In Vivo Målrettet udtryk af Optogenetic proteiner ved hjælp af silke/AAV film

Summary

Vi præsenterer her, en metode til at levere viral udtryk vektorer ind i hjernen, ved hjælp af silke fibroin film. Denne metode giver mulighed for målrettet levering af udtryk vektorer ved hjælp af silke/AAV coatede optiske fibre, tilspidset optiske fibre og kranie vinduer.

Abstract

Søgen efter at forstå, hvordan neurale kredsløb procesoplysninger for at drive adfærdsmæssige output har været stærkt hjulpet af for nylig udviklet optiske metoder til at manipulere og overvågning af aktiviteten af neuroner in vivo. Disse typer af forsøg er afhængige af to hovedkomponenter: 1) implantabelt udstyr, der giver optisk adgang til hjernen, og 2) lysfølsomme proteiner, der ændrer neuronal ophidselse eller give en udlæsning af neuronal aktivitet. Der er en række måder at udtrykke lysfølsomme proteiner, men stereotaxisk injektion af virale vektorer er i øjeblikket den mest fleksible tilgang, fordi udtrykket kan styres med præcision genetiske, anatomiske og tidsmæssige. Trods den store nytte af virale vektorer, levere virussen til webstedet af optiske implantater udgør talrige udfordringer. Stereotaxisk virus injektioner krævende operationer, der øger kirurgisk tid, øge udgifterne til undersøgelser og udgøre en risiko for dyrets sundhed. Det omkringliggende væv kan være fysisk beskadigede ved injektion sprøjten og immunogen betændelse forårsaget af pludselige levering af en bolus af høj-titer virus. Tilpasse injektioner med optisk implantater er særligt vanskeligt, når du målretter små regioner dybt i hjernen. For at overvinde disse udfordringer, beskriver vi en metode til påføring flere typer af optiske implantater med film består af silke fibroin og Adeno-associeret virus (AAV) vektorer. Fibroin, en polymer stammer fra kokonen af Bombyx mori, kan indkapsle og beskytte biomolekyler og kan forarbejdes til former lige fra opløselige film til keramik. Når implanteret i hjernen, frigive silke/AAV belægninger virus på grænsefladen mellem optiske elementer og de omgivende hjerne, kørsel udtryk netop hvor det er nødvendigt. Denne metode er nemt at implementere og lover at i vivo studier af neurale kredsløb funktion i høj grad lette.

Introduction

Det seneste årti har produceret en eksplosion af manipuleret proteiner, lysfølsomme til overvågning og manipulere neurale aktivitet¹. Virus tilbyder uovertruffen fleksibilitet til at udtrykke disse optogenetic værktøjer i hjernen. I forhold til transgene dyr, er vira langt nemmere at producere, transportere og opbevare, giver mulighed for hurtig gennemførelse af de nyeste værktøjer, optogenetic. Udtryk kan målrettes genetisk forskellige neuronal populationer, og virus designet til retrograd transport kan endda bruges til at målrette udtryk baseret på neuronal connectivity².

Vira er som regel indført med stereotaxisk injektioner, hvilket kan være tidskrævende og udfordrende. Netop målrettet små regioner kan være svært, mens kørsel udtryk over brede områder ofte kræver mange indsprøjtninger. Desuden, når en optisk enhed er efterfølgende implanteret i hjernen til at levere lys i vivo, implantatet skal være korrekt justeret med den virale injektion. Her beskriver vi en let gennemføres metode til at levere virale vektorer til vævet omkring en indopereret enhed ved hjælp af silke fibroin film³. Silke fibroin er kommercielt tilgængelige, veltolereret af neurale væv, og kan bruges til at producere materialer med forskellige egenskaber. Silke film kan anvendes til implantater ved hjælp af fælles laboratorieudstyr som mikroinjektion pipetter eller hånd pipetter. Silke/AAV film fjerne kravet om to kirurgiske procedurer og sikre, at virus-medieret udtryk korrekt justeret til det optiske implantat. Det resulterende udtryk er begrænset til spidsen af fibre og resultater i mindre uønskede udtryk langs spor i fiber end stereotaxisk injektioner.

