Summary
وهنا نقدم طريقة لإيصال النواقل الفيروسية التعبير في الدماغ باستخدام الأفلام fibroin الحرير. هذا الأسلوب يسمح التنفيذ الهادف لناقلات التعبير باستخدام الألياف البصرية المغلفة بالحرير/إف ومدبب من الألياف الضوئية ونوافذ الجمجمة.
Abstract
السعي فهم كيف العصبية دوائر المعلومات العملية من أجل إخراج محرك الأقراص السلوكية قد ساعد إلى حد كبير بوسائل بصرية وضعت مؤخرا للتلاعب ورصد نشاط الخلايا العصبية في الجسم الحي. تعتمد هذه الأنواع من التجارب على عنصرين رئيسيين هما: 1) القابلة للغرس من الأجهزة التي توفر الوصول البصرية إلى الدماغ، والبروتينات 2) حساسة للضوء أن تغيير استثارة الخلايا العصبية أو تقديم قراءات لنشاط الخلايا العصبية. وهناك عدد من الطرق للتعبير عن البروتينات حساسة للضوء، ولكن الحقن ستيريوتاكسيك من النواقل الفيروسية حاليا النهج الأكثر مرونة لأنه يمكن التحكم في التعبير بدقة الوراثية والتشريحية والزمانية. على الرغم من فائدة كبيرة من النواقل الفيروسية، إيصال الفيروس إلى الموقع الذي يزرع الضوئية يطرح العديد من التحديات. حقن فيروس ستيريوتاكسيك يطالبون بالعمليات الجراحية التي زيادة وقت الجراحة، وزيادة تكلفة الدراسات، وتشكل خطرا على صحة الحيوان. يمكن أن تتلف الأنسجة المحيطة فعلياً بحقنه الحقن ومكسبه الالتهابات الناجمة عن تسليم المفاجئ بلعه فيروسات عالية-عيار. محاذاة الحقن مع يزرع الضوئية ومن الصعوبة عند استهداف المناطق الصغيرة في أعماق الدماغ. للتغلب على هذه التحديات، يمكننا وصف طريقة لطلاء أنواع متعددة من يزرع بصري مع الأفلام تتكون من الحرير fibroin ومتجهات (إف) الفيروسية المرتبطة بالغدة. يمكن تغليف بوليمر المستمدة من الشرنقة من موري بومباي، فيبروين، وحماية الجزيئات الحيوية ويمكن معالجتها في أشكال تتراوح بين الأفلام القابلة للذوبان للسيراميك. عند زرعها في الدماغ، الطلاء الحرير/إف الإفراج عن الفيروسات في مجال التفاعل بين العناصر البصرية والدماغ المحيطة بها، ويقود التعبير تحديداً حيث أنه مطلوب. هذا الأسلوب هو تنفيذها بسهولة ويبشر بأن ييسر إلى حد كبير في فيفو دراسات مهمة الدائرة العصبية.
Introduction
العقد الماضي أسفر انفجار هندسة البروتينات حساسة للضوء لرصد ومعالجة النشاط العصبي1. فيروسات توفر مرونة لا مثيل لها للتعبير عن هذه الأدوات أوبتوجينيتيك في المخ. وبالمقارنة بالحيوانات المحورة وراثيا، الفيروسات أسهل بكثير لإنتاج ونقل وتخزين والسماح بالتنفيذ السريع لأحدث أدوات أوبتوجينيتيك. يمكن استهداف التعبير وراثيا للسكان العصبية متميزة، والفيروسات المصممة لنقل إلى الوراء حتى يمكن أن تستخدم لاستهداف التعبير استناداً إلى اتصال الخلايا العصبية2.
عادة ما يتم إدخال الفيروسات مع حقن ستيريوتاكسيك، التي يمكن أن تكون صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً. دقة استهداف المناطق الصغيرة يمكن أن تكون صعبة، بينما القيادة التعبير أكثر مجالات واسعة كثيرا ما يتطلب العديد من الحقن. وعلاوة على ذلك، عندما يكون جهاز بصري مزروع في وقت لاحق في الدماغ لتسليم الخفيفة في فيفو، عملية الزرع يجب أن تكون محاذاة بشكل صحيح مع حقن الفيروسية. هنا، يمكننا وصف أسلوب تنفيذها بسهولة عن تسليم ناقلات الأمراض الفيروسية للأنسجة حول جهاز مزروع باستخدام الحرير fibroin الأفلام3. فيبروين الحرير المتاحة تجارياً، ويتغاضى عنها جيدا بالانسجة العصبية، ويمكن استخدامها لإنتاج مواد ذات خصائص متنوعة. يمكن تطبيقها ليزرع باستخدام معدات المختبرات المشتركة مثل الماصات microinjection أفلام الحرير أو من ناحية الماصات. الأفلام الحرير/إف إلغاء شرط اثنين العمليات الجراحية والتأكد من أن الفيروس بوساطة التعبير بشكل صحيح محاذاة لزرع الضوئية. التعبير الناتج مقيد إلى غيض من الألياف، والنتائج في أقل تعبير غير المرغوب فيها على طول مسار الألياف من حقن ستيريوتاكسيك.
