Summary
Vi presenterer en protokoll for å skaffe proteomic signaturer av menneskelig makrofager og dette gjelder fastsettelse av virkningen av et lavt oksygeninnhold miljø macrophage polarisering.
Abstract
Makrofager er medfødte immunceller involvert i en rekke fysiologiske funksjoner mellom Svar å smittsomme patogener vev homeostase. De forskjellige funksjonene i disse cellene er knyttet til deres aktivisering stater, som også kalles polarisering. Den presise molekylære beskrivelsen av disse ulike polarisasjonene prioriteres innen macrophage biologi. Det er nå anerkjent som en flerdimensjonal tilnærming er nødvendig å beskrive hvordan polarisering er kontrollert av Miljøsignaler. I denne rapporten beskriver vi utviklet å få proteomic signaturen av ulike polarisasjonene i menneskelig makrofager. Denne protokollen er basert på en etikett-fri kvantifisering av macrophage protein uttrykk innhentet fra in-gel fraksjonert og Lys C/trypsin-fordøyd mobilnettet lysis innhold. Vi tilbyr også en protokoll basert på-løsning fordøyelsen og isoelectric fokuserer fraksjoneres å bruke som et alternativ. Oksygen konsentrasjon er relevante miljømessige parameter i vev, vi bruk denne protokollen til å utforske hvordan atmosfærens sammensetning eller et lavt oksygeninnhold miljø påvirker klassifiseringen av macrophage polarisering.
Introduction
Makrofager er medfødte immunceller involvert i en rekke fysiologiske funksjoner mellom Svar å smittsomme patogener vev homeostase, inkludert fjerning av apoptotisk celler og ombygging av ekstracellulær matrix1. Disse cellene er preget av en sterk fenotypiske plastisitet2 som oversetter til en mange mulig aktivering stater, også kalt polarisasjonene. Den presise molekylære beskrivelsen av disse ulike polarisasjonene prioriteres innen macrophage biologi3. Det har blitt foreslått å klassifisere disse polarisasjonene bruker den såkalte M1/M2 motsetningen, der M1 representerer pro-inflammatoriske og M2 representerer anti-inflammatorisk makrofager. Denne modellen passer godt i ulike patologisk situasjoner som akutte infeksjoner, allergi og fedme4. Men i kronisk betent vev og kreft, har det vært vist at klassifiseringen er i stand til å forstå bred fenotypiske repertoaret makrofager presenterer i visse mobilnettet miljøer5,6, 7. den gjeldende konsensus er at macrophage polarisering er bedre beskrevet med en flerdimensjonal modell for å integrere microenvironmental sender8. Denne konklusjonen er bekreftet gjennom transcriptomic analyse av menneskelig makrofager viser at M1/M2 modellen er ineffektive i beskriver innhentet polarisasjonene9.
Studien presentert mål å gi en protokoll for å få proteomic signaturer av ulike polarisasjonene i menneskelig makrofager. Vi beskriver hvordan å skille menneskelig makrofager i miljøer med ulike oksygennivået og få peptider fra hele macrophage proteom til å utføre en etikett-fri kvantifisering. Denne kvantifisering tillater sammenligning av uttrykket nivåer av. Som forskning på stamceller har avdekket betydningen av oksygen som en miljømessig Nøkkelparameteren10, søker vi å forstå hvordan denne vev-parameteren kan påvirke macrophage polarisering i mennesker. Delvis trykket av oksygen har funnet å rekkevidde fra 3 til 20% (av totale lufttrykk) i menneskekroppen, der 20% tilsvarer omtrent til hva er vanligvis brukes i en celle kultur inkubator (den nøyaktige verdien er rundt 18.6% mens du tar er tilstedeværelsen av vann i betraktning).
Tidligere arbeid har vist at alveolar avvike fra interstitiell makrofager fra funksjonelle og morfologiske hensikten utsikt11 og som disse forskjellene er trolig delvis på grunn av ulike oksygen nivåer som de er utsatt12. Videre viser Ben margtransplantasjon-avledet makrofager en økt evne til å phagocytize bakterier utsettes for en oksygen miljø12. Motsatte er funnet for THP1-differensiert menneskelige makrofager13, men disse resultatene støtter ideen om at oksygen er en regulator macrophage biologi og at det er nødvendig å avklare denne rollen på molekylært nivå i menneskelig makrofager. I en tidligere studie, har vi brukt en Proteomikk tilnærming for å løse disse problemene. Ved å måle uttrykk nivåer for tusenvis av proteiner samtidig, vi fremhevet virkningen av oksygen på polarisering og laget en liste over nye molekylære markører. Vi var også i stand til å relatere disse funnene til noen makrofager funksjoner. Spesielt fant vi at frekvensen av fagocytose apoptotisk celler ble økt i IL4/IL13-polarisert makrofager, som var knyttet til oppregulering av ALOX15 som åpenbart av proteomic analyse14. I studien beskriver vi hvordan du utfører slik analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menneskelig blodprøver (LRSC) fra sunne, de identifiserte givere var oppnådd fra EFS (fransk nasjonale blod Service) som en del av en autorisert protokoll (CODECOH DC-2018-3114). Givere ga signert samtykke for bruk av blod.
1. Media og Buffer forberedelse
- Forberede macrophage mediet [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1 x ikke-essensielle aminosyrer (NEAA)] og varme den til 37 ° C.