Ud over at producere målrettede udtryk på spidsen af små fibre, silke/AAV film kan bruges til at drive udbredt (> 3 mm i diameter) kortikale udtryk under kranie windows. In vivo 2-foton billeddannelse af fluorescerende aktivitet sensorer er blevet et uundværligt redskab til at vurdere rollen af neuronal aktivitet i kørsel sensorisk og kognitiv bearbejdning. Men, for at drive ensartet udtryk over de brede kortikale områder, eksperimentatorer ofte udføre flere injektioner. Disse injektioner kan være meget tidskrævende og kan føre til usammenhængende udtryk på tværs af synsfeltet. Derimod er silke/AAV-belagt kraniel Vinduer ekstremt nemt at fremstille, i høj grad reducere den nødvendige tid til operationer, og mest bemærkelsesværdigt køre udtryk hundredvis af mikron under den kortikale overflade.

Protocol

Alle eksperimenter, der involverer dyr blev udført i overensstemmelse med protokoller godkendes af Harvard stående udvalg om dyret sig følgende retningslinjer beskrevet i os NIH vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Voksne C57BL/6 mus af begge køn (6-15 uger gammel) blev brugt til alle eksperimenter.

1. få vandig silke Fibroin

1. Forberede eller købe vandig silke fibroin (5-7,5% w/v).

2. Bland vandig silke med AAV udtryk vektorer

1. Vælg en AAV udtryk vektor til at drive optogenetic protein eller fluorescerende indikator for valg.
   Bemærk: For at minimere mængden af silke/AAV, der skal anvendes på implantater mens stadig køre robuste udtryk, stock-titer AAV (stock titers typisk fremstillet af vektor kerner er omkring ~ 10¹³ gc/mL) anbefales.
2. Umiddelbart inden belægning implantater, tø en alikvot af AAV og kombinere med 5-7,5% vandig silke fibroin (denne blanding vil være henvist til som silke/AAV). I en 200 µL PCR rør, bland vandige fibroin og AAV i forholdet 1:1 (til kranie windows brug 1:4) umiddelbart før anvendelsen. Forsigtigt afpipetteres løsningen ind og ud flere gange blandes grundigt fibroin og AAV.
3. Holde silke/AAV blandingen på køl før anvendelsen.

3. Forbered udstyr til fremstilling og opbevaring af silke/AAV-belagt enheder

1. Fremskaf udstyr til belægning optiske fibre og Gradient-indeks (GRIN) linser (tallene 1, 2).
   1. Konstruere en stabil Doppsko indehaver. For at holde keramiske dupsko, bore 1,25 mm huller i en blok af ¼" ark akryl. Tryk huller for at indsætte sæt skruer fra siden at holde dupsko på plads.
      Bemærk: Enhver klemme kan bruges til dette formål.
   2. Placer en manipulator med sub millimeter præcision til at flytte de optiske fibre (stereotaxisk apparatur eller andre præcision micromanipulator).
   3. Samle en stabil indehaveren for at placere microinjector.
   4. Bruge en Stereoskopet for at visualisere optiske fibre og silke slipværktøj.
   5. Placer en lyskilde for at belyse de optiske fibre.
2. Forberede udstyr til belægning kraniel windows (figur 3).
   1. Vælg enhver P10 pipette.
   2. Få en container med låg.
      Bemærk: Enhver container med en silikone bunden foreslås — blød bunden letter løft op kraniel windows.
3. Forberede udstyr til at gemme færdige implantater (figur 4).
   1. Få en lille (1-5 L) vakuumkammer.
   2. Sørg for, at der er plads til at gemme implantater i 4 ° C køleskab.

