    नोट: उत्तेजना अंय परीक्षणों के लिए आगे बढ़ने से पहले 24 और ४८ ज के बीच प्रदर्शन किया जा सकता है ।
  2. फसल एक अलग समाधान या एक सेल खुरचनी का उपयोग कर कोशिकाओं ।

6. कम ऑक्सीजन की स्थिति के तहत सेल संस्कृति

  1. चरण 4 से प्रारंभ कर रहा है, monocytes को बनाए रखने और फिर hypoxic स्थिति विश्लेषण करने के लिए एक ऑक्सीजन-नियंत्रित वातावरण में मैक्रोफेज । प्रयोग के दौरान वांछित ऑक्सीजन आंशिक दबाव के तहत कोशिकाओं को बनाए रखने के क्रम में एक हाइपोक्सिया काम स्टेशन का उपयोग करें ।
    नोट: कम ऑक्सीजन दबाव के तहत काम करते समय, यह सभी मीडिया और स्टेशन के तहत धोने बफ़र्स तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है और पर्याप्त तरल में सही आंशिक दबाव प्राप्त करने के लिए प्रतीक्षा करें । उदाहरण के लिए, एक ६० mm पेट्री डिश में पंजाब के 10 मिलीलीटर मोटे तौर पर 2 एच के लिए 25 mmHg तक पहुंचने के लिए की आवश्यकता है ओ2 आंशिक वायुमंडलीय दबाव से शुरू दबाव (जैसा कि हम मापा है यह एक फाइबर ऑप्टिक ऑक्सीजन सेंसर का उपयोग) । कई hypoxic स्टेशनों या मशीन में, ऑक्सीजन दबाव वायुमंडलीय दबाव के एक प्रतिशत के रूप में स्थापित किया गया है । सटीक माप आवश्यक हैं, तो यह सीधे mmHg में ऑक्सीजन दबाव सेट करने के लिए अधिकृत एक स्टेशन का उपयोग करने के लिए बेहतर है.

7. Lysis और जेल पाचन (प्रोटोकॉल 1)

नोट: इस और निंनलिखित वर्गों में, दो प्रोटोकॉल पेप्टाइड्स प्राप्त करने के लिए और नियंत्रण रेखा-ms/ प्रोटोकॉल 1 का वर्णन करता है कक्ष lysis और में-जेल भिन्नीकरण और पाचन, और प्रोटोकॉल 2 का वर्णन करता है-समाधान कक्ष में समाधान पाचन और भिन्नीकरण एक isoelectric ध्यान केंद्रित विधि का उपयोग कर के बाद lysis.

  1. Laemmli बफ़र में कक्ष lysis निष्पादित करें [२३४ mM Tris-HCL (pH ६.८), ७.५% एसडीएस, ३७% ग्लिसरॉल, ३३.३% (v/v) β-mercaptoethanol, bromophenol blue ०.२% w/ 4-12% बीआईएस-Tris acrylamide जैल पर प्रत्येक नमूने के लिए ३००,००० कोशिकाओं के प्रोटीन के बराबर लोड ।
  2. प्रत्येक प्रोटीन नमूने 6 जेल बैंड में उदाहरण के रूप में चित्र 3में विभाजित करने के लिए अनुमति देने के लिए electrophoretic माइग्रेशन की अवधि को नियंत्रित करें ।
  3. एक फिक्सिंग समाधान के साथ जेल फिक्स (20 मिनट के लिए 30% इथेनॉल + ७.५% एसिटिक एसिड), तो धुंधला समाधान जोड़ने (R-२५० Coomassie नीले ४५ मिनट के लिए) । धुंधलाना समाधान जोड़ें (30% इथेनॉल + ७.५% एसिटिक जब तक बैंड दिखाई) एक स्वच्छ स्केलपेल के साथ प्रोटीन बैंड उत्पाद बनाने से पहले ।
  4. ५०० µ एल ट्यूबों में परिचय से पहले प्रत्येक उत्पाद के बैंड पासा । एक साफ गिलास सतह keratins के साथ संदूषण से बचने के लिए वारंट है (5% एसडीएस समाधान में पानी की सतहों को साफ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है) ।
  5. जेल स्लाइसें धो 25 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट के २०० µ एल में 3 बार ३७ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए, 25 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट और acetonitrile में एक धोने के बाद (५०% v/ 10 मिनट के लिए १००% acetonitrile के २०० µ एल के साथ जेल टुकड़े निर्जलीकरण ।
  6. ४५ मिनट के लिए ५६ डिग्री सेल्सियस (२०० µ एल) में 10 मिमी डीटीटी (dithiothreitol) के साथ प्रत्येक जेल टुकड़ा मशीन, 25 मिमी अमोनियम iodoacetamide (२०० बिकारबोनिट एल) में ५५ mm µ द्वारा पीछा पर अंधेरे में आर टी में ३५ मिनट के लिए ।
  7. alkylation रोकने के लिए, २०० µ एल के साथ प्रत्येक जेल टुकड़ा में 10 मिमी डीटीटी 25 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट में 10 मिनट के लिए RT. धो जेल टुकड़ों में २०० µ एल के 25 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट, तो 10 मिनट के लिए १००% µ के २०० acetonitrile एल के साथ निर्जलीकरण ।
  8. निर्माता के निर्देशों के अनुसार Trypsin/Lys-सी मिक्स के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात प्रोटीन को पचाने में ।
  9. 15 मिनट के लिए ५०% acetonitrile की ५० μL जोड़कर जेल टुकड़े से परिणामी पेप्टाइड्स निकालें, फिर 15 मिनट के लिए 5% फार्मिक एसिड की ५० μL, और अंत में, 15 मिनट के लिए १००% acetonitrile के ५० μL. पूल और कम अवशोषण ट्यूबों में प्रत्येक अंश सूखी पेप्टाइड्स की सोखना सीमा के लिए और नमूना हानि । नमूनों की दुकान पर-८० ° c आगे विश्लेषण तक ।

