Summary
I detta protokoll beskriver vi komplett arbetsflöde för snabb isolering av extracellulära blåsor från humant helblod och karakterisering av specifika markörer genom fluorescens-baserade nanopartikel-tracking-analys. De presenterade resultaten visar en hög reproducerbarhet och kan justeras till cell cellkulturer.
Abstract
Extracellulära blåsor (EVs), inklusive exosomes, är specialiserade membranös nanostorlek blåsor finns i kroppsvätskor som frigörs konstitutivt från många celltyper och spela en central roll i regleringen av cell-cell kommunikation och ett varierat utbud av biologiska processer. Många olika metoder för karakterisering av EVs har beskrivits. De flesta av dessa metoder har dock nackdelen att förberedelse och karakterisering av proverna är mycket tidskrävande, eller är det extremt svårt att analysera specifika markörer av intresse på grund av sin ringa storlek och på grund av diskreta populationer. Medan metoder för analys av EVs har förbättrats avsevärt under det senaste decenniet, finns det fortfarande ingen standardiserad metod för karakterisering av enda EVs. Här visar vi en halvautomatisk metod för karakterisering av enda EVs genom fluorescens-baserade nanopartikel-tracking-analys. Protokollet som presenteras korrigerar vanliga problem av många forskare inom detta område och ger den komplett arbetsflöden för snabb isolering av EVs och karakterisering med PKH67, en allmän cellmembranet länkare, samt med specifika yta markörer sådana som CD63, CD9, vimentin och lysosomala-associerade membranprotein 1 (lampa-1). De presenterade resultaten visar en hög reproducerbarhet, som bekräftas av andra metoder, såsom Western blotting. I de genomförda experiment, vi används uteslutande EVs isolerade från humant serumprover, men denna metod är också lämplig för plasma eller andra kroppsvätskor och kan justeras för karakterisering av EVs från cell cellkulturer. Oavsett framtida utveckling av forskning om EV biologi ger det protokoll som presenteras här en snabb och tillförlitlig metod för snabb karaktärisering av enda EVs specifika markörer.
Introduction
Extracellulära blåsor (EVs), inklusive exosomes, är specialiserade membranös nanostorlek blåsor (20-150 nm) som innehåller vissa kombinationer av lipider, vidhäftning och intercellulära signalmolekyler, samt andra funktionella cytosoliska komponenter som mikroRNA (miRNA) och mRNA och spela en central roll i regleringen av cell-cell kommunikation1,2. EVs är släppt i sin omgivning från många olika celltyper, exempelvis endotelceller, immuna celler och tumörceller, och kan upptäckas i kroppsvätskor såsom serum sperma, urin, bröstmjölk, saliv eller cerebrospinalvätska3, 4. öka antalet studier belysa EVs olika bidrag som potentiella biomarkörer för tidig diagnos av flera sjukdomar eller förutsägelse av sjukdomsprogression5,6. Exosomes beskrivs ofta av närvaron av molekyler som de är särskilt förknippade med, oavsett den celltyp som de härrör från7. Till exempel exosomes innehåller olika tetraspanins (CD9, CD63, CD81), major histocompatibility complex klass jag (MHC jag) molekyler, olika transmembrana proteiner, typiska cytosoliska proteiner (tubulin och aktin), molekyler involverade i multivesicular kropp ( MVB) biogenes (TSG101 och alix), värma chockar proteiner (HSP 70 och HSP 90), och proteiner som deltar i signal transduktion (proteinkinaser)8.