- Forberede macrophage medium + 10% humant serum fra AB plasma (SAB), filtrere den (0.22 µm filter), og deretter varme den 37 ° c (referert til som macrophage medium + 10% SAB heretter).
- Forberede sortering bufferen [1 x fosfat bufret saltvann (PBS) + 0,5% bovin serum albumin (BSA) + 2 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA)], filtrere den (0.22 µm filter) og opprettholde den på 4 ° C.
2. isolering av perifert blod mononukleære celler (PBMCs) fra Leukoreduction System kammer (LRSC)
- Sette 15 mL tetthet gradert celle separasjon løsning (se Tabell for materiale) i et 50 mL sentrifugering rør så den kan varm til romtemperatur (RT) før LRSC.
Merk: Tetthet avhengig av temperaturen. Som dette produktet er lagret på 4 ° C, må dette trinnet gjøres på forhånd slik at det kan equilibrate til RT. - Tømmes i LRSC i et 50 mL sentrifugering rør, Legg opptil 50 mL 1 x PBS, og bland. Veldig sakte, legge til 25 mL av miksen utarbeidet under trinn 2.2 over 15 mL tetthet gradert løsning varmet opp under trinn 2.1.
Merk: Vær forsiktig ikke for å blande fasene i dette trinnet. Blodet legges på tetthet gradert løsning uten forstyrrelser av denne fasen. - Sentrifuge både sentrifugering rør for 25 min 700 x g uten pauser.
Merk: På slutten av tetthet gradert sentrifugering, lag fra bunn til topp er: erytrocytter og granulocytter danner pellet, tetthet gradert løsning fase, laget av PBMCs og plasma. - Med en Pipetter, passere gjennom plasma fasen uten aspirating det og samle PBMC laget i en ny 50 mL sentrifugering tube. Legge til opptil 50 mL 1 x PBS PBMCs som vask trinn og sentrifuge for 10 min 300 x g.
- Sug opp nedbryting og resuspend pellet i 40 mL av macrophage medium.
3. magnetiske merking og isolering av CD14+ celler (monocytter)
- Telle PBMCs i en Malassez kammer. Ta ut mengden PBMCs nødvendig for å gjennomføre eksperimentet (vanligvis 100-300 x 106 celler), plassere dem i en sentrifugeringsrøret, og sentrifuge for 10 min 300 x g.
- Sug opp nedbryting og resuspend pellet i 80 µL sortering bufferen som utarbeidet under trinn 1.3 per 107 PBMCs. legge til 20 µL av CD14 microbeads per 107 PBMCs. Mix godt og ruge i 15 min på 4 ° C under konstant uro.
- Legg 1 mL av sortering buffer per 107 PBMCs som en vask trinn og sentrifuge for 10 min på 300 x g. Sug opp nedbryting og resuspend pellet i 500 µL av sortering buffer per 108 PBMCs.
- Plass en kolonne i det magnetiske feltet i skilletegnet. Klargjør kolonnen ved å skylle den med 3 mL sortering buffer.
- Bruke celle suspensjon på kolonnen. Kolonnen, avhenger av antall celler isoleres (her LS kolonner for opptil 109 PBMCs brukes). Samle gjennomflytsenhet inneholder umerkede celler.
Merk: Starter på dette trinnet, beholdes alle rør (negative og positive valg) for senere kontroll av de ulike trinnene av flowcytometri. - Vask kolonnen med 3 x 3 mL sortering buffer. Samle umerkede celler passerer gjennom samme rør fra trinn 3.12. Vask fremgangsmåten ved å legge til sortering buffer, være forsiktig med å tørke kolonnen. Plasser en samling rør under kolonnen og fjerne den fra skilletegnet.
- Pipetter 5 mL av sortering buffer i kolonnen. Umiddelbart skylle ut magnetisk merket cellene ved å skyve stempelet fast i kolonnen. Å øke renhet av CD14+ celler, eluted brøken berikes over en andre kolonne.
- Gjenta trinn 3.4 til 3,7 med en ny kolonne.
4. plating av monocytter
- Telle monocytter i en Malassez kammer. Sjekk renheten av CD14+ celler av flowcytometri. Trekke beløpet av monocytter nødvendig for eksperimentet og plassere dem i en sentrifugeringsrøret.
- Sentrifuge for 10 min på 300 x g. leveringstanken nedbryting og resuspend monocytt pellet i macrophage medium. Plate cellene og la dem betale for 50 min til 1 h. Sug opp mediet og erstatte den med macrophage medium + 10% SAB + 25 ng/mL macrophage koloni stimulerende faktor (M-CSF) for å indusere differensiering.
5. polarisering av makrofager på dag 6
- Sug opp mediet. Erstatte den med macrophage medium + 10% SAB med ulike stimuli. For eksempel legge 10 ng/mL interferon gamma (INFγ) + 1 ng/mL lipopolysakkarid (LPS) å få M1 polarisasjon, eller 20 ng/mL interleukin 4 (IL4) + 20 ng/mL interleukin 13 (IL13) for M2 polarisering.
Merk: Stimulering kan utføres mellom 24 og 48 h før du fortsetter til andre tester. - Høste celler ved hjelp av en detaching løsning eller en celle skraper.
