Summary
في هذا البروتوكول، يصف لنا إكمال سير العمل لعزل السريع من حويصلات خارج الخلية من دماء كل البشر وتوصيف علامات محددة بتحليل تتبع نانوحبيبات المستندة إلى الأسفار. إظهار درجة عالية من إمكانية تكرار نتائج النتائج المعروضة ويمكن تعديلها ل supernatants ثقافة الخلية.
Abstract
حويصلات خارج الخلية (EVs)، بما في ذلك اكسوسوميس، هي حويصلات نانو الحجم الغشائي المتخصصة الموجودة في سوائل الجسم التي تصدر مؤثرا من العديد من أنواع الخلايا وتلعب دوراً محوريا في تنظيم الاتصالات خلية خلية ومجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية. وقد وصف العديد من أساليب مختلفة لتوصيف المركبات الكهربائية. ومع ذلك، معظم هذه الأساليب قد عيب أن إعداد وتوصيف للعينات التي تستغرق وقتاً طويلاً جداً، أو أنها صعبة للغاية لتحليل علامات محددة من الاهتمام نظراً لصغر حجمها، ونظرا لعدم وجود منفصلة والسكان. بينما أساليب لتحليل المركبات الكهربائية قد تحسنت إلى حد كبير خلال العقد الماضي، لا يزال هناك أي أسلوب موحد لتوصيف واحد ف. س. هنا، نحن تثبت أسلوب شبه الآلي لتوصيف المركبات الكهربائية واحدة بتحليل تتبع نانوحبيبات المستندة إلى الأسفار. البروتوكول الذي يرد يعالج مشكلة مشتركة للعديد من الباحثين في هذا الميدان وتقدم سير العمل كاملة للعزلة السريع للمركبات الكهربائية وتوصيف مع PKH67، رابط غشاء الخلية عامة، فضلا عن علامات محددة السطحية هذه كما CD63، CD9، فيمنتين، وغشاء الليزوزومية المرتبطة بالبروتين 1 (مصباح-1). وتظهر النتائج قدم مستوى عال في إمكانية تكرار نتائج، كما أكدت بأساليب أخرى، مثل النشاف الغربية. في التجارب التي أجريت، قمنا باستخدام المركبات الكهربائية المعزولة من عينات مصل الدم البشري حصرا، ولكن هذا الأسلوب هو أيضا مناسبة للبلازما أو سوائل الجسم الأخرى، ويمكن تعديلها لتوصيف المركبات الكهربائية من supernatants ثقافة الخلية. بغض النظر عن التقدم في المستقبل للبحث عن الأحياء EV، ينص البروتوكول على أن يرد هنا طريقة سريعة وموثوق بها لتوصيف السريع للمركبات الكهربائية واحدة مع علامات محددة.
Introduction
حويصلات خارج الخلية (EVs)، بما في ذلك اكسوسوميس، المتخصصة الغشائي نانو الحجم حويصلات (20-150 nm) الذي يحتوي على تركيبات معينة من الدهون، والالتصاق وجزيئات إرسال الإشارات بين الخلايا، فضلا عن المكونات الأخرى الفنية سيتوسوليك مثل ميكرورنا (ميرنا) ومرناً، وتلعب دوراً محوريا في تنظيم خلية خلية الاتصالات1،2. المركبات الكهربائية يتم الإفراج في بيئتهم من العديد من أنواع مختلفة من الخلايا، مثل خلايا بطانية، والخلايا المناعية والخلايا السرطانية، ويمكن الكشف عن في سوائل الجسم مثل السائل المنوي المصل أو البول، حليب الثدي، اللعاب أو النخاعي3، 4-زيادة إعداد الدراسات تسليط الضوء على مساهمة متنوعة من المركبات الكهربائية كالمؤشرات الحيوية المحتملة للتشخيص المبكر للعديد من الأمراض و/أو التنبؤ بتطور المرض5،6. كثيرا ما توصف اكسوسوميس بوجود الجزيئات التي ترتبط على وجه التحديد مع، بغض النظر عن نوع الخلية التي تجنيها من7. على سبيل المثال، تحتوي على تيتراسبانينس مختلفة (CD9، CD63، CD81) اكسوسوميس، الرئيسية الفئة المعقدة histocompatibility أنا (MHC أنا) الجزيئات، ومختلف البروتينات transmembrane، البروتينات سيتوسوليك نموذجي (tubulin واكتين)، جزيئات المتورطين في (هيئة مولتيفيسيكولار نشوء حيوي مفب) (TSG101 وأليكس)، حرارة صدمة بروتينات (HSP 70 و HSP 90)، والبروتينات التي تشارك في الإشارات تنبيغ (بروتين مؤنزم)8.