8. प्रोटीन निष्कर्षण और समाधान पाचन में (2 प्रोटोकॉल)

  1. कक्ष lysis (2 x 106 कक्षों) १५० µ l के साथ निम्न lysis बफ़र के साथ निष्पादित करें:
    1. 7 एम यूरिया, 2 एम thiourea, ४० mM Tris, और 4% लोग, को छेड़ने वाले अवरोधकों के साथ पूरक (पूरा मिनी, EDTA-मुक्त छेड़ने अवरोधक कॉकटेल) ।
  2. Homogenize एक thermoshaker के साथ आरटी में 30 मिनट के लिए समाधान । 20 मिनट आरटी के लिए १३,८०० x g पर केंद्रापसारक और supernatant रखो ।
  3. एक 2d साफ-अप किट के साथ दूषित पदार्थों को निकालें:
    1. किट precipitant समाधान, co-precipitant समाधान, धो बफर, और योजक additive शामिल हैं ।
    2. जोड़ें precipitant समाधान के ३०० µ एल और अच्छी तरह से मिश्रण । 15 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन जोड़ें ३०० µ एल के सह precipitant समाधान । ट्यूबों के केंद्रापसारक (कम) 5 मिनट के लिए १२,००० x g पर । एक छोटी सी गोली दिखाई जानी चाहिए । अगले कदम के लिए तेजी से निलंबन या गोली के फैलाव से बचने के लिए आगे बढ़ें । गोली परेशान बिना supernatant निकालें ।
    3. ट्यूब के साथ फिर से ऊपर टोपी-काज और जावक का सामना करना पड़ रहा गोली के साथ ट्यूबों के नीचे करने के लिए किसी भी शेष तरल लाने के लिए । एक संक्षिप्त नाड़ी पर्याप्त है । ट्यूबों में कोई दिखाई तरल शेष होना चाहिए ।
    4. गोली परेशान बिना, सह precipitant समाधान के ४० µ एल जोड़ें । ट्यूब 5 मिनट के लिए 5 min. केंद्रापसारक के लिए बर्फ पर बैठते हैं, तो निकालें और धो त्यागें । डी-जल के 25 µ एल जोड़ें । भंवर प्रत्येक ट्यूब के लिए 5-10 s गोली फैलाने चाहिए लेकिन पानी में घुल नहीं.
    5. धोने बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें (पूर्व ठंडा कम 1 ज पर-20 डिग्री सेल्सियस के लिए) और धो additive के 5 µ एल । भंवर जब तक गोली पूरी तरह से फैलाया है । पर ट्यूब-20 ° c के लिए ंयूनतम 30 min. भंवर के लिए 20-30 हर 10 मिनट s मशीन
      नोट: ट्यूबों कम से कम प्रोटीन क्षरण या संशोधन के साथ 1 सप्ताह के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
    6. ट्यूबों के केंद्रापसारक (कम) १२,००० × g पर 5 मिनट के लिए. ध्यान से निकालें और supernatant को त्यागें । एक सफेद गोली दिखाई जानी चाहिए । कोई अधिक से अधिक 5 मिनट के लिए airdry करने के लिए गोली की अनुमति दें (यदि गोली भी सूखी है, यह resuspend मुश्किल हो जाएगा) ।
  4. 8 एम यूरिया और ०.१ मीटर अमोनियम बिकारबोनिट के ३०० µ एल में प्रोटीन गोली resuspend । भंवर 1 मिनट के लिए दृढ़ता से एक वर्णमिति परख का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण ।

9. में समाधान पाचन (प्रोटोकॉल 2)

  1. एक ७०० मिमी डीटीटी जलीय समाधान (अंतिम एकाग्रता १२.५ मिमी) के ५.१ µ एल जोड़कर डाइसल्फ़ाइड पुलों को कम करने के लिए कदम ८.४ से resuspend प्रोटीन और एक thermoshaker के साथ 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन । Alkylate एक ७०० मिमी iodoacetamide जलीय समाधान (अंतिम एकाग्रता ४० मिमी) के २०.३ µ एल जोड़कर cysteine अवशेषों और एक thermoshaker के साथ अंधेरे में 30 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर मशीनिंग ।
  2. ०.१ मीटर अमोनियम बिकारबोनिट के नमूने के ९९० µ l को जोड़ें । Trypsin/Lys-C मिश्रण (एंजाइम: सब्सट्रेट अनुपात 1:100 w/डब्ल्यू) के एक इसी मात्रा जोड़ें । 37 ° c एक thermoshaker के साथ रातोंरात में मशीन ।