6. cellekultur Under oksygen forhold
- Fra trinn 4, opprettholde den monocytter og makrofager i oksygen-kontrollert miljø å utføre hypoxic tilstand analyse. Bruke en hypoksi arbeidsstasjon for å vedlikeholde celler under ønsket oksygen delvis press under eksperimentet.
Merk: Når arbeider presset oksygen, er det viktig å forberede all media og vask buffere under stasjonen og vente tilstrekkelig å få riktig delvis trykket i væsken. For eksempel krever 10 mL PBS i en 60 mm Petriskål omtrent 2 timer å nå 25 mmHg for O2 delvis press fra atmosfærisk trykk (som vi har målt den ved hjelp av en fiberoptisk oksygen sensor). Mange hypoxic stasjoner eller inkubatorer, er oksygen trykket satt som en prosent av lufttrykk. Hvis nøyaktige mål er nødvendig, er det bedre å bruke en stasjon godkjenne direkte sette oksygen trykket i mmHg.
7. lysis og i-Gel fordøyelse (Protocol 1)
Merk: I dette og nedenfor, er to protokoller brukes til å få peptider og utføre Langbane--MS-/ MS analyse beskrevet. Protokollen 1 beskriver cellen lyse og i-gel fraksjoneres og fordøyelsen, og protokollen 2 beskriver i-løsning celle lysis etterfulgt av i-løsning fordøyelsen og fraksjoneres ved hjelp av en isoelectric fokus metode.
- Utføre celle lysis Laemmli buffer [234 mM Tris-HCL (pH 6.8), 7,5% SDS, 37% glyserol, 33,3% (v/v) β-mercaptoethanol, bromophenol blue 0,2% w/v]. Last protein tilsvarende 300 000 celler for hvert utvalg på 4-12% bis-Tris akrylamid gels.
- Kontroll varigheten av electrophoretic overføringen slik at hver protein prøve å deles i 6 gel band som eksemplifisert i Figur 3.
- Fastsette gel med en fikse løsning (30% etanol + 7,5% eddiksyre for 20 min), deretter legge flekker løsningen (R-250 Coomassie blå for 45 min). Legge det destaining løsningen (30% etanol + 7,5% eddiksyre til band vises) før excising protein band med en ren skalpell.
- Terninger hver forbrukeravgift bandet før innføring i 500 µL rør. En ren glassoverflate er garantert for å unngå forurensning med keratins (5% SDS løsning i deionisert vann kan brukes å vaske overflater).
- Vask gel skiver 3 ganger i 200 µL av 25 mM ammonium bikarbonat for 20 min på 37 ° C, etterfulgt av en vask i 25 mM ammonium bikarbonat og acetonitrile (50% v/v). Tørke gel stykker med 200 µL av 100% acetonitrile i 10 min.
- Inkuber brikkene gel med 10 mM DTT (dithiothreitol) i 25 mM ammonium bikarbonat for 45 min ved 56 ° C (200 µL), etterfulgt av 55 mM iodoacetamide i 25 mM ammonium bikarbonat (200 µL) for 35 min i mørket på RT.
- For å stoppe alkylation, ruge hvert gel stykke med 200 µL av 10 mM DTT 25 mM ammonium bikarbonat i 10 min på RT. Wash gel bitene i 200 µL av 25 mM ammonium bikarbonat og deretter tørke med 200 µL av 100% acetonitrile i 10 min.
- Oversikten protein overnatting på 37 ° C med Trypsin/Lys-C blanding i henhold til produsentens instruksjoner.
- Ekstra de resulterende peptidene fra gel stykker av 50 μL av 50% acetonitrile i 15 minutter, deretter 50 μL av 5% maursyre i 15 min, og til slutt, 50 μL av 100% acetonitrile for 15 min. bassenget og tørr hver fraksjon i lav-absorpsjon rør begrense opptak av peptider og eksempel tap. Lagre prøvene ved-80 ° C til videre analyse.
8. protein utvinning og i-løsning fordøyelse (Protocol 2)
- Utføre celle lysis (2 x 106 celler) med 150 µL av følgende lyseringsbuffer:
- 7 M urea, 2 M thiourea, 40 mM Tris og 4% CHAPS, supplert med proteasehemmere (komplett mini, EDTA-fri protease hemmer cocktail).
- Homogenize løsninger for 30 min på RT med en thermoshaker. Sentrifuge 13 800 x g for 20 min RT og holde nedbryting.
- Fjerne forurensninger med en 2D oppryddingen kit:
- Pakken inneholder precipitant løsning, co precipitant løsning, vaskebuffer og vask additiv.
- Legger 300 µL precipitant løsning og bland godt. Ruge på is 15 min. legger 300 µL av co precipitant løsning. Sentrifuge rør (minst) på 12.000 x g i 5 min. Lite pellets skal vises. Videre raskt til det neste trinnet å unngå rørets eller spredning av pellet. Fjerne nedbryting uten å forstyrre pellet.
- Sentrifuge rør igjen med cap-hengsel og pellets vender utover å bringe gjenværende væske til bunnen av røret. En kort puls er tilstrekkelig. Det skal ingen synlige flytende igjen i rørene.
- Uten å forstyrre pellet, Legg 40 µL av co precipitant løsning. La røret sitter på is 5 min. sentrifuge for 5 minutter, deretter fjerne og slette vask. Legg til 25 µL de-ionisert vann. Vortex hver rør for 5-10 s. Pellet skal spre men oppløses i vann.