4. Anvend silke/AAV Film til enheder

1. Belægning optiske fibre til drev fokale udtryk på fiber tip
   1. Forberede kronisk fiber implantater som tidligere beskrevet⁴.
   2. Før brug, skylles implantater med ethanol, så med ultrarent vand for at sikre, at de optiske fibre er ren.
      Bemærk: Silke film overholde mere pålideligt for at rengøre glasoverflader.
   3. Forbered en enhed til at holde fiber dupsko. For typiske 1,25 mm diameter tyller, brug en blok ¼ tommer klar akryl med ~1.3 mm huller, og tappet sæt skruer ind fra siden til hul implantater fast på plads (figur 1A).
   4. Mount indehaveren af Doppsko i et stereotaxisk apparatur (eller enhver manipulation løsning med submillimeter præcision) udstyret med en microinjector. Placer indehaveren af Doppsko over microinjector og anvende silke/AAV blanding fra neden.
      Bemærk: Dette er fordi programmer af store mængder fra ovennævnte resulterede i silke/AAV, der ikke var begrænset til spidsen. Dog kan anvendelse af mange små sekventielle mængder fra over eller under producere AAV/silke indskud, der er begrænset til spidsen (selvom vi foretrækker at anvende fra neden).
   5. Trække en standard intrakraniel injektion pipette fra borsilikatglas kapillær.
      1. At gøre det lettere at
      2. At producere en injektion spids med en ren flad spids af den ønskede diameter, hold en pipette i hver hånd og bruge den tykkere del af tilspidsning på en pipette til at score de andre pipette på lokationen ønskede pause.
      3. Forsigtigt gnide frem og tilbage i en savning (glas på glas scoring metode).
      4. Efter scoring pipetten, anvende blid pres på spidsen af den scorede pipette med liget af den andre pipette til at opnå en ren pause.
   6. Placer en Stereoskopet for at give et klart billede af optisk fiber ansigter.
      Bemærk: Forstørrelse bør være tilstrækkelige til præcist at placere injektion pipette over ansigtet af optiske fibre.
   7. Indsæt fiber implantater i indehaveren med hjerne-side af optisk fiber vender nedad.
   8. Indlæse injektion pipette med silke/AAV løsning, hvad angår enhver standard intrakraniel injektion⁵. Indlæse de beløb, der kræves for antallet af brystimplantater gøres, plus ~ 30% ekstra til at rumme tab som følge af pipetter tilstopning. For eksempel, hvis 10 implantater fremstilles, derefter indlæse med 100 nL indskud og trække ~1.3 µL.
      Bemærk: Silke/AAV kan tørre på pipette spidsen i mellem ejections, som kan tilstoppe pipetten. Stor diameter pipetter (50-100 µm) er mindre tilbøjelige til at tilstoppe. Træsko kan være fortrængt af blide børster ned spidsen af pipetten med et vådt papir serviet eller alkohol vatpind.
   9. Manøvrere injektion pipette, indtil det rørende eller næsten rører midten af optisk fiber overflade. Skubbe 10-20 nL af silke/AAV løsning. Trække pipetten.
      Bemærk: Sats på levering er ikke kritisk, men typisk er 5-20 nL/s.
   10. Observere bolus af silke/AAV på en flad overflade, der vises som et flydende kuppel, der tørrer til en flad film indenfor ~ 1 min (figur 1B).
   11. Gentag trin 4.1.9-4.1.10 indtil den ønskede mængde af silke/AAV er deponeret (i alt 20-200 nL for de fleste applikationer). Når du forbereder flere implantater, gælde ét implantat silke/AAV og derefter gå videre til pels andre implantater før han vendte tilbage til først.
   12. Tillad 1 h til tørring før flytte implantater.
   13. Vakuum desiccate overnatning på ~ 125 Torr (-25 i. HG), 4 ° C. Gøre dette ved at placere indehaveren af hele Doppsko i en vakuumkammer.
   14. Evaluere geometri og placering af den resulterende silke film under en høj effekt mikroskop. Sikre, at film er begrænset til spidsen af optisk fiber overflade, være relativt tynde (> 100 µm), og symmetrisk (figur 1 c).
       Bemærk: Store eller asymmetrisk silke/AAV film kan løsne fra fiber under implantation (fig. 1 d). Den mest almindelige årsag til problemer skyldes anvendelsen af enkelt store mængder snarere end sekventielle anvendelsen af mange små mængder.
2. Belægning koniske optiske fibre til at drive udtryk langs fiber akse
   1. Få tilspidset optisk fiber implantater og udføre trin 4.1.2-4.1.8, bortset fra at den tilspidsede fiber er placeret sideværts således, at det er vinkelret på injektor (figur 2A). Placer injektor ovenfor den koniske fiber.