بالإضافة إلى إنتاج التعبير المستهدفة في غيض من ألياف صغيرة، يمكن استخدام أفلام الحرير/إف لحملة على نطاق واسع (> 3 مم) التعبير القشرية تحت windows الجمجمة. في فيفو التصوير 2-فوتون من أجهزة الاستشعار النشاط الفلورسنت أصبحت أداة لا غنى عنها لتقييم دور نشاط الخلايا العصبية في القيادة المعالجة الحسية والمعرفية. ومع ذلك، أداء التعبير على مناطق واسعة القشرية، المجربون في كثير من الأحيان لقيادة موحدة حقنات متعددة. هذه الحقن يمكن أن تستغرق وقتاً طويلاً جداً، ويمكن أن يؤدي إلى التعبير غير متناسقة عبر مجال الرؤية. وفي المقابل، الحرير/إف-المغلفة النوافذ الجمجمة سهلة للغاية صنع ويقلل كثيرا من الوقت اللازم للعمليات الجراحية، وآخر ملحوظ محرك التعبير مئات ميكرون تحت السطح القشرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب التي تنطوي على الحيوانات وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها "اللجنة الدائمة هارفارد" في "رعاية الحيوان" ووصف المبادئ التوجيهية التالية في "المعاهد الوطنية للصحة لنا" دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. واستخدمت الفئران C57BL/6 الكبار من كلا الجنسين (6-15 أسبوعا عمر) لجميع التجارب.
1-الحصول على فيبروين الحرير مائي
- إعداد أو شراء fibroin الحرير مائي (5-7.5% w/v).
2-خلط مائي الحرير مع ناقلات التعبير إف
- اختر متجه تعبير إف محرك البروتين أوبتوجينيتيك أو مؤشر الفلورسنت الاختيار.
ملاحظة: للتقليل من حجم الحرير/إف التي يجب تطبيقها ليزرع أثناء القيادة لا تزال قوية التعبير، ينصح إف عيار الأوراق المالية (الأسهم التتر الحصول عليها عادة من النوى ناقلات حوالي ~ 1013 gc/mL). - قبل مباشرة يزرع طلاء، ذوبان الجليد قاسمة إف والجمع fibroin الحرير مائي 5-7.5 ٪ (سيشار إلى هذا الخليط كالحرير/إف). في أنبوب بكر 200 ميليلتر، مزيج فيبروين المائية واف في نسبة 1:1 (لاستخدام windows الجمجمة 1:4) قبل التطبيق مباشرة. بلطف "الماصة؛" الحل والخروج عدة مرات مزيج دقيق fibroin واف.
- تبقى خليط الحرير/إف على الجليد قبل استخدامها.
3-إعداد المعدات لتصنيع وتخزين أجهزة الحرير/إف-المغلفة
- شراء معدات لطلاء الألياف الضوئية والعدسات متدرجة-فهرس (ابتسامة) (الأرقام 1، 2).
- بناء حامل التسليح مستقرة. عقد الحلقات, والسيراميك، وحفر ثقوب 1.25 ملم في كتلة من ورقة اﻷكريليك ¼ ". اضغط على ثقوب لإدراج مجموعة مسامير من الجانب لعقد الحلقات, وفي المكان.
ملاحظة: يمكن استخدام أي المشبك لهذا الغرض. - ضع مناور بدقة ملليمتر الفرعية لنقل الألياف الضوئية (جهاز ستيريوتاكسيك أو ميكرومانيبولاتور الدقيقة الأخرى).
- تجميع حامل مستقرة لتحديد موضع في ميكروينجيكتور.
- استخدام ستيريوسكوبي لتصور التجميعية الحرير والألياف البصرية.
- ضع مصدر ضوء لإضاءة الألياف البصرية.
- بناء حامل التسليح مستقرة. عقد الحلقات, والسيراميك، وحفر ثقوب 1.25 ملم في كتلة من ورقة اﻷكريليك ¼ ". اضغط على ثقوب لإدراج مجموعة مسامير من الجانب لعقد الحلقات, وفي المكان.
- إعداد المعدات لدهان الجمجمة windows (الشكل 3).
- اختيار أي بيبيتور P10.
- الحصول على حاوية مع غطاء.
ملاحظة: يتم اقتراح أي حاوية مع قاع سيليكون – الجزء السفلي لينة يسهل رفع النوافذ الجمجمة.
- إعداد المعدات لتخزين يزرع الانتهاء (الشكل 4).
- الحصول على فراغ (1-5 لتر) غرفة صغيرة.
- تأكد من أن هناك مساحة لتخزين يزرع في ثلاجة 4 درجات مئوية.
4-تطبيق الفيلم الحرير/إف للأجهزة
- طلاء الألياف الضوئية للتعبير تنسيق محرك الأقراص على طرف الألياف
- إعداد يزرع الألياف المزمن كما هو موضح سابقا4.
- قبل الشروع في الاستخدام، شطف يزرع مع الإيثانول، ثم مع الماء عالي النقاوة للتأكد من أن الألياف الضوئية نظيفة.
ملاحظة: الأفلام الحرير التقيد أكثر موثوقية لتنظيف أسطح الزجاج. - تحضير جهاز لعقد الحلقات, والألياف. مم للحلقات, نموذجية 1.25 مم وقطرها استخدام كتلة اﻷكريليك واضحة، مع ~1.3 ¼ بوصة الثقوب، وتستغل مجموعة مسامير تدخل من الجانب إلى ثقب يزرع بشدة في مكان (الشكل 1A).
- جبل صاحب التسليح في جهاز ستيريوتاكسيك (أو أي حل التلاعب بدقة سوبميليميتير) مجهزة ميكروينجيكتور. مكان صاحب التسليح أعلاه ميكروينجيكتور وتطبيق الخليط الحرير/إف من الأسفل.
ملاحظة: هذا بسبب التطبيقات كميات كبيرة من فوق أسفرت الحرير/إف أن لم يكن مقصورا على الحافة. ومع ذلك، يمكن أن تنتج تطبيق العديد من أحجام صغيرة متسلسلة من أعلى أو أسفل الودائع إف/الحرير التي تقتصر على الطرف (على الرغم من أننا نفضل أن تطبق من الأسفل). - سحب ماصة حقن داخل الجمجمة قياسية من زجاج البورسليكات الشعرية.
