Summary
여기, 우리는 바이러스 성 식 벡터 실크 fibroin 영화를 사용 하 여 뇌에 전달 하는 방법을 제시. 이 메서드는 식 벡터 실크/AAV 코팅된 광섬유, 광섬유 테이퍼 및 두개골 창 사용의 대상된 배달 수 있습니다.
Abstract
드라이브 동작 출력 하기 위해서는 프로세스 정보를 크게 조작 하 고 신경 비보의 활동을 모니터링에 대 한 최근 개발 된 광학 방법으로 지원 되었습니다 어떻게 신경 회로 이해 하는 탐구. 두 가지 주요 구성 요소에 의존 하는 이러한 유형의 실험: 두뇌에 광 액세스를 제공 하는 1) 이식 장치 및 신경 흥분을 변경 또는 신경 활동의 판독을 제공 하는 2) 빛에 민감한 단백질. 빛에 민감한 단백질을 표현 하는 방법의 수 있지만 바이러스 성 벡터의 stereotaxic 주입은 현재 가장 유연한 접근 식 유전, 해부학, 그리고 시간적 정밀도로 제어할 수 있기 때문에. 바이러스 성 벡터의 위대한 유틸리티에 불구 하 고 제공 하는 바이러스 광학 임 플 란 트 포즈의 사이트에 수많은 도전을. Stereotaxic 바이러스 주사는 수술 수술 시간을 증가, 연구, 비용 증가 및 동물의 건강에 위험이 포즈를 요구 하 고 있다. 주입 주사기와 높은 titer 바이러스의 bolus의 갑작스러운 납품으로 인 한 면역성 염증 주변 조직은 물리적으로 손상 될 수 있습니다. 작은 영역을 대상으로 주사 광학 임 플 란 트를 정렬 하는 것은 특히 어려운 뇌에 깊은. 이러한 과제를 극복 하기 위해 여러 유형의 영화 실크 fibroin 및 Adeno 관련 바이러스 (AAV) 벡터의 구성된으로 광학 임 플 란 트를 코팅 하는 방법을 설명 합니다. Fibroin, 누에나방, 누에고치에서 파생 된 폴리머 캡슐화 할 수 있습니다 및 생체를 보호 하 고 수용 성 필름에서 도자기까지 양식에 처리할 수 있습니다. 뇌에 이식, 실크/AAV 코팅 식이 필요한 곳에 정확 하 게 운전 하는 광학 요소와 주변 뇌 사이의 인터페이스에서 바이러스를 해제 합니다. 이 메서드는 쉽게 구현 되며 크게 신경 회로 기능 vivo에서 연구를 촉진 하는 약속.
Introduction
지난 10 년간 모니터링 및 신경 활동1조작에 대 한 설계 빛에 민감한 단백질의 폭발을 생산 하고있다. 바이러스는 뇌에서 이러한 optogenetic 도구를 표현 하기 위한 탁월한 유연성을 제공 합니다. 유전자 변형 동물에 비해, 바이러스까지 쉽게 생산, 수송, 저장, 최신 optogenetic 도구 빠른 구현을 허용 하는. 식 유전자 뚜렷한 신경 인구를 대상 수 있습니다 그리고 역행 수송을 위해 고안 된 바이러스도 대상으로 신경 연결2를 기반으로 식에 사용할 수 있습니다.
바이러스는 일반적으로 시간이 많이 걸리는 및 어려운 수 stereotaxic 주사와 함께 도입 됩니다. 정확 하 게 작은 영역을 대상으로 어려울 수 있습니다, 하지만 종종 넓은 지역에 식 운전 많은 주사. 또한, 광학 장치 이후에 빛 vivo에서제공 하는 두뇌에 심은 경우는 임 플 란 트 정렬 되어야 합니다 제대로 바이러스 주입으로. 여기, 이식된 장치 실크 fibroin 영화3를 사용 하 여 주위 조직에 바이러스 성 벡터를 제공 하기 위한 쉽게 구현 하는 방법을 설명 합니다. 실크 fibroin 상용, 신경 조직에 의해 잘 용납 이며 다양 한 특성을 가진 재료를 생산 하는데 사용 될 수 있습니다. 실크 영화 microinjection 펫 같은 일반적인 실험실 장비를 사용 하 여 임 플 란 트에 적용할 수 또는 펫 손. 실크/AAV 영화 두 수술 절차에 대 한 요구를 제거 하 고 바이러스 중재 식 광학 임 플 란 트에 제대로 정렬입니다. 결과 식이 섬유, 그리고 stereotaxic 주사 보다 섬유 트랙을 따라 덜 원치 않는 식에는 결과의 끝에 제한 됩니다.