- Legg 1 mL av vaskebuffer (pre kjølt minst 1t på 20 ° C) og 5 µL av vask tilsetningsstoff. Vortex inntil pellet er helt spredt. Inkuber rør på 20 ° C i minst 30 min. Vortex for 20-30 s hvert 10 min
Merk: Rørene kan lagres på 20 ° C i opptil 1 uke med minimal protein fornedrelse eller modifikasjon. - Sentrifuge rør (minst) på 12.000 × g for 5 min. nøye fjerne og slette nedbryting. Hvit pellets skal vises. Tillate pellets til airdry for mer enn 5 min (hvis pellet er for tørr, blir det vanskelig å resuspend).
- Resuspend protein pellet i 300 µL av 8 M urea og 0.1 M ammonium bikarbonat. Vortex sterkt i 1 bestemme protein konsentrasjonen med en kolorimetrisk analysen.
9. i-løsning fordøyelse (Protocol 2)
- Redusere disulfidbroer ved å legge til 5.1 µL av en 700 mM DTT vandig løsning (siste konsentrasjon 12.5 mM) til resuspended proteiner fra trinn 8.4 og ruge på 37 ° C i 30 min med en thermoshaker. Alkylate cystein rester ved å legge 20,3 µL av en 700 mM iodoacetamide vandig løsning (siste konsentrasjon 40 mM) og rugende ved 25° C i 30 min i mørket med en thermoshaker.
- Legg 990 µL av 0.1 M ammonium bikarbonat til prøven. Legge til et tilsvarende antall Trypsin/Lys-C blanding (enzym: substrat forholdet 1: 100 w/w). Ruge på 37° C over natten med en thermoshaker.
10. rydde opp patron (Protocol 2)
- Fukt en kassett med 1 kolonne-volum (1 mL) av metanol. Rengjør kassetten med 1 kolonne-volum (1 mL) 80% acetonitrile/HPLC-grade vann og kast gjennomflytsenhet. Equilibrate kassetten med 4 kolonne-volumer (4 mL) 0,1% maursyre/HPLC-grade vann og kast gjennomflytsenhet.
- Syre prøver med 90 µL av 10% maursyre eller vann til pH 2-3 (se pH med en pH-indikator). Last sur prøvene og samle gjennomflytsenhet. Reload gjennomflytsenhet (som inneholder ikke-beholdt peptidene). Vask kassetten med 6 kolonne-volum (6 mL) på 0,1% maursyre/HPLC-grade vann.
- Elute peptider fra kassetten med 1 kolonne-volumer (1 mL) 0,1% formic acid/50% acetonitrile/HPLC-grade vann. Overføre til en 1,5 mL microcentrifuge tube. Konsentrer deg prøven med en vakuum konsentrator (150 x g, vakuumet på 160 mBar).
11. fraksjoneres av Isoelectric fokus (Protocol 2)
Merk: Peptider skilles i henhold til sine isoelectric poeng med en av gel fractionator på en 13 cm stripe dekker en pH varierer fra 3 til 10. Vi brukte følgende protokollen leveres av leverandøren (oppsummert nedenfor):
- Klargjør følgende løsninger: løsning en (600 µL glyserol løsning, 60 µL OFFGEL bufferen, 4.34 mL ultrapure vann) og B (1.776 mL av løsning) og 444 µL ultrapure vann-løsning.
- Montere den IPG strimler, rammer og elektrodene i henhold til produsentens instruksjoner.
- Resuspend prøven med 1,8 mL løsning B. legge 40 µL løsning B i hver brønn. Legg 150 µL av prøve i hver brønn.
- Velg standard for peptider: OG12PE00 (OFFGEL standardmetoden for peptider for bruk med en 3100 OFFGEL lav oppløsning Kit, pH 3-10, 12-vel rammer. Vent til denne metoden er fullført (~ 20 h). Samle fraksjoner i riktig merket rør.
12. rydde opp Harvard apparater kolonnen omvendt C18 innlegg-IEF (Protocol 2)
- Gradvis legge til noen μL samtidig på 1% TFA i de-ionisert vann til hver fraksjon til syre prøven. Sjekk at pH er om 3 eller under pH papiret.
- Klargjør følgende løsninger: løsning 1 (5 mL av acetonitrile, 10 µL av maursyre, 4.99 mL ultrapure vann) og løsning 2 (0,5 mL av acetonitrile, 10 µL av maursyre, 9.49 mL ultrapure vann).
- Pre våt spinn kolonnen med 150 µL av løsning 1. Sentrifuger for 90 s på 750 x g og kast gjennomflytsenhet. Vask spinn kolonnen med 150 μL av løsning 2. Sentrifuger for 90 s på 750 x g og kast gjennomflytsenhet.
- Passere brøken gjennom kolonnen. Sentrifuger for 90 s på 750 x g og kast gjennomflytsenhet. Vask med 150 μL av løsning 2. Sentrifuger for 90 s på 750 x g og kast gjennomflytsenhet.
- Elute andel med 50 μL av løsning 1. Sentrifuger for 90 s på 750 x g. Gjenta disse trinnene igjen.
- Tørr-fraksjon bruker en vakuum konsentrator (150 x g, vakuum 160 mBar) og lagre-80 ° c
13. analyse av Proteomic Data og bioinformatikk18
- Analysere data innhentet av en nano-LC MS/MS masse spectrometer kvantifisering programvare som MaxQuant (versjon 1.5.2.8) og Andromeda søkemotoren.