- لتجعل من السهل على
- لإنتاج نصيحة حقن مع تلميح شقة نظيفة للقطر المطلوب وعقد ماصة واحدة في كل جهة واستخدم الجزء أكثر سمكا من تفتق على ماصة واحدة لنقاط ماصة أخرى في موقع فاصل المطلوب.
- فرك بلطف ذهابا وإيابا في حركة سونج (أسلوب التهديف الزجاج على الزجاج).
- بعد التسجيل الماصة، تطبيق ضغط لطيف على غيض ماصة سجل مع جثة ماصة أخرى لتحقيق الانفصال.
- ضع ستيريوسكوبي لإعطاء فكرة واضحة عن وجوه الألياف الضوئية.
ملاحظة: يجب أن يكون التكبير كافية بدقة موقف ماصة حقن أعلاه على وجه الألياف الضوئية. - إدراج يزرع الألياف مع الجانب الدماغ من الألياف الضوئية التي تواجه أسفل حامل.
- تحميل ماصة حقن مع حل الحرير/إف، أما بالنسبة لأي معيار الحقن داخل الجمجمة5. تحميل المبلغ المطلوب لعدد يزرع تبذل، بالإضافة إلى ~ 30% إضافية لاستيعاب الخسائر بسبب انسداد الماصات. على سبيل المثال، إذا كان يتم إجراء عملية زرع 10، ثم تحميل مع 100 nL الودائع وسحب ~1.3 ميليلتر.
ملاحظة: قد تجف الحرير/إف في تلميح ماصة بين الانقذافات، التي يمكن أن تسد الماصة. كبيرة قطرها الماصات (50-100 ميكرومتر) أقل احتمالاً لتسد. يمكن فكها قباقيب بالفرشاة لطيف أسفل طرف الماصة مع مسحه مسح أو الكحول ورق رطب. - مناورة ماصة حقن حتى يتم لمس أو لمس تقريبا وسط سطح الألياف الضوئية. إخراج nL 10-20 لحل الحرير/إف. سحب الماصة.
ملاحظة: أن معدل الولادة ليست حاسمة، ولكن معدلات نموذجية هي 5-20 nL/s. - نلاحظ بولس من الحرير/إف على سطح مسطح الذي يظهر كقبة سائل الذي يجف لفيلم شقة داخل ~ 1 دقيقة (الشكل 1B).
- كرر الخطوات 4.1.9-4.1.10 حتى المبلغ المطلوب من الحرير/إف أودعت (أي ما مجموعة 20-200 nL لمعظم التطبيقات). عند إعداد يزرع متعددة، تطبيق الحرير/إف لزرع واحد وثم الانتقال إلى معطف أخرى يزرع قبل العودة إلى الأولى.
- تسمح ح 1 تجفيف قبل أن ينتقل يزرع.
- فراغ بين عشية وضحاها ديسيككاتي في ~ 125 عربة (-25 في. Hg)، 4 درجة مئوية. القيام بذلك عن طريق وضع صاحب أسرة التسليح في فراغ غرفة.
- تقييم الشكل والموقف من الفيلم الحرير الناتجة تحت مجهر عالية الطاقة. ضمان أن تقتصر الأفلام غيض سطح الألياف الضوئية، وأن تكون رقيقة نسبيا (> 100 ميكرومتر)، ومتناظرة (الشكل 1).
ملاحظة: قد إزاحة كبيرة أو غير متناظرة من أفلام الحرير/إف من الألياف أثناء غرس (الشكل 1). السبب الأكثر شيوعاً لمشاكل ناشئة عن تطبيق كميات كبيرة واحدة بدلاً من تطبيق العديد من أحجام صغيرة متتالية.
- طلاء مدبب الألياف البصرية إلى التعبير بالسيارة على طول محور الألياف
- الحصول على الألياف الضوئية مدبب يزرع وإجراء الخطوات 4.1.2-4.1.8، إلا أن الألياف مدبب يوضع أفقياً فإنه يكون عمودي على محقن (الشكل 2A). موقف الحاقن أعلاه الألياف مدبب.
ملاحظة: تحميل قطيرات على ألياف مدبب يشكل إضافة التحديات، نظراً للتوتر السطحي يميل إلى يسبب قطرات القفز إلى الوراء على ماصة الحقن أو ترحيل إعداد الألياف مدبب. أصغر حقن الماصات (30-50 ميكرون القطر) تساعد على التغلب على هذه المشكلة ولكن زيادة الخطر الذي سوف تسد ماصة حقن. بسبب التوتر السطحي، قطرات تميل إلى التمسك بمجال أكبر من المساحة السطحية، لذلك حقن الأمثل "الماصة؛" الحجم يعتمد على حجم الألياف مدبب والتسامح واحد لتسد أحياناً. - ضع ماصة حقن الحرير/إف ضد الجانب من الألياف الضوئية في بداية تفتق. تأكد من أن يلمس ماصة حقن الألياف الضوئية.
- إخراج 20 nL من الحرير/إف لبدء عملية الطلاء. ضمان أن الحبرية تتمسك بالألياف الضوئية، وما زال في الواجهة من الألياف/الماصة. فتيلة الحبرية نهاية طرف الألياف بلطف كما يجف الحرير/إف (~ 45 ثانية). تبقى ماصة الحقن على اتصال مع الحبرية التجفيف لتجنب انسداد طرف ماصة.