وقد وصف العديد من أساليب مختلفة لتوصيف المركبات الكهربائية9. هي الأساليب الأكثر شيوعاً وانتشارا المستخدمة لتحليل EV التدفق الخلوي10، المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)، وانتقال الميكروسكوب الإلكتروني (TEM)11. هو أسلوب بيستيستابليشيد وتستخدم عادة لوصف المحتوى EV البيوكيميائية الغربية النشاف12،13. بينما تسمح تيم ووزارة شؤون المرأة للكشف عن المركبات الكهربائية عبر طيف كامل الحجم، محدودة للغاية تحديد البروتينات السطحية محددة وضع غير مؤات لهذه الأساليب. وفي المقابل، التدفق الخلوي أداة قوية لتحديد معالم السطح EV محددة، ولكن على عتبة هذا الأسلوب يحد مع التحليل للمركبات الكهربائية بحجم أكبر من 500 نانومتر. ومن ثم تحليل للمركبات الكهربائية المعزولة بالكشف عن علامات السطحية المحددة حاليا لا الوصول إليها من خلال أي من هذه الطرق الثلاث الراسخة. ونحن سابقا وصف طريقة أخرى حساسة للغاية لتصور وتحليل للمركبات الكهربائية، تحليل تتبع نانوحبيبات (NTA)14. باختصار، هذا الأسلوب يجمع بين اثنين من مبادئ فيزيائية مختلفة. أولاً، مبعثر جزيئات الضوء عندما كانوا هم المشع بشعاع ليزر، والمبدأ الثاني، يعرف باسم الحركة البراونية، يعني ضمناً أن نشر جزيئات مختلفة في تعليق سائل تناسبا عكسيا مع حجمها. أداة تحليل نانوحبيبات سطح المكتب شبه الآلي لعينات سائلة تتكون من الجسيمات تتبع محلل بتحليل يستند إلى البرامج، حيث يتم تسجيل الصور الرقمية الضوء المتناثرة من جزيئات مفردة. يتم الكشف عن الجسيمات وحركة الجسيمات مجهر نثر ليزر مع كاميرا فيديو. شعاع الليزر موجه عمودياً، بينما المحور الضوئي الأفقي ومركزة في القناة خلية مليئة العينة. البيانات المقدمة من مؤامرات للبقع الخفيفة المتناثرة وسرعة الحركة تمكين تحديد الجسيمات مجموع عدد وحجم التوزيع. بعد التشعيع بالليزر، مبعثر الجسيمات الضوء، ومسجل من قبل كاميرا الفيديو رقمية عن طريق المجهر14. النهوض باسلوبنا السابق هو إدراج عامل تصفية الوقف نانومتر طويلة الموجه-تمرير (LWP) 500 بين الليزر (الطول الموجي 488 نانومتر) وقناة الخلية، مما يتيح التحليل المباشر للجسيمات الفلورية المسمى (الشكل 1). لدينا بروتوكول يتناول الطلب المشتركة العديد من الباحثين في هذا الحقل لوصف سريع للمركبات الكهربائية واحدة، مثلاً، حسب أصلهم الأبوية. في هذا البروتوكول، يصف لنا إكمال سير العمل لعزل السريع للمركبات الكهربائية من دماء كل البشر وتوصيف سريع لعلامات محددة بالأسفار-على أساس تحليل تتبع جسيمات نانوية. ويمكن الكشف عن المركبات الكهربائية تلطيخ مع PKH67، رابط غشاء الخلية عامة، وكذلك مع علامات اكسوسومال محددة، مثلاً، CD63، CD9، وفيمنتين. أن البروتوكول أيضا مناسبة يدتا والبلازما سيتراتيد، فضلا عن غيرها من سوائل الجسم و supernatants ثقافة الخلية.
Protocol
وقد وافق مجلس جامعة دوسلدورف الأخلاقية المؤسسية التجارب التي عرضت في هذا العمل (مرجع رقم: 3381).
1-EV في معزل عن دم كل البشر
- عزل المركبات الكهربائية مع الحل هطول الأمطار اكسوسومي.
- جمع 2 مل دم كل البشرية في فصل المصل عن طريق الأنابيب (SST) فينيبونكتوري واحتضان الأنبوب لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى يتم الانتهاء من تخثر الدم.
- الطرد المركزي طائرة أسرع من الصوت في س 1,700 ز لمدة 10 دقيقة على RT لفصل الخلايا من مصل الدم ونقل 1 مل المصل لأنبوب رد فعل 1.5 مل. الطرد المركزي البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) في 3,000 س ز لمدة 15 دقيقة عند 4 درجة مئوية لإزالة الصفائح الدموية ونقل 100 ميكروليتر من البلازما الصفائح الدموية-الفقراء (PPP) إلى أنبوب 1.5 مل رد فعل جديد.
- إضافة 25 ميليلتر من اكسوسومي حل هطول الأمطار (PPP 4 أجزاء، جزء 1 اكسوسومي حل هطول الأمطار) ودوامه تماما. احتضان العينة لمدة 30 دقيقة على الجليد. إبقاء الأنبوب مستقيم ولا تدوير أو خلط الأنبوب خلال فترة الحضانة.
- الطرد المركزي العينة في س 1,500 ز لمدة 30 دقيقة عند 4 درجة مئوية بيليه EVs. بعد الطرد المركزي، تظهر EVs بيليه بيج أو أبيض في الجزء السفلي من السفينة. نضح المادة طافية والطرد المركزي العينة في س 1,500 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إزالة آثار كل من السوائل وإعادة تعليق بيليه في 100 ميليلتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي كثيرا ما بيبيتينج صعودا وهبوطاً. تخزين تعليق EV في-80 درجة مئوية عندما لا يتم تحليل فورا.
