Summary
אנו מתארים את השימוש immunoblotting כמותיים כדי לאמת היסטולוגיה immunofluorescence בשילוב עם ניתוח תמונות כאמצעי לכימות חלבון עניין בפורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע דגימות רקמה (FFPE). התוצאות שלנו להפגין את התועלת של היסטולוגיה immunofluorescence עבור ברור הכמות היחסית של חלבונים סמן דגימות ביופסיה שגרתית.
Abstract
כימות של חלבונים עניין בפורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע דגימות רקמה (FFPE) היא חשובה קלינית ומחקר יישומי. שיטה אופטימלית של כימות מדויק, יש טווח דינמי רחב ליניארי ושומר את השלמות. המבנית של המדגם כדי לאפשר זיהוי של סוגי תאים בודדים. שיטות כגון אימונוהיסטוכימיה (IHC), ספקטרומטר מסה immunoblotting אחד לא לעמוד תנאים אלה בשל טבעם קטגורית או homogenize את הדגימה. כאמצעי חלופי, אנו מציעים את השימוש immunofluorescence (אם) וניתוח התמונה כדי לקבוע את השפע היחסי של חלבון עניין ברקמות FFPE. בזאת אנחנו מדגימים כי שיטה זו ממוטבת בקלות, התשואות טווח דינמי רחב, והוא באופן ליניארי לכימות לעומת תקן הזהב של immunoblotting כמותיים. יתר על כן, שיטה זו מאפשרת שמירה על שלמות המבנה של המדגם ומאפשר ההבחנה של סוגי תאים שונים, אשר עשוי להיות מכריע ביישומים אבחון. בסך הכל, זהו שיטה חזקה כימות היחסי של חלבונים בדגימות FFPE והוא ניתן להתאים בקלות להתאים קליני או מחקר צרכים.
Introduction
הצורך לכמת חלבונים בפורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע של דגימות ביופסיה של (FFPE) רקמה קיים בתחומים רפואיים רבים. לדוגמה, כימות של חלבונים סמן בדגימות ביופסיה שגרתית משמש כדי להבהיר פרוגנוזה ולהודיע טיפול עבור סרטן המטופלים1. עם זאת, שיטות הם בדרך כלל סובייקטיבי, חוסר אימות.
אימונוהיסטוכימיה (IHC) משמש באופן שגרתי במעבדות פתולוגיה, תלוי בדרך כלל של נוגדן ראשוני מכוונים את חלבון המטרה של נוגדנים משניים מצומדת עם תווית אנזימטי כגון חזרת peroxidase2. IHC קונבנציונלי הוא רגיש, יכול לעשות שימוש של דקה דגימות ושומר על שלמות מורפולוגי של דגימות רקמה ובכך מאפשרת הערכה של חלבון הביטוי בתוך ההקשר היסטולוגית הרלוונטיות שלה. עם זאת, מכיוון שהאות הדפסות כסף שנוצר על ידי IHC מופחתים, הוא סובל טווח דינמי צר יחסית, ומציע פוטנציאל מוגבל ריבוב2,3,4. לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון ספקטרומטר מסה הדמיה (MALDI-MSI) שומר על הגינות מורפולוגית. אולם, זו הטכנולוגיה המתפתחת מזוהה עם רזולוציה מורפולוגי צנוע, דורש כיול משמעותית, נורמליזציה, ופוגע שלה היתכנות לשימוש קליני5,6,7. טכניקות חלופיות לכמת חלבון דגימות רקמה כוללים immunoblotting8, ספקטרומטר מסה9,10,11, מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה)12, כל של שמתחיל עם הומוגני lysate של דגימת רקמה. דגימות רקמה הראשי הם הטרוגנית כי הם מכילים שפע של סוגי תאים. לכן, טכניקות שכרוכים homogenizing את הדוגמאות אינן מתירות כימות של חלבון באוכלוסייה לתא מסוים עניין כגון תאים סרטניים.
כאילו IHC, אם הוא ישים קטן FFPE דוגמאות וההיתרים השמירה של שלמות היסטולוגית13. עם זאת, תודה לטבע מוספים של אותות פלורסצנטיות, אם הוא נוטה היישום של מספר נוגדנים העיקרי ותוויות פלורסנט. לפיכך, חלבון עניין עשוי להיות יחסית לכמת בתוך תאים ספציפיים או תאים סלולריים (לדוגמה, גרעין לעומת הציטופלסמה) המוגדרים באמצעות נוגדנים אחרים. קרינה פלואורסצנטית אותות גם יש את היתרון של13,טווח דינמי גדול14. עליונות הפארמצבטית, ריבוב הפוטנציאל של אם מוחל על דגימות FFPE כבר הפגינו13,14,15.
במסמך זה אנו מתארים את השימוש immunoblotting כמותיים באמצעות שורות תאים הוקמה כמו תקן הזהב כדי לברר את מהות כמותיים אם בשילוב עם ניתוח תמונות המחשב בסיוע בקביעת שפע יחסי של חלבון עניין ב- סעיפים היסטולוגית של דגימות רקמה FFPE. לנו יש להחיל שיטה זו בהצלחה בגישה מולטיפלקס לכמת חלבונים סמן קליני ביופסיה דגימות16,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
האישור לשימוש דגימות רקמה אנושית העיקרי היה מתקבל למדעי הבריאות, המזוהה עם בתי חולים מחקר אתיקה לוח (HSREB) באוניברסיטת קווין.
1. בניית Microarray רקמות של התא-קו (TMA)
- הקציר ולשטוף תאים.
הערה: פרוטוקול זה נבדקו על שורות תאים מונצחים הוקמה שונים (למשל הלה, Jurkat, RCH-ACV).- עבור תאים חסיד, לקצור כ 1.3 x 107 תאים, ברגע שהם יגיעו כ 80% confluency. ניתוק תאים באמצעות ריאגנט המתאים עבור קו תא זה.