      Bemærk: Indlæsning af flydende dråber på koniske fibre udgør tilføjet udfordringer, fordi overfladespænding tendens til at forårsage droplets til at hoppe tilbage på injektion pipette eller overflytte op den koniske fiber. Mindre injektion pipetter (30-50 µm diameter) bidrage til at løse dette problem, men øge risikoen for, at injektion pipette vil tilstoppe. På grund af overfladespænding, dråber tendens til at holde sig til området af største areal, så den optimale injektion afpipetteres størrelse er afhængig af størrelsen af den tilspidsede fiber og ens tolerance for lejlighedsvise tilstoppe.
   2. Placer silke/AAV injektion pipette mod siden af optiske fibre i begyndelsen af tilspidsning. Kontroller, at injektion pipette er rørende optisk fiber.
   3. Udsende 20 nL af silke/AAV at starte belægning proces. Sikre at dråben overholder optisk fiber og forbliver på grænsefladen af fiber/pipette. Forsigtigt væge droplet i slutningen af fiber tip som silke/AAV tørrer (~ 45 s). Holde den indsprøjtning pipette kontakt med tørring slipværktøjet til at undgå tilstopning pipette tip.
      Bemærk: Hver indbetaling skal pels ca 400 µm af koniske fiber (figur 2B).
   4. Når den første bolus er tørret næsten helt, udsende en anden 20 nL og fortsætte fugtspredende droplet langs tilspidsning.
      Bemærk: Den flydende silke vil overholde den tørrede silke, forankring ene ende af droplet som pipetten bevæger sig langs tilspidsning.
   5. Gentag trin 4.2.4 ved at skubbe små mængder af silke/AAV og gradvist tegning løsning op på siden af tilspidsning. 5-6 ejections er tilstrækkelig til at krydse en 2,5 mm koniske overflade.
   6. For at drive mere ensartet udtryk omkring alle sider af fiber, rotere fiber og gentage trin 4.2.2-4.2.5, indtil den ønskede mængde af silke/AAV har deponeret.
   7. Hvis en hængende strand af tørrede silke/AAV strækker sig ud over den fiber spids, omhyggeligt skæres stranden med saks, eller bruge udslyngning pipette til at bøje strand tilbage og overholde det tilspidsning af fiber.
   8. Tillad 1 h til tørring før flytte implantater.
   9. Vakuum desiccate overnatning i 4 ° C. Indehaveren af hele Doppsko kan placeres i en vakuumkammer.
   10. Evaluere geometri og placering af den resulterende silke film under en høj effekt mikroskop.
       Bemærk: Film behøver ikke at være helt ensartede, men bør ikke har bump, der strækker sig mere end 100 µm ud over overfladen af fiber at minimere skader på omkringliggende væv under implantation (figur 3 c). For at minimere film størrelse, er det afgørende, at hver dråbe er helt tørt, før efterfølgende indskud er lavet.
3. Belægning Øjenimplantater GRIN
   1. Få GRIN linser^6,7 , og Gentag trin 4.1.2-4.1.8. Injektoren kan være monteret over.
   2. Depositum silke/AAV i en enkelt udslyngning (1 µL for en 1,0 mm diameter objektiv).
      Bemærk: Dette vil give en kuppel af væske, der klæber til ansigt af linsen, og tørrer til at producere en ensartet film (100-200 µm tykt). Men i tilfælde af, at en enkelt stor udslyngning tørrer ujævnt og producerer en film, der er tykkere nær kanten af GRIN linse, prøve deponering flere mindre dråber (100-200 nL) i midten af objektivets overflade (at lade hver dråbe tørre inden deponering den næste) for at sikre, at filmen vil drive udtryk i midten af synsfeltet.
   3. Tillad 1 h til tørring før flytte implantater.
   4. Evaluere geometri og placering af den resulterende silke film under en high-power mikroskop for at sikre at filmen dækker overfladen af linsen.
4. Belægning glas kraniel windows
   1. Forbered glas kraniel windows af vedhængende to 3 mm diameter runde coverslips (nr. 1 tykkelse) til en 5 mm diameter vindue med optiske limen (for detaljer, se Goldey et al. 2014⁸).
   2. Bland silke: virus i et forhold på 1:4 til at reducere den samlede mængde af silke i filmen. Store mængder af silke ikke opløses under kranie windows efter implantation. Titrering eksperimenter kan være nødvendigt at bestemme forholdet og mængden, der giver den ønskede udtryk profil.
   3. Hånd afpipetteres 5 µL slipværktøj på overfladen af 3 mm (hjernen vender) coverslip. Slipværktøjet skal spredes ud til at dække hele barometer overflade (figur 3).
   4. Mulighed 2-3 h for tørring før du flytter vinduer.