ملاحظة: عند عزل المركبات الكهربائية من البلازما، الفيبرينوجين وفيبرينوجين يمكن أن يعوق كفاءة الاسترداد واستثارة أثقل ويستغرق وقتاً أطول.
- عزل المركبات الكهربائية مع تنبيذ فائق.
- تأخذ الدوار قبل تبريد (TLA-55 ثابت-الزاوية) من الثلاجة ويبرد أولتراسينتريفوجي قبل الاستخدام.
- نقل 1.25 مل (من إعداد في الخطوة 1، 1) تعادل القوة الشرائية إلى أنبوب تنبيذ فائق مناسبة 1.5 مل مع كاب والطرد المركزي العينة في س 110,000 ز لمدة 90 دقيقة في 4 درجات مئوية. تأكد من أن متوازنة التحميل الدوار قبل البدء.
- صب المادة طافية ومكان الأنبوب رأسا على منشفة ورقية للحد الأدنى 2 إعادة تعليق بيليه في 500 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي العينة في س 110,000 ز لمدة 90 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- نضح المادة طافية وإعادة تعليق بيليه في 50 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: استخدم فقط الدوارات والملحقات المصممة أولتراسينتريفوجي الذي قيد الاستخدام. المجهضة هذه الأنابيب في الدوار باستخدام المياه بسبب قوة الأنابيب يمكن أن تختلف بين الكثير.
2-تلوين العينات
- وصمة عار عينات مع PKH67.
- يعد الحل المصبوغة بإضافة 1 ميكروليتر من الحل صبغ اثانوليك PKH67 إلى 50 ميكروليتر من مادة C (المدرجة في هذه المجموعة) في أنبوب رد فعل 1.5 مل والمزيج بدقة.
- نقل 10 ميكروليتر من الحل المصبوغة إلى 20 ميكروليتر تعليق EV (أعد في الخطوة 1، 1) للأنبوب رد فعل، ومزيج دقيق واحتضان لمدة 5 دقائق في RT في الظلام.
- تمييع 50 ميكروليتر من تعليق EV ملطخة بالماء 2.5 مل المقطر في أنبوب رد فعل 15 مل ومزيج دقيق، واستخدم هذا الوقف النهائي لقياس الجسيمات.
ملاحظة: أنها حاسمة بالنسبة لاستخدام المياه كمخفف لتعليق EV، منظفة أخرى (مثلاً، برنامج تلفزيوني) يمكن أن تضر القياس. عند استخدام تخزين EV-تعليق، إذابة العينات على الجليد ومزيج دقيق قبل التلوين.
- وصمة عار عينات مع الأجسام المضادة المحددة.
- تمييع 10-20 ميكروليتر من تعليق EV (أعد في الخطوة 1، 1) مع 50 ميكروليتر من الماء المقطر في أنبوب رد فعل 1.5 مل ومزيج دقيق.
- إضافة 2.5-5 ميكروليتر من جسم معين (الجدول 1) إلى الأنبوبة رد فعل ومزيج دقيق، واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
- نقل 50 ميكروليتر من تعليق EV الملون إلى 2.5-10 مل ماء المقطر (الجدول 1) في أنبوب رد فعل 15 مل ومزيج دقيق، واستخدم هذا الوقف النهائي لقياس الجسيمات.
ملاحظة: في بعض الحالات، تركيز الأجسام المضادة المستخدمة يجب تعديلها (الجدول 1).
3-تجهيز العينات
ملاحظة: المبادئ الأساسية لهذا الأسلوب على نطاق واسع ووصفت سابقا وأدناه ويركز البروتوكول على الخطوات المحددة اللازمة لتحليل المركبات الكهربائية المسمى fluorescence14.
- تنفيذ إجراء بدء التشغيل.
- دفع عامل التصفية الأسفار إلى المسار الضوئي المجهر والكاميرا. بدء تشغيل البرنامج واتبع الإرشادات التي تظهر على الشاشة لتنفيذ الآلية.
- تحديد عدد الخلايا الصحيح (Z158_C1149_Fluor) في علامة التبويب "التحقق من خلية" (تعريف الخلية) لقياس الأسفار. حدد مرجع للبصريات للتأكد من أن الليزر ومجهر في محور اهتمام مشترك (الليزر ومجهر الانتقال إلى هذا الموضع تلقائياً).
- مسح القناة خلية مع حقنه مليئة 10 مل ماء المقطر. التأكد من أن الخلية قياس مجاني لفقاعات الهواء وليس حقن فقاعات الهواء في النظام.
- إعداد تعليق معايرة التي تتضمن موحدة 200 نانومتر الحجم المسمى fluorescence البوليستيرين الجسيمات التي لها مجموعات كاربوكسيلات على سطحها. تمييع 10 ميكروليتر من الجزيئات مع الماء المقطر ميكروليتر 990. ثم تضعف 10 ميكروليتر من هذا الحل الجسيمات في أنبوب 15 مل مع 10 مل ماء المقطر للحصول على التركيز المطلوب.
- حقن 2.5 مل الحل الجسيمات المخففة في قناة الخلية، وانقر فوق "تحسين التركيز" لضبط الكاميرا.
- قياس العينة.