Många olika metoder har beskrivits för karakterisering av EVs9. Vanligaste och mest utbredda metoderna för EV analys är flödet flödescytometri10, scanning electron microscopy (SEM) och överföring elektronmikroskopi (TEM)11. Översättningsföretag och vanligaste metoden för biokemisk karakterisering av EV innehåll är Western blotting12,13. SEM och TEM tillåta för detektion av EVs över hela storlek spektrumet, är mycket begränsad identifiering av specifika yta proteiner särskilt missgynnar dessa metoder. Däremot flödescytometri är ett kraftfullt verktyg för att identifiera specifika EV yta markörer, men tröskeln till denna metod begränsar analysen till EVs med en storlek som är större än 500 nm. Analys av isolerade EVs med påvisande av specifik yta markörer är därför för närvarande inte tillgängliga via någon av dessa tre väletablerade metoder. Vi beskrev tidigare en annan mycket känslig metod för visualisering och analys av EVs, nanopartikel-tracking analys (NTA)14. Kort, denna metod kombinerar två olika fysikaliska principer. Först, scatter partiklar ljus när de bestrålas med en laserstråle, och den andra principen, känd som Brownsk rörelse, innebär att spridningen av olika partiklar i en flytande suspension är omvänt proportionell mot deras storlek. Halvautomatisk stationära nanopartiklar analys instrumentet för flytande prov består av partikeln spårning analyzer med en mjukvaran-baserat analys, där digitala bilder av spritt ljus från enstaka partiklar registreras. Partiklarna och rörelsen av partiklarna upptäcks av en laser scattering Mikroskop med en videokamera. Laserstrålen är orienterad vertikalt, medan den optiska axeln är horisontella och fokuserad in i cellen kanal fylld med provet. Data som tillhandahålls av tomter utspridda ljusa fläckar och deras rörelsehastighet möjliggöra bestämning av total fördelning av antal och storlek. Efter bestrålning av lasern, partiklarna scatter ljuset, som är inspelad av en digital videokamera via Mikroskop14. Befordran till vår tidigare metod är införandet av en 500 nm lång våg-pass (LWP) cut-off-filter mellan laser (våglängd av 488 nm) och cell-kanalen, som möjliggör direkt analys av fluorescens-märkta partiklar (figur 1). Våra protokoll adresser gemensamma begäran av många forskare inom fältet för en snabb karakterisering av enda EVs, t.ex., enligt deras föräldrars ursprung. I detta protokoll beskriver vi den komplett arbetsflöden för snabb isolering av EVs från humant helblod och snabb karakterisering av specifika markörer genom fluorescens-baserade nanopartiklar-tracking-analys. EVs kan upptäckas genom färgning med PKH67, en allmän cellmembranet länkare, samt med specifika exosomal markörer, t.ex., CD63, CD9 och vimentin. Våra protokoll är också lämplig för EDTA och citrerade plasma, samt andra kroppsvätskor och cell cellkulturer.
Protocol
Institutionella etiska styrelse universitet av Düsseldorf har godkänt de experiment som presenteras i detta arbete (referensnummer: 3381).
1. EV isolering från humant helblod
- Isolera EVs med exosome nederbörd lösning.
- Samla 2 mL humant helblod i serum-separerande rör (SST) via venpunktion och Inkubera röret under 15 minuter vid rumstemperatur (RT) tills koagulation är klar.
- Centrifugera SST vid 1.700 x g i 10 min vid RT att separera celler från serum och överför 1 mL serum till ett 1,5 mL reaktionsröret. Centrifugera trombocyt-rich plasma (PRP) vid 3 000 x g i 15 minuter vid 4 ° C att ta bort trombocyter och överföra 100 μL av trombocyt-fattiga plasma (PPP) till en ny 1,5 mL reaktionsröret.
- Tillsätt 25 µL av exosome nederbörd lösning (PPP-4 delar, 1 del exosome nederbörd lösning) och vortex grundligt. Inkubera provet för 30 min på is. Håll röret upprätt och inte rotera eller blandar röret under inkubationstiden.
- Centrifugera provet vid 1 500 x g under 30 minuter vid 4 ° C till pellet EVT. Efter centrifugering visas EVT som en beige eller vit pellet längst ned i fartyget. Aspirera supernatanten och centrifugera provet vid 1 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Ta bort alla spår av vätska och resuspendera pelleten i 100 µL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) av ofta pipettering upp och ner. Förvara EV suspensionen vid-80 ° C när analysen inte utförs omedelbart.
Obs: När isolera EVs från plasma, fibrinogen och fibrin kan hindra effektiv återhämtning och resuspension är tyngre och tar mer tid.
- Isolera EVs med ultracentrifugering.
- Ta nedkylda rotorn (TLA-55 fast-vinklad) från kylskåp och svalna i ultracentrifugen före användning.