הערה: חומצה Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) עדיף בדרך כלל מעל טריפסין כדי להפחית את הסיכון של משפיל חלבונים פני שטח. אם משתמש טריפסין, לנטרל את טריפסין שימוש בסרום שור עוברית (FBS) מיד לאחר הקטיף התאים. - עבור תאים ההשעיה, לקצור כ 8 x 10 תאים7 יומן-שלב הצמיחה.
- לאסוף את התאים שנקטפו/מנותק על ידי צריך שתוציאו בשביל 5 דקות ב g x 225 צינור חרוטי 50 מ.
- Decant את תגובת שיקוע, מחדש להשעות את צניפה ב 10 מ ל 1 X באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 225 x g, decant את תגובת שיקוע.
הערה: 1 X PBS מורכב מ מ 137 NaCl 2.7 מ"מ אשלגן כלורי, 10 מ מ נה2HPO4, מ מ 1.8 ח'2PO4 במים מזוקקים; להתאים את ה-pH ל 7.4.
- עבור תאים חסיד, לקצור כ 1.3 x 107 תאים, ברגע שהם יגיעו כ 80% confluency. ניתוק תאים באמצעות ריאגנט המתאים עבור קו תא זה.
- לתקן את התאים בפורמלין, גלולה אותם.
- להשעות בגדר תא בתוך הצינור חרוט ב 10 מ"ל של 10% פורמלין במאגר נייטרלי (NBF).
הערה: ניתן להכין NBF על ידי דילול 1 מ"ל של 37% פורמלדהיד פתרון מניות 9 מ ל 1 X PBS.
התראה: נקוט זהירות בעת טיפול פורמלין פורמלדהיד. השתמש ברדס fume שלבים פורמלין ופורמלדהיד. - דגירה התאים על כיסא נדנדה ב rpm 24 שעות בטמפרטורת החדר למשך הלילה (כ ג 17).
- להכין פתרון 1% של agarose נקודת התכה נמוכה ב- PBS (0.01 גרם של agarose לכל 1 מ"ל PBS).
- להכין מספיק בשביל 500 µL של agarose פתרון עבור תא קו דגימה.
- להמיס את agarose בבלוק 80 מעלות צלזיוס המים באמבט או חום, עם ערבוב מזדמן למשך 2-5 דקות. ברגע התפרקה, לשמור את הפתרון ב- 37 מעלות צלזיוס המים בלוק אמבט או חום למניעת התקשות.
- צניפה תאים קבוע מן צעד 1.2.2 צריך שתוציאו בשביל 5 דקות ב ג x 225 הסר את תגובת שיקוע, resuspend תאי µL 500 ל- PBS 1 x.
- להעביר את התאים לתוך צינור 1.5 mL microcentrifuge צנפה מאת צריך שתוציאו בשביל 5 דקות ב x 290 ג לשאוב את כל תגובת שיקוע.
- להשעות בגדר תא בתוך הצינור חרוט ב 10 מ"ל של 10% פורמלין במאגר נייטרלי (NBF).
- הטיל בתאים agarose.
- להוסיף ~ 500 µL של 1% פתרון agarose (מתוך שלב 1.2.3) כל שפופרת המכילות את התאים. בעדינות, אך במהירות, פיפטה תערובת למעלה ולמטה באמצעות micropipette P-1000 לערבב.
הערה: לחתוך את הקצה של הקצה פיפטה כדי להגדיל את הצמצם ולמנוע יצירת בועות. שמור את הפתרון agarose עובד באמבט מים 37 ° C למניעת התקשות. - לאפשר את הפתרון agarose-תא להקשיח (5-10 דקות) בטמפרטורת החדר. להוסיף 1 מ"ל של 10% NBF כדי microcentrifuge כל צינור המכילה את דגימת ולשמור בטמפרטורת החדר עד פרפין הטבעה (עד 24 שעות).
- להוסיף ~ 500 µL של 1% פתרון agarose (מתוך שלב 1.2.3) כל שפופרת המכילות את התאים. בעדינות, אך במהירות, פיפטה תערובת למעלה ולמטה באמצעות micropipette P-1000 לערבב.
- הכינו את התקע agarose להטבעת פרפין.
- . תשאף את NBF מדגם.
- הסר את תקע התא באמצעות סכין גילוח כדי לחתוך את הצינור microcentrifuge, למקם את התקע לתוך רקמות פלסטיק קלטת. חנות קסטות ב 10% NBF בטמפרטורת החדר.
- לעבד את הדגימות לילה גם באופן ידני או באמצעות מעבד רקמות אוטומטיות, להטביע פרפין בשיטות היסטולוגיה סטנדרטי.
הערה: ראה פישר ואח. 19 עבור פרוטוקול דוגמה. - באמצעות מיוחדת "רקמת arrayer" כלי, קציר כפולים ליבות 0.6-מ מ מ הפרפין לחסום מכל שורה תא ולהוסיפם, בשורות, בלוק פרפין הנמען ריק כדי ליצור קו תא TMA.
הערה: יש להשתמש בשיטות הרגילות כמו אלה שתוארו פדור, דה Marzo20. - לשלב ליבות מדגימות העיקרי המייצג 2-3 סוגי רקמות נוספות (למשל, שקדים, המעי הגס, האשכים, וכו ') כפקדים חיובי או שלילי לתוך TMA. לבחור לרקמות המתאימות החלבון עניין.
- השתמש מיקרוטום כדי להכין שני היסטולוגית מקטעים, עבה, כ 4-6 מיקרומטר של הקו הסלולרי TMA. הר החלק בשקופית היסטולוגיה, לייבש אותו, deparaffinize (כפי שמתואר פדור, דה Marzo20).