대상된 표현의 끝에 작은 섬유 생산, 뿐만 아니라 실크/AAV 영화를 광범위 하 게 사용할 수 있습니다 (> 3 m m 직경) 두개골 창 아래 피 질 식. 형광 활동 센서의 2 광자 영상 vivo에서 감각 및 인지 처리 운전에 신경 활동의 역할을 평가 하기 위한 필수적인 도구 되고있다. 그러나, 동일한 드라이브에 광범위 한 대뇌 피 질의 영역, 자주 경험 식 여러 주사를 수행 합니다. 이러한 주사 매우 시간이 오래 걸릴 수 있으며 보기의 필드에 걸쳐 일치 하지 않는 식으로 이어질 수 있습니다. 반면, 실크/AAV 코팅 두개골 윈도우는 매우 쉽게 제조, 크게 수술에 필요한 시간을 줄일 수 및 가장 눈에 띄게 표현 수백 미크론 대뇌 피 질의 표면 아래 드라이브.
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Protocol
동물을 포함 하는 모든 실험 동물 관리 미국 NIH 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 설명 된 다음 지침에 하버드 상임 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 수행 했다. 성인 C57BL/6 마우스 중 섹스 (나이의 6-15 주)의 모든 실험을 위해 사용 되었다.
1. 수성 실크 Fibroin을 구하십시오
- 준비 하거나 수성 실크 fibroin (5-7.5 %w / v)을 구입 합니다.
2. AAV 식 벡터와 수성 실크 믹스
- AAV 식 벡터 optogenetic 단백질 또는 선택의 형광 표시기를 선택 합니다.
참고: 여전히 강력한 식 운전 하면서 임 플 란 트를 적용 해야 하는 실크/AAV의 볼륨을 최소화 하기 위해 주식 titer AAV (재고는 10 ~13 gc/mL 주위에 일반적으로 벡터 코어에서 얻은 titers) 것이 좋습니다. - 코팅 임 플 란 트, 직전 AAV의 약 수를 해 동 하 고 5-7.5% 수성 실크 fibroin (이 혼합물 것 이다 라고도 실크/AAV) 결합. 200 µ L PCR 튜브에 믹스 수성 fibroin AAV (두개골 windows 사용 1:4)에 대 한 1:1 비율로 응용 프로그램 직전. 부드럽게 플라스틱 솔루션 여러 번 밖으로 철저히 fibroin AAV를 믹스 하.
- 얼음에 실크/AAV 혼합물 계속 사용 하기 전에.
3. 제조 및 실크/AAV 코팅 장치 저장 장비 준비
- 코팅 광섬유 및 그라데이션 인덱스 (미소) 렌즈 (그림 1, 2)에 대 한 장비를 조달.
- 안정적인 아무 홀더를 생성 합니다. 잡고 세라믹 깃 봉, ¼"시트 아크릴 블록에 1.25 m m 구멍을 드릴 합니다. 구멍 세트 나사 장소에 깃 봉 잡아 측면에서 삽입을 누릅니다.
참고: 어떤 클램프는이 목적을 위해 사용할 수 있습니다. - 서브 밀리미터 정밀도 광학 섬유 (stereotaxic 장치 또는 다른 정밀 micromanipulator)를 이동 하는 조작 위치.
- 안정적인 홀더는 microinjector를 조립.
- 광학 섬유와 실크 물방울을 시각화 하는 stereoscope를 사용 합니다.
- 광학 섬유 조명 광원을 배치 합니다.
- 안정적인 아무 홀더를 생성 합니다. 잡고 세라믹 깃 봉, ¼"시트 아크릴 블록에 1.25 m m 구멍을 드릴 합니다. 구멍 세트 나사 장소에 깃 봉 잡아 측면에서 삽입을 누릅니다.
- 두개골 창 (그림 3) 코팅 장비를 준비 합니다.
- 어떤 P10 pipettor를 선택 합니다.
- 뚜껑이 있는 컨테이너를 가져옵니다.
참고: 실리콘 바닥 어떤 콘테이너 든 지 제안-부드러운 바닥 용이 두개골 윈도우를 해제.
- 완성 된 보 형 물 (그림 4)를 저장 하는 장비를 준비 합니다.
- 작은 (1-5 L) 진공 챔버를 얻을.
- 저장 공간을 4 ℃ 냉장고에 이식 되어 있는지 확인 합니다.
4. 장치를 실크/AAV 영화 적용
- 섬유 끝에 드라이브 초점 식 광학 섬유 코팅
- 앞에서 설명한4만성 섬유 임 플 란 트를 준비 합니다.
- 사용 전에 린스 에탄올, 임 플 란 트 다음 되도록 초순 광학 섬유는 깨끗 합니다.
참고: 실크 영화 유리 표면을 청소를 더 안정적으로 준수. - 깃 봉 섬유를 장치를 준비 합니다. 전형적인 1.25 m m 직경 깃 봉, 사용 블록 ¼ 인치 명확한 아크릴, ~1.3 mm 구멍 및 구멍 임 플 란 트 (그림 1A) 장소에 단단히에 측면에서 입력 설정된 나사를 도청.
- 마운트는 microinjector 장착 stereotaxic 장치 (또는 어떤 조작 솔루션 submillimeter 정밀)으로 아무 홀더. 아무 소유자는 microinjector 위에 놓고 아래에서 실크/AAV 혼합물을 적용 합니다.