- Överföra 1,25 mL PPP (bereddes i steg 1.1) till en lämplig 1,5 mL ultracentrifugering tub med mössa och centrifugera provet vid 110 000 x g under 90 minuter vid 4 ° C. Kontrollera att rotorns lasten balanseras innan du börjar.
- Dekantera supernatanten och plats tube uppochner på en pappershandduk för 2 min. resuspendera pelleten i 500 μL av PBS och centrifugera provet vid 110 000 x g under 90 minuter vid 4 ° C.
- Aspirera supernatanten och resuspendera pelleten i 50 μL av PBS.
Obs: Använd endast rotorer och tillbehör avsedda för den ultracentrifugen som används. Testar du rören i rotorn genom att använda vatten eftersom styrkan i rören kan variera mellan massor.
2. färgning av proverna
- Fläcken prover med PKH67.
- Förbereda färglösningen genom att lägga till 1 μL PKH67 enprocentig dye lösning 50 μL av spädmedel C (medföljer i satsen) i en 1,5 mL reaktionsröret och blanda noggrant.
- Överföra 10 μL av färglösningen till 20 μL av EV upphängning (bereddes i steg 1.1) till reaktionsröret, blanda väl och inkubera i 5 min på RT i mörkret.
- Späd 50 μL av färgade EV fjädringen med 2,5 mL destillerat vatten i en 15 mL reaktionsröret, blanda väl och Använd denna slutliga suspension för partikel mätning.
Obs: Det är viktigt att använda vatten som spädningsmedel för EV fjädringen, eftersom andra spädningsvätskor (t.ex. PBS) kan störa mätningen. När med lagrade EV-fjädring, Tina proverna på is och blanda väl innan färgning.
- Fläcken prover med specifika antikroppar.
- Späd 10-20 μL av EV upphängning (bereddes i steg 1.1) med 50 μl destillerat vatten i en 1,5 mL reaktionsröret och blanda noggrant.
- Tillsätt 2,5-5 μl av den specifika antikroppen (tabell 1) till reaktionsröret, blanda väl och inkubera i 30 min på RT i mörkret.
- Överföra 50 μl av den färgade EV suspensionen till 2.5-10 mL destillerat vatten (tabell 1) i en 15 mL reaktionsröret, blanda väl och Använd denna slutliga suspension för partikel mätning.
Obs: Under vissa omständigheter måste koncentrationen av begagnade antikroppen vara justerat (tabell 1).
3. bearbetningen av proverna
Obs: Grunderna i denna metod omfattande beskrevs tidigare och nedanför de protokoll fokuserar på de specifika steg som behövs för analys av fluorescens-märkt EVs14.
- Utföra startproceduren.
- Tryck fluorescens filtret i den optiska vägen av Mikroskop och kameran. Starta programmet och följ instruktionerna på skärmen för automatiserad genomförandet.
- Välj rätt cell numret (Z158_C1149_Fluor) i ”Cell Check”-fliken (cell definition) för fluorescens mätningar. Välj referens position för optiken att göra säker på att laser och Mikroskop är i ett gemensamt fokus (laser och Mikroskop flyttar till denna position automatiskt).
- Spola kanalen cell med en spruta fylld med 10 mL destillerat vatten. Se till att cellen mätning är fri från luftbubblor och injicera inte luftbubblor i systemet.
- Förbereda en kalibrering suspension som innehåller enhetliga 200 nm storlek fluorescens-märkt polystyren partiklar som har bildas grupper på deras yta. Späd 10 μL av partiklarna med 990 μL destillerat vatten. Späd sedan 10 μL av denna partikel lösning i en 15 mL tub med 10 mL destillerat vatten för att få önskad koncentration.
- Injicera 2,5 mL av den utspädda partikel lösningen i kanalen cell och klicka på ”optimera fokus” att justera kameran.
- Mäta provet.
- Spola kanalen cellen flera gånger med en spruta fylld med 10 mL destillerat vatten före varje prov mätning. Injicera färgade EV suspensionen (förberedda i steg 2) i den cell kanalen.