2. דוגמת צביעת על-ידי Immunofluorescence
- למטב את הדילול של נוגדן ראשוני.
הערה: קיימים פרוטוקולים סטנדרטיים עבור אופטימיזציה של IHC או אם עבור מקטעים FFPE רקמות כגון Kajimura. et al. 21. סקירה קצרה של הגישה מחולקת לרמות כאן.- להכין 4-5 דילולים של נוגדן ראשוני כדי החלבון עניין מונחה על ידי הוראות היצרן.
- זיהוי סוג הרקמה של פקד ממקור בעלי חיים או אדם שמבטא החלבון עניין באוכלוסיות תא מורפולוגית ניתן לזיהוי. להכין מקטעים של הרקמה והר אותם בשקופית לפי הנוהלים אימונוהיסטוכימיה סטנדרטיים כגון פדור, דה Marzo20.
הערה: מספר קטעים הנדרש הוא המספר של נוגדן ראשוני דילולים פלוס תוספת אחת. - באמצעות מערכת אוטומטית או ידנית עבור פראפין, לבדוק את דילולים נוגדן ראשוני מהשלב 2.1.1 כל בשקופית מהשלב 2.1.2. להשמיט היישום של נוגדן ראשוני משקופית נוספות ולהשתמש בו בתור פקד שלילי.
- במהלך תהליך צביעת, מכתים כל השקופיות עם 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) וגם של counterstain הגרעין של נוגדנים משניים מתויגות fluorescently. אם נדרשת רגישות, להשתמש HRP (חזרת peroxidase)-מצומדת נוגדנים משניים, מערכת הגברה אותות מבוסס tyramide (ראה מחסנית. ואח 13).
הערה: כאשר ריבוב נוגדנים העיקרי, תווית שונה פלורסנט משמש עבור כל חלבון. - סריקת שקופיות immunostained באמצעות מכשיר המתאים מסוגל לייצר קובץ תמונה דיגיטלית באמצעות עירור וזיהוי אורכי הגל המתאים fluorophores ששימשו.
- להשתמש בתוכנה המתאימה כדי להציג את התמונות הדיגיטליות ובחרו מדעית דילול נוגדן ראשוני זה מייעל את עוצמת האות יחסית רקע זריחה.
הערה: אם רצונך בכך, מיטוב זה יכול להתרחש באמצעות מצומדת HRP משני נוגדן, 3, 3'-diaminobenzidine (DAB), מיקרוסקופיה brightfield.
- לבצע אם צביעת על הקו תא TMA.
- השתמש מערכת אוטומטית או ידנית עבור פראפין כדי להכתים שקופית של הקו הסלולרי TMA עם דילול ממוטבת נוגדן ראשוני (כפי שנקבע בשלב 2.1). להשמיט את היישום של נוגדן ראשוני של השקופית השניה ולהשתמש בו בתור פקד שלילי.
- במהלך תהליך צביעת, מכתים כל השקופיות עם 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) כמו counterstain גרעינית, ולא עם נוגדנים משניים, tyramide כמו שלב 2.1.4.
- סריקת שקופיות immunostained באמצעות מכשיר המתאים מסוגל לייצר קובץ תמונה דיגיטלית באמצעות עירור וזיהוי אורכי הגל המתאים fluorophores ששימשו.
- השתמש בחבילה תוכנת ניתוח התמונה כדי לזהות תא הסלולר עניין (קרי, הציטופלסמה נגד גרעין) ולכמת את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע (MFI) עבור כל קו תא.
הערה: חבילות תוכנה שונים יכול לשמש למטרה זו, רבות נידונות מחסנית. et al. 13.
3. כמותית Immunoblotting של שורות תאים
- להכין את lysates של תאים.
- קציר 2 מיליון תאים של כל קו תא, כמתואר בצעדים 1.1.1 ל 1.1.3.
- ספין תאים למטה במשך 5 דקות ב g x 650 צינור חרוטי 50 מ. Decant את תגובת שיקוע.
- רחץ תאים עם 10 מ"ל של PBS קר כקרח. Resuspend ב 1 מ"ל של PBS קר כקרח, העברת צינור microcentrifuge 1.5 mL. צנטריפוגה לפי שלב 3.1.2, decant, ולהשאיר תאים קרח.
- להוסיף כ- 200 µL קר radioimmunoprecipitation (ריפה) מאגר פירוק עם מעכבי פרוטאז (10 µL של מעכבי X 100 לכל מיליליטר ריפה פירוק מאגר) התאים, מערבולת דגירה על קרח למשך 15 דקות.
הערה: הסכום של פירוק מאגר הדרושים עבור פירוק יעיל משתנה לפי שורת התאים, יכול להיקבע מדעית. ריפה המאגר מורכב 150 מ מ NaCl, 5 מ מ EDTA, 50 מ מ. טריס, 1.0% NP-40, 0.5% נתרן deoxycholate, 0.1% מרחביות במים מזוקקים. - כדי להבטיח יחסית גם טעינה-immunoblots, לכמת החלבון הכולל של מדגם 20 µL, כל שימוש lysate שיטה המתאימה כגון וזמינותו ברדפורד. להוסיף כ- 40 µL 6 X Laemmli פירוק מאגר השארית (µL כ- 180) של כל תא lysate, להרתיח ב 100 מעלות צלזיוס באמבט חום בלוק או מים במשך 5 דקות.
הערה: 6 X Laemmli מאגר מורכב 300 מ"מ טריס-HCl (pH 6.8), 4% (w/v) מרחביות, 60% גליצרול, 0.6% (w/v) bromophenol כחול, dithiothreitol 50 מ מ (DTT) של מים מזוקקים. - אחסן את הדגימות ב-20 ° C עד שבועיים.