ملاحظة: ينبغي أن معطف كل إيداع ما يقارب 400 ميكرون من الألياف مدبب (الشكل 2). - عند بولس الأول قد جفت تماما تقريبا، إخراج آخر 20 nL ومواصلة فتل الحبرية على طول تفتق.
ملاحظة: سوف تتمسك الحرير السائل بالحرير المجففة، ترسيخ واحدة من نهاية الحبرية ماصة تتحرك على طول تفتق. - كرر الخطوة 4-2-4 بإخراج كميات صغيرة من الحرير/إف، والرسم الحل الذي يصل إلى جانب تفتق تدريجيا. 5-6 الانقذافات تكفي لاجتياز سطح تفتق 2.5 ملم.
- لدفع المزيد من التعبير موحدة حول كافة جوانب من الألياف، تدوير الألياف وكرر الخطوات 4.2.2-4.2.5 حتى بعد إيداع المبلغ المطلوب من الحرير/إف.
- إذا شنقاً حبلا من المجففة الحرير/إف يمتد إلى أبعد من طرف الألياف، قطع حبلا عناية مع مقص، أو استخدام ماصة الإخراج لثني حبلا العودة والتمسك بأنها تفتق الألياف.
- تسمح ح 1 تجفيف قبل أن ينتقل يزرع.
- فراغ بين عشية وضحاها ديسيككاتي في 4 درجات مئوية. يمكن وضع صاحب أسرة التسليح في فراغ غرفة.
- تقييم الشكل والموقف من الفيلم الحرير الناتجة تحت مجهر عالية الطاقة.
ملاحظة: الأفلام لا يلزم أن تكون موحدة تماما ولكن لا ينبغي أن تكون المطبات التي تمتد أكثر من 100 ميكرومتر خارج سطح الألياف للتقليل من الضرر للأنسجة المحيطة من خلال غرس (الشكل 3). لتصغير حجم الفيلم، من الأهمية بمكان أن كل قطره جافة تماما قبل الإيداعات اللاحقة.
- الحصول على الألياف الضوئية مدبب يزرع وإجراء الخطوات 4.1.2-4.1.8، إلا أن الألياف مدبب يوضع أفقياً فإنه يكون عمودي على محقن (الشكل 2A). موقف الحاقن أعلاه الألياف مدبب.
- عملية زرع العدسة ابتسامة طلاء
- الحصول على ابتسامة العدسات6،7 وكرر الخطوات 4.1.2-4.1.8. يمكن تركيبة الحاقن أعلاه.
- إيداع الحرير/إف في قذف واحدة (1 ميليلتر لعدسة قطرها 1.0 مم).
ملاحظة: هذا سيؤدي إلى قبة سائل أن تتمسك بوجه العدسة، ويجفف لإنتاج فيلم موحدة (100-200 ميكرومتر سميكة). ومع ذلك، في حالة ما إذا يجف موزعة قذف كبير واحد وتنتج فيلم الذي أكثر سمكا قرب حواف العدسة ابتسامة، حاول إيداع قطرات أصغر متعددة (100-200 nL) في وسط سطح العدسة (السماح لكل قطره الجافة قبل إيداع القادم) لضمان أن الفيلم سيكون محرك التعبير في مركز مجال الرؤية. - تسمح ح 1 تجفيف قبل أن ينتقل يزرع.
- تقييم الشكل والموقف من الفيلم الحرير الناتجة تحت مجهر عالية الطاقة لضمان أن الفيلم يغطي سطح العدسة.
- طلاء زجاج النوافذ الجمجمة
- إعداد الزجاج ويندوز الجمجمة المنضمة قطرها 3 مم اثنين جولة كوفيرسليبس (سمك رقم 1) إلى نافذة واحدة قطرها 5 ملم بمادة لاصقة الضوئية (لمزيد من التفاصيل، انظر جولديي وآخرون عام 20148).
- مزيج من الحرير: الفيروس بنسبة 1:4 لتخفيض المبلغ الإجمالي للحرير في الفيلم. لا تذوب كميات مفرطة من الحرير تحت windows الجمجمة بعد زرع. قد يلزم تجارب المعايرة لتحديد نسبة وحجم الذي يعطي الشخصية التعبير المطلوب.
- اليد "الماصة؛" معالجة تجميعية 5 ميليلتر على السطح ساترة 3 مم (المواجه للدماغ). وينبغي أن تنتشر الحبرية لتغطية سطح الزجاج كامل (الشكل 3).
- تسمح ح 2-3 للتجفيف قبل نقل الإطارات.
5-تخزين يزرع الحرير/إف-المغلفة
- تخزين الحرير/إف-المغلفة الألياف الضوئية في مجفف فراغ تبريد (~ 125 عربة، 4 درجة مئوية) قبل استخدام (الشكل 4 أ).
- لا تقم بتخزين windows الجمجمة والعدسات ابتسامة تحت الفراغ، حيث أن الأفلام الحرير الكبيرة المخزنة تحت فراغ لا تذوب تماما بعد زرع. زرع نوافذ الجمجمة والعدسات ابتسامة فورا بعد التجفيف، أو خلال يوم من صنعها إذا كانت مخزنة في الضغط الجوي و 4 درجة مئوية.
6-غرس الأجهزة
- إعداد الحيوانات لجراحة زرع كما هو موضح سابقا4.
- بإيجاز، تخدير الفئران مع حقن داخل من الكيتامين/إكسيلازيني (100/10 مغ/كغ) وتحقق من عمق التخدير باستخدام إصبع القدم-قرصه لطيف. يحلق في الجمجمة في مجال الزرع وتنظيف فروة الرأس مع اليود والكحول.