- مسح القناة الخلية عدة مرات مع حقنه مليئة 10 مل ماء المقطر قبل كل قياس العينة. حقن القناة خلية تعليق EV الملون (إعدادها في الخطوة 2).
- ضبط المعلمات الكاميرا الرئيسية التالية في علامة التبويب "التحقق من خلية" في البرنامج حسب الحاجة (الجدول 2). استخدام وضع إشارة أو موقف 0.41193 لضبط المعلمات.
- لحساسية، البحث عن نطاق حساسية الأمثل بالنقر فوق الزر "عدد من الجسيمات مقابل حساسية" لعرض منحنى الجسيمات قياس كل شاشة لمستويات مختلفة من الحساسية.
ملاحظة: - للمصراع، ضبط الفترة الزمنية التي الكاميرا يسمح للضوء بالمرور لفترة زمنية محددة.
- لاقتناء ما بعد المعلمات، اختر سطوع الحد أدنى من 20، الحد أدنى لحجم 20 نانومتر، والحد أقصى لحجم 500 نيوتن متر للقياس.
- لحساسية، البحث عن نطاق حساسية الأمثل بالنقر فوق الزر "عدد من الجسيمات مقابل حساسية" لعرض منحنى الجسيمات قياس كل شاشة لمستويات مختلفة من الحساسية.
- ملاحظة عدد الجسيمات المكتشفة تم عدها في مجال الرؤية من العرض. يجب أن يكون شريط نثر الأخضر لمجموعة أورانج (50-300 الجسيمات). إذا كان شريط نثر أحمر، سوف الصمامات مبعثر الجسيمات الفردية ويتم عدها كجسيم واحد واحد، مما يؤدي إلى نتائج خاطئة. وفي هذه حالة، كذلك تمييع عينة لتجنب التداخل بين الجزيئات أو أقل الحساسية.
- انقر على "الاختيار الانجراف الجسيمات في 0 الخامس" في علامة التبويب "التحقق من خلية" قبل البدء القياس. إذا كان الانحراف أعلى من 5 ميكرومترات/s، انتظر حتى يتوقف العينة تتدفق إلى مواصلة القياس.
ملاحظة: إذا كانت عالية جداً في بداية القياس الانجراف، القياسات المتكررة يمكن أن تختلف وسوفيستيكاتي النتائج. نظراً للمبادئ الأساسية للإدارة الوطنية للسياحة، انجراف ذات صلة قد يكون لها تأثير في حجم الجسيمات العزم، محسوبة بالبرنامج. - انقر فوق "تشغيل الفيديو اقتناء" في علامة التبويب "القياس" حدد عدد التجارب (3-5) والتأخير الزمني بينهما (0 دقيقة).
- تحديد عدد المناصب (الفردية سوبفولومي-) (11) وعدد الدورات (القياس) (10) في كل موضع القياس، حيث يجب أن يتم تحليل الجزيئات
- حدد مجلد وقم بإنشاء اسم ملف جديد، وانقر فوق "موافق" لبدء القياس.
4-تفسير النتائج
- عرض النتائج ومعلمات في علامة التبويب "تحليل" بعد القياس. تحقق من المعلمات التالية بعد التحليل قبل تنظيف القناة خلية: عدد متوسط من الجسيمات كل موقف، ومجموع عدد الجسيمات تتبع وتركيز الجسيمات، عرض توزيع الجسيمات (قيم x10 و x50 و x90)، قيمة المتوسط والانحراف المعياري. كرر قياس العينة إذا لزم الأمر.
ملاحظة: يتم أيضا حفظ النتائج كملف.pdf أو.txt. - انقر فوق علامة التبويب "تحليل" لعرض الرسم البياني حسابها بعد القياس، الذي يبين توزيع الجسيمات المكتشفة بحجم. انقر فوق "عرض" في علامة التبويب "تحليل"، واستخدام الرموز لضبط وتغيير إعدادات الرسم البياني لمتطلبات معينة.
5-التحقق من الصحة عن طريق EV الكشف بواسطة النشاف الغربية
- حل بيليه EV (أعد في الخطوة 1) في المخزن تحلل واستخراج ريبا، "الماصة؛" دقيق واحتضان على الجليد للحد الأدنى 30 أجهزة الطرد المركزي العينة في 8,000 س ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية لتوضيح ونقل المادة طافية إلى أنبوب جديد.
- قياس البروتين الكلي بمجموعة مقايسة بروتين لوري. تمييع ميكروليتر 1 تعليق EV معزولة مع 49 ميكروليتر من المخزن المؤقت للمعهد الملكي، واستخدام ميكروليتر 5 في تريبليكاتيس للتحليل. تمييع تعليق EV مع المخزن المؤقت تحميل x Laemmli 2 بتركيز نهائي 2 ميكروغرام/ميكروليتر والحرارة لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية.
- تحميل 20 ميكروغرام من البروتين لكل بئر. فصل ونقل البروتينات بالتفريد جل polyacrylamide وخزان النشاف طبقاً للبروتوكولات القياسية.