- ביצוע של immunoblot של כל תאי שורות כדי לקבוע אילו תאים בטור הוא החלבון הנפוץ ביותר של עניין.
הערה: בצע את ההליך המתואר בסעיף ורד פנחסוב, טי ויאנג, PC. 22, עם השינויים הבאים.- Aliquot תא lysate (מוכן ב שלב 3.1) המכילה 10-50 µg של חלבון (תלוי השפע של החלבון עניין) לתוך צינורות microcentrifuge. להוסיף 2.5 µL של 6 X Laemmli מאגר, מאגר פירוק ריפה מספיק כדי להפוך את אמצעי האחסון עד 15 µL.
- עומס של % 5 לערום וריכוז המתאים לפתרון (למשל, 10% חלבונים בין 15-100 kDa) ג'ל מרחביות-דף עם סולם חלבון, דגימות מן שלב 3.2.1. לטעון מאגר X Laemmli 1 לתוך בארות ריק. להפעיל את אספקת החשמל בכל ההגדרות המתאימות, בדרך כלל 125 V, במשך 80 דקות, או עד לצבוע bromophenol הכחול מגיע החלק התחתון של הלוח.
- לבצע העברה חצי יבש חלבון כפי שמתואר Wiedemann. et al. 23.
הערה: לקבלת תוצאות נציג, קרום ניטרוצלולוזה (אשר אינו צריך להיות ספוגה במתנול), קר מאגר העברה Bjerrum שייפר-נילסן (BSN) שימשו. מאגר BSN מורכב 48 מ מ טריס, גליצין 39 מ מ, 20% מתנול במים מזוקקים. - לאחר ההעברה, השתמש סכין גילוח לחתוך את הממברנה אופקית כדי להפריד בין החלק המכיל את החלבון ריבית חלבון בקרה פנימית המתאים, כגון GAPDH.
- המשך incubations חסימה ו נוגדן באמצעות המאגר חסימה המומלץ על ידי היצרן של נוגדנים העיקרי.
הערה: נוגדן ראשוני אופטימלית דילולים יכול להשתנות באופן דרמטי בהתאם חלבון שפע ורגישות. לקבלת תוצאות נציג להלן, הנוגדן לחלבון עניין נדרש לדילול 1:1,000 בזמן הפקד GAPDH נדרש לדילול 1:40,000. הדילול של נוגדנים משניים בשימוש היה 1:3, 000. - לאחר נוגדן incubations, כביסה של הקרום, מקם את רצועות ממברנה נדן פלסטיק שקוף כמו שקית סנדוויץ.
- להכין תערובת chemiluminescence (ECL) בבית ההוראות של היצרן. השתמש פיפטה P-1000 כדי לכסות את הקרום עם התערובת ECL לסגור נדן, דגירה את רצועות קרום עם התערובת בחושך בטמפרטורת החדר למשך 1-2 דקות.
- מקום נדן ממברנה פלטפורמה הדמיה דיגיטלית. השתמש chemiluminescence וזיהוי סמן ערכי צבע מוחלטים כדי ללכוד חשיפות שונות של הקרום.
הערה: פעמים חשיפה ישתנו בהתבסס על כמות חלבון טעון, שפע של חלבון המטרה, נוגדן זיקה וכו מתחילים עם חשיפה אוטומטית (בדרך כלל מספר שניות) ולאחר מבחן פעמים חשיפה מעל ומתחת במרווחים של כמה שניות. - מדעית, או באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, לקבוע אילו תאים בטור מבטא ביותר חלבון המטרה.
- למצוא את הטווח הדינמי ליניארי של כל נוגדן ראשוני באמצעות לדילול טורי.
- לבצע צעדים 3.2.1-3.2.8 באמצעות סדרה של דילולים טורי משורת תאים אשר מבטאת את הריכוז הגבוה ביותר של החלבון היעד (המזוהה בשלב 3.2.9).
- להשתמש בתמונה ניתוח תוכנה כגון ImageJ לביצוע densitometry על התמונות חשיפה.
- לדוגמה, באמצעות ImageJ, השתמש בכלי מלבני בחירות לבחירת הנתיב הראשון של הג'ל לכמת. . לך לנתח | ג'לים | בחר קודם ליין. להשתמש בעכבר כדי להעביר את המלבן שנוצר לנתיב הבא. . לך לנתח | ג'לים | בחר ליין הבא. שוב ושוב לעבור את המלבן לנתיב הבא ובחר את ליין למשך שאר המסלולים.
- . לך לנתח | ג'לים | להתוות מסלולים. השתמש בכלי קו ישר כדי לצייר קווים לרוחב הבסיסים של כל שיא כדי להסיר את רעשי הרקע. השתמש בכלי מטה לבחירת כל שיא, ולאסוף את הצפיפות של כל שיא, מעתה ואילך המכונה הלהקה עוצמה, מתוך חלון תוצאות .
- השתמש את densitometry פלט כדי ליצור scatterplot של הלהקה בעוצמה לעומת כמות החלבון הכולל הטעונה עבור כל נוגדן ראשוני. באמצעות שורה של מיטבית, בדיקה ויזואלית, לקבוע את המיקום (טווח בעוצמה) של הטווח הדינמי ליניארי של כל נוגדן.
- לבחור ריכוז חלבון שיוצר ערך על קצה גבוה של הטווח ליניארי להיות הריכוז לנוע קדימה עם כל שורות תאים.
הערה: מאחר הריכוז הזה מתחת לרמת רוויה בשורת תאים עם הכמות הגדולה ביותר של חלבון זה, צריך להיות אין סכנת מעל חשיפת הלהקות עבור שורות תאים אחרים.