- جبل الحيوانات في جهاز ستيريوتاكسيك وتكملة التخدير باستخدام خليط من الأوكسجين وإيسوفلوراني (1-2%). جعل شق في فروة الرأس أكثر من مجال الاهتمام، وتؤدي اوديما كبيرة بما يكفي لاستيعاب عملية الزرع.
- زرع الألياف البصرية9 وميكروندوسكوبي العدسات10 وفقا لإجراءات سبق نشرها. مقبض يزرع بعناية، كما يمكن أن تربعت إيداع الحرير/إف اوديما ناقصة، أو بزرع الأنظار على حافة الجمجمة. انخفاض عملية الزرع في الدماغ ببطء (~ 2 مم/دقيقة).
- زرع windows الجمجمة كما وصف سابقا8. لا تلمس الجانب المغلفة إطار وتجنب الشطف النافذة مع السائل إذا كان أداء تزقيمية مدتها، كهذا قد يغسل الفيروس. لتحقيق أقصى حد من التعبير، أداء دوروتومي.
7-تقييم التعبير واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
- تقييم تعبير البروتينات أعرب فيروسي، تسمح ~ 2-3 أسابيع بالنسبة للفيروس إلى محرك التعبير، ثم إجراء نضح إينتراكارديال مع بارافورمالدهيد 4 ٪ في الفوسفات مخزنة أنسجة المخ11 وعملية المحلول الملحي في فلوري 12من الفحص المجهري.
- تقييم التعبير باستخدام مجهر فلوري الصورة في نمط التعبير للبروتينات أوبتوجينيتيك معلم فلوروفوري.
- في حالة عدم كفاية مستوى التعبير، زيادة كمية الفيروس في الطلاء أما زيادة الحجم الإجمالي لطلاء الحرير/إف، أو يفضل أن يتم ذلك باستخدام فيروس عيار أعلى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتقييم نجاح الأفلام الحرير/إف في قيادة التعبير، نحن perfused الحيوانات 2-3 أسابيع بعد زرع وإعداد شرائح الدماغ من المنطقة من الفائدة. صور الأسفار من البروتينات أوبتوجينيتيك معلم فلوروفوري (ChR2-يفب) تقدم مقياسا لمدى تعبير (الشكل 1). الألياف الضوئية النموذجية (230 ميكرومتر القطر) يمكن سهولة استيعاب 200 nL من الحرير/إف. مع الممارسة، يمكن تحقيق المجربون التعبير موثوق بها للغاية حول غيض من ألياف مزروع (الشكل 5).
تقييم التعبير يقودها windows الجمجمة الحرير/إف-المغلفة، تبدأ تصوير ابتداء من 7 إلى 10 أيام بعد زرع. وقد استخدمنا التصوير يومين-فوتون للتصور، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم أساليب أخرى مثل الأسفار التصوير مع اتفاقية مكافحة التصحر. ممكن مع windows الجمجمة المغلفة المسألتان التعبير غير كافية، والأفلام الحرير التي تفشل في حل ويحجب مجال الرؤية. لزيادة التعبير، فإننا نقترح إجراء دوريكتومي من قبل ترسيخ الإطار، و/أو زيادة كمية الفيروس في الفيلم. حققنا أفضل التعبير باستخدام خليط من 1:4 من الحرير والأوراق المالية-عيار إف، على التوالي. بينما هذا يمثل عدد أكبر بكثير من الجسيمات الفيروسية مما تستخدم عادة في حقن ستيريوتاكسيك، عدادات الوقت الجراحية انخفضت التكلفة الإضافية الهامشية للفيروس. ومن ناحية أخرى، إذا فشلت الأفلام الحرير حل أسفل النافذة، كذلك تقليل كمية الحرير تستخدم لمعطف النافذة. المبلغ الإجمالي للحرير في windows المغلفة 10-100 مرة أكثر من شأن يزرع الألياف، والفيلم هو أقل جزءا لا يتجزأ من النسيج، وهكذا قد لا يتعرض لنفس مستويات النشاط proteolytic مما يمكن أن يحل الحرير الأفلام13. ومع ذلك، وجود بعض الحرير ضروري لتحقيق التعبير تحت ويندوز3، يحتمل لأنه هو جرف فيلم مصنوع من الفيروسات وحدها بسائل خلالي أثناء الجراحة.