- Angi false oppdagelsen rate (FDR) til 1% for både proteiner og peptider og Minimumslengden på 7 aminosyrer. Angi enzym spesifisitet som C-terminalen Arg og Lys. Tillat 2 tapte cleavages på proline obligasjoner. Velg carbamidomethylation av cystein som fast endring og N-terminal protein acetylation og metionin oksidasjon som variabel modifikasjoner.
- Analysere data med statistisk analyse software. Utføre en funksjonell berikelse analyse med FunRich programvare (www.funrich.org/). Utføre en genet ontologi berikelse analyse ved hjelp av DAVID programvare (https://david.ncifcrf.gov/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utgangspunkt i perifert blod mononukleære celler (PBMCs) ved differensial sentrifugering, protokollen tillater å oppnå en befolkning på CD14+ monocytter med en vurdert renhet på mer enn 98% av flowcytometri (figur 1). Disse monocytter skilles sekundært mot ulike polarisasjonene (figur 2). Når en fraksjoneres på gel er valgt, overføringen på SDS side gels er tilpasset å få antall ønskede felt, og feltene er forbrukeravgift (Figur 3). Fordøyelsen utføres sekundært i forbrukeravgift band av gel, så peptidene pakkes. Peptidene er analysert ved hjelp av en nano-LC (flytende kromatografi)-MS-/ MS masse spectrometer. MS-/ MS spectra gir identiteten av ifølge merknaden til spectra innhentet for kjente peptider (figur 4A). Kvantifisering av overflod av et protein beregnes i forbindelse med antallet identifiserte peptider ifra protein publiserte programvare og databaser15,16. Denne protokollen-gel fordøyelsen gir ca 4000 identifiserte proteiner, og det dynamiske området har blitt funnet for å dekke 5 logaritmisk skala enheter (figur 4B). Analyse av differensial uttrykket av disse identifiserte proteinene kan brukes til å bestemme klynging av ulike polarisasjonene under forskjellige oksygen miljøer.
Med denne metoden kan vi også gjenkjenne klynger av proteiner som er opp-regulert utsettes for en oksygen konsentrasjon av 3% (figur 5, tabell 1). For å vurdere effektiviteten av fordøyelsen, som er ikke mulig når en i-gel-protokollen brukes, vi foreslått en i-løsning fordøyelsen metode som er tilpasset til menneskelig makrofager (figur 6A). Med denne metoden kan vi lett få (etter-løsning fordøyelsen) identifikasjon av 3600 proteiner uten fraksjoneres, betyr at fraksjoneres med IEF vil fornuftig øke dette antallet (figur 6B).
Figur 1: Flow cytometri analyse av CD14 uttrykk for PBMC før sortering (venstre panel) og etter sortering (høyre panel) viser innhentet renheten etter magnetiske perler utvalg. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: kontrast bilder av ulike menneskelige makrofager viser heterogenitet innhentet morphologies for to ulike polarisasjonene. Skala linjen representerer 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: bildebehandling av Coomassie blå farget gel viser de ulike bandene som vil kreditert [her, 6 band i M(Ø) makrofager] for 5 polarisasjonene av makrofager utsatt for et lavt oksygeninnhold miljø. IC = immun komplekser, DXM = deksametason. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: MS-/ MS spectrum og kvantifisering. (A) et eksempel på et MS-/ MS spektrum. Vist her er CID (kollisjon-indusert dissosiasjon) spekteret av et peptid på m/z 597.29 på MS spekteret med en elektrisk ladning av 2. Tilsvarende sekvensen var bestemt fra dette spekteret som Val-Ala-Glu-Leu-Glu-Asn-Ser-Glu-Phe-Arg fra protein CD58. (B) rang organisert etikett-fri kvantifisering for hver av de identifiserte proteinene (logge10 LFQ). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: varmekartet representerer den hierarkiske klynger av alle polarisering sier bruker ulikt uttrykt proteiner. Analysen avdekker en klynge av proteiner overexpressed i alle polarisasjonene 3% O2 tilstanden (rød rektangel). Fargeskala representerer z-score (log2 intensitet). Hver rad er et protein og hver kolonne er et eksempel. Dette tallet stammer fra en tidligere publikasjon14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: SDS side og chromatogram. (A) sølv-farget SDS side gels med protein fra cellen lyse og etter-løsning fordøyelsen viser fraværet av nedbrytning under lyse og effektiviteten av fordøyelsen. (B) chromatogram innhentet fra etter-løsning fordøyelsen uten fraksjoneres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Klynge | proteinID | Protein navn | Gene navn | Peptider | Razor + unike peptider | Unik peptider | Protein-IDer | ||