- ביצוע של immunoblot באמצעות ריכוז חלבון שבחרת בשלב 3.3.4 עבור כל שורות תאים וחזור על שלבים 3.2.1-3.2.8.
- מבצע densitometry סריקות דיגיטליות כמו שלב 3.3.2. בחר את התמונות חשיפות המניבים אותות בטווחים ליניארי עבור כל נוגדן שזוהו בשלב 3.3.3.
- באמצעות האותות בעוצמה את הלהקה החשיפות אידיאלי מ 3.4.1, לחשב את היחס שבין עוצמת הלהקה חלבון היעד ומאפשרת לטעון בקרת העוצמה הלהקה עבור כל קו תא. ערכים אלה יחס מציינים את השפע היחסי של החלבון היעד עניין.
- לבצע מבחן מתאם פירסון (ניתן לעשות זאת באמצעות חבילת תוכנה סטטיסטית) לתאם הערכים שהתקבלו מניתוח תמונה של אם מכתימים (השלב 2.2) לאלו המתקבלים immunoblotting (שלב 3.4.2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה נעשה שימוש כדי לאשר את היכולת של IF כדי לקבוע את הכמות היחסית של החלבון אנטי-מוות Bcl-2 של שורות תאים הפך גושי רקמה FFPE. לכימות Bcl-2 באופן בררני בתאי סרטן ניתן להסבר מנגנוני oncogenic והוא יכול להיות שימושי באבחון פתולוגי, סיפור קליני ניהול החלטות24. ליתר דיוק, Bcl-2 תפקיד מרכזי בהתפתחות B-lymphocyte תקין, הביטוי שלה בדרך כלל נחקר בהקשר של לימפומה25,26,27. איור 1 מתאר את השלבים הכרוכים בפרוטוקול. ב אם אופטימיזציה צעד ראשוני, נבדקו דילולים שונים של נוגדן anti-Bcl-2 ראשי על רקמת שקדים האנושי באמצעות של הוספת גוון לסמלים פראפין אוטומטית כפי שמתואר בשלב 2.1. איור 2 מכיל תמונות של השקופיות מוכתם וסקר היסטולוגיה של רקמת שקדים האנושית כי כל אחד קיבל לדילול שונים של נוגדנים. ניתן לראות 1:50 הזה הוא דילול אופטימלית הניב אות חזק, קצת רקע זריחה. דילול זה שימש אז על הקו תא TMA כפי שמתואר בשלב 2.2. TMA היה מוכתם גם באמצעות דאפי לזיהוי גרעינים. ערכת הגברה אות מבוססי tyramide שימשה תווית Bcl-2 עם fluorophore Cy5. ניתוח תמונות שימש כדי לכמת את האות זריחה Cy5 cytoplasmic לייחס Bcl-2 בכל שורה בתא. להחליפן בתמונות של ההכתמה ניתן לראות באיור3. הקווים תא מונצחים שבחרת עבור ניסוי זה כללו מגוון של קווים תא הלימפה נגזר, כלומר 697, JeKo-1, Jurkat, RCH-ACV, Granta-519, REH וראג'י, בנוסף הלה, נגזר סרטן צוואר הרחם. התאים הלה ידועים לבטא Bcl-2 ב ברמה מאוד נמוכה28.
על סמך של immunoblot הראשונית של כל תא שמונה שורות, Granta-519 היה נחוש לקיים את השפע הרב ביותר של Bcl-2 (לא מוצג). דילולים טורי של Granta-519 lysate שימשו immunoblot הבאים כדי למצוא את טווח דינמי ליניארי של Bcl-2, GAPDH (טעינת פקד) אותות (איור 4A). Immunoblot הזה נחשף באמצעות סורק דיגיטלי של לפרקי זמן משתנים. Densitometry באמצעות תוכנת ניתוח התמונה שימש כדי לכמת את האות של כל הלהקה, ערכים אלו שורטטו נגד כמות החלבונים טעון (איור 4B). מתוך הנתונים 4B איור-העליון, טווח דינמי עבור Bcl-2 ב- assay הזה החובקת מ הלהקה האינטנסיביות של כמעט אפס 7500 (קו שרירותי יחידות, כחול). פעמיים חשיפה גבוהה יותר מתאים ריבועית בעלת הלא-משוואה לינארית, רומז חשיפת יתר והרוויה של עוצמת האות. הטווח עבור GAPDH נע בין 3000 ל 6500 (יחידות שרירותי, איור 4B-התחתון). הערכים מתחת 3000 (יחידות שרירותיות) ירד בתלילות אפילו בעת שימוש זמן חשיפה נמוכה יחסית. חשיפה ארוכה בבירור התוצאה רוויה. מ גרפים אלה, נקבע כי 12 µg יהיה כמות סבירה של חלבון כדי לטעון בעת ביצוע את immunoblot עם כל הקווים תא, מאז זה כמות חלבון הניב Bcl-2 ערכי העוצמה בתוך הטווח. ליניארית עבור התאים Granta-519, הפחתת הסיכון של חשיפת יתר עבור כל שורות תאים אחרים.
Immunoblot השני של כל שורות תאים ואז בוצעה כמו שלב 3.4, ניתן לראות באיור 5A. כתם זה היה נדרש מאז הלהקות חשופה הראשוני הכיל בעוצמה האות ' מחוץ לטווח ליניארי. תוכנת ניתוח התמונה נעשה שימוש כדי לקבוע את עוצמת האות של כל הלהקה ב האבן החשופה חדש. רק ערכי העוצמה שהיו בתוך טווחים דינאמיים נקבע לעיל שימשו. החיצים בצד ימין של איור 4B מדגימים ערכי העוצמה נציג ששימשו ולהראות היכן הם מתאימים בתוך הטווח. ליניארית. היחס של Bcl-2:GAPDH מכן מחושב עבור כל קו תא. יחס זה, יחד עם פלורסצנטיות האיתות אם ניתן לראות באיור 5B. מבחן מתאם פירסון הדגימו כי היחס בעוצמה של immunoblotting היו בחריפות, חיובית בקורלציה עם הקריאות בעוצמה של אם כמותית (r = 0.983, p < 0.001; ראה איור 5C).