5. opbevaring silke/AAV-belagt implantater

1. Gemme silke/AAV-coatede optiske fibre i et afkølet vakuum ekssikkator (~ 125 Torr, 4 ° C) før brug (figur 4A).
2. Må ikke opbevares kraniel windows og GRIN objektiver under vakuum, da store silke film opbevares under vakuum ikke fuldt opløses efter implantation. Implantatet kraniel windows og GRIN linser umiddelbart efter tørring, eller inden for en dag i fremstilling hvis opbevares ved atmosfærisk tryk og 4 ° C.

6. implanterer enhederne

1. Forberede dyr til implantatkirurgi som tidligere beskrevet⁴.
   1. Kort, bedøver mus med en intraperitoneal injektion af ketamin/xylazin (100/10 mg/kg) og kontrollere dybde af anæstesi ved hjælp af en blid tå-knivspids. Barbere kraniet i området af implantatet og rense hovedbunden med jod og alkohol.
   2. Mount dyr i et stereotaxisk enhed og supplement anæstesi ved hjælp af en blanding af ilt og isofluran (1-2%). Gøre et snit i hovedbunden over område af interesse, og udføre en stor nok til at rumme implantatet kraniotomi.
2. Implantatet optiske fibre⁹ og microendoscope linser¹⁰ ifølge tidligere udgivne procedurer. Håndtag implantater med omhu, da silke/AAV depositum kan være slået af en ufuldkommen kraniotomi eller af implantatet fangst på kanten af kraniet. Lavere implantatet i hjernen langsomt (~ 2 mm/min).
3. Implantatet kraniel windows, som beskriver tidligere⁸. Ikke røre den coatede side af vinduet og undgå skylning vinduet med væske, hvis udfører mavesonde, som dette kan vaske væk virussen. For at opnå maksimal udtryk, udføre en durotomy.

7. evaluering af udtryk og fejlfinding

1. Hvis du vil evaluere udtryk for viralt udtrykte proteiner, tillade ~ 2-3 uger for virus at drive udtryk og derefter udføre intracardial perfusion med 4% PARAFORMALDEHYD i phosphat bufferet saltopløsning¹¹ og proces hjernevæv for lysstofrør mikroskopi¹².
2. Evaluere udtrykket ved hjælp af fluorescerende mikroskopi til billede udtryk mønster af fluorophore-mærket optogenetic proteiner.
3. Hvis udtryk er utilstrækkeligt, øge mængden af virus i belægninger ved enten at øge det samlede omfang af silke/AAV belægning, eller helst ved hjælp af en højere titer virus.

Representative Results

For at vurdere silke/AAV film succes i kørsel udtryk, vi perfunderet dyr 2-3 uger efter implantation og forberedte hjerne skiver fra område af interesse. Fluorescens billeder af fluorophore-mærket optogenetic proteiner (ChR2-YFP) fastsat et mål for omfanget af udtrykket (fig. 1 d). Typiske optiske fibre (230 µm diameter) kan let rumme 200 nL af silke/AAV. Med praksis, kan eksperimentatorer opnå meget pålidelige udtryk omkring spidsen af implanterede fibre (figur 5).

For at vurdere udtryk drevet af silke/AAV-belagt kraniel windows, Begynd imaging begynder 7-10 dage efter implantation. Vi har brugt to-foton imaging til visualisering, men kunne også anvendes andre metoder såsom fluorescens imaging med en CCD. To mulige problemer med coated kraniel windows er utilstrækkelig udtryk og silke film, der undlader at opløse og obskure synsfelt. For at øge udtryk, foreslår vi, at udføre en durectomy før implanterer vinduet, og/eller øge mængden af virus i filmen. Vi opnåede den bedste udtryk med et 1:4 blanding af silke og stock-titer AAV, hhv. Mens dette repræsenterer et betydeligt større antal viruspartikler end der normalt bruges i stereotaxisk injektioner, tællere nedsat kirurgisk tiden den marginale ekstra omkostning af virus. I mellemtiden, hvis silke film ikke opløses under vinduet, yderligere reducere mængden af silke anvendes til at belægge vinduet. Det samlede beløb af silke i coated windows er 10 - 100 gange mere end på fiber implantater, og filmen er mindre indlejret i væv og dermed ikke kan være udsat for de samme niveauer af proteolytiske aktivitet end kan opløse silke film¹³. Tilstedeværelsen af nogle silke er imidlertid afgørende at opnå udtryk under windows³, sandsynligvis fordi en film lavet af virus alene er skyllet væk af interstitiel væske under kirurgi.