| Rød | P0DMV9 | Varme sjokk 70 kDa protein 1B | HSPA1A | 40 | 37 | 4 | P0DMV9; P0DMV8; A8K5I0; Q59EJ3; B4DNT8; B4DWK5; B4DFN9; B4DI39; B4E1S9; B4DVU9; V9GZ37; B3KTT5; B4DNX1; B4E1T6; B4DNV4; Q9UQC1 | ||
| Rød | P54709 | Natrium/kalium-transport ATPase delenhet beta-3 | ATP1B3 | 8 | 8 | 8 | P54709; D3DNF9; C9JXZ1; C9JA36; H7C547; F8WBY4; Q58I18 | ||
| Rød | O00462 | Beta-mannosidase | MANBA | 14 | 13 | 13 | O00462; A7LFP5; A8K6D3; E9PFW2; B4DT18; Q59EG5 | ||
| Rød | Q8NAS7 | NADH dehydrogenase [ubiquinone] jern-svovel protein 7, mitokondrie | NDUFS7 | 4 | 4 | 4 | Q8NAS7; Q6ZQU6; F5H5N1; B7Z1U1; A8K0V6; Q7LD69; F5GXJ1; O75251; B7Z4P1; Q9H3K5; A0A087WXF6; A0A087WTI3; Q6ZS38 | ||
| Rød | Q8WWQ0 | PH-samspill protein | PHIP | 5 | 5 | 4 | Q8WWQ0; Q9NWP3 | ||
| Rød | E5RHK8 | Dynamin-3 | DNM3 | 11 | 2 | 2 | E5RHK8; Q9UQ16; B3KPF2; E5RIK2 | ||
| Rød | A0A024QZ64 | Fruktose-bisphosphate aldolase C | ALDOC | 18 | 14 | 7 | A0A024QZ64; P09972; B7Z1Y2; B7Z3K9; B7Z1N6; B7Z3K7; A8MVZ9; J3KSV6; J3QKP5; B7Z1L5; C9J8F3; K7EKH5; J3QKK1; B7Z1H6 | ||
| Rød | O75489 | NADH dehydrogenase [ubiquinone] jern-svovel protein 3, mitokondrie | NDUFS3 | 12 | 12 | 12 | O75489; Q9UF24; Q53FM7; E9PS48; E9PKL8; G3V194 | ||
| Rød | P21912 | Succinate dehydrogenase [ubiquinone] jern-svovel underenheten, mitokondrie | SDHB | 11 | 11 | 11 | P21912; A0A087WXX8; A0A087WWT1 | ||
| Rød | A0A024R1Y7 | GH3 domenet inneholder protein | LGP1; GHDC | 7 | 7 | 7 | A0A024R1Y7; Q8N2G8; B3KVB0; K7ESN3; K7EJT7; K7EQ41; K7EL54 | ||
| Rød | E5KRK5 | NADH-ubiquinone oxidoreductase 75 kDa underenheten, mitokondrie | NDUFS1 | 29 | 29 | 29 | E5KRK5; P28331; B4DJ81; Q9P1A0; C9JPQ5; F8WDL5 | ||
| Rød | A0A024QZ30 | Succinate dehydrogenase [ubiquinone] flavoprotein underenheten, mitokondrie | SDHA | 17 | 17 | 17 | A0A024QZ30; P31040; D6RFM5; B3KT34; A0A087X1I3; Q0QF12; B4DYN5; B3KYA5; B4DNB2; H0Y8X1; B7Z6J5 | ||
| Rød | A0A024R2F9 | Transmembrane protein 43 | TMEM43 | 16 | 16 | 16 | A0A024R2F9; Q9BTV4; Q8TEP9; V9GY05 | ||
| Rød | A0A024R5K3 | NADH dehydrogenase [ubiquinone] jern-svovel protein 8, mitokondrie | NDUFS8 | 5 | 5 | 5 | A0A024R5K3; E9PPW7; O00217; E9PN51; F8W9K7; E9PKH6; B4DYI3; Q53G17 | ||
| Rød | O76003 | Glutaredoxin-3 | GLRX3 | 13 | 13 | 13 | O76003 | ||
| Rød | Q1HBJ4 | Mitogen-aktivert protein kinase; Mitogen-aktivert protein kinase 1 | MAPK1 | 26 | 26 | 21 | Q1HBJ4; P28482; B4DHN0; Q499G7; K7ELV1; K7EN18; B4E104; P31152; Q16659 | ||
| Rød | Q13151 | Heterogen kjernefysiske ribonucleoprotein A0 | HNRNPA0 | 8 | 8 | 8 | Q13151 | ||
| Rød | V9HWN7 | Fruktose-bisphosphate aldolase A | ALDOA | 36 | 36 | 14 | V9HWN7; P04075; J3KPS3; H3BQN4; H3BUH7; H3BR04; H3BMQ8; H3BU78; H3BR68; A4UCS9; A4UCT0 | ||
| Rød | B4DVJ0 | Glukose-6-fosfat isomerase | GPI | 32 | 32 | 23 | B4DVJ0; P06744; B4DE36; A0A0A0MTS2; K7EQ48; K7EP41; K7EPY4; K7ELR7; K7ERC6; K7ENA0; K7ESF4; K7EIL4; K7ERK8; Q59F85 | ||
| Rød | V9HWB9 | L-laktat dehydrogenase; L-laktat dehydrogenase en kjede | LDHA | 36 | 36 | 34 | V9HWB9; P00338; B4DJI1; F5GXY2; F5GYU2; F5GXH2; F5H5J4; F5H6W8; F5GZQ4; F5H8H6; F5GXC7; F5GWW2; F5GXU1; A0A087WUM2; Q96L19; Q6ZMR3 | ||
| Rød | P13674 | Prolyl 4-hydroksylase delenhet alfa-1 | P4HA1 | 26 | 26 | 26 | P13674; Q5VSQ6 | ||
| Rød | Q6FHV6 | Gamma-enolase; Enolase | O2 | 18 | 15 | 14 | Q6FHV6; P09104; A8K3B0; F5H0C8; F5H1C3; U3KQP4; U3KQQ1; Q9NPL4 | ||