- كتلة الغشاء (0.2 ميكرو الفينيليدن ثنائي الفلوريد) مع مسحوق حليب البقر (5%) ح 1 في الرايت واحتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية المحددة (CD9 و CD63 وفيمنتين) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يتم استخدام الأجسام المضادة الأساسي في إضعاف 1:1,000. - يغسل الغشاء مع تبسة 3 x 5 دقيقة واحتضان الغشاء مع الفجل البيروكسيديز (HRP)-الجسم المضاد الثانوي مترافق (01:20، 000 في تبسة) لمدة 60 دقيقة في الرايت
- يغسل الغشاء مع تبسة 3 x 5 دقيقة والكشف عن البروتينات التي تشيميلومينيسسينسي بمحلول الركازة حساسية عالية على نظام تصوير.
ملاحظة: نظراً لأن مستضد CD63 على نطاق واسع والعارضة الغليكوزيلاتي، الوزن الجزيئي يمكن أن تختلف، ويمكن أن يظهر الفرق بين 40-65 كاتشين.
Representative Results
المركبات الكهربائية المعزولة من الدم كله وتميزت نانوحبيبات تتبع التحليل مع الكواشف الاستشعاع. تم تحديد حساسية الأمثل لقياس الجسيمات أونستاينيد إلى مجموعة في 70% خلال تجاربنا. وأظهرت الخرز الفلورسنت تستخدم لتعديل ومعايرة القياس إعداد أمثل في حساسية من 85% (الشكل 2A). بين حساسية من 70% و 90%، ازداد عدد الجسيمات تم الكشف عنها سريعاً، بينما زيادة الحساسية يمكن أن يؤدي إلى تدهور في توزيع حجم الجسيمات حيث عدد الجسيمات إعادة الانخفاض. إعدادات الكاميرا عرض صورة حادة (الشكل 2B) وتكرار القياسات أظهرت انخفاض الانحراف المعياري (الشكل 2). قدر، تم تعديل البروتوكول لتجهيز العينات من المركبات الكهربائية حيث أنه يمكن أن تجري كافة القياسات مع نفس الإعدادات (الجدول 2). عرض التوزيع يحددها القيم الثلاث على المحور س، x10 و x50 و x90. في x50، أو حجم الجسيمات الوسيط هو القطر الذي يكمن نصف السكان أقل من هذه القيمة. وبالمثل، x10 و x90 تشير إلى قطر التي 10% و 90% من الجزيئات المكتشفة تحت حجم المبلغ عنها. تلطيخ مع PKH67 خلية رابط عدة، بما في ذلك رابط خلية فلورسنت بصبغة فلورسنت أخضر مع ذيول طويلة الاليفاتيه ودمج المناطق الدهنية في غشاء الخلية، أظهرت وجود ترابط قوي بين الحساسية وعدد قياس الجسيمات (الشكل 3A). غالباً ما يستخدم لرصد انتشار PKH67 لكن أيضا قد أثبتت أنها مفيدة لرصد الإقبال اكسوسومي أو الحويصلية، وكذلك فيما يتعلق بالاتجار في فيفو الخلية. سبب العلامات غير محددة من PKH67، يمكن المسمى مجموعة متنوعة واسعة من المركبات الكهربائية والكشف عنها. وكان توزيع الجسيمات في نطاق بين 266 نانومتر (x10) و 1946 نانومتر (x90) مع ذروة قصوى في 857 نانومتر (x50) مع انحراف معياري منخفض بين القياسات (28.1 nm). مصباح--1، المعروف أيضا يحلول المرتبطة غشاء بروتين سكري 1، و CD107a الموجودة أساسا عبر أغشية الليزوزومية. بعد تلطيخ مع 488 فلور أليكسا المسمى جسم معين ضد مصباح-1، توزيع الجسيمات تتراوح من 220 نانومتر نانومتر (x10) إلى 1145 (x90) مع ذروة قصوى في 541 شمال البحر الأبيض المتوسط (x50) وانحراف معياري 11.7 نيوتن متر (الشكل 3B). لتوصيف المركبات الكهربائية، استخدمنا 488 فلور أليكسا المسمى أضداد علامات اكسوسومال المشتركة وأكدت النتائج التي توصلنا إليها من النشاف الغربية. بعد تلطيخ مع أليكسا فلور 488 المسمى CD9-جسم، يتراوح توزيع الجسيمات 251 نانومتر نانومتر (x10) إلى 1139 (x90) مع ذروة قصوى في 548 نانومتر وذروة ثانوية ثانية في حوالي 25 نانومتر (الشكل 4 أ). تلطيخ مع أليكسا فلور 488 المسمى CD63 (الشكل 4 باء) وفيمنتين (الشكل 4) أسفرت عن نتائج مماثلة. الغربية النشاف التحليل يثبت لدينا نتيجة إيجابية للأجسام المضادة المستخدمة هنا. وأظهرت القياسات المتكررة النتائج استنساخه لجميع الأجسام المضادة المستخدمة في هذا التقرير. كعناصر تحكم، نحن الملون المياه خالية من حويصلة مع كل الأجسام المضادة (الشكل 5A)، التي يكتشف فيها الأجسام المضادة PKH67 و LAMP1 تقريبا EV لا تصل إلى حساسية ما يقرب من 100%. باستخدام مثال فيمنتين، زيادة حساسية عالية العدد من التحف الفنية الناشئة، حتى عندما تكون العينة خالية أساسا من جزيئات. إذا كان القياس هو عندما بدأ الانجراف بعد مرتفع جداً (> 5 ميكرومتر/s)، التكرار الفردية الانحراف واضح فيما بينها (الشكل 5 (ب)). كما مثلت مع ثلاثة أجسام مختلفة، من الأهمية بمكان أن الانجراف الحد