Figur 1: anvende silke/AAV film til optiske fibre. (A) kronisk fiber implantater er placeret fiber og ned i en holder (indsatser) monteret på XYZ oversætter. En fast microinjector under fibrene dispenserer silke/AAV på fiber tips. En Stereoskopet giver mulighed for visualisering af processen. (B) gælde silke/AAV fiber tips i små mængder (10-20 nL). Efter skubbe en bolus, trække pipetten og tillade ~ 60 s for slipværktøjet til at tørre til en flad film. Gentag processen, indtil den krævede diskenhed er blevet anvendt til fiber spids. (C) inspicere silke belægninger. Optimal belægning skal centreret fiber spids (venstre), mens forkert belægninger udvide udad fra fiber ansigt gør dem mere tilbøjelige til at løsne fra fiber (til højre). (D) repræsentative fibre belagt med 200 nL af silke/AAV, og den resulterende AAV-drevet ChR2-YFP udtryk 2 uger efter implantation. Den kompakte silke/AAV belægning på venstre resulterede i robust udtryk, mens belægning på højre stak forbi ansigt af fiber og førte næsten ingen udtryk, sandsynligvis fordi silke/AAV ikke overholder den optiske fiber under implantation. Skala barer 0,2 mm (fibre) og 1.0 mm (hjernen skiver). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Setup for belægning tilspidset fiber implantater. (A) microinjector er monteret over tilspidset fiber indehaveren, og tilspidset fibre er placeret vinkelret at udslyngning sprøjten. (B) begynder på det bredeste punkt (indsatser) og skubbe små mængder mens du flytter udslyngning sprøjte mod punktet af tilspidsning. Dette resulterer i en kontinuerlig belægning langs længden af tilspidsning. (C) repræsentative tilspidset fiber belagt med silke blandet med hurtigt grøn til støtte i visualisering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: belægning kraniel windows. Silke/AAV kan være anvendt kraniel windows ved hjælp af en hånd pipette. En standard 3 mm diameter vindue kan være beklædt med et 5 µL slipværktøj, som vil langsomt tørre til en flad film. Indsatser: GCaMP6f udtryk som følge af silke/AAV-belagt kraniel windows implanteret med og uden durectomies. Dette tal er blevet tilpasset fra Johansen et al. (2018) ³. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: lagring af silke/AAV belagt implantater. (A) at fjerne resterende fugt og bevare viral effekt, implantater skal opbevares under vakuum ved 4 ° C indtil anvendes. Implantater gemt denne måde forbliver levedygtige i mindst 7 dage. (B) udtryk som følge af 4 silke/AAV overtrukne fibre implanteret efter 7 dage oplagring. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: silke/AAV-NGL coatede optiske fibre køre pålideligt udtryk. Fluorescerende billeder af skiver fra 24 sammenhængende striatal implantater. Hver implantat var belagt med 100-400 nL 1:1 silke/AAV-normal god landbrugspraksis. Denne kohorte af implantater angiver silke evne til at begrænse udtryk til implantatstedet (i dette tilfælde den dorsale striatum). Normal god landbrugspraksis Fluorescens er angivet med grønt; DAPI farvning er vist med blåt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Brug af silke/AAV at målrette udtryk af optogentic proteiner overvinder begrænsningerne af tiltag, der er i øjeblikket i brug. Selv om mange undersøgelser med held bruge AAV injektioner for at udtrykke optogenetic proteiner, er det en udfordring at tilpasse udtryk til spidsen af optiske fibre, regionerne omkring længden af koniske fibre og regionen visning af et GRIN linse. På grund af misforholdet mellem optiske komponenter og optogenetic udtryk, stereotaxisk injektioner kan være upålidelige, og mange forsøg mislykkes. Silke/AAV mærkning metode vi beskrive her løser dette problem. Det forenkler proceduren ved at fjerne en anden kirurgisk skridt og i nogle tilfælde, eliminerer behovet for en anden kirurgi. Det kan også være vanskeligt at bruge virus for at få udbredt udtryk under kranie windows, og eksperimentatoren udfører typisk lange operationer til at injicere virus flere steder. Evnen til at få udbredt udtryk over store kortikale regioner af simpelthen belægning kraniel windows med silke/AAV er en forenkling, der eliminerer behovet for de mange invasive injektioner.