10. साफ-कारतूस (प्रोटोकॉल 2)

  1. गीला 1 कॉलम के साथ एक कारतूस-मेथनॉल की मात्रा (1 मिलीलीटर) । 1 कॉलम-८०% acetonitrile/HPLC ग्रेड पानी की मात्रा (1 मिलीलीटर) के साथ कारतूस साफ और प्रवाह के माध्यम से त्यागें । Equilibrate 4 कॉलम-खंड के साथ कारतूस ०.१% फार्म का एसिड/HPLC ग्रेड पानी की (4 मिलीलीटर) और प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
  2. ९० µ एल के साथ Acidify नमूने 10% फार्मिक एसिड या पीएच के लिए पानी 2-3 (एक पीएच संकेतक के साथ पीएच की जाँच करें). acidified नमूने लोड और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा । (न बनाए गए पेप्टाइड्स युक्त) प्रवाह-थ्रू को पुनः लोड करें । 6 कॉलम-०.१% फार्मिक एसिड की मात्रा (6 मिलीलीटर) के साथ कारतूस धो/HPLC ग्रेड पानी ।
  3. 1 कॉलम के साथ कारतूस से Elute पेप्टाइड्स-खंड (1 एमएल) के ०.१% फार्मिक एसिड/50% acetonitrile/HPLC-ग्रेड पानी । एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण । एक निर्वात का उपयोग कर नमूना ध्यान केंद्रित (१५० एक्स जी, १६० mBar पर निर्वात).

11. Isoelectric फोकस (प्रोटोकॉल 2) द्वारा भिंन

नोट: पेप्टाइड्स उनके isoelectric अंक के अनुसार एक 13 सेमी एक पीएच रेंज 3 से 10 को कवर पट्टी पर एक बंद जेल fractionator का उपयोग कर अलग कर रहे हैं । हम निंनलिखित आपूर्तिकर्ता द्वारा प्रदान की प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया (नीचे संक्षेप):

  1. निम्न समाधान तैयार करें: समाधान a (६०० µ l of ग्लिसरॉल solution, ६० µ l of OFFGEL बफर, ४.३४ मिलि of ultrapure water) और हल B (१.७७६ ml ऑफ सॉल्यूशन a और ४४४ µ l of ultrapure water).
  2. IPG स्ट्रिप्स, फ्रेम, और इलेक्ट्रोड निर्माता के निर्देशों के अनुसार इकट्ठा ।
  3. समाधान बी के १.८ मिलीलीटर के साथ नमूना resuspend एक अच्छी तरह से समाधान बी के ४० µ एल जोड़ें । प्रत्येक अच्छी तरह से नमूना के १५० µ एल लोड ।
  4. पेप्टाइड्स के लिए डिफ़ॉल्ट विधि का चयन करें: OG12PE00 (OFFGEL डिफ़ॉल्ट विधि पेप्टाइड्स के लिए एक ३१०० OFFGEL कम Res किट, पीएच 3-10, 12-अच्छी तरह से फ्रेम के साथ उपयोग के लिए । इस विधि के पूर्ण होने तक प्रतीक्षा करें (~ 20 h) । ठीक से लेबल ट्यूबों में अंशों लीजिए ।

12. साफ अप हार्वर्ड उपकरण कॉलम रिवर्स C18 पोस्ट-आईईएफ (प्रोटोकॉल 2)

  1. उत्तरोत्तर एक समय में कुछ μL जोड़ें de-TFA में 1% के लिए प्रत्येक अंश के लिए पानी के नमूने acidify । पीएच कागज का उपयोग कर जांच करें कि पीएच के बारे में 3 या नीचे है ।
  2. निम्न समाधान तैयार करें: समाधान 1 (5 मिलीलीटर की acetonitrile, 10 µ एल के फार्मिक एसिड, ४.९९ मिलीलीटर की ultrapure पानी) और समाधान 2 (०.५ मिलीलीटर की acetonitrile, 10 µ एल के फार्मिक एसिड, ९.४९ मिलीलीटर की ultrapure पानी) ।
  3. पूर्व गीले समाधान 1 के १५० µ एल के साथ स्पिन कॉलम । ९० के लिए केंद्रापसारक ७५० x जी पर s और प्रवाह के माध्यम से त्यागें । स्पिन कॉलम को धो 2 समाधान के १५० μL के साथ । ९० के लिए केंद्रापसारक ७५० x जी पर s और प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
  4. स्तंभ के माध्यम से अंश पास । ९० के लिए केंद्रापसारक ७५० x जी पर s और प्रवाह के माध्यम से त्यागें । 2. समाधान के १५० μL के साथ धो लें । ९० के लिए केंद्रापसारक ७५० x जी पर s और प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
  5. Elute समाधान 1 के ५० μL के साथ भिंन है । ९० के लिए केंद्रापसारक एस ७५० एक्स जी पर एक बार फिर इन चरणों दोहराएं ।
  6. सूखी-एक वैक्यूम ध्यानी (१५० x g, निर्वात १६० mBar) और दुकान पर-80 डिग्री सेल्सियस का उपयोग कर अंश