رقم 1: تطبيق الأفلام الحرير/إف للألياف الضوئية. (أ) يزرع الألياف المزمن توضع الألياف الجانبية إلى أسفل إلى حامل (اقحم) التي شنت على مترجم XYZ. يوزع ميكروينجيكتور ثابتة أدناه الألياف الحرير/إف على نصائح الألياف. ستيريوسكوبي يسمح التصور لهذه العملية. (ب) تطبيق الحرير/إف على نصائح الألياف بكميات صغيرة (10-20 nL). بعد إخراجها من بلعه، تتراجع الماصة وتسمح ~ 60 ثانية الحبرية الجاف لفيلم شقة. كرر العملية حتى تم تطبيق وحدة التخزين المطلوب لنصيحة الألياف. (ج) فحص الطلاء الحرير. الطلاء الأمثل ينبغي أن تتركز على تلميح الألياف (يسار)، بينما الطلاء غير سليمة تمتد إلى الخارج من الوجه الألياف مما يجعلهم أكثر عرضه لإزاحة من الألياف (يمين). (د) ألياف الممثل المغلفة مع 200 nL من الحرير/إف، والناتج يحركها إف ChR2-يفب التعبير 2 أسابيع بعد زرع. طلاء الحرير/إف المدمجة على اليسار أدت إلى التعبير قوية، بينما الطلاء على اليمين من بروز في الماضي على وجه الألياف وأدت إلى تقريبا أي التعبير، ويحتمل لأنه لم يلتزم الحرير/إف الألياف الضوئية خلال غرس. مقياس أشرطة 0.2 مم (ألياف) و 1.0 مم (شرائح المخ). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الإعداد لطلاء الألياف مدبب يزرع. (أ) محمل ميكروينجيكتور أعلاه صاحب الألياف مدبب، وألياف مدبب متوضعة أورثوجونالي للمحاقن قذف. (ب) البدء في أوسع نقطة (داخلي) وإخراج كميات صغيرة بينما تتحرك المحاقن طرد نحو نقطة تفتق. هذه النتائج في طلاء مستمرة على طول تفتق. (ج) ممثل مدبب الألياف المغلفة بالحرير مختلطة مع "الأخضر سريع" المعونة في التصور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الطلاء ويندوز الجمجمة. الحرير/إف يمكن تطبيق windows الجمجمة باستخدام ماصة يد. يمكن أن تكون مغلفة نافذة قطرها 3 مم قياسية مع معالجة تجميعية 5 ميليلتر، الذي سوف يجف ببطء إلى فيلم شقة. داخلي: GCaMP6f التعبير الناتجة عن ويندوز الجمجمة الحرير/إف-المغلفة مزروع مع أو بدون دوريكتوميس. وهذا الرقم قد تم تكييفه من جاكمان et al. (2018) 3- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تخزين الحرير/إف المغلفة يزرع. (أ) لإزالة الرطوبة المتبقية والحفاظ على كفاءة الفيروسية، يجب تخزين يزرع تحت الفراغ عند 4 درجة مئوية إلى حين استخدامها. يزرع المخزنة بهذه الطريقة تظل صالحة لمدة 7 أيام على الأقل. (ب) التعبير الناتجة عن الألياف المغلفة الحرير/إف 4 مزروع بعد 7 أيام تخزين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: الألياف الضوئية الحرير/إف-بروتينات فلورية خضراء المغلفة موثوق بها محرك التعبير. يزرع الصور الفلورية لشرائح من 24 سترياتال على التوالي. كل زرع مغطاة nL 100-400 1:1 الحرير/إف-التجارة والنقل. هذا الفوج من يزرع يشير إلى قدرة الحرير على تقييد التعبير إلى موقع عملية الزرع (في هذه الحالة المخطط الظهرية). تتم الإشارة إلى الأسفار بروتينات فلورية خضراء اللون الأخضر؛ تلوين DAPI يظهر باللون الأزرق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
استخدام الحرير/إف أن تستهدف التعبير عن البروتينات أوبتوجينتيك ويتغلب على القيود المفروضة على النهج التي قيد الاستخدام حاليا. على الرغم من أن العديد من الدراسات بنجاح استخدام حقن إف للتعبير عن البروتينات أوبتوجينيتيك، أنها تمثل تحديا لمحاذاة التعبير إلى غيض الألياف الضوئية وإلى المناطق المحيطة بطول ألياف مدبب، وإلى منطقة العرض لعدسة ابتسامة. بسبب اختلال بين المكونات البصرية والتعبير أوبتوجينيتيك، حقن ستيريوتاكسيك يمكن الاعتماد عليها، وفشل العديد من التجارب. الحرير/إف وسم الأسلوب يصف لنا هنا يحل هذه المشكلة. كما أنه يبسط الإجراءات بإلغاء خطوة جراحية ثانية وفي بعض الحالات، مما يلغي الحاجة لعملية جراحية ثانية. قد أيضا يكون من الصعب استخدام الفيروسات للحصول على التعبير على نطاق واسع تحت windows الجمجمة، والمجرب عادة إجراء العمليات الجراحية الطويلة لحقن الفيروس في مواقع متعددة. القدرة على الحصول على التعبير على نطاق واسع عبر المناطق القشرية كبيرة ببساطة طلاء نوافذ الجمجمة مع الحرير/إف هو تبسيط أن يلغي الحاجة للحقن الغازية كثيرة.
ميزة محتملة أخرى للأسلوب الحرير/إف أنه قد حمل أقل التهاب في الأنسجة العصبية مقارنة بالحقن الفيروسية. حقن إف عيار عالية في الدماغ يمكن أن تسبب استجابات التحريضية مثل أستروسيتوسيس رد الفعل الذي يمكن أن يغير الخلوية والدائرة14،خصائص15 (على الرغم من أن مثل هذه المضاعفات المحتملة عادة تجاهل). أفلام الحرير تحفز استجابة مكسبه قليلاً في الخاصة بهم13 والأفلام الحرير/إف ومن المتوقع الإفراج عن الفيروسات على مدى العديد من ساعات أو أيام16، الذي قد الحمل الفيروسي في الأنسجة المحيطة وتقليل الاستجابات مكسبه. مع النهج التقليدية التي ستسبق غرس جهاز حقن إف، يمكن أن تنشأ ردود تحريضية من غرس والحقن. في المستقبل سوف يكون من المستصوب بشكل منتظم مقارنة النهج التقليدية وأسلوب الحرير/إف لتحديد ما إذا كانت الأفلام الحرير/إف يقلل عموما الردود الملتهبة.