En anden potentiel fordel af silke/AAV metode er, at det kan fremkalde mindre betændelse i de neurale væv i forhold til viral injektioner. Indsprøjte high-titer AAV i hjernen kan forårsage inflammatoriske respons som reaktive astrocytosis, der har potentiale til at ændre cellulære og kredsløb egenskaber^14,15 , (selv om sådanne potentielle komplikationer er normalt ignoreret). Silke film fremkalde lille immunogen svar på deres egen¹³ og silke/AAV film forventes at frigive virus i løbet af mange timer eller dage¹⁶, som kan sænke virusmængde i det omgivende væv og reducere immunogen svar. Med konventionelle tilgange, hvor implantation af en enhed er indledes med en AAV indsprøjtning, kan inflammatoriske respons opstå fra både implantation og injektion. I fremtiden vil det være ønskeligt at systematisk sammenligne konventionelle tilgange og silke/AAV metode til at bestemme, om silke/AAV film reducerer samlede inflammatoriske respons.

Flere trin er afgørende for vellykket brug af silke/AAV film. Vigtigst, overfladebehandling af optiske fibre skal gøres omhyggeligt, som beskrevet i metoderne og placeringen af de tørrede film bør vurderes omhyggeligt ved visuel inspektion under et mikroskop for at sikre, at filmene er kompakt, i den korrekte placering, og overholde ansigt af optisk fiber. Enhver silke/AAV på siderne af optisk fiber vil føre til interessetilkendegivelse uden for regionen, og misshaped film, der rager ud over ansigtet af fiber kan knække under implantation og føre til upålidelige eller ingen udtryk. De teknikker vi beskrive for anvende silke/AAV implantabelt udstyr kan være tilpasset til brug af materialer er der er let tilgængelige og giver mulighed for præcis aflejring af små mængder af silke/AAV.

En smule af praksis er kræves for at opnå nøjagtige og reproducerbare resultater. Hvis udtryk er observeret langs med sporet af fiber, er det sandsynligt, at silke filmen tørres på siden af fiber frem for fiber ansigt. Gentag fremstillingsprocessen og nøje undersøge tørrede implantater for tegn på, at film tørring på siden af fiber. Fordi silke/AAV film er optisk gennemsigtig, kan det hjælpe at praksis anvender silke blandet med farvestof (hurtigt grøn eller en lignende farvestof) bedre visualisere form af resulterende film (figur 2 c). Hvis der er ingen udtryk, er det sandsynligt, at silke filmen fortrængt fra fiber tip under implantation. Vi foreslå brugen af stock-titer virus, når du foretager implantater. Til optiske fibre reducerer dette den samlede mængde, der skal anvendes på små diameter fibers. Hvis størrelsen af belægningen er en bekymring overveje at vente længere mellem hver 10 nL ansøgning tillade fuldstændig udtørring af de deponerede droplet. Silke/AAV dråber tørre hurtigere under en varme lampe. For kraniel windows, kan høj-titer virus være nødvendigt at levere tilstrækkelig viral belastning på tværs af pia eller dura. Visse typer af implantater kan opløse silke og frigive AAV lettere end andre. Vi har fundet, at kraniel windows implanteret over overfladen af hjernen kræver et lavere forhold på silke/virus at opnå pålidelige udtryk, måske på grund af forskellige cerebral spinal fluid dynamik eller protease aktivitet. Hvis udtrykket ikke kan øges ved at øge effektiv AAV koncentrationer, er faldende volumen af vandige silke et plausibelt alternativ.

Endelig er det vigtigt at gemme de optiske komponenter ordentligt og implantat dem ganske snart efter at de er parate. Vi har vist, at overtrukne fibre, der er nedkølet under vakuum kan opbevares i mange dage før brug. Vakuum opbevaring fjerner resterende fugt¹⁷ som kan reducere opløseligheden af silke film, og også hjælpe med at opretholde viral effekt. Ideelt set bør optiske fibre implanteres inden 24 timer efter fremstilling. Vi finder imidlertid, at silke/AAV-belagte fibre opbevares under vakuum drev lignende niveauer af udtryk når implanteret 7 dage efter fabrikation (figur 4B). Derimod kørte belagt kraniel windows og GRIN linser den mest pålidelige udtryk, når de blev tørret ved stuetemperatur og anvendes inden for timer til forberedelse. Årsagen til denne forskel er fortsat uklart. Yderligere undersøgelser kan være nødvendige for at forfine tilberedning og opbevaring betingelser til yderligere udvide opbevaringstid.