الأدنى قدر الإمكان قبل البدء القياس. ووفقا لخبرتنا، استخدام fluorescein isothiocyanate (فيتك) كنتائج فلوروتشرومي في القياسات غير دقيقة واستنساخه لأنه فيتك عرضه لصور سريعة تبيض (الشكل 5). ولذلك، نوصي باستخدام حصرا أليكسا فلور 488 المسمى الأجسام المضادة لتوصيف EV. في هذا البروتوكول، تم عزل المركبات الكهربائية بحل هطول الأمطار اكسوسومي على أساس البوليمر الذي يحتوي على البولي إيثيلين غليكول. للتأكد من أن النتائج التي توصلنا إليها هي مزورة لا بطريقة العزل المطبقة، ونحن تتميز المركبات الكهربائية بعد عزلة مع تنبيذ فائق. كما مثلت مع PKH67 واثنين من الأجسام المضادة المختلفة (CD63 ومصباح-1)، نتائج عزلتنا التطبيقية مع هطول الأمطار اكسوسومي الحل (الشكل 6A) قابلة للمقارنة مع المركبات الكهربائية معزولة عن طريق تنبيذ فائق (الشكل 6B ). لسوء الحظ، بسبب سوء المحصول من المركبات الكهربائية بعد تنبيذ فائق، مجموعة أولية من المصل لعزل يجب أن يكون واضح أعلى بالمقارنة مع العزل مع الحل هطول الأمطار اكسوسومي.
رقم 1: الإعداد التخطيطي نانوحبيبات تتبع التحليل. شعاع الليزر ومحور مجهر والفيديو الموجه أورثوجونالي لبعضهما البعض، معبر في الخلية قناة المقطع العرضي. يتم وضع عامل تصفية الأسفار بين القناة خلية والمجهر. يتم عرض الضوء المتناثرة بالجسيمات في الإطار "عرض لايف" من البرنامج. بعد شراء، يتم عرض النتائج كنظام إحداثيات منحنى توزيع حجم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: المعايرة بالأسفار المسماة الخرز. (أ) عدد الجسيمات مقابل منحنى الحساسية يعرض الجسيمات في موقف واحد في لحظة واحدة في الوقت المناسب أثناء تفحص حساسية تلقائي. (ب) التصور للجسيمات على شاشة عرض حي. حجم الجسيمات (ج) توزيع بعد القياسات المتكررة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: يؤدي الممثل بعد تلطيخ مع PKH67 ومصباح-1- عدد الجسيمات مقابل حساسية منحنى (1)، التصور للجسيمات في طريقة العيش الشاشة (2)، والجسيمات توزيع حجم (3) بعد تلطيخ مع PKH67 (A) ومصباح-1 (ب). ويلاحظ توزيع حجم مماثل من الجسيمات، بينما التغييرات في حساسية وضع يؤدي إلى تغيير مماثل ولكن حتى الآن ليست متطابقة تماما للكشف عن الجسيمات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: يؤدي الممثل بعد تلطيخ مع أليكسا فلور 488 المسمى CD9 و CD63 وفيمنتين- عدد الجسيمات مقابل حساسية منحنى (1)، تصور جسيمات على شاشة عرض حي (2) وتوزيع حجم الجسيمات (3)، والممثل البقع الغربية من المعلقات EV مختلفة اثنين (4) ل CD9 (24-27 كاتشين، A)، CD63 (26 كاتشين، ب)، وفيمنتين (54 كاتشين، ج). إشارات حدوث تأخر للجسيمات على طول حساسية متزايدة (س) يرتبط مع انخفاض كثافة إشارة في الغربية لطخة تحليل، تؤكد مبلغ أدنى لعلامة سطح الجسيمات ذات الصلة (مثلاً، فيمنتين مقابل CD63). ملاحظة منحنيات متطابقة تقريبا من القياسات تمثيلاً لجميع علامات تم تحليلها مما يشير إلى إمكانية تكرار نتائج عالية (3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: نتائج ممثلة لعناصر التحكم المستخدمة ومصادر الخطأ الممكنة. (أ) خالية من حويصلة الماء الملون مع PKH67 (1)، مصباح-1 (2)، وفيمنتين (3) كعناصر تحكم. (ب) توزيع حجم الجسيمات الممثل بعد تلطيخ مع مصباح-1 (1)، CD63 (2)، و CD9 (3)، والقيام بقياسات عندما وقف الانجراف بعد مرتفع جداً. (ج) عدد الجسيمات مقابل منحنى الحساسية (1) وتوزيع حجم الجسيمات (2) بعد تلطيخ مع جسم فيتك المسمى CD63. ويلاحظ تأثير تبييض واضحة بعد كل قياس، أسفر عن عدد الجسيمات تدريجيا أقل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: مقارنة طرق العزل المختلفة للمركبات الكهربائية- توزيع حجم الجسيمات من المركبات الكهربائية المعزولة بحل هطول الأمطار اكسوسومي (A) وتنبيذ فائق (ب) بعد تلطيخ مع PKH67 (1)، مصباح-1 (2)، و CD63 (3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| مصباح-1 | CD9 | CD63 | فيمنتين | |
| جسم (ميليلتر) | 5 | 2.5-5 | 2.5-5 | 5 |
| تعليق EV (ميليلتر) | 10 | 20 | 10 | 10 |
| ح2س (ميليلتر) للتلوين | 50 | 50 | 50 | 50 |
| الحجم النهائي (mL) | 5-10 | 2.5-5 | 5 | 10 |
الجدول 1: قائمة بالأجسام المضادة المستخدمة وتمييع مجموعة من العينات.