| Rød | Q99798 | Aconitate hydratase, mitokondrie | ACO2 | 40 | 40 | 40 | Q99798; B4DZ08; B2RBW5; A2A274; B4DJW1; B4DLY4; Q71UF1; B4DEC3; B4DW08; O75944 | ||
| Rød | P17858 | ATP-avhengige 6-phosphofructokinase, lever type | PFKL | 32 | 29 | 28 | P17858; Q7L2M7; Q9BSP4; B3KNQ7; B4E108; Q59GI2; F8WEU2; Q7Z3R9; Q6MZK4 | ||
| Rød | A0A024R872 | Niban-lignende protein 1 | FAM129B | 32 | 32 | 32 | A0A024R872; Q96TA1; Q9H8K1; Q2YD88; Q9H6L6 | ||
| Rød | A0A024RC61 | Aminopeptidase N | ANPEP | 58 | 58 | 25 | A0A024RC61; P15144; Q59E93; B4DV63; B4DP01; B4DP96; H0YKT6; H0YLZ8; Q71E46; H0YMC1; Q8IVL7 | ||
| Rød | V9HWF4 | Phosphoglycerate kinase; Phosphoglycerate kinase 1 | PGK1 | 41 | 41 | 35 | V9HWF4; P00558; B4E1H9; B4DHM5; B4DHB3; B4DWQ3; Q16444 | ||
| Rød | Q12882 | Dihydropyrimidine dehydrogenase [NADP(+)] | DPYD | 44 | 44 | 44 | Q12882; B4DML1 | ||
| Rød | B4DEQ0 | Elektron overføring flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase, mitokondrie | ETFDH | 9 | 9 | 9 | B4DEQ0; Q547S8; A7UNU5; Q16134; D6RAD5 | ||
| Rød | D9UAX9 | MHC klasse I antigen | HLA-B | 13 | 3 | 2 | D9UAX9 | ||
| Rød | V9HWK1 | Triosephosphate isomerase | TPI1 | 29 | 29 | 17 | V9HWK1; P60174; Q53HE2; B4DUI5; U3KPZ0; U3KQF3; U3KPS5 | ||
| Rød | Q96HE7 | ERO1-lignende protein alpha | ERO1L | 28 | 28 | 28 | Q96HE7; G3V3E6; G3V5B3; G3V2H0; G3V503; Q5TAE8; B2RD00; Q86YB8 | ||
| Rød | P14868 | Aspartate - tRNA ligase, cytoplasmatiske | DARS | 29 | 29 | 2 | P14868; Q53T60; Q53R85; H7BZ35; H7C278 | ||
| Rød | P36871 | Phosphoglucomutase-1 | PGM1 | 24 | 24 | 5 | P36871; B4DFP1; Q9H1D2 | ||
Tabell 1: Liste over uttrykt proteiner for menneskelig makrofager felles for hver polarisering under oksygen spenning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Proteomikk er et kraftig verktøy for å studere uttrykk for ulike proteiner fra en hel celle eller subcellular rom, er optimalisering av cellen lysis protokollen og fordøyelse av proteiner rettet av en rekke studier. Det er tre hovedgrupper av metoder, inkluderer i-gel fordøyelse (fordøyelsen av proteiner i polyakrylamid gel matrix)17, fordøyelsen løsning18 og filter-hjulpet eksempel forberedelse19. Denne siste metoden, først beskrevet som universell, har blitt rapportert å lav reproduserbarhet og mulig tap av proteiner på filteret20. I-gel fordøyelsen er en robust metode som kan være tidkrevende og uheldig at vurdere effektiviteten av fordøyelsen ikke er lett, hvis mulig. I-løsning fordøyelsen tilbyr denne muligheten, men krever rengjøring av prøver etter fordøyelsen og IEF. Når disse to metodene sammenlignes mellom samme prøven, gir i-løsning fordøyelsen med IEF fraksjoneres protokollen et høyere antall identifiserte proteiner (med samme antall fraksjoner) enn i-gel fordøyelsen21.
Til tross for denne fordelen er det nødvendig å vurdere mulig protein fornedrelse under-løsning lysis på grunn av intracellulær proteaser (spesielt i myeloide celler). Det er også viktig å huske at disse teknikkene er basert på protein fordøyelse og bare kjøpedyktig analysere proteiner presentere trypsin bestemte kuttesetet nettsteder. Det er mulig å bruke en topp-ned proteomic tilnærming som lindrer denne fordøyelsen betingelsen men legger data analyse trinnene og bioinformatikk ressources22. Solubilization av proteiner fra ulike mobilnettet rom kan også være vanskelig å få, spesielt fra plasma membraner, fører til en ukontrollert utvalg av mobilnettet proteom. For å fortsette med en nano-LC--MS-/ MS masse spectrometer analyse av prøvene, er det viktig å få en tilstrekkelig mengde peptider som kan avhenge av masse spectrometer brukes (vanligvis starter totale protein bør være minst 1 µg vilkår, og Det er underforstått for å øke antallet av antall brøk med IEF). Denne betingelsen kan være en ulempe hvis cellen befolkningen blir studert er knappe, som skiller proteomic fra genomisk teknikker som forsterkning av råvaren er mulig.