- Justera följande huvudkameran parametrar på fliken ”Cell Check” i programvaran som behövs (tabell 2). Använd referenspositionen eller placera 0.41193 för att justera parametrar.
- För känslighet, hitta den optimala känslighet sortiment genom att klicka på knappen ”antal partiklar vs. känslighet” att visa en kurva av uppmätta partiklar per skärm för olika känslighetsnivåer.
Obs: - Justera tidsperioden som kameran tillåter ljuset att passera för en bestämd intervall för slutare.
- För efter förvärvet parametrar, välja en minsta ljusstyrka på 20, en minsta storlek på 20 nm, och en maximal storlek på 500 nm för mätning.
- För känslighet, hitta den optimala känslighet sortiment genom att klicka på knappen ”antal partiklar vs. känslighet” att visa en kurva av uppmätta partiklar per skärm för olika känslighetsnivåer.
- Obs antalet upptäckta partiklar räknas i synfältet från displayen. Scattering baren måste vara i grönt till orange utbud (50-300 partiklar). Om fältet spridning är röd, scatter kommer säkring enskilda partiklar och de räknas som en enda partikel, vilket leder till felaktiga resultat. I sådant fall ytterligare späd provet för att undvika överlappning av partiklar eller lägre känslighet.
- Klicka på ”Kontrollera partikel drift vid 0 V” i fliken ”Cell Kontrollera” innan du startar mätningen. Om drivan är högre än 5 μm/s, vänta tills provet slutar flöda för att fortsätta mätningen.
Obs: Om drivan är för hög i början av mätningen, kan de upprepa mätningarna skiljer sig och ökar resultaten. På grund av de underliggande principerna för NTA, kan en relevant drift påverka i beslutsamma partikelstorlek, som beräknas av programvaran. - Klicka på ”Kör Video förvärv” i fliken ”mätning” Välj antalet experiment (3-5) och tidsfördröjningen mellan dem (0 min).
- Definiera antalet (individuella subvolume-) positioner (11) och antalet (mätning) cykler (10) vid varje mätning position, där partiklar bör analyseras
- Välj en mapp, skapa ett nytt filnamn och klicka på ”OK” för att starta mätningen.
4. tolkning av resultaten
- Visa resultat och parametrar på fliken ”analys” efter mätningen. Kontrollera följande parametrar efter analysen innan du rengör kanalen cell: Genomsnittligt antal partiklar per position, totala antalet spårade partiklar och partikel koncentration, distribution bredden av partiklar (x10, x50 och x90 värden), värdet av medelvärdet och standardavvikelsen. Upprepa mätningen av provet om det behövs.
Obs: Resultaten sparas också som en PDF- eller txt-fil. - Klicka på ”analys” fliken för att Visa grafen beräknas efter den mätning, som visar fördelningen av de upptäckta partiklarna av storlek. Klicka på ”Display” i fliken ”analys” och Använd ikonerna för att justera och ändra diagrammet inställningarna för särskilda krav.
5. validering via EV upptäckt av Western Blotting
- Lös upp EV pelleten (bereddes i steg 1) i RIPA lysis och utvinning buffert, pipett noggrant och inkubera på is för 30 min. Centrifugera provet vid 8000 x g under 10 minuter vid 4 ° C för att klargöra den lysate och överför supernatanten till en ny tub.
- Mät det totala proteinet genom en Lowry protein analyssats. Späd 1 μL av isolerade EV upphängning med 49 μL av RIPA bufferten och använda 5 μL i exemplar för analys. Späd EV fjädringen med 2 x Laemmli lastning buffert till en slutkoncentration av 2 µg/μL och värme i 10 min vid 95 ° C.
- Ladda 20 μg protein per brunn. Separata och överföra proteinerna av polyakrylamid gelelektrofores och tank blotting enligt standardprotokoll.
- Blockera membranet (0,2 μm polyvinylidene difluorid) med nötkreatur mjölkpulver (5%) för 1 h på RT och inkubera membranet med specifika primära antikroppar (CD9, CD63 och vimentin) över natten vid 4 ° C.
Obs: De primära antikropparna används vid en 1:1,000 spädning. - Tvätta membranet med TBST 3 x 5 min och inkubera membranet med pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerad sekundär antikropp (1:20, 000 i TBST) för 60 min på RT.