| اكتساب المعلمات | |
| الحساسية (%) | 85 |
| المصراع | 70 |
| سطوع الحد الأدنى | 20 |
| ماكس. الحجم (nm) | 500 |
| حجم الحد الأدنى (nm) | 20 |
| قطبية | السلبية |
| الجهد الكهربي | إيقاف تشغيل |
| الانجراف الجسيمات في 0 الخامس (ميكرومتر/s) | < 5 |
| المناصب | 11 |
| دورات | 10 |
| الشراء متعددة | 3-5 |
| تأخير الوقت (دقيقة) | 0 |
الجدول 2: لبارامترات لتتبع تحليل نانوحبيبات.
Discussion
نظهر بروتوكول مفصل لعزل المركبات الكهربائية من الدم كله وتوصيف سريع لعلامات السطحية محددة مع جسيمات نانوية تتبع التحليل القائم على الأسفار. في التجارب التي أجريت، قمنا باستخدام المركبات الكهربائية المعزولة من عينات المصل حصرا، ولكن هذا الأسلوب هو أيضا مناسبة للبلازما سيتراتيد وحمض الإيثيلين (يدتا) ويمكن أيضا توسيع لسوائل الجسم الأخرى مثل البول وحليب الأم واللعاب، النخاعي، والسائل المنوي. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل هذا البروتوكول لتوصيف المركبات الكهربائية من supernatants ثقافة الخلية. في هذا البروتوكول، بتعليق EV تم إنشاؤها من 100 ميكروليتر من المصل باستخدام كاشف اكسوسومي هطول الأمطار، الذي يتضمن بوليمر ملكية التي بلطف رواسب اكسوسوميس والمركبات الكهربائية وفقا لحجم كوربوسكولار تتراوح بين 30 نانومتر إلى 200 نانومتر، حيث 10-20 ميكروليتر وعين من المركبات الكهربائية لتوصيف كل علامة السطحية. ولسوء الحظ، خطوة العزل أمر لا مفر منه، لأن كمية عالية من البروتين في عينات مصل الدم (مثل الزلال والجلوبيولين) يتداخل مع جسم تلطيخ الداخلي ويؤدي إلى ارتفاع مستوى الخلفية ونتائج متطورة. وعلاوة على ذلك، استناداً إلى توافر اكسوسوميس في العينات البيولوجية، يجب تعديل المبلغ تعليق EV العاملين، فضلا عن إضعاف قبل المعالجة للمواد المصدر الأخرى. مقارنة عينات متعددة، من الضروري اتباع نهج موحد للتخفيف من عينات، فضلا عن اقتناء متسقة المعلمات (حساسية، مصراع، إلخ). هناك نقطة أخرى مهمة أن القياسات لم تبدأ حتى الانجراف منخفض (في أيدينا، < 5 ميكرومترات/s). إذا كان الانحراف عالية جداً، القياسات المتكررة للعينة أسفرت عن الانحراف المعياري عالية فيما بينها، ولكن مع انجراف منخفضة، تتفق والغاية البيانات الناتجة وأكدت على مستوى عال من إمكانية تكرار نتائج. من المهم أن الأجسام المضادة المحددة لها فلوروتشرومي مناسبة. يجب أن يكون مترافق الأجسام المضادة مع أليكسا فلور 488، سبب فيتك لديها نسبة عالية من تبييض الصورة. ربما فلوفوريس أكثر استقرارا التأكيد سيؤدي إلى المقايسة زيادة الاستقرار في المستقبل. عادة، استخدام العديد من الباحثين PBS كمخفف لف. س. لهذا البروتوكول، من الأهمية بمكان لاستخدام الماء المقطر مخفف لأن الإيقاف EV. عندما تتم تسمية المركبات الكهربائية مع الأصباغ الاستشعاع، أوسمولاليتي عالية وتركيز أيون منظفة الأخرى، مثل برنامج تلفزيوني، يمكن أن تتداخل مع القياس، وتؤدي إلى تغيير النتائج.