Selv etter banebrytende verk av Richer og kolleger23 og Packer og Fuehr24, har viktigheten av oksygen i cellekulturer vært anerkjent. Vi vet nå at dyrking celler under Oksygenkonsentrasjoner favoriserer vedheft, levetid og divisjon. Det er anerkjent at dette er av største betydning i stilk cellen forskning25. De viktigste tekniske problemet for cellekulturer under kontrollerte oksygen forhold knyttet til vedlikehold av ønsket oksygen konsentrasjon under hele eksperimentet. Dette krever pre-inkubering av alle media å hindre utgivelsen av oppløst oksygen og bruke hypoxic arbeider stasjoner for å tillate manipulering av celler under oksygen (behandling kammeret hanskerommet) og hindre forbigående exposition høy oksygen forhold .
Beskrevet protokollen ble brukt til å få den molekylære signaturer av ulike polarisasjonene av menneskelig monocytt-avledet makrofager og studere virkningene av oksygen modulering på disse signaturer. Denne studien har gitt innsikt på beskrivelsen av de polarisasjonene og har avslørt noen funksjonell konsekvenser. For eksempel fant vi at mange proteiner involvert i efferocytosis var modulert av et lavt oksygeninnhold miljø. Denne proteomic basert på beskrevet protokollen, gir muligheten til å utforske hvordan miljømessige parametere endre macrophage funksjoner og hvordan disse signalene kan brukes til å utforme nye behandlingsmetoder14.
Proteomic-tilnærming som er beskrevet i dette arbeidet er komplementære til genomisk tilnærminger som har blitt brukt de siste årene i feltet av menneskelig macrophage polarisering studier. Proteomikk tilbyr fordelen av protein kvantifisering, som kan presentere et annet uttrykk enn deres tilsvarende mRNAs på grunn av post-translasjonell modifikasjoner og føre til oppdagelsen av nye biomarkers. Til tross for denne fordelen er proteomic data vanligvis vanskelig å tolke, delvis på grunn av høy følsomheten av massespektrometri, fører til svært komplekse MS spectra og false positiv oppdagelsen av peptider. Nylig fått analyseprogramvare effektivitet for å hindre dette. Selv om det er en endring situasjon, Proteomikk også ansikter lavere reproduserbarhet genomics26 , og er forbundet med godkjenningen skritt benytter andre teknikker (flowcytometri, immunoblotting) for å bekrefte kvantitative modifikasjoner av protein uttrykket nivåer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke interessekonflikter.
Acknowledgments
AM er finansiert av unge gruppen leder Program (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), av la Ligue Nationale contre le kreft og la ARC Fondation pour la recherche sur le kreft. Vi takker Mariette Matondo fra massespektrometri for biologi plattformen (UTECHS MSBIO, Pasteur Institute, Paris). Vi takker Lauren Anderson for hennes av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hypoxia Working Station | Oxford Optronix | Hypoxylab | |
| C6 Flow cytometer | BD | Accuri C6 | |
| Urea | Agilent Technologies | 5188-6435 | |
| Formic acid (FA) | ARISTAR | 450122M | |
| R-250 Coomassie blue | Biorad | 1,610,436 | |
| Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS) | Calbiochem | 437627 | |
| 2D clean-up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| RPMI 1640 medium, glutamax supplement | Gibco | 61870044 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X | Gibco | 11140-035 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column | Harvard Apparatus | 74-4601 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| NuPAGE Bis-Tris 4-12% | Life Technologies SAS | NP0321 BOX | |
| CD14 Microbeads human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| MACS separation column LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) | Miltenyi Biotec | 130-096-485 | |
| Interleukin 4 (IL4) | Miltenyi Biotec | 130-093-917 | |
| Interleukin 13 (IL13) | Miltenyi Biotec | 130-112-410 | |
| Interferon gamma (INFγ) | Miltenyi Biotec | 130-096-482 | |
| CD14-FITC (clone TÜK4) | Miltenyi Biotec | 130-080-701 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Pierce | 28904 | |
| Trypsin/Lys-C Mix | PROMEGA | V5073 | |
| Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Density Gradient Solution (Histopaque 1077) | Sigma Aldrich | 10771-100ML | |
| Accumax | Sigma Aldrich | A7089-100ML | |
| Human Serum from human male AB plasma (SAB) | Sigma Aldrich | H4522-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30% | Sigma Aldrich | A9576-50ML | |
| Trisma-base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | 49767 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 114405 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% | Sigma Aldrich | 5030 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34888 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | 57670 | |
| Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | |
| CHAPS | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Micro BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| 5 mL sterile plastic pipette | VWR | 612-1685 | |
| Thermomixer C Eppendorf | VWR | 460-0223 | |
| Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg | Waters | WAT036820 |
References
- Okabe, Y., Medzhitov, R. Tissue biology perspective on macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
- Murray, P. J. Macrophage Polarization. Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).
- Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation. Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).
- Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
- Xue, J., et al. Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).
- Csete, M. Oxygen in the cultivation of stem cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).
- Johansson, A., et al. Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).
- Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).
- Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line. PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).
- Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Court, M., et al. Toward a standardized urine proteome analysis methodology. Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).
- Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
- Liebler, D. C., Ham, A. -J. L. Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics. Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).
- Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis. Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells. Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
- Lengner, C. J., et al. Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations. Cell. 141 (5), 872-883 (2010).
- Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology. Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).