- Tvätta membranet med TBST 3 x 5 min och upptäcka proteinerna genom chemiluminescence med en hög känslighet substratlösningen på ett bildsystem.
Obs: Eftersom CD63 antigen är omfattande och steglöst glykosylerat, molekylvikt kan variera, och band kan visas mellan 40-65 kDa.
Representative Results
EVs var isolerade från helblod och kännetecknas av nanopartiklar spårning analys med fluorescerande reagenser. Optimal känslighet för mätning av ofärgade partiklar identifierades till utbud på 70% under våra experiment. De fluorescerande pärlor används för justering och kalibrering av mätning visade en optimal inställning på en känslighet på 85% (figur 2A). Mellan en känslighet på 70% och 90% ökade antalet upptäckta partiklar snabbt, medan ytterligare öka känsligheten kan leda till en försämring av fördelningen av partiklarnas storlek där antalet partiklar är åter släppa. Inställningarna för kameran visas en skarp bild (figur 2B) och upprepade mätningar visade låg standardavvikelse (figur 2 c). I den mån, justerades protokollet för bearbetning av proven av EVs så att alla mätningar kan utföras med samma inställningar (tabell 2). Distribution bredden definieras av tre värden på x-axeln, x10, x50 och x90. X50, eller median partikelstorlek är diametern på som hälften av befolkningen ligger under detta värde. Likaså anger x10 och x90 diametern som är 10% och 90% av de upptäckta partiklarna under rapporterade storlek. Färgning med PKH67 cell linker kit, inklusive en fluorescerande cell länkare som införlivar en grön fluorescerande färg med långa alifatiska svansar i lipid regioner i cellmembranet, visade en stark korrelation mellan känslighet och antalet partiklar mätt (figur 3A). PKH67 används ofta för spridning övervakning men har också visat sig användbar för att övervaka exosome eller Liposom upptag samt när det gäller in-vivo cell människohandel. På grund av icke-specifik märkning av PKH67, kan ett brett utbud av EVs vara märkt och påvisas. Fördelningen av partiklarna var mellan 266 nm (x10) och 1946 nm (x90) med ett toppvärde på 857 nm (x50) och med en låg standardavvikelse mellan mätningarna (28,1 nm). LAMPA-1, även känd som Lysosomen-associerade membran glykoprotein 1 och CD107a bosatta främst över lysosomala membraner. Efter färgning med en Alexa Fluor 488 märkt gruppspecifika antikroppar mot lampa-1, fördelningen av partiklarna varierar från 220 nm (x10) till 1145 nm (x90) med ett toppvärde på 541 nm (x50) och en standardavvikelse på 11,7 nm (figur 3B). För karakterisering av EVs, vi använde Alexa Fluor 488 märkt antikroppar mot vanliga exosomal markörer och bekräftade våra fynd av Western blotting. Efter färgning med Alexa Fluor 488-märkt CD9-antikropp, fördelningen av partiklarna varierar från 251 nm (x10) till 1139 nm (x90) med ett toppvärde på 548 nm och en andra mindre topp ca 25 nm (figur 4A). Färgning med Alexa Fluor 488 märkt CD63 (figur 4B) och vimentin (figur 4 c) gav liknande resultat. Western blotting analys underbyggt vår positivt resultat för antikroppar används här. Upprepade mätningar visade reproducerbara resultat för alla antikroppar används i denna rapport. Som kontroller färgade vi vesikler-gratis vatten med respektive antikroppar (figur 5A), där PKH67 och LAMP1 antikroppar upptäckts praktiskt taget ingen EV upp till en känslighet nära 100%. I exemplet med vimentin, ökat hög känslighet antalet framväxande artefakter, även när provet är väsentligen fri från partiklar. Om mätningen startas när drivan ännu för hög (> 5 µm/s), den enskilda repetitioner avvika påtagligt sinsemellan (figur 5B). Som representerade med tre olika antikroppar, är det avgörande att drivan är så minimal som möjligt innan du startar mätningen. Enligt vår erfarenhet, med fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) som fluorokrom resulterar i mätningar som inte är exakt och reproducerbar eftersom FITC är utsatt för snabb foto blekning (figur 5 c). Därför rekommenderar vi använder uteslutande Alexa Fluor 488 märkt antikroppar för EV karakterisering. I detta protokoll isolerades EVs av en polymer-baserade exosome nederbörd lösning innehållande polyetylenglykol. För att säkerställa att våra resultat inte är förfalskade av metoden tillämpad isolering, kännetecknas vi EVs efter isolering med ultracentrifugering. Som representeras med PKH67 och två olika antikroppar (CD63 och lampa-1), är resultaten av vår tillämpad isolering med exosome nederbörd lösning (figur 6A) jämförbara med EVs isolerade via ultracentrifugering (figur 6B ). Tyvärr, på grund av den dåliga avkastningen av EVs efter ultracentrifugering, den ursprungliga uppsättningen serum för isolering måste vara påtagligt högre jämfört med isolering med exosome nederbörd lösning.