참고: 응용 프로그램에서 대용량의 결과 끝에 제한 되었다 실크/AAV 때문입니다. 그러나, 많은 작은 순차 볼륨에서 위 또는 아래에의 응용 (비록 우리가 아래에서 적용 하는 것을 선호) 끝에 수감 되는 AAV/실크 예금 생성할 수 있습니다. - 붕 규 산 유리에서 표준 intracranial 주입 피펫은 당겨 모 세관.
- 쉽게 하려면
- 원하는 직경의 깨끗 한 플랫 팁 주입 팁을 생성 하려면 각 손에 한 피 펫을 보유 하 고 한 피 펫에는 테이퍼의 두꺼운 부분을 사용 하 여 원하는 휴식 위치에서 다른 피 펫을 점수.
- 부드럽게 문 지 르와 톱 모션 (유리에 유리 채 점 방법).
- 피펫으로 득점 후 깨끗 한 휴식을 달성 하기 위해 다른 피 펫의 시체와 함께 득점된 피 펫의 끝에 부드러운 압력을 적용.
- 광섬유의 명확한 보기를 주고 stereoscope 위치.
참고: 배율 광학 섬유의 얼굴 위에 주입 피펫으로 정확 하 게 위치 충분 해야 한다. - 홀더 아래쪽으로 직면 하는 광섬유의 두뇌 측면에 섬유 임 플 란 트를 삽입 합니다.
- 모든 표준 intracranial 주입5실크/AAV 솔루션 주입 피 펫을 로드 합니다. 임 플 란 트 ~ 30% 손실 펫 막힘 때문에 맞게 추가 플러스 만들어지고 수에 필요한 금액을 로드 합니다. 예를 들어 10 이식 사항이 되 고, 다음 100 nL 예금 로드 하 고 ~1.3 µ L를 철회.
참고: 실크/AAV 피펫으로 방해할 수 분출 사이 피 펫 끝에 건조 수 있습니다. 큰 직경 펫 (50-100 µ m) 덜 방해할 가능성이 있다. 나 막 신 젖은 종이 지우기 또는 알코올 면봉으로 피 펫의 끝 아래로 부드러운 칫 솔 질에 의해 dislodged 수 있습니다. - 만지거나 거의 광섬유 화면 가운데의 감동까지 주입 피펫으로 기동. 실크/AAV 솔루션의 10-20 nL를 꺼냅니다. 피펫으로 철회.
참고: 배달 속도가 중요 하지만 일반 요금은 5-20 nL/s. - ~ 1 분 이내 평면 필름 건조 액체 돔으로 표시 되는 평평한 표면에 실크/AAV의 bolus 관찰 (그림 1B).
- 반복 단계 4.1.9-4.1.10 때까지 실크/AAV의 원하는 금액 입금 (대부분의 응용 프로그램에 대 한 20-200 nL의 총). 여러 개의 임 플 란 트를 준비할 때 한 임 플 란 트에 실크/AAV를 적용 하 고 반환 하기 전에 다른 임 플 란 트 코트 이동 첫 번째.
- 임 플 란 트를 이동 하기 전에 건조를 위한 1 시간을 허용 합니다.
- 진공 desiccate 하룻밤에 ~ 125 Torr (-25에. Hg), 4 ° c. 진공 챔버에 전체 아무 홀더를 배치 하 여 이렇게 합니다.
- 모양 및 고 전력 현미경 결과 실크 영화의 위치를 평가 합니다. 영화 광 표면 끝에 수감 된다, 상대적으로 얇은 것 (> 100 µ m), 및 대칭 (그림 1C).
참고: 크거나 비대칭 실크/AAV 영화 수 분리 하십시오 섬유에서 이식 (그림 1D) 동안. 문제의 가장 일반적인 원인은 많은 작은 볼륨의 순차 응용 프로그램 보다는 하나의 큰 볼륨의 응용 프로그램에서 발생합니다.
- 코팅 섬유 축 드라이브 식 광섬유 테이퍼
- 테이퍼 광섬유 임 플 란 트를 구하는 고 테이퍼 섬유는 인젝터 (그림 2A)에 수직이 되도록 옆으로 위치를 제외 하 고 단계 4.1.2-4.1.8를 수행 합니다. 인젝터를 테이퍼 섬유 위에 놓습니다.
참고: 표면 장력 방울 주입 피 펫에 다시 하거나 마이그레이션할 테이퍼 섬유를 일으킬 경향이 있기 때문에 과제를 추가 로드 테이퍼 섬유 포즈에 액체 방울. 작은 사출 펫 (30-50 µ m 직경)이이 문제를 극복 하지만 주입 피펫으로 방해할 것입니다 위험을 증가 시킬 것을 도울. 표면 장력으로 인해 방울 큰 면적의 영역을 준수 하는 경향이, 그래서 최적의 주입 플라스틱 크기 테이퍼 섬유와의 가끔 덩어리에 대 한 허용 오차의 크기에 따라 달라 집니다. - 광섬유의 측에 대하여 실크/AAV 주입 피펫으로 테이퍼의 시작 부분에 배치 합니다. 사출 피펫으로 광섬유를 만지고 있다 다는 것을 확인 하십시오.