عدة خطوات ضرورية للاستخدام الناجح لأفلام الحرير/إف. الأهم من ذلك، طلاء الألياف الضوئية ويجب أن يتم بعناية كما هو موضح في الأساليب وموقع الأفلام المجففة ينبغي أن تقيم بدقة الفحص البصري تحت مجهر للتأكد من وجود هذه الأفلام المدمجة، في الموقع الصحيح، والتمسك بوجه الألياف الضوئية. الحرير/إف أي على جانبي الألياف الضوئية يؤدي إلى التعبير خارج المنطقة من الفائدة، وشوه الأفلام التي تبرز خارج وجه الألياف قد قطع خلال غرس وتؤدي إلى غير موثوق بها أو لا تعبير. تقنيات يصف لنا لتطبيق الحرير/إف للأجهزة القابلة للغرس يمكن تكييفها لاستخدام أي من المواد هي التي متاحة بسهولة والسماح لترسب دقيقة لكميات صغيرة من الحرير/إف.
قليلاً من الممارسة مطلوب لتحقيق نتائج دقيقة واستنساخه. إذا كان التعبير الملاحظ على طول مسار الألياف، من المرجح أن الفيلم الحرير المجففة على جانب الألياف بدلاً من الوجه الألياف. كرر عملية التصنيع وتفقد عن كثب يزرع المجفف لدلائل على أن يتم تجفيف الأفلام إلى جانب الألياف. نظراً للحرير/إف أفلام شفافة بصريا، فإنه قد يساعد على ممارسة تطبيق الحرير مختلطة مع صبغ (الأخضر سريع أو صبغة مشابهة) لأفضل تصور شكل الأفلام الناتجة عن ذلك (الشكل 2). إذا لم يكن هناك أي تعبير، ومن المحتمل أن الفيلم الحرير فكها من طرف الألياف أثناء غرس. ونحن نقترح استخدام الأسهم-عيار الفيروس عند إجراء عملية زرع. للألياف البصرية، وهذا يقلل من الحجم الإجمالي الذي يجب تطبيقه على ألياف صغيرة القطر. إذا كان الحجم للطلاء النظر مصدر قلق في انتظار أطول بين كل تطبيق nL 10 للسماح بإكمال تجفيف الحبرية المودعة. قطرات الحرير/إف الجاف أسرع تحت مصباح حارة. ويندوز الجمجمة، وقد يلزم عالية-عيار الفيروس إمدادات كافية من الحمل الفيروسي عبر بيا أو دوراً. أنواع معينة من يزرع قد حل الحرير وإطلاق سراح إف بسهولة أكبر من غيرها. وقد وجدنا أن الجمجمة windows مزروع على سطح المخ تتطلب نسبة أقل من الحرير/فيروس لتحقيق التعبير موثوق بها، وربما كان سبب ديناميات السائل الشوكي الدماغي مختلفة أو نشاط البروتياز. إذا كان لا يمكن زيادة التعبير عن طريق زيادة فعالية إف التركيزات، تناقص حجم الحرير مائي بديل معقول.
وأخيراً، من المهم تخزين المكونات البصرية بشكل صحيح وزرع لهم قريبا جداً بعد إعدادها. وقد أظهرنا أن الألياف المغلفة التي هي مبردة تحت الفراغ يمكن تخزينها للعديد من الأيام قبل الاستخدام. فراغ التخزين يزيل الرطوبة المتبقية17 الذي قد خفض قابلية ذوبان الأفلام الحرير، ويساعد أيضا على الحفاظ على فعالية الفيروسية. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن مزروع الألياف الضوئية خلال 24 ساعة تصنيع. ومع ذلك، نجد أن ألياف الحرير/إف-المغلفة المخزنة تحت محرك فراغ مستويات مماثلة من التعبير عند زرعها 7 أيام بعد تلفيق (الشكل 4 باء). على النقيض من ذلك، قاد windows الجمجمة المغلفة والعدسات ابتسامة التعبير الأكثر موثوقية عندما كانوا المجففة في درجة حرارة الغرفة وتستخدم في غضون ساعة التحضير. والسبب في هذا التفاوت لا يزال غير واضح. كذلك الدراسات قد تكون مطلوبة لتحسين ظروف التحضير والتخزين لمواصلة توسيع نطاق وقت التخزين.
الحرير/إف-المغلفة windows الجمجمة إمكانيات كبيرة لأنهم جذريا تقصير أوقات العمليات الجراحية وهي بسيطة للغاية لتصنيع، ولكن في الوقت الحالي هذا الأسلوب له قيود. ويندوز الجمجمة المغلفة شكل موحد تسمية مناطق كبيرة من اللحاء ومحرك التعبير الكافي في الطبقة 2/3 للتصوير، مع بعض الشيء وأقل التعبير في طبقات أعمق جكامب. بيد أن حقن ستيريوتاكسيك محرك التعبير أكثر قوة وتوفير المزيد من التحكم في الطبقات المستهدفة للتعبير. قد تحقق التعبير موثوق بها فقط عندما تمت إزالته في بلده دوراً. على الرغم من أن غالباً ما تتم إزالة في دوراً للعديد من تجارب التصوير 2-فوتون لتحسين جودة الصورة8، للعديد من التجارب من المرغوب فيه الحصول على العلامات بطريقة أقل الغازية. ولذلك نحن استكشفت قدرتنا على استخدام الحرير/إف لتسمية المناطق القشرية دون إزالة دوراً. حصلنا على بعض العلامات، ولكن من الممكن أن هذا كان نتيجة لإتلاف دوراً في عملية التحضير اوديما. مزيد من الدراسة الحاجة إلى ويندوز الجمجمة المغلفة التي ستستخدم للتسمية القشرة موثوق بها دون إزالة دوراً.