באופן כמותי להערכת מידת Bcl-2 הוכיח להם קשה במיוחד, שכן היה מגוון רחב של ביטוי של חלבון זה על פני קווי בדוקות תא שמונה. שימוש של חשיפה ארוך מספיק כדי ללכוד את האות של הקווים תא נמוך Bcl-2-הבעת ' (> 1 s) הקשו להישאר בטווח דינמי עבור שורות תאים גבוהה Bcl-2-הבעת '. בניסיון לכמת את הלהקות להתעלף המיוצר על ידי שורות תאים כגון הלה ראג'י, חשיפה שונה מספר פעמים, החל מ- 0.1 s 5 s, נלכדו כדי לקבוע את זמן החשיפה הארוכה ביותר שניתן להשתמש בו תוך שמירה בטווח דינמי עבור תאים כמו Granta -519 (ראה איור 6). הטבע של טכניקה זו immunoblotting מגביל את הדיוק של הזיהוי אות אחת הגישות רעש, רומז שבצורה אופטימלית משמש לכמת חלבונים ב רמות הביטוי בינוני עד גבוה.
איור 1 : דיאגרמת זרימת עבודה פרוטוקול. Immunofluorescence (אם)-microarray רקמות קו התא (TMA) היה לפעול במקביל immunoblotting כמותית (ליברות) של הקווים באותו תא. אותות מכל שורה תא מושווים באמצעות מתאם פירסון לאימות היכולת הכמותית של פרוטוקול אם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : בדיקות ואופטימיזציה פרוטוקול immunofluorescence (אם)- קטעים של שקדים היו מודגרות עם דילולים שונים של נוגדנים אנטי-Bcl-2 (1:50 מטריים, אין נוגדן ראשוני). השקופיות היו מודגרות עם מצומדת HRP נוגדנים משניים, האות היה מוגבר באמצעות המספר המשלים של tyramide-Cy5, השקופיות היו מוכתמים דאפי. השקופיות נסרקו בגיל 20 X הגדלה באמצעות מסנן מגדיר המתאים הפסגות מקסימלי עירור/פליטה של 350/470 nm ו 649/666 nm דאפי, Cy5, בהתאמה. פעמים חשיפה בהתאמה היו 160 ms, 200 גב בתחום התצוגה ממורכזת על זקיקי הלימפה אותו, אשר צפוי להיות Bcl-2 במרכז נבטי (המרכזי) ואתאיזם באזור מנטל (היקפי). 1:50 דילול נתן אות חזק פלורסצנטיות ספציפיים מבלי להגדיל את האות לא ספציפית ולכן שימש דילול הולך קדימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : Immunofluorescence (אם) משתמש תא קו רקמות microarray (TMA) סעיפים. מקטעים של הקו הסלולרי TMA היו לקחו, מודגרות עם 1:50 דילול של אנטי-Bcl-2 או עם נוגדן ראשוני אין. השקופיות היו מודגרות עם נוגדנים משניים, האות היה מוגבר באמצעות המספר המשלים של tyramide-Cy5, השקופיות היו מוכתמים דאפי. השקופיות נסרקו בגיל 20 X הגדלה באמצעות מסנן מגדיר המתאים הפסגות מקסימלי עירור/פליטה של 350/470 nm ו 649/666 nm דאפי, Cy5, בהתאמה. היו פעמים חשיפה בהתאמה 250 ms ו 625 גב' להחליפן בתמונות אלה מצביעים על צביעת היה מוצלח, כי יש ביטוי מגוון של Bcl-2 לאורך הקווים תא. השקופית שליטה שלילי "אין נוגדנים Bcl-2" לא להפגין כל אות Cy5, כצפוי. התמונה נציג היא מן הקו תא 697. גרעין של רקמת שקדים hyperplastic כלולים ב TMA מדגים דפוס מקביל לזה המוצג באיור2. עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע (MFI) עבור כל קו תא נקבע על ידי לכימות האות זריחה Cy5 באמצעות תוכנת ניתוח התמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : קביעת הטווח הדינמי ליניארי של האותות immunoblot (ליברות). תסמונת המעי הרגיז (A) של דילולים טורי של Granta-519 lysate. כל כתם נחשף למגוון רחב של הזמן למצוא את טווח דינמי ליניארי. (B) עוצמת הלהקה Bcl-2 (למעלה) וגם GAPDH (למטה) לעומת כמות החלבון הכולל נטען עבור ליברות (לה). עוצמות הלהקה היו לכמת באמצעות התוכנה ניתוח תמונה ImageJ. Bcl-2 (למעלה), האותות נותרה ליניארי לאורך כל הטווח של הלהקה עוצמות כאשר זמן החשיפה הנמוכים (הוצאה) (0.2 s) היה בשימוש (עוצמות מ 0-7,200) נתמך על ידי מקדם המתאם פירסון (ערך r) של 0.994 (0.001 < p), אך לא עבור גדול פעמים חשיפה של s 1 ו- 2 דקות. עבור GAPDH (למטה), הנתונים נשאר לינארית מעל עוצמה של 3000 (יחידות שרירותיות) נמוך (0.2 s), בינוני (2.2 s) פעמים חשיפה כמו הנתמך על-ידי ערכי r פירסון 0.994 (0.001 < p) ו- 0.992 (p < 0.001), בהתאמה, אבל לא לחשיפה גבוהה זמן ( 7 s). חיצים מצד הימין מציינים את עוצמת הלהקה עבור שורת תאים מסוים זוהה דרך immunoblot ב איור 5A. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : Immunoblotting כמותית (ליברות) של שורות תאים מונצחים, בהשוואה immunofluorescence (אם)- ליברות (A) של כל שורות תאים. 12 µg של חלבון הכולל נטען בכל טוב. ליברות (B) ואם אות עוצמות עבור כל קו תא. האות ליברות הוא היחס של Bcl-2:GAPDH עוצמת הלהקה מ האבן החשופה ב (א) כפי לכמת על-ידי ImageJ. האות אם הוא עוצמת קרינה פלואורסצנטית הליבה קו לכל תא TMA (איור 3) כפי שנקבע על ידי ניתוח תמונות. (ג) Scatterplot של אם האות לעומת ליברות אות. כל נקודת נתונים מייצג קו תא נתון. שתי השיטות מיוצר תוצאות באופן ליניארי בקורלציה עם ערך r Pearson 0.984 (p < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : מציאת הזמן חשיפה אופטימלית עבור immunoblotting כמותית (ליברות). ליברות של שורות תאים כל מוצג. 12 מיקרוגרם של חלבון היו טעון כל היטב. עבור כל ליברות, פעמים חשיפה שונים שימשו כדי ללכוד תמונה איפה כל להקות נשאר בתוך הטווח הדינמי ליניארי. טיימס חשיפה של הרצועות Bcl-2 ו- GAPDH בהתאמה היו: (א) 0.1 s ו- 0.1 s, (B) 1 s ו- 0.2 s, ו- (ג) 5 s ו- 5 פאנלים ש A ו- C להראות דוגמאות של חשיפות שם לפחות חלק הלהקות האבן החשופה היו חלש או יותר מדי חזק, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תארנו שיטה לשימוש immunoblotting כמותית (ליברות) כדי להדגים את התועלת של immunofluorescence (אם) עבור ברור שפע יחסי של חלבון המטרה דגימות רקמה FFPE. שיטות הנוכחי של כימות חלבונים מוגבלים לפי טבעם קטגורית, כגון2,הדפסות כסף IHC3, או בצורך homogenize דגימות, מניעת חקירה דוגמת מבנה ותא האוכלוסיות, כגון עם ליברות, ספקטרומטר מסה8,9,10,11. אם כמותי יכול להתעלות מעל מגבלות אלה אם שיטת אימות מיושם היטב. על ידי השוואת הקריאות אם ל iIF כמותית של שורות תאים מונצחים, הצלחנו לאמת את מהות הגישה אם חצי כמותית.
דגימות רקמה העיקרי של חולים או חיות ניסוי הם הטרוגנית בכך שהם מכילים סוגי תאים מרובים. היישום של מספר נוגדנים הראשי אם מולטיפלקס מאפשרת כימות של חלבונים אחד או יותר של עניין סוגי תאים ספציפיים או תאים תאים4,13. אופטימיזציה של היישום של אם מולטיפלקס חורג מהיקף מאמר זה אך מסומן במיתאר הבאים ניירות16,17,18,29. פילוסופיה רחבה לאוכלוסיות תא תווית, רק לכמת את החלבון של עניין בתוך התא התא הרצוי, לדוגמה גרעינים או ציטופלזמה, בסוג התא הרצוי. ברגע הטבע כמותית של אם עם נוגדנים מסוימים אומתה על ידי ליברות כמותית, הפרוטוקול יכול להיות upscaled כדי לאפשר חלבון מהיר, תפוקה גבוהה כימות בדגימות קליניות. יישומים קליניים דורשים בדרך כלל הקביעה של חלבון יחסית, ולא מוחלט, שפע. עם זאת, הגישה אם יכול להתבצע באופן רשמי כמותיים במידת הצורך. לדוגמה, פתרון המכיל מטוהרים רקומביננטי Bcl-2 חלבון יכול להיות מוכן, לכמת באמצעות שיטה ביוכימית סטנדרטית. טורי דילולים אז יכול להיות מוערך על ידי ליברות כמותית, עיקול רגיל שנוצר כדי להעריך את תכולת החלבון המוחלטת בכל תא בכל שורה תא.
אנחנו יחולו פרוטוקול שלנו אם מקטעים TMA המייצג דגימות ביופסיה מ 66 ארגזי דה נובו ' מאטום לשקוף ' B-cell לימפומה גדולים. התוצאות שלנו הפגינו מקובל הפארמצבטית לרוץ--לרוץ (Pearson r = 0.837) והאגודה הצפוי, חזק בין מצב "Bcl-2-חיובי נחוש סובייקטיבי כשקלע חזותי של IHC קונבנציונאלי וביטוי מוגברות נחוש באופן אובייקטיבי על ידי אם (p < 0.001). יתר על כן, שפע Bcl-2 מאת אם בקורלציה עם Bcl-2 שפע mRNA הדגימות באותו (ספירמן ρ = 0.69, p < 0.001) היה גדול משמעותית במקרים עם רווחים מספר עותק של הגן BCL2 (p = 0.042) או טרנסלוקציה של BCL2 את מיקומה וקשתות (p = 0.004), כפי שנקבע על ידי קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה. השגנו תוצאות שוות ערך במדגם נפרדים של מקרים. ממצאים אלה מספקים ראיות נוספות התומך אם כשיטה חוקית לקביעת שפע יחסי של Bcl-2 בדגימות FFPE שגרתית. השימוש אם כדי לכמת את מספר חלבונים אחרים סמן בדגימות העיקרי היה שתואר לעיל16,17.