- 20 꺼내기 코팅 과정을 시작 하려면 실크/AAV의 nL. 드롭릿에 광학 섬유에 고착, 섬유/피 펫의 인터페이스에 남아 확인 하십시오. 실크/AAV 마른로 부드럽게 섬유 끝의 끝으로 물방울을 심지 (~ 45 s). 피 펫 팁 막힘 방지 하려면 건조 작은 물방울 접촉 주입 피 펫을 계속.
참고: 각 보증금 테이퍼 섬유 (그림 2B)의 약 400 µ m을 코트 한다. - 첫 번째 bolus 거의 완전히 건조 했다, 또 다른 20를 꺼내기 nL 테이퍼 따라 물방울 wicking 계속.
참고: 액체 실크 것입니다 준수 건조 실크 피펫으로로 작은 물방울의 한쪽 끝을 고정 테이퍼를 따라 이동. - 적은 양의 실크/AAV, 꺼내기 및 점차적으로 테이퍼의 측면을 솔루션 그리기 여 4.2.4 단계를 반복 합니다. 5-6 분출은 2.5 m m 테이퍼의 표면을 통과 하기에 충분.
- 더 균일 한 표현의 모든 측면 주위 섬유를, 섬유를 회전 하 고 실크/AAV의 원하는 금액 입금 되었습니다 때까지 4.2.2-4.2.5 단계를 반복 합니다.
- 매달려 물가의 경우 건조 실크/AAV 섬유 팁, 신중 하 게가 위, 가닥을 잘라 확장 하거나 방출 피 펫을 사용 하 여 다시 가닥을 구 부 섬유의 테이퍼에 고착을 합니다.
- 임 플 란 트를 이동 하기 전에 건조를 위한 1 시간을 허용 합니다.
- 4 ° c.에서 진공 desiccate 하룻밤 전체 아무 홀더 진공 챔버에 놓일 수 있다.
- 모양 및 고 전력 현미경 결과 실크 영화의 위치를 평가 합니다.
참고: 영화 완전히 균일 하지 않이 필요 하지만 이식 (그림 3C) 동안 조직 주위에 손상을 최소화 하기 위해 섬유의 표면 넘어 100 µ m를 확장 하는 요동 하지 말았어야. 필름 크기를 최소화 하려면 각 방울 이후의 예금 하기 전에 완전히 건조 하다 중요 하다.
- 테이퍼 광섬유 임 플 란 트를 구하는 고 테이퍼 섬유는 인젝터 (그림 2A)에 수직이 되도록 옆으로 위치를 제외 하 고 단계 4.1.2-4.1.8를 수행 합니다. 인젝터를 테이퍼 섬유 위에 놓습니다.
- 코팅 미소 렌즈 임 플 란 트
- 미소 렌즈6,7 을 얻기 고 4.1.2-4.1.8 단계를 반복 합니다. 인젝터 위에 장착할 수 있습니다.
- 단일 방출 (1.0 m m 직경 렌즈에 대 한 1 µ L)에 실크/AAV를 입금.
참고:이 렌즈의 얼굴에 고착 하 고 균일 한 필름 (100-200 µ m 두께) 생산 건조 액체의 돔을 얻을 것입니다. 그러나, 하나의 큰 방출 균일 하 게 건조 하 고 미소 렌즈의 가장자리 근처 두꺼운 필름을 생산 하 고, 그 시도 여러 작은 물방울 (100-200 nL) 입금 (입금 하기 전에 건조 각 방울 수 있도록 렌즈 표면의 중심에서 다음) 영화 보기의 필드의 중앙에 식 드라이브 것입니다 수 있도록. - 임 플 란 트를 이동 하기 전에 건조를 위한 1 시간을 허용 합니다.
- 모양 및 영화는 렌즈의 표면을 커버 수 있도록 고 전력 현미경 결과 실크 영화의 위치를 평가 합니다.
- 코팅 유리 두개골 창
- 준비 유리 접착 2 3 m m 직경에 의해 두개골 창 광학 접착제로 한 5 mm 직경 창 coverslips (제 1 두께) 라운드 (자세한 내용은 Goldey 외. 20148참조).
- 실크: 바이러스 영화에서 실크의 총 금액을 줄이기 위해 1: 4의 비율로 섞는다. 과도 한 양의 실크 할 하지 이식 후 두개골 창 아래 분해 됩니다. 적정 실험 비율 및 원하는 식 프로필을 제공 하는 볼륨을 결정 해야 할 수 있습니다.
- 손 5 µ L 방울 3mm (뇌 연결) coverslip의 표면에 플라스틱. 드롭릿에 전체 유리 표면 (그림 3)에 밖으로 전파 한다.
- 윈도우를 이동 하기 전에 건조 하는 2-3 h를 하실 수 있습니다.
5. 저장 실크/AAV 코팅 임 플 란 트
- (그림 4A)를 사용 하 여 전에 냉각된 진공 desiccator (125 ~ 하루, 4 ° C)에 실크/AAV 코팅 광섬유를 저장 합니다.