Figur 1: Schematisk inställning av nanopartikelportföljen spårning analys. Mikroskop/video axis och laser strålen är orienterade vinkelrätt mot varandra, passerar på cellen kanal tvärsnitt. Ett fluorescens filter placeras mellan cell kanalen och mikroskopet. Ljus som sprids av partiklar visas i fönstret ”live-view” av programvaran. Efter förvärvet visas resultatet som ett storlek fördelningen kurva koordinatsystem. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: kalibrering med fluorescens märkt pärlor. (A) antalet partiklar vs. känslighet kurvan visar partiklar i en position på en punkt i tid under en automatisk känslighet scan. (B) visualisering av partiklar på live view-skärmen. (C) partikel storlek fördelningen efter upprepade mätningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa resultat efter färgning med PKH67 och lampa-1. Antal partiklar vs. känslighet kurva (1), visualisering av partiklar på Livevy skärm (2) och partikel storlek distribution (3) efter färgning med PKH67 (A) och lampa-1 (B). En liknande storlek distribution av partiklar observeras, medan förändringar i känslighet inställning leder till en liknande men ännu inte helt identisk ändring av upptäckta partiklar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa resultat efter färgning med Alexa Fluor 488 märkt CD9, CD63 och vimentin. Antal partiklar vs. känslighet kurva (1), visualisering av partiklar på live view-skärmen (2), partikelstorleksfördelning (3) och representativa Western blotting av två olika EV suspensioner (4) för CD9 (24-27 kDa, A), CD63 (26 kDa, ( B), och vimentin (54 kDa, C). Sen förekomsten av partikel signaler längs den ökande känsligheten (x-axeln) korrelerar med lägre signalintensitet i västra blot analys, bekräftar den lägsta mängden respektive partikel ytan markören (t.ex. vimentin vs. CD63). Observera den nästan identiska kurvor av representativa mätningar för alla analyserade markörer som indikerar hög reproducerbarhet (3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativa resultat för använda kontroller och möjliga felkällor. (A) vesikel-gratis vatten färgas med PKH67 (1), lampa-1 (2) och vimentin (3) som kontroller. (B) representativa partikel storlek distributioner efter färgning med lampa-1 (1), CD63 (2), och CD9 (3), och mätningar utförs när suspension drift ännu är för hög. (C) antal partiklar vs. känslighet kurva (1) och partikelstorleksfördelning (2) efter färgning med FITC-märkt CD63 antikropp. En tydlig blekande effekt observeras efter varje mätning, vilket resulterar i gradvis lägre partikeln numrerar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: jämförelse av olika isoleringsmetoder för EVs. Partikelstorleksfördelning av EVs isolerat med exosome nederbörd lösning (A) och ultracentrifugering (B) efter färgning med PKH67 (1), lampa-1 (2) och CD63 (3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| LAMPA-1 | CD9 | CD63 | Vimentin | |
| Antikropp (µL) | 5 | 2.5-5 | 2.5-5 | 5 |
| EV suspension (µL) | 10 | 20 | 10 | 10 |
| H2O (µL) för färgning | 50 | 50 | 50 | 50 |
| Slutlig volym (mL) | 5-10 | 2.5-5 | 5 | 10 |
Tabell 1: Lista över används antikroppar och utspädning rad prover.