بينما أساليب لتحليل المركبات الكهربائية قد تحسنت إلى حد كبير خلال العقد الماضي، لا يزال هناك أي أسلوب موحد لعزل وتوصيف ف. س. أما العيب الرئيسي للتدفق الخلوي، حيث المركبات الكهربائية غالباً ما ترتبط الخرز لتوفير مساحة أكبر، هو أن العديد من المركبات الكهربائية قفص الاتهام إلى سطح لتوفير إشارة قوية وقابلة للاكتشاف10. تيم ووزارة شؤون المرأة قد عيب أن إعداد العينات مضيعة للوقت ويمكن تمييز المركبات الكهربائية فقط على حجم ومورفولوجيا11. حتى الآن، طريقة بيستيستابليشيد واستخداما للنوعية (أي، البيوكيميائية) هو توصيف EV الغربية النشاف، حيث يمكن أن تحلل البروتينات مع الأجسام المضادة المحددة12،13. ومع ذلك، عيوب كل هذه الأساليب تكمن في عدم القدرة على تحليل المركبات الكهربائية واحدة لعلامات سطح معين. وعلاوة على ذلك، أوقات المعالجة طويلة وإجراءات الغسيل/العزلة الطويلة المستخدمة من قبل العديد من البروتوكولات الحالية تنطوي على خطوات ذات العمالة الكثيفة، مما يجعلهم غير مناسب للعينة عالية الإنتاجية وتوصيف واحد ف. س. لدينا بروتوكول يوفر سير عمل كاملة لعزله سريعة وتوصيف المركبات الكهربائية واحدة مع علامات السطحية محددة مثل CD63، CD9، فيمنتين، و CD107a، ويمكن توسيعها لنطاق عريض من علامات أخرى السطحية تحديد منشأ صدر ف. س. بسبب تقدم تقني دائم لجهاز الإدارة الوطنية للسياحة، ونحن أكدت النتائج التي توصلنا إليها بالتعاون مع الشركة المصنعة مع محلل أحدث. البروتوكول الذي يرد هنا بغض النظر عن التقدم في المستقبل للبحث عن الأحياء EV، لا سيما فيما يتعلق اكسوسوميس، سوف توفر طريقة سريعة وموثوقة لتوصيف المركبات الكهربائية واحدة علامات محددة. نظراً لتجميع المركبات الكهربائية أثناء العزل والإجراء المصبوغة حتى الآن أمرا لا مفر منه، ينبغي أن تركز البحوث المستقبلية على تطوير أساليب لمنع التراكم EV وتمكين تحديد حجم دقيق المسمى فلوري داس.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون الجسيمات Metrix GmbH لتغطية تكاليف نشر هذا العمل جزئيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Serum-separation tube | BD | 366882 | BD Vacutainer |
| Ampuwa water | Fresenius Kabi | 10060 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Sigma | 56064C | |
| Falcon tube, 15 mL | Greiner Bio One | 188271 | |
| Falcon tube, 50 mL | Greiner Bio One | 227270 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Speciality tubes for ultra centrifugation |
| Tube with Snap-On Cap 1.5 mL | Beckman Coulter | 357448 | |
| Polybeads Microspheres 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 7304 | Alignment Solution |
| Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres beads 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 09834-10 | Alignment Solution |
| Syringe, 2 mL | Braun | 4606027V | |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606728V | |
| Exoquick | SBI | EXOQ20A-1 | EV precipitation solution |
| Laemmli Sample Buffer (2x) | BioRad | 1610737 | |
| DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | Lowry prtein assay |
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH67GL-1KT | For general membrane labelling |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD107a Antibody | BioLegend | 328609 | Lysosomal-associated membrane protein-1 (LAMP-1) |
| Human CD9-Alexa Fluor 488 | R&D Systems | FAB1880G | |
| Anti-CD9 Antibody | SBI | EXOAB-CD9A-1 | |
| CD63-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | MA5-18149 | |
| FITC anti-human CD63 Antibody | BioLegend | 353005 | |
| CD63. Antibody, polyclonal | SantaCruz | Sc-15363 | |
| Alexa Fluor 488 anti-vimentin Antibody | BioLegend | 677809 | |
| Anti-Vimentin Antibody | SBI | EXOAB-VMTN-1 | |
| Goat anti mouse IgG + IgM | Jackson Immuno | 315-035-048 | |
| Goat anti rabbit IgG | Dianova | 111-035-003 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | ThermoFisher | 34094 | |
| ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
| Chemiluminescence Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 |
References
- Ibrahim, A., Marban, E. Exosomes: Fundamental Biology and Roles in Cardiovascular Physiology. Annual Review of Physiology. 78, 67-83 (2016).
- Su, S. A., et al. Emerging role of exosome-mediated intercellular communication in vascular remodeling. Oncotarget. 8 (15), 25700-25712 (2017).
- Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. Journal of Translational Medicine. 9, 9 (2011).
- Li, M., et al. Analysis of the RNA content of the exosomes derived from blood serum and urine and its potential as biomarkers. Philosophical Transactions of The Royal Society B Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
- Lin, J., et al. Exosomes: novel biomarkers for clinical diagnosis. The Scientific World Journal. 2015, 657086 (2015).
- Properzi, F., Logozzi, M., Fais, S. Exosomes: the future of biomarkers in medicine. Biomarkers in Medicine. 7 (5), 769-778 (2013).
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3 Unit 3 22 (2006).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. 2nd Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
- Bianco, N. R., Kim, S. H., Morelli, A. E., Robbins, P. D. Modulation of the immune response using dendritic cell-derived exosomes. Methods in Molecular Biology. 380, 443-455 (2007).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7 (12), 5157-5166 (2008).
- Mehdiani, A., et al. An innovative method for exosome quantification and size measurement. Journal of Visualized Experiments. (95), 50974 (2015).