- 대형 실크 영화 진공 저장 실패 완전히 이식 후 해산 두개골 창과 아래 진공, 미소 렌즈를 저장 하지 마십시오. 임 플 란 트 두개골 창과 미소 렌즈 즉시 건조 후, 또는 제조 대기압와 4 ° C에 저장 하는 경우의 하루
6. 이온 주입 장치
- 앞에서 설명한4동물 임 플 란 트 수술에 대 한 준비.
- 간단히, 케 타 민/xylazine (100/10 mg/kg)의 복 주사와 쥐를 anesthetize 하 고 부드러운 발가락-핀치를 사용 하 여 마 취의 깊이 확인 합니다. 이식의 영역에서 두개골을 면도 하 고 요오드와 알코올 두 피를 청소.
- 산 동물 stereotaxic 장치와 산소와 isoflurane (1-2%)의 혼합물을 사용 하 여 보충 마 취에서. 관심의 영역 두 피에 절 개를 확인 하 고 수행 craniotomy 플을 수용할 수 있습니다.
- 광학 섬유9 와 microendoscope 렌즈10 이전 게시 절차에 따라 이식. 핸들 식은 주의 실크/AAV 예금은 불완전 craniotomy, 또는 임 플 란 트 두개골의 가장자리에 의해 떨어져 나 수 있습니다로. 뇌에는 임 플 란 트를 천천히 낮은 (~ 2 m m/분).
- 8이전 설명으로 임 플 란 트 두개골 창. 윈도우의 코팅된 면을 터치 고이 바이러스를 씻어 수 있습니다 gavage, 수행 하는 경우 액체와 창을 rinsing 방지 하지. 최대한 식을 달성 하는 durotomy를 수행 합니다.
7. 식의 계산 및 문제 해결
- 평가 virally 표현 단백질의 표현, 하 수 ~ 2-3 주 식 드라이브 다음 인산 염에 4 %paraformaldehyde intracardial 관류를 수행 하는 바이러스에 대 한 버퍼링 염11 및 프로세스 뇌 조직의 형광에 대 한 현미경 검사 법12.
- 형광 현미경 fluorophore 태그 optogenetic 단백질의 표정 패턴 이미지를 사용 하 여 식을 평가 합니다.
- 실크/AAV 코팅의 총 볼륨을 증가 하거나 선호 높은 titer 바이러스를 사용 하 여 식의 수준이 충분 하지 않을 경우 코팅에 바이러스의 양을 증가.
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Representative Results
평가 식에서 실크/AAV 영화의 성공, 우리 끼얹는다 동물 이식 후 2-3 주 하 고 관심의 영역에서 두뇌 분할 영역을 준비. Fluorophore 태그 optogenetic 단백질 (YFP ChR2)의 형광 이미지 (그림 1D) 표현의 넓이의 측정을 제공합니다. 일반적인 광학 섬유 (230 µ m 직경) 쉽게 200을 수용할 수 있는 실크/AAV의 nL. 연습, 경험 이식된 섬유 (그림 5)의 신뢰할 수 있는 식 팁 주위를 얻을 수 있습니다.
평가 식 두개골 창 실크/AAV 코팅에 의해 구동, 이미징 이식 후 7-10 일을 시작 합니다. 우리는 시각화에 대 한 2 광자 영상을 사용 하지만 형광 이미징는 CCD와 같은 다른 방법을 사용할 수도. 코팅 두개골 창문이 두 가능한 문제는 부족 한 표현과 해산 하 고 시야를 어둡게 실패 실크 영화입니다. 식 증가, 창, 이식 또는 영화에서 바이러스의 양을 증가 하기 전에 durectomy를 수행 하는 것이 좋습니다. 우리는 최고의 식 각각 실크와 주식 titer AAV의 1: 4의 혼합물을 사용 하 여 달성. 이 바이러스 성 입자 stereotaxic 주사에 일반적으로 사용 하는 보다 실질적으로 더 큰 수를 나타냅니다, 하는 동안 감소 수술 시간 카운터 바이러스의 한계 추가 비용. 한편, 실크 영화 창 아래 해산 하지, 실크 코트 창 사용의 양을 줄입니다. 실크 코팅된 윈도에서 총 금액 이상의 섬유 임 플 란 트에 10-100 배 이며 영화는 덜 조직에 포함 된 및 따라서 노출 되지 않을 수 분해 활동의 동일한 수준에 보다는 실크 영화13를 분해 수 있습니다. 그러나, 일부 실크의 존재 때문에 바이러스의 혼자 만든 영화 수술 동안 틈새 액체에 의해 멀리 세척은 windows3, 가능성이 아래 식을 달성 하는 데 필수적 이다.