| Förvärv parametrar | |
| Känslighet (%) | 85 |
| Slutare | 70 |
| Min. ljusstyrka | 20 |
| Max. Storlek (nm) | 500 |
| Min. storlek (nm) | 20 |
| Polaritet | Negativa |
| Spänning | Utanför |
| Partikel drift vid 0 V (µm/s) | < 5 |
| Positioner | 11 |
| Cykler | 10 |
| Flera anskaffningar | 3-5 |
| Tidsfördröjning (min) | 0 |
Tabell 2: Förvärv parametrar för nanopartiklar spårning analys.
Discussion
Vi visar ett detaljerat protokoll för isolering av EVs från helblod och snabb karakterisering av specifik yta markörer med fluorescens-baserade nanopartiklar spårning analys. I de genomförda experiment, vi används uteslutande EVs isolerade från serumprov, men denna metod är också lämplig för etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) och citrerade plasma och kan också utökas till andra kroppsvätskor såsom urin, bröstmjölk, saliv, cerebrospinalvätska, och sperma. Detta protokoll kan dessutom justeras för karaktärisering av EVs från cell cellkulturer. I detta protokoll, EV suspensionen genererades från 100 μL serum med användande av exosome nederbörd reagens, som innehåller en patentskyddad polymer som försiktigt påskyndar exosomes och EVs enligt en korpuskulära storlek alltifrån 30 nm till 200 nm, whereby 10-20 μL volontärtjänstens utsågs för karakterisering av varje yta markör. Tyvärr, steget isolering är oundvikligt, eftersom den höga mängden protein i serumprover (exempelvis albumin och globulin) stör antikroppen färgning förfarande och resulterar i hög bakgrund och sofistikerade resultat. Dessutom måste utifrån biologiska tillgänglighet av exosomes i proven, mängden sysselsatta EV fjädringen liksom utspädningen före bearbetning justeras för andra råvaror. Att jämföra flera prover, en standardiserad metod för utspädning av de prov samt konsekvent förvärv parametrar (känslighet, slutare, etc.) är nödvändigt. En annan viktig punkt är att mätningarna inte startas förrän drivan är låg (i våra händer, < 5 μm/s). Om drivan var alltför hög, upprepade mätningar av provet gav hög standardavvikelse sinsemellan, men med en låg drift, resulterande data var mycket konsekvent och bekräftade en hög reproducerbarhet. Det är viktigt att de valda antikropparna har en lämplig fluorokrom. Antikroppar måste vara konjugerat med Alexa Fluor 488, eftersom FITC har en hög foto-blekning. Möjligen kommer mer stabil fluophores säkerligen leda till ökad assay stabilitet i framtiden. Normalt använder många forskare PBS som ett spädningsmedel för EVs. För detta protokoll är det viktigt att använda destillerat vatten som ett spädningsmedel för EV upphängningarna. När EVs är märkta med fluorescerande färger, höga osmolalitet och jonkoncentration av andra spädningsvätskor, såsom PBS, kan störa mätningen och leda till förändrad resultat.