13. Proteomic डेटा का विश्लेषण और Bioinformatics18

  1. इस तरह के MaxQuant (संस्करण 1.5.2.8) और एंड्रोमेडा खोज इंजन के रूप में ठहराव सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक नैनो-LC ms/एमएस मास स्पेक्ट्रोमीटर द्वारा प्राप्त आंकड़ों का विश्लेषण ।
  2. सेट गलत डिस्कवरी दर (एफडीआर) दोनों प्रोटीन और पेप्टाइड्स और 7 अमीनो एसिड की एक ंयूनतम लंबाई के लिए 1% करने के लिए । Arg और Lys के लिए सी-टर्मिनल के रूप में एंजाइम विशिष्टता सेट करें । की अनुमति दें 2 लाइन बांड पर याद दरारें । एक निश्चित संशोधन और N-टर्मिनल प्रोटीन acetylation और methionine ऑक्सीकरण के रूप में चर संशोधनों के रूप में cysteine के carbamidomethylation का चयन करें ।
  3. इसके अलावा सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ डेटा का विश्लेषण । एक कार्यात्मक संवर्धन FunRich सॉफ्टवेयर (www.funrich.org/) का उपयोग कर विश्लेषण करते हैं । प्रदर्शन एक जीन आंटलजी संवर्धन डेविड सॉफ्टवेयर (https://david.ncifcrf.gov/) का उपयोग कर विश्लेषण ।

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Representative Results

परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं से शुरू (PBMCs) विभेदक केंद्रापसारक द्वारा प्राप्त की, प्रोटोकॉल CD14 की आबादी के प्राप्त करने परमिट+ monocytes से अधिक ९८% की एक आकलन शुद्धता के साथ प्रवाह cytometry (चित्रा 1) । इन monocytes विभिन्न ध्रुवीकरण (चित्रा 2) की ओर secondarily विभेदित कर रहे हैं. जेल पर एक भिन्नता चुना जाता है, एसडीएस-पृष्ठ जैल पर माइग्रेशन वांछित बैंड की संख्या प्राप्त करने के लिए अनुकूलित है, और बैंड (चित्रा 3) एक्साइज कर रहे हैं । पाचन secondarily जेल के एक्साइज बैंड में प्रदर्शन किया है, तो पेप्टाइड्स निकाले जाते हैं । पेप्टाइड्स एक नैनो-नियंत्रण रेखा (तरल क्रोमैटोग्राफी) का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं-ms/ms मास स्पेक्ट्रोमीटर. ms/ms स्पेक्ट्रा स्पेक्ट्रा ज्ञात पेप्टाइड्स (चित्रा 4a) के लिए प्राप्त की एनोटेशन के अनुसार विभिन्न प्रोटीन की पहचान दे । एक प्रोटीन की प्रचुरता का ठहराव तो प्रकाशित सॉफ्टवेयर और डेटाबेस15,16का उपयोग प्रोटीन से आ रही पहचान पेप्टाइड्स की मात्रा के संबंध में गणना की जाती है । जेल में पाचन के साथ इस प्रोटोकॉल लगभग ४००० पहचान प्रोटीन देता है, और गतिशील रेंज 5 लघुगणक स्केल इकाइयों (चित्रा 4B) को कवर करने के लिए पाया गया है । इन की पहचान प्रोटीन के अंतर अभिव्यक्ति का विश्लेषण विभिंन ऑक्सीजन वातावरण के तहत विभिंन ध्रुवीकरण के clustering का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

इस विधि के साथ, हम भी कर रहे हैं कि प्रोटीन के समूहों को पहचान सकते हैं-विनियमित जब 3% की एक कम ऑक्सीजन एकाग्रता के संपर्क में (चित्रा 5, तालिका 1). पाचन की दक्षता का आकलन करने के लिए, जो संभव नहीं है जब एक में जेल प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाता है, हम एक में समाधान पाचन पद्धति है कि मानव मैक्रोफेज (चित्रा 6A) के लिए अनुकूलित किया गया है प्रस्तावित है । इस विधि के साथ, हम आसानी से प्राप्त कर सकते हैं (में समाधान पाचन के बाद) अंश के बिना ३६०० प्रोटीन की पहचान, जिसका अर्थ है कि आईईएफ के साथ भिन्नता इस संख्या में वृद्धि समझदारी जाएगा (आंकड़ा घमण्ड).