אופטימיזציה של פרוטוקול זה הוא תהליך כפולה. ראשית, אם עם נוגדנים העיקרי המשמש חייב להיות מותאם (שלב 2.1). נוגדנים המסחרי מציע בדרך כלל דילולים עבור פרוטוקולים IHC אשר אמור לשמש כנקודת התחלה יחד עם דילול או שתיים מעל ומתחת זה (קרי, אם מטריים מומלץ, להוסיף 1:50 ו- 1:150). לאחר ביצוע IF וסריקת מהשקופית, לקבוע אילו הדילול הוא "אופטימלית" מצריכה בדיקה ויזואלית לזהות דילול נוגדן ראשוני שיוצר את האות המבריקים מבלי להגדיל את רקע זריחה. השלב השני של אופטימיזציה כרוך בבחירת כמות חלבון כדי לטעון עבור immunoblot להבטיח שכל הלהקה יישאר בטווח ליניארי (שלב 3.4). כדי להבטיח זאת, immunoblot מתבצעת באמצעות לדילול טורי של הקו הסלולרי המבטאת את השפע הרב ביותר של חלבון המטרה. מכאן, ניתן להתוות עוצמות הלהקה לעומת כמות חלבון כדי לקבוע הטווחים בעוצמה שדרכו האות נשארת ליניארי. מאז טווח זה נוצר בשורת תאים עם החלבון היעד הנפוץ ביותר, עבור כמות נתונה של חלבון כל שורות תאים אחרים תניב אותות נמוכים יותר. כשאתה עובר immunoblot של כל שורות תאים (שלב 3.4), הסדרה דילול משמש להודיע כמות חלבון כדי לטעון את זה תניב אותות חזקים ללא הסיכון של חשיפת יתר מעבר לטווח ליניארי.
למרות היתרונות של פרוטוקול זה, השימוש immunoblotting כשיטת אימות כמת יש את חסרונותיו. החשש העיקרי סובבת סביב מגוון רחב של ביטוי חלבונים שונים בין דגימות. זה עשוי להיות קשה לשמור כל דוגמאות בגבולות טווח ליניארית אם כמה דגימות אקספרס החלבון עניין ביתר פירוט רב יותר מאחרים. בתוצאות נציג המוצג לעיל, נלכדו חשיפות שונות כדי להשיג תמונה שבו הקצוות (גבוה ונמוך) נמצאים שניהם במרחק הטווח הדינמי ליניארי (איור 6). גדול יותר מהמצופה אם אותות ראו התאים הלה ו Jurkat ב איור 5B עשוי להצביע על הנמוך ביותר האפשרי אם האות עבור מערכת זו, או כי האותות ליברות הגיעו התחתון של זיהוי ליניארי להגביל, הן פחות מדויקות. בכל מקרה, הדבר מציין כי אם הערכים בטווח כזה נוטים פחות מדויק במערכת זו, וכי הטכניקה היא אופטימלית בינוני - עד מאוד-בא לידי ביטוי חלבונים. בנוסף, השימוש מצומדת HRP נוגדנים משניים אינה אופטימלית עבור מטרות כמותיות, כפי שפורט קודם לכן ביחס IHC2,3. באמצעות נוגדנים משניים מתויגות fluorescently עבור immunoblot לספק אישור עמידים יותר כי אם הוא אכן באופן ליניארי כמותיים30,31, עם זאת, ערך r Pearson 0.984 שהושג באמצעות HRP מצומדת נוגדנים משניים בפרוטוקול לעיל היה מספיק לצורך הנוכחי. חסרונות פוטנציאליים הקשורים אם, כמו autofluorescence של שכבתה להשתנות בהתבסס על מכשור מעבדה בודדים, שיטות עבודה, סוג הרקמה, ניתן למזער על ידי אמצעי המניעה השונים32,33. ניתן לראות כמות מאוד קטנה של autofluorescence בתוצאות נציג לא מדגם נוגדן Bcl-2 באיור3, אולם סכום זה אינו טריוויאלי בהשוואה IF הנותרים אותות.
הצורך לכמת במדויק חלבונים ריבית דגימות רקמה FFPE מתייחס קליניים לצרכי עיון ומחקר על פני שדות ביולוגיים רבים. פרוטוקול המובאת כאן מתאר את השימוש אם כמותיים על מקטעי רקמת FFPE ומאמת טבעה הכמותיים למחצה על ידי immunoblotting של שורות תאים מונצח. שיטה זו מאפשרת כימות על פני טווח דינמי רחב, כמו גם שמירה על שלמות המבנה של דגימת הרקמות, אשר אינו נשמר רבים אחרים כימות שיטות3,8,11. בנוסף, פרוטוקול זה ניתנת להתאמה בקלות, ניתן ליישם מחקר והגדרות קליני, במיוחד עבור מחקר הקשורים לסרטן, פרוגנוזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומן בחלקו על ידי פרדריק בנטינג ו צ'ארלס הטוב ביותר בקנדה לתואר שני מלגה (בבוקר).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | - | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | - | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | - | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | - | For densitometry analysis |
References
- Khoury, J. D., et al. Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).
- Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. Interpretation and quantification of immunostains. The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).
- Rimm, D. L. What brown cannot do for you. Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).
- Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).
- Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging? Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).
- Rzagalinski, I., Volmer, D. A. Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry – A tutorial review. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).
- Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).
- Denburg, M. R., et al. Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Peck, A. R., et al. Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).
- AlJohani, N., et al. Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival. Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).
- Wood, B., et al. Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease. Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).
- Weberpals, J. I., et al. First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16. Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH protocols. , (2008).
- Fedor, H. L., Marzo, A. M. De Practical Methods for Tissue Microarray Construction. Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).
- Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting. Nature Protocol Exchange. , (2013).
- Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies. Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).
- Bosch, M., et al. A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).
- Li, Y., et al. BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).
- Choi, Y. W., et al. High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy. International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).
- The Human Protein Atlas BCL2. , https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment & Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9 (1), 13 (2008).