그림 1: 광학 섬유 실크/AAV 영화를 적용. (A) 만성 섬유 임 플 란 트 섬유 홀더 (삽입 된)로 사이드 다운 XYZ 번역기에 배치 됩니다. 섬유 아래 고정된 microinjector 섬유 팁에 실크/AAV dispenses. stereoscope 프로세스의 시각화 수 있습니다. (B) 실크/AAV 섬유 팁 (10-20 nL) 작은 볼륨에 적용 됩니다. 꺼내기는 bolus, 후 철회 피펫으로 고 ~ 60 방울 플랫 영화 건조에 대 한 s. 프로세스를 반복 하 여 필요한 볼륨 섬유 팁에 적용 되었습니다. (C) 실크 코팅 검사 합니다. 부적 절 한 코팅 섬유 얼굴 만드는 그들 섬유에서 꺼내 려 하는 경향이 (오른쪽)에서 바깥쪽으로 확장 하는 동안에 최적의 코팅을 중심 하 여 섬유 팁 (왼쪽)으로 한다. (D) 대표 섬유 실크/AAV의 nL 그리고 결과 AAV 기반 ChR2 YFP 200 코팅 식 이식 후 2 주. 오른쪽에 코팅 섬유의 얼굴 과거 protruded 실크/AAV 주입 하는 동안 광학 섬유에 고착 하지 않았다 때문에 가능성이 거의 없는 식 결과 하는 동안 왼쪽에 소형 실크/AAV 코팅 강력한 식 결과. 규모는 0.2 m m (섬유) 및 1.0 m m (뇌 조각) 바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 설치를 위한 테이퍼 섬유 코팅 임 플 란 트. (A)는 microinjector 테이퍼 섬유 홀더 위에 탑재 되 고 테이퍼 섬유는 기가 방출 주사기를. (B) 시작에서 가장 넓은 (삽입 된) 고 방출 주사기는 테이퍼의 지점으로 이동 하는 동안 작은 볼륨을 추출. 이 테이퍼의 길이 따라 연속 코팅에 결과. (C) 대표 테이퍼 섬유 시각화에 도움 빠른 그린 섞인 실크로 코팅. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 두개골 창 코팅. 실크/AAV 손 피 펫을 사용 하 여 적용된 두개골 창 될 수 있습니다. 표준 3 m m 직경 창 평면 영화에 서서히 건조 됩니다 5 µ L 물방울 코팅 될 수 있습니다. 삽입: GCaMP6f 식 실크/AAV 코팅 두개골 윈도 durectomies 없이 이식에서 발생. 이 그림에서 잭 맨 외 적응 되었습니다. (2018) 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 임 플 란 트 코팅 실크/AAV 저장. (A) 잔여 습기를 제거 하 고 바이러스 효능, 보존에 사용 될 때까지 4 ° C에서 진공에서 임 플 란 트를 저장 합니다. 이 방식으로 저장 하는 임 플 란 트 유지 가능한 최소 7 일. (B) 식 스토리지의 7 일 후 이식 4 실크/AAV 코팅된 섬유에서 발생. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 실크/AAV-GFP 코팅 광섬유 안정적으로 운전 식. 24 연속 striatal에서 조각의 형광 이미지 식은. 각 임 플 란 트 1: 1의 100-400 nL 실크/AAV-GFP 코팅 했다. 이 일대 임 플 란 트의 제한 (이 경우 지가)에서 임 플 란 트 사이트에 식 실크의 기능을 나타냅니다. GFP 형광 녹색; 표시 DAPI 얼룩은 파란색으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
실크/optogentic 단백질의 표현 대상으로 AAV를 사용 하 여 현재 사용 중인 접근법의 한계를 극복 한다. 많은 연구에서는 성공적으로 AAV 주사를 사용 하 여 optogenetic 단백질을 표현 하기 위해, 비록 식 광 섬유의 끝에, 테이퍼 섬유의 길이 주변 지역 그리고 미소 렌즈의 보기 영역에 맞게 도전 이다. 광학 부품 및 optogenetic 식 사이의 부정합, 인해 stereotaxic 주사 신뢰할 수 있는, 수 고 많은 실험 실패. 실크/AAV 방법 우리가 여기 설명 라벨에이 문제를 해결 합니다. 그것은 또한 두 번째 수술 단계를 제거 하 여 및 경우에 따라 두 번째 수술에 대 한 필요성을 제거 절차를 간소화 합니다. 그것은 바이러스 두개골 창 아래 광범위 하 게 식을 사용 하 여 또한 어려울 수 있습니다 그리고 일반적으로 여러 위치에 바이러스를 주입 하 긴 수술을 수행 하는 실험. 실크/AAV와 단순히 코팅 두개골 windows에서 큰 대뇌 피 질의 영역에 광범위 한 식을 얻을 수 많은 침략 주사에 대 한 필요성을 제거 하는 단순화 이다.
실크/AAV 방법의 또 다른 잠재적인 장점은 그것 바이러스 성 주사에 비해 신경 조직에 덜 염증 유도 수 있습니다. 뇌에 높은 titer AAV를 주입 반응 astrocytosis (비록 같은 잠재적인 합병증은 일반적으로 휴대 및 회로 속성14,15 를 변경할 가능성이 있는 등 염증 성 반응 일으킬 수 있습니다. 무시). 실크 영화 그들의 자신의13 에 작은 면역성 응답을 유도 하 고 실크/AAV 영화 많은 시간 또는 일 하는16, 주변 조직에 바이러스 부하를 낮출 수 있으며 면역성 응답을 감소의 과정을 통해 바이러스를 발표할 것으로 예상 된다. 기존의 접근 이식 장치는 AAV 주입 하 여 앞, 선 동적인 응답 주입 및 주입에서 발생할 수 있습니다. 앞으로 체계적으로 기존의 접근 및 실크/AAV 영화 전반적으로 감소 여부를 확인 하려면 실크/AAV 메서드를 비교 하는 것이 있을 것입니다 선 동적인 응답.