Figure 1
चित्रा 1: छंटाई से पहले PBMC की CD14 अभिव्यक्ति का प्रवाह cytometry विश्लेषण (बाएं पैनल) और छंटाई के बाद (सही पैनल) चुंबकीय मोती चयन के बाद प्राप्त पवित्रता दिखा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: विभेदित मानव मैक्रोफेज के चरण विपरीत छवियों को दो अलग ध्रुवीकरण के लिए प्राप्त morphologies के विविधता दिखा । स्केल बार का प्रतिनिधित्व करता है ५० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: Coomassie नीले दाग विभिंन बैंड है कि [यहां, एम में 6 बैंड (Ø) मैक्रोफेज] मैक्रोफेज के 5 ध्रुवीकरण के लिए एक कम ऑक्सीजन पर्यावरण से अवगत कराया जाएगा दिखा जेल की इमेजिंग । आईसी = प्रतिरक्षा परिसरों, DXM = डेक्समेतएसॉनी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: एमएस/एमएस स्पेक्ट्रम और ठहराव । (A) एक एमएस/एमएस स्पेक्ट्रम का एक उदाहरण । यहां दिखाया गया है सीआईडी (टक्कर प्रेरित पृथक्करण) एक पेप्टाइड के स्पेक्ट्रम एम पर पाया + 2 के एक बिजली के आरोप के साथ एमएस स्पेक्ट्रम पर । इसी अनुक्रम में इस स्पेक्ट्रम से वैल-ाला-Glu-लियू-Glu-Asn-Ser-Glu-Phe-Arg प्रोटीन CD58 से निर्धारित किया गया था. (ख) कोटि आदेशित लेबल-प्रत्येक की पहचान प्रोटीन के लिए निःशुल्क ठहराव (लॉग१० LFQ). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: हीट नक्शा विभेदक व्यक्त प्रोटीन का उपयोग सभी ध्रुवीकरण राज्यों के पदानुक्रमित clustering का प्रतिनिधित्व । विश्लेषण 3% ओ2 हालत (लाल आयत) में सभी ध्रुवीकरण में व्यक्त प्रोटीन के एक क्लस्टर पता चलता है । रंग स्केल z-स्कोर (log2 तीव्रता) का प्रतिनिधित्व करता है । प्रत्येक पंक्ति एक प्रोटीन है और प्रत्येक स्तंभ एक नमूना है । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन14से शुरू हुआ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: एसडीएस-पृष्ठ और वर्णलेख । (क) कोशिका lysis से प्रोटीन के साथ चांदी से सना एसडीएस-पृष्ठ जैल और बाद में समाधान पाचन lysis और पाचन की दक्षता के दौरान क्षरण के अभाव दिखा । (ख) वर्णलेख के बाद समाधान पाचन में अंश के बिना से प्राप्त की । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