Medan metoder för analys av EVs har förbättrats avsevärt under det senaste decenniet, finns det fortfarande ingen standardiserad metod för isolering och karakterisering av EVs. Den stora nackdelen med flödescytometri, där EVs är ofta bundna till pärlor att ge en större yta, är att många EVs docka till ger en stark och detekterbara signal10tryckytan. SEM och TEM har nackdelen att beredning av prover är tidskrävande och EVs kan endast skiljas genom sin storlek och morfologi11. Upp till datum, översättningsföretag och vanligaste metoden för kvalitativa (dvs biokemiska) är EV karakterisering Western blotting, där proteiner kan analyseras med specifika antikroppar12,13. Nackdelarna med alla dessa metoder ligger däremot i en oförmåga att analysera enstaka EVs för specifika yta markörer. Dessutom innefatta de långa handläggningstider och lång tvätt/isolering-förfaranden som används av många av de aktuella protokollen arbetsintensiva steg, vilket gör dem inte lämpar sig för hög provkapacitet och karakterisering av enda EVs. Våra protokoll ger en komplett arbetsflöde för snabb isolering och karakterisering av enda EVs med specifika yta markörer såsom CD63, CD9, vimentin och CD107a och kan utökas för ett brett spektrum av andra yta markörer att fastställa ursprunget på släppta EVs. På grund av en permanent teknisk befordran av NTA enheten bekräftade vi våra fynd i samarbete med tillverkaren med nyaste analyzer. Oavsett framtida utveckling av forskning om EV biologi, särskilt när det gäller exosomes, ger det protokoll som presenteras här en snabb och tillförlitlig metod för karakterisering av enda EVs specifika markörer. Eftersom aggregering av EVs under isolering och färgningsproceduren är hittills oundvikligt, bör framtida forskning fokusera på att utveckla metoder för att förhindra EV aggregering och möjliggöra en korrekt storleksbestämning av lysrör-märkt EVs.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka partikel Metrix GmbH för att delvis täcka kostnader publiceringen av detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Serum-separation tube | BD | 366882 | BD Vacutainer |
| Ampuwa water | Fresenius Kabi | 10060 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Sigma | 56064C | |
| Falcon tube, 15 mL | Greiner Bio One | 188271 | |
| Falcon tube, 50 mL | Greiner Bio One | 227270 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Speciality tubes for ultra centrifugation |
| Tube with Snap-On Cap 1.5 mL | Beckman Coulter | 357448 | |
| Polybeads Microspheres 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 7304 | Alignment Solution |
| Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres beads 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 09834-10 | Alignment Solution |
| Syringe, 2 mL | Braun | 4606027V | |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606728V | |
| Exoquick | SBI | EXOQ20A-1 | EV precipitation solution |
| Laemmli Sample Buffer (2x) | BioRad | 1610737 | |
| DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | Lowry prtein assay |
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH67GL-1KT | For general membrane labelling |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD107a Antibody | BioLegend | 328609 | Lysosomal-associated membrane protein-1 (LAMP-1) |
| Human CD9-Alexa Fluor 488 | R&D Systems | FAB1880G | |
| Anti-CD9 Antibody | SBI | EXOAB-CD9A-1 | |
| CD63-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | MA5-18149 | |
| FITC anti-human CD63 Antibody | BioLegend | 353005 | |
| CD63. Antibody, polyclonal | SantaCruz | Sc-15363 | |
| Alexa Fluor 488 anti-vimentin Antibody | BioLegend | 677809 | |
| Anti-Vimentin Antibody | SBI | EXOAB-VMTN-1 | |
| Goat anti mouse IgG + IgM | Jackson Immuno | 315-035-048 | |
| Goat anti rabbit IgG | Dianova | 111-035-003 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | ThermoFisher | 34094 | |
| ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
| Chemiluminescence Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 |
References
- Ibrahim, A., Marban, E. Exosomes: Fundamental Biology and Roles in Cardiovascular Physiology. Annual Review of Physiology. 78, 67-83 (2016).
- Su, S. A., et al. Emerging role of exosome-mediated intercellular communication in vascular remodeling. Oncotarget. 8 (15), 25700-25712 (2017).
- Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. Journal of Translational Medicine. 9, 9 (2011).
- Li, M., et al. Analysis of the RNA content of the exosomes derived from blood serum and urine and its potential as biomarkers. Philosophical Transactions of The Royal Society B Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
- Lin, J., et al. Exosomes: novel biomarkers for clinical diagnosis. The Scientific World Journal. 2015, 657086 (2015).
- Properzi, F., Logozzi, M., Fais, S. Exosomes: the future of biomarkers in medicine. Biomarkers in Medicine. 7 (5), 769-778 (2013).
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3 Unit 3 22 (2006).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. 2nd Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
- Bianco, N. R., Kim, S. H., Morelli, A. E., Robbins, P. D. Modulation of the immune response using dendritic cell-derived exosomes. Methods in Molecular Biology. 380, 443-455 (2007).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7 (12), 5157-5166 (2008).
- Mehdiani, A., et al. An innovative method for exosome quantification and size measurement. Journal of Visualized Experiments. (95), 50974 (2015).