إعداد مائي فيبروين الحرير من الشرانق من بومباي موري يرد بالتفصيل في روكوود et al. (2011) 18-فيبروين الحرير مائي الآن متوفرة تجارياً (5% w/v). على الرغم من أن معظم تجاربنا أجريت باستخدام مخزون مائي fibroin الحرير أعدت في المختبر لدينا (5-7.5% w/v)، حصلنا على نتائج مماثلة باستخدام فيبروين المائية التجارية. Fibroin مائي مستقر عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر، بعدها تلقائياً الانتقال من السائل إلى المائية18. نوصي بأن مخزونات fibroin مقسمة إلى قاسمة ~ 1 مل وتخزينها في-80 درجة مئوية. يمكن تخزين عند 4 درجة مئوية قاسمة عامل 1 مل (يكفي لطلاء مئات يزرع) وتستخدم حتى يبدأ في جل. كن حذراً لا اهتزاز، دوامة أو تحرض أو عدوانية "الماصة؛" فيبروين مائي، قوي القص يمكن أن يؤدي إلى جيليشن19،20.
تسمح الأفلام الحرير/إف مجموعة واسعة من أنماط التعبير، من التعبير القشرية على نطاق واسع تحت windows الجمجمة، إلى دقة التعبير subcortical في التلميح الألياف الضوئية الصغيرة-قطر. هذه التقنيات تم تطويرها للاستفادة من ناقلات التعبير إف المشتركة لكن المحتمل يمكن أن تستخدم لتفريق ناقلات التعبير الأخرى مثل لينتيفيروسيس أو الفيروسات داء الكلب في الدماغ. يمكن أيضا أن تصنع الأفلام الحرير إلى الأشكال ثلاثية الأبعاد لتحسين الإصدار الفيروسية في الأنسجة. على سبيل المثال، من أجل التعبير محرك قوي تحت windows القشرية دون الاستخدام من دوروتومي، يمكن المغلفة windows الجمجمة مع صفائف من الحرير ميكرونيدليس التي سوف بيرس دوراً والإفراج عن الفيروس في أعمق الطبقات القشرية21. المرجح أن يؤدي مزيد من الصقل لخصائص محسنة للإفراج عن الفيروسات، وتطبيقات جديدة للأفلام الحرير/إف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب أود أن أشكر فاسكويز جيه للرسوم التوضيحية وكابلان دال وجيم بريدًا الكواشف وتوجيهات مفيدة، ومختبرات ساباتيني باء وجيم هارفي للتصوير في فيفو . الفحص المجهري وأمكن أوكانا م ومركز تصوير بيولوجيا الأعصاب، تدعمها جزئيا مركز التصوير العصبي كجزء من "الوطني المعهد من الاضطرابات العصبية" و "السكتة الدماغية" (NINDS) P30 الأساسية مركز منح (NS072030). وأيد هذا العمل من مؤسسة الأسرة خوداداد جبر، والمؤسسة، و "علامات لوري نانسي" بمنح المعاهد الوطنية للصحة، R21NS093498 نيندس، U01NS108177 و R35NS097284 نيندس إلى W.G.R، ومن المعاهد الوطنية للصحة ما بعد الدكتوراه زمالة F32NS101889 إلى C.H.C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aqueous silk fibroin | Sigma | 5154-20ML | Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films |
| Microinjector to deposit silk/AAV | Drummond | 3-000-207 | Nanoject III nanoliter injector |
| Manipulator to hold implants | Narashige | MM-33 | Micromanipulator |
| Stereoscope to visualize silk deposits | AmScope | SM-6TX-FRL | 3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light |
| Vacuum chamber to store implants | Ablaze | N/A | 3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber |
| Optional, implant holder for storage | N/A | N/A | To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block. |
| Optical fiber | Thorlabs | FT200EMT | Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants |
| Ferrules | Kientec | FZI-LC-230 | LC Zirconia Ferrule for fiber implants |
| Various materials for manufacturing chronic fiber implants | Various | N/A | For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68). |
| Tapered fiber implants | Optogenix | Lambda-B | Tapered fiber implants |
| GRIN lenses | GoFoton | CLH-100-WD002-002-SSI-GF3 | GRIN lenses |
| Small glass cranial windows | Warner | 64-0726 (CS-3R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Large glass cranial windows | Warner | 64-0731 (CS-5R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Various materials for manufacturing cranial windows | Various | N/A | For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515. |
References
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Tervo, D. G., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Jackman, S. L., et al. Silk Fibroin Films Facilitate Single-Step Targeted Expression of Optogenetic Proteins. Cell Reports. 22 (12), 3351-3361 (2018).
- Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (68), e50004 (2012).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2011).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin sectioning of slice preparations for immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. (3), 194 (2007).
- Cao, Y., Wang, B. Biodegradation of silk biomaterials. International Journal of Molecular Sciences. 10 (4), 1514-1524 (2009).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
- Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nature Neuroscience. 13 (5), 584-591 (2010).
- Hines, D. J., Kaplan, D. L. Mechanisms of controlled release from silk fibroin films. Biomacromolecules. 12 (3), 804-812 (2011).
- Hu, X., et al. Regulation of silk material structure by temperature-controlled water vapor annealing. Biomacromolecules. 12 (5), 1686-1696 (2011).
- Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
- Yucel, T., Cebe, P., Kaplan, D. L. Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels. Biophysical Journal. 97 (7), 2044-2050 (2009).
- Wang, X., Kluge, J. A., Leisk, G. G., Kaplan, D. L. Sonication-induced gelation of silk fibroin for cell encapsulation. Biomaterials. 29 (8), 1054-1064 (2008).
- Lee, J., Park, S. H., Seo, I. H., Lee, K. J., Ryu, W. Rapid and repeatable fabrication of high A/R silk fibroin microneedles using thermally-drawn micromolds. European Journal of Biopharmaceutics. 94, 11-19 (2015).