क्लस्टर proteinID प्रोटीन के नाम जीन नाम पेप्टाइड्स उस्तरा + अद्वितीय पेप्टाइड्स अद्वितीय पेप्टाइड्स प्रोटीन आईडी
लाल P0DMV9 हीट शॉक ७० केडीए प्रोटीन 1b HSPA1A ४० ३७ 4 P0DMV9; P0DMV8; A8K5I0; Q59EJ3; B4DNT8; B4DWK5; B4DFN9; B4DI39; B4E1S9; B4DVU9; V9GZ37; B3KTT5; B4DNX1; B4E1T6; B4DNV4; Q9UQC1
लाल P54709 सोडियम/पोटेशियम-परिवहन ATPase उपइकाई बीटा-3 ATP1B3 8 8 8 P54709; D3DNF9; C9JXZ1; C9JA36; H7C547; F8WBY4; Q58I18
लाल O00462 बीटा-mannosidase मनबा 14 13 13 O00462; A7LFP5; A8K6D3; E9PFW2; B4DT18; Q59EG5
लाल Q8NAS7 नध डिहाइड्रोजनेज [ubiquinone] लौह-सल्फर प्रोटीन ७, mitochondrial NDUFS7 4 4 4 Q8NAS7; Q6ZQU6; F5H5N1; B7Z1U1; A8K0V6; Q7LD69; F5GXJ1; O75251; B7Z4P1; Q9H3K5; A0A087WXF6; A0A087WTI3; Q6ZS38
लाल Q8WWQ0 पीएच-बातचीत प्रोटीन PHIP 5 5 4 Q8WWQ0; Q9NWP3
लाल E5RHK8 Dynamin-3 DNM3 11 2 2 E5RHK8; Q9UQ16; B3KPF2; E5RIK2
लाल A0A024QZ64 फ्रुक्टोज-bisphosphate aldolase ग ALDOC 18 14 7 A0A024QZ64; P09972; B7Z1Y2; B7Z3K9; B7Z1N6; B7Z3K7; A8MVZ9; J3KSV6; J3QKP5; B7Z1L5; C9J8F3; K7EKH5; J3QKK1; B7Z1H6
लाल O75489 नध डिहाइड्रोजनेज [ubiquinone] लौह-सल्फर प्रोटीन ३, mitochondrial NDUFS3 12 12 12 O75489; Q9UF24; Q53FM7; E9PS48; E9PKL8; G3V194
लाल P21912 Succinate डिहाइड्रोजनेज [ubiquinone] लौह-सल्फर उपइकाई, mitochondrial SDHB 11 11 11 P21912; A0A087WXX8; A0A087WWT1
लाल A0A024R1Y7 GH3 डोमेन-प्रोटीन युक्त LGP1; GHDC 7 7 7 A0A024R1Y7; Q8N2G8; B3KVB0; K7ESN3; K7EJT7; K7EQ41; K7EL54
लाल E5KRK5 नध-ubiquinone oxidoreductase ७५ केडीए उपइकाई, mitochondrial NDUFS1 29 29 29 E5KRK5; P28331; B4DJ81; Q9P1A0; C9JPQ5; F8WDL5
लाल A0A024QZ30 Succinate डिहाइड्रोजनेज [ubiquinone] flavoprotein उपइकाई, mitochondrial SDHA 17 17 17 A0A024QZ30; P31040; D6RFM5; B3KT34; A0A087X1I3; Q0QF12; B4DYN5; B3KYA5; B4DNB2; H0Y8X1; B7Z6J5
लाल A0A024R2F9 Transmembrane प्रोटीन ४३ TMEM43 16 16 16 A0A024R2F9; Q9BTV4; Q8TEP9; V9GY05
लाल A0A024R5K3 नध डिहाइड्रोजनेज [ubiquinone] लौह-सल्फर प्रोटीन ८, mitochondrial NDUFS8 5 5 5 A0A024R5K3; E9PPW7; O00217; E9PN51; F8W9K7; E9PKH6; B4DYI3; Q53G17
लाल O76003 Glutaredoxin-3 GLRX3 13 13 13 O76003
लाल Q1HBJ4 Mitogen-आपन प्रोटीन कळेनासे; Mitogen-आपन प्रोटीन कळेनासे 1 MAPK1 26 26 21 Q1HBJ4; P28482; B4DHN0; Q499G7; K7ELV1; K7EN18; B4E104; P31152; Q16659
लाल Q13151 विषम नाभिकीय ribonucleoprotein ए0 HNRNPA0 8 8 8 Q13151
लाल V9HWN7 फ्रुक्टोज-bisphosphate aldolase एक ALDOA ३६ ३६ 14 V9HWN7; P04075; J3KPS3; H3BQN4; H3BUH7; H3BR04; H3BMQ8; H3BU78; H3BR68; A4UCS9; A4UCT0
लाल B4DVJ0 ग्लूकोज-6-फॉस्फेट isomerase जीपीआई ३२ ३२ 23 B4DVJ0; P06744; B4DE36; A0A0A0MTS2; K7EQ48; K7EP41; K7EPY4; K7ELR7; K7ERC6; K7ENA0; K7ESF4; K7EIL4; K7ERK8; Q59F85
लाल V9HWB9 L-स्तनपान डिहाइड्रोजनेज; L-स्तनपान डिहाइड्रोजनेज एक चेन LDHA ३६ ३६ ३४ V9HWB9; P00338; B4DJI1; F5GXY2; F5GYU2; F5GXH2; F5H5J4; F5H6W8; F5GZQ4; F5H8H6; F5GXC7; F5GWW2; F5GXU1; A0A087WUM2; Q96L19; Q6ZMR3
लाल P13674 Prolyl 4-hydroxylase उपइकाई अल्फा-1 P4HA1 26 26 26 P13674; Q5VSQ6
लाल Q6FHV6 गामा-enolase; Enolase ENO2 18 15 14 Q6FHV6; P09104; A8K3B0; F5H0C8; F5H1C3; U3KQP4; U3KQQ1; Q9NPL4
लाल Q99798 Aconitate hydratase, mitochondrial ACO2 ४० ४० ४० Q99798; B4DZ08; B2RBW5; A2A274; B4DJW1; B4DLY4; Q71UF1; B4DEC3; B4DW08; O75944
लाल P17858 एटीपी-निर्भर 6-phosphofructokinase, जिगर प्रकार PFKL ३२ 29 28 P17858; Q7L2M7; Q9BSP4; B3KNQ7; B4E108; Q59GI2; F8WEU2; Q7Z3R9; Q6MZK4
लाल A0A024R872 Niban-जैसे प्रोटीन 1 FAM129B ३२ ३२ ३२ A0A024R872; Q96TA1; Q9H8K1; Q2YD88; Q9H6L6
लाल A0A024RC61 Aminopeptidase एन ANPEP ५८ ५८ 25 A0A024RC61; P15144; Q59E93; B4DV63; B4DP01; B4DP96; H0YKT6; H0YLZ8; Q71E46; H0YMC1; Q8IVL7
लाल V9HWF4 Phosphoglycerate कळेनासे; Phosphoglycerate कळेनासे 1 PGK1 ४१ ४१ ३५ V9HWF4; P00558; B4E1H9; B4DHM5; B4DHB3; B4DWQ3; Q16444
लाल Q12882 Dihydropyrimidine डिहाइड्रोजनेज [NADP (+)] DPYD ४४ ४४ ४४ Q12882; B4DML1
लाल B4DEQ0 इलेक्ट्रॉन अंतरण flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase, mitochondrial ETFDH 9 9 9 B4DEQ0; Q547S8; A7UNU5; Q16134; D6RAD5
लाल D9UAX9 MHC वर्ग I antigen एचएलए-बी 13 3 2 D9UAX9
लाल V9HWK1 Triosephosphate isomerase TPI1 29 29 17 V9HWK1; P60174; Q53HE2; B4DUI5; U3KPZ0; U3KQF3; U3KPS5
लाल Q96HE7 ERO1-जैसे प्रोटीन अल्फा ERO1L 28 28 28 Q96HE7; G3V3E6; G3V5B3; G3V2H0; G3V503; Q5TAE8; B2RD00; Q86YB8
लाल P14868 Aspartate--tRNA ligase, cytoplasmic डीएआरएस 29 29 2 P14868; Q53T60; Q53R85; H7BZ35; H7C278
लाल P36871 Phosphoglucomutase-1 PGM1 24 24 5 P36871; B4DFP1; Q9H1D2

तालिका 1: कम ऑक्सीजन तनाव के तहत प्रत्येक ध्रुवीकरण के लिए आम मानव मैक्रोफेज के लिए अधिक व्यक्त प्रोटीन की सूची ।