Silke/AAV-belagt kraniel windows har stort potentiale, fordi de drastisk forkorte kirurgisk gange og er meget enkel at fremstille, men på nuværende tidspunkt denne metode har begrænsninger. Coatede kraniel windows ensartet etiket store områder af cortex og drive tilstrækkelig udtryk i layer 2/3 for GCaMP imaging, med lidt mindre udtryk i dybere lag. Men stereotaxisk injektioner drive mere robust udtryk og giver mere kontrol over de lag, der er målrettet til udtryk. Pålidelig udtryk var kun opnås, når dura blev fjernet. Selv om dura er ofte fjernet for mange 2-foton imaging eksperimenter til at forbedre billed kvalitet⁸, for mange eksperimenter er det ønskeligt at opnå mærkning i en mindre invasiv måde. Vi har derfor undersøgt vores evne til at bruge silke/AAV for at mærke kortikale regioner uden at fjerne dura. Vi fik nogle mærkning, men det er muligt, at dette var en konsekvens af skadelige dura ved at forberede kraniotomi. Yderligere undersøgelse er nødvendig for belagt kraniel windows skal bruges til at pålideligt mærke cortex uden at fjerne dura.

Forberedelse af vandige silke fibroin fra kokoner af Bombyx Mori er beskrevet i detaljer i Rockwood et al. (2011) ¹⁸. vandig silke fibroin er nu kommercielt tilgængelige (5% w/v). Selv om de fleste af vores eksperimenter blev udført ved hjælp af vandige silke fibroin bestande tilberedt i vores lab (5-7,5% w/v), har vi opnået lignende resultater ved hjælp af kommercielle vandige fibroin. Vandige fibroin er stabil ved 4 ° C i op til 3 måneder, hvorefter det spontant overgange fra flydende til hydrogel¹⁸. Vi anbefaler at fibroin bestande være inddelt i ~ 1 mL delprøve og opbevares ved-80 ° C. En 1 mL arbejder delprøve (tilstrækkelig til belægning hundredvis af implantater) kan opbevares ved 4 ° C og anvendes indtil det begynder at gel. Være forsigtig ikke ryste, vortex, agitere eller aggressivt afpipetteres vandig fibroin, da shear styrker kan føre til gellation^19,20.

Silke/AAV film tillader en bred vifte af udtryk mønstre, fra udbredt kortikale udtryk under kranie windows, til præcise subkortikale udtryk på spidsen af en lille diameter optiske fibre. Disse teknikker blev udviklet for at drage fordel af fælles AAV udtryk vektorer men kan sandsynligvis anvendes til at sprede andre udtryk vektorer som Lentiviruses eller rabies virus ind i hjernen. Silke film kan også fremstilles i tre-dimensionelle figurer at forbedre viral overgang til væv. For eksempel, for at drive stærke udtryk under kortikale windows uden brug af en durotomy, kunne kraniel windows være belagt med arrays af silke microneedles, der ville gennembore dura og frigivelse virus i dybere kortikale lag²¹. Yderligere finjustering vil sandsynligvis føre til forbedret egenskaber af virus frigivelse, og nye ansøgninger om silke/AAV film.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aqueous silk fibroin	Sigma	5154-20ML	Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films
Microinjector to deposit silk/AAV	Drummond	3-000-207	Nanoject III nanoliter injector
Manipulator to hold implants	Narashige	MM-33	Micromanipulator
Stereoscope to visualize silk deposits	AmScope	SM-6TX-FRL	3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light
Vacuum chamber to store implants	Ablaze	N/A	3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber
Optional, implant holder for storage	N/A	N/A	To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block.
Optical fiber	Thorlabs	FT200EMT	Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants
Ferrules	Kientec	FZI-LC-230	LC Zirconia Ferrule for fiber implants
Various materials for manufacturing chronic fiber implants	Various	N/A	For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68).
Tapered fiber implants	Optogenix	Lambda-B	Tapered fiber implants
GRIN lenses	GoFoton	CLH-100-WD002-002-SSI-GF3	GRIN lenses
Small glass cranial windows	Warner	64-0726 (CS-3R-0)	Small round cover glass, #0 thickness
Large glass cranial windows	Warner	64-0731 (CS-5R-0)	Small round cover glass, #0 thickness
Various materials for manufacturing cranial windows	Various	N/A	For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515.