몇 가지 단계는 실크/AAV 영화의 성공적인 사용에 중요 합니다. 가장 중요 한 것은, 광섬유의 코팅 방법에 설명 된 대로 신중 하 게 이루어져야 합니다. 및 말린된 영화의 위치를 신중 하 게 되도록 영화 소형, 올바른 위치에서 현미경으로 검사 하 여 평가 합니다. 광섬유의 얼굴에 고착 하 고. 광섬유의 측면에 어떤 실크/AAV 관심의 영역 밖에 식으로 이어질 것입니다 하 고 섬유의 얼굴 너머 내 다 misshaped 영화 주입 및 불안정으로 이어질 또는 식이 없는 동안 끊다 수 있습니다. 우리가 설명 하는 모든 자료의 사용에 적응 될 수 있습니다 실크/AAV 이식할 수 있는 장치를 적용 하는 기법을 쉽게 사용할 수 있으며 실크/AAV의 작은 볼륨의 정확한 증 착을 수 있습니다.
연습의 조금 정확 하 고 재현 가능한 결과 달성 하기 위해 필요 합니다. 식이 섬유의 트랙을 따라, 관찰 하는 경우 실크 영화 섬유 얼굴 보다는 섬유 측면 건조 가능성이 높습니다. 제조 과정을 반복 하 고 밀접 하 게 징후를 영화는 섬유 측면 건조 말린된 임 플 란 트를 검사. 실크/AAV 영화 광학 투명 하기 때문에, 그것은 실크 (빠른 녹색 또는 유사한 염료) 더 나은 결과 영화 (그림 2C)의 모양을 시각화 염료와 혼합을 적용 하는 연습에 도움이 됩니다. 식이 없는 경우에, 그것은 실크 영화 주입 중 섬유 팁에서 dislodged 있습니다. 임 플 란 트를 할 때 주식 titer 바이러스의 사용을 좋습니다. 광학 섬유에 대 한이 작은 직경의 섬유에 적용 해야 하는 전체 볼륨을 줄일 수 있습니다. 코팅의 크기가 관심사 예금 된 물방울의 완벽 한 건조 수 있도록 각 10 nL 응용 프로그램 사이 더 이상 기다리고 고려 하십시오. 실크/AAV 방울 따뜻한 램프 아래 빠른 건조. 두개골 윈도 즈를 위해 높은 titer 바이러스 피아 또는 경질 적절 한 바이러스 부하를 공급 하는 데 필요한 수 있습니다. 임 플 란 트의 특정 종류는 실크 분해 하 고 AAV를 다른 사람 들 보다 더 쉽게 풀어 수 있습니다. 우리 두뇌의 표면에 이식 하는 두개골 창 실크/바이러스 다른 뇌 척추 유체 역학 또는 효소 활동 때문에 아마도 신뢰할 수 있는 식 달성 하기의 더 낮은 비율을 필요로 발견 했다. 식 효과적인 AAV 농도 증가 의해 증가 될 수 없습니다, 경우 수성 실크의 볼륨을 감소 하는 것은 그럴듯한 대안 이다.
마지막으로, 그것은 중요 한 광학 구성 요소를 제대로 저장 하 고 그들을 매우 빨리 이식 후 그들은 준비가. 우리는 진공에서 냉장 코팅된 섬유 사용 하기 몇 일 전에 대 한 저장할 수 있습니다 나타났습니다. 진공 저장소 잔여 습기17 실크 영화의 용 해도 감소 하 고 바이러스 성 효능을 유지할 수 있습니다 제거 합니다. 이상적으로, 광학 섬유 제조의 24 시간 안에 이식 한다. 그러나, 우리는 실크/AAV 코팅 섬유 제조 (그림 4B) 후 7 일 이식 때 표현의 진공 드라이브 비슷한 수준에서 저장 된 찾으십시오. 대조적으로, 코팅 두개골 창과 미소 렌즈 그들은 실 온에서 건조 되었고 준비의 시간 사용 하는 경우 가장 신뢰할 수 있는 식 운전. 이 격차를 위한 이유는 불분명 남아 있습니다. 추가 연구 준비 및 저장 조건 추가 확장 저장 시간을 수정 하기 위해 필요할 수 있습니다.