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Discussion

क्योंकि प्रोटियोमिक् एक पूरे सेल या सेलुलर डिब्बों से अलग प्रोटीन की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, कोशिका lysis प्रोटोकॉल और प्रोटीन के पाचन का अनुकूलन अध्ययन के एक नंबर से संबोधित किया गया है । वहाँ तीन मुख्य वर्गों के तरीके हैं, जो जेल पाचन में शामिल हैं (polyacrylamide जेल मैट्रिक्स में प्रोटीन के पाचन)17, समाधान में पाचन18 और फिल्टर-एडेड नमूना तैयारी19. यह पिछले विधि, पहले यूनिवर्सल के रूप में वर्णित पर, कम reproducibility और फिल्टर20पर प्रोटीन के संभावित नुकसान प्रदर्शन करने के लिए सूचित किया गया है । जेल में पाचन एक मजबूत तरीका है कि समय लेने वाली और नुकसान में है कि पाचन की क्षमता का आकलन आसान नहीं है, अगर संभव हो सकता है । समाधान में पाचन इस संभावना प्रदान करता है, लेकिन पाचन और आईईएफ के बाद नमूनों की सफाई की आवश्यकता है । जब इन दोनों पद्धतियों एक ही नमूना के बीच तुलना कर रहे हैं, में समाधान पाचन आईईएफ अंश प्रोटोकॉल के साथ पैदावार की पहचान प्रोटीन की एक उच्च संख्या (अंशों की एक ही संख्या के साथ) की तुलना में जेल पाचन21।

इस लाभ के बावजूद, यह समाधान lysis के दौरान संभव प्रोटीन क्षरण पर विचार करने के लिए आवश्यक है intracellular के कारण (विशेष रूप से माइलॉयड कोशिकाओं में) । यह भी ध्यान में रखना है कि इन तकनीकों प्रोटीन पाचन पर आधारित है और केवल trypsin विशिष्ट दरार साइटों पेश प्रोटीन का विश्लेषण करने में सक्षम है महत्वपूर्ण है । यह एक ऊपर-नीचे proteomic दृष्टिकोण है कि इस पाचन बाधा से राहत मिलती है का उपयोग करने के लिए संभव है, लेकिन डेटा विश्लेषण कदम जोड़ता है और bioinformatics ressources22। विभिन्न सेलुलर डिब्बों से प्रोटीन की solubilization भी प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है, विशेष रूप से प्लाज्मा झिल्ली से, सेलुलर proteome के एक अनियंत्रित नमूना करने के लिए अग्रणी. आदेश में एक नैनो के साथ आगे बढ़ने के लिए-LC-ms/एमएस मास स्पेक्ट्रोमीटर विश्लेषण नमूनों की, यह एक पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है पेप्टाइड्स, जो बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया स्पेक्ट्रोमीटर पर निर्भर कर सकते हैं (आमतौर पर, शुरू कुल प्रोटीन होना चाहिए एक शर्त के लिए एक µ जी, और यह आईईएफ के साथ प्रयुक्त अंश की संख्या के अनुसार इस मात्रा को बढ़ाने के लिए निहित है) । इस बाधा एक खामी अगर सेल जनसंख्या का अध्ययन किया जा रहा है दुर्लभ है, जो जीनोमिक तकनीकों में कच्चे माल के प्रवर्धन संभव है से proteomic अंतर हो सकता है ।

यहां तक कि अमीर और सहयोगियों23 और पैकर और Fuehr24, सेल संस्कृतियों में ऑक्सीजन के महत्व को अपर्याप्त मांयता प्राप्त किया गया है की प्राथमिक काम करता है के बाद । अब हम जानते है कि कम ऑक्सीजन सांद्रता के तहत संवर्धन कोशिकाओं आसंजन, उंर एहसान, और विभाजन । यह मांयता प्राप्त है कि इस स्टेम सेल अनुसंधान25में अत्यंत महत्व का है । नियंत्रित ऑक्सीजन की स्थिति के तहत सेल संस्कृतियों के लिए मुख्य तकनीकी मुद्दा पूरे प्रयोग के दौरान वांछित ऑक्सीजन एकाग्रता के रखरखाव से संबंधित है । यह सभी मीडिया की पूर्व-मशीन की आवश्यकता को भंग ऑक्सीजन और hypoxic काम कर रहे स्टेशनों के उपयोग को रोकने के लिए कम ऑक्सीजन के तहत कोशिकाओं के हेरफेर की अनुमति (दस्ताने बॉक्स के साथ चैंबर प्रसंस्करण) और उच्च ऑक्सीजन की स्थिति को क्षणिक प्रदर्शनी को रोकने के .

वर्णित प्रोटोकॉल का इस्तेमाल मानव monocyte के विभिन्न ध्रुवीकरण के आणविक हस्ताक्षर प्राप्त मैक्रोफेज के लिए किया जाता था और इन हस्ताक्षरों पर ऑक्सीजन मॉडुलन के प्रभाव का अध्ययन करता था. यह अध्ययन उन ध्रुवीकरण के वर्णन पर अंतर्दृष्टि दिया है और कुछ कार्यात्मक परिणाम से पता चला है । उदाहरण के लिए, हमने पाया है कि कई efferocytosis में शामिल प्रोटीन एक कम ऑक्सीजन वातावरण द्वारा संग्राहक थे । इस proteomic दृष्टिकोण, वर्णित प्रोटोकॉल के आधार पर, कैसे पर्यावरण मानकों मैक्रोफेज कार्यों को संशोधित करने और कैसे इन संकेतों को नए चिकित्सीय14दृष्टिकोण डिजाइन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है का पता लगाने का अवसर प्रस्तुत करता है ।

proteomic दृष्टिकोण इस काम में वर्णित जीनोमिक दृष्टिकोण है कि मानव मैक्रोफेज ध्रुवीकरण अध्ययन के क्षेत्र में हाल के वर्षों के दौरान इस्तेमाल किया गया है के पूरक है । प्रोटियोमिक् प्रोटीन ठहराव का लाभ प्रदान करते हैं, जो पोस्ट-शोधों के संशोधनों के कारण उनके इसी mRNAs की तुलना में एक अलग अभिव्यक्ति पेश कर सकते हैं और नए विमार्कों की खोज के लिए नेतृत्व करते हैं. इस लाभ के बावजूद, proteomic डेटा आमतौर पर व्याख्या करने के लिए मुश्किल है, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के उच्च संवेदनशीलता के कारण भाग में, बहुत जटिल एमएस स्पेक्ट्रा और गलत पेप्टाइड्स के सकारात्मक का पता लगाने के लिए अग्रणी. हाल ही में, विश्लेषण सॉफ्टवेयर दक्षता प्राप्त की है ताकि इस को रोकने के लिए । यहां तक कि अगर यह एक बदलती स्थिति है, प्रोटियोमिक् भी26 जीनोमिक्स से कम reproducibility चेहरे और मांयता अंय तकनीकों (प्रवाह cytometry, immunoblotting) का उपयोग कर कदम के साथ जुड़े प्रोटीन के मात्रात्मक संशोधनों की पुष्टि अभिव्यक्ति का स्तर ।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव की घोषणा ।

Acknowledgments

AM युवा समूह के नेता कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित है (ातिप/Avenir Inserm-CNRS), ला Ligue राष्ट्रीयकृत contre le कैंसर और ला शौकीन चाप डालो ला सभ्य सुर le कैंसर द्वारा । हम मास स्पेक्ट्रोमेट्री फॉर बायोलॉजी प्लेटफार्म (UTECHS MSBIO, पाश्चर इंस्टीट्यूट, पेरिस) से Mariette Matondo का धन्यवाद करते हैं । हम उसे पांडुलिपि के पढ़ने के लिए लॉरेन एंडरसन धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hypoxia Working Station Oxford Optronix Hypoxylab
C6 Flow cytometer BD Accuri C6
Urea Agilent Technologies 5188-6435
Formic acid (FA) ARISTAR 450122M
R-250 Coomassie blue Biorad 1,610,436
Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS) Calbiochem 437627
2D clean-up kit GE Healthcare 80-6484-51
RPMI 1640 medium, glutamax supplement Gibco 61870044
HEPES 1 M Gibco 15630-080
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X Gibco 11140-035
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X Gibco 14190-094
Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column Harvard Apparatus 74-4601
EDTA 0.5 M, pH 8.0 Invitrogen AM9260G
NuPAGE Bis-Tris 4-12% Life Technologies SAS NP0321 BOX
CD14 Microbeads human Miltenyi Biotec 130-050-201
MACS separation column LS Miltenyi Biotec 130-042-401
Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) Miltenyi Biotec 130-096-485
Interleukin 4 (IL4) Miltenyi Biotec 130-093-917
Interleukin 13 (IL13) Miltenyi Biotec 130-112-410
Interferon gamma (INFγ) Miltenyi Biotec 130-096-482
CD14-FITC (clone TÜK4) Miltenyi Biotec 130-080-701
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753
Trifluoroacetic Acid (TFA) Pierce 28904
Trypsin/Lys-C Mix PROMEGA V5073
Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail Roche 11836170001
Density Gradient Solution (Histopaque 1077) Sigma Aldrich 10771-100ML
Accumax Sigma Aldrich A7089-100ML
Human Serum from human male AB plasma (SAB) Sigma Aldrich H4522-100ML
Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30% Sigma Aldrich A9576-50ML
Trisma-base Sigma Aldrich T1503
Glycerol Sigma Aldrich 49767
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148
Bromophenol blue Sigma Aldrich 114405
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% Sigma Aldrich 5030
Ammonium bicarbonate Sigma Aldrich 9830
Acetonitrile Sigma Aldrich 34888
Dithiothreitol Sigma Aldrich 43819
Iodoacetamide Sigma Aldrich 57670
Thiourea Sigma Aldrich T8656
CHAPS Sigma Aldrich C9426
Micro BCA Assay Kit ThermoFisher 23235
5 mL sterile plastic pipette VWR 612-1685
Thermomixer C Eppendorf VWR 460-0223
Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg Waters WAT036820

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References

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जैव रसायन १४३ अंक मैक्रोफेज ध्रुवीकरण proteome नियंत्रण रेखा एमएस/ms हाइपोक्सिया बंद जेल अंश
एक कम ऑक्सीजन पर्यावरण के तहत मानव मैक्रोफेज ध्रुवीकरण का Proteomic विश्लेषण
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Court, M., Malier, M., Millet, A. Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment. J. Vis. Exp. (143), e58727, doi:10.3791/58727 (2019).

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