실크/AAV 코팅 두개골 windows 현재이 메서드는 제한 하지만 그들은 크게 수술 시간을 단축 하 고 제조, 매우 간단 하기 때문에 상당한 잠재력을 있다. 코팅된 두개골 windows 균일 하 게 외피의 큰 영역을 분류 하 고 GCaMP 이미징, 약간 더 깊은 층에서 적은 식에 대 한 충분 한 식 레이어 2/3에에서 드라이브. 그러나, stereotaxic 주사 보다 강력한 식 드라이브 하 고 식에 대 한 타겟 층에 더 많은 제어를 제공. 경질 제거 하는 경우에 신뢰할 수 있는 식 달성 되었다. 경질 종종 이미지 품질8을 개선 하기 위해 많은 2 광자 이미징 실험에 대 한 제거는, 비록 많은 실험에 대 한 그것은 보다 적게 침략 적 방식으로 라벨을 얻기 위해 바람직하다. 우리는 따라서 실크/AAV 경질을 제거 하지 않고 대뇌 피 질의 영역을 사용 하 여 우리의 능력을 탐험 있다. 우리가 얻은 어떤 라벨, 그러나 이것에서 craniotomy를 준비 하는 과정에서 경질 손상의 결과 이었다 가능 하다. 추가 연구 코팅된 두개골 windows 안정적으로 경질을 제거 하지 않고 피 질을 사용할 수 필요 합니다.
누에나방의 고치에서 수성 실크 fibroin 준비 록우드 외 에 자세히 설명 되어 (2011 년) 18. 수성 실크 fibroin 지금 상용 (5 %w / v) 이다. 우리의 실험의 대부분 수성 실크 fibroin 주식 연구소 (5-7.5 %w / v)에서 준비를 사용 하 여 수행 된, 있지만 우리 상업 수성 fibroin를 사용 하 여 비슷한 결과 얻은 있다. 수성 fibroin 후 저절로 전환 액체에서 하이드로 겔18최대 3 개월, 4 ° C에서 안정적입니다. Fibroin 주식 수 약 수 ~ 1 mL로 분할 하 고-80 ° c.에 저장 하는 것이 좋습니다. (코팅 임 플 란 트의 수백에 대 한 충분 한)는 1 mL 작업 약 수 4 ° C에 저장 하 고 젤 시작 될 때까지 사용할 수 있습니다. 조심 동요, 소용돌이, 선동 하거나 적극적으로 전단 세력 겔19,20이어질 수 수성 fibroin를 플라스틱.
실크/AAV 영화는 작은-직경 광섬유의 끝에 정확한 바꾸어 식 두개골 윈도우에서는 광범위 한 대뇌 피 질의 식에서 식 패턴의 다양 한 범위를 허용합니다. 이러한 기술은 일반적인 AAV 식 벡터를 활용 하기 위해 개발 되었다 하지만 뇌에 Lentiviruses 또는 광견병 바이러스 같은 다른 식 벡터를 분산 하는 데 사용 될 가능성이. 실크 영화 또한 조직으로 바이러스 성 자료를 개선 하기 위해 3 차원 모양으로 제조 될 수 있었다. 예를 들어 드라이브는 durotomy의 사용 없이 대뇌 피 질의 창 아래 강한 식 순서로 두개골 윈도 깊은 대뇌 피 질의 레이어21경질 및 릴리스 바이러스 피어스 것 실크 바늘의 배열을 가진 코팅 수 있습니다. 추가 수정 가능성이 바이러스 릴리스 및 실크/AAV 영화에 대 한 새로운 응용 프로그램의 향상 된 속성 이어질 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 대 제이 바스 케 스, D. 카 플 란과 C. Preda 시 약 및 유용한 지도, 그리고 vivo에서 화상 진 찰에 대 한 B. 사바 티 니 및 C. 하 비의 실험실에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 현미경 M. Ocana 지원 부분에서 신경 이미징 센터는 국립 연구소의 신경 장애의 신경 생물학 이미징 센터에 의해 가능 하 게 되었다 고 치기 (NINDS) P30 코어 센터 (NS072030)를 부여 합니다. GVR 호 가족 재단, 낸시 Lurie 마크 재단과 NIH 교부 금, NINDS R21NS093498, U01NS108177 및 W.G.R에 NINDS R35NS097284과 C.H.C.에는 NIH 박사 후 친목 F32NS101889이이 작업 지원
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aqueous silk fibroin | Sigma | 5154-20ML | Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films |
| Microinjector to deposit silk/AAV | Drummond | 3-000-207 | Nanoject III nanoliter injector |
| Manipulator to hold implants | Narashige | MM-33 | Micromanipulator |
| Stereoscope to visualize silk deposits | AmScope | SM-6TX-FRL | 3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light |
| Vacuum chamber to store implants | Ablaze | N/A | 3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber |
| Optional, implant holder for storage | N/A | N/A | To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block. |
| Optical fiber | Thorlabs | FT200EMT | Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants |
| Ferrules | Kientec | FZI-LC-230 | LC Zirconia Ferrule for fiber implants |
| Various materials for manufacturing chronic fiber implants | Various | N/A | For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68). |
| Tapered fiber implants | Optogenix | Lambda-B | Tapered fiber implants |
| GRIN lenses | GoFoton | CLH-100-WD002-002-SSI-GF3 | GRIN lenses |
| Small glass cranial windows | Warner | 64-0726 (CS-3R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Large glass cranial windows | Warner | 64-0731 (CS-5R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Various materials for manufacturing cranial windows | Various | N/A | For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515. |
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