Summary
Wir beschreiben die Verwendung von quantitativen Immunoblotting, Immunfluoreszenz Histologie gepaart mit Bildanalyse als Mittel zur Quantifizierung eines Proteins des Interesses in Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebeproben zu validieren. Unsere Ergebnisse zeigen den Nutzen der Immunfluoreszenz Histologie für die Ermittlung der relativen Menge Biomarker Proteine im Routine-Biopsie Proben.
Abstract
Quantifizierung der Proteine des Interesses in Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebeproben ist wichtig in der klinischen und Forschung Anwendungen. Eine optimale Methode zur Quantifizierung stimmt, hat einen breiten linearen Dynamikbereich und unterhält die strukturelle Integrität der Probe zur Identifizierung der einzelnen Zelltypen zu ermöglichen. Aktuelle Methoden wie Immunhistochemie (IHC), Massenspektrometrie und Immunoblotting jeweils nicht erfüllen diese Bestimmungen aufgrund ihrer kategorischen oder brauchen, um die Probe zu homogenisieren. Als eine alternative Methode schlagen wir die Verwendung von Immunfluoreszenz (IF) und Bildanalyse, die relative Häufigkeit eines Proteins des Interesses an FFPE Gewebe zu bestimmen. Hier zeigen wir, dass diese Methode ist leicht optimiert, einen breiten dynamischen Bereich liefert und im Vergleich zu der Goldstandard der quantitativen Immunoblotting linear quantifizierbar ist. Darüber hinaus ist diese Methode ermöglicht die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität der Probe und ermöglicht die Unterscheidung der verschiedenen Zelltypen, die im diagnostischen Anwendungen entscheidend sein können. Insgesamt, dies ist eine robuste Methode für die relative Quantifizierung von Proteinen in FFPE-Proben und kann leicht an klinischen passen oder Forschung muss angepasst werden.
Introduction
Die Notwendigkeit zur Quantifizierung von Proteinen in Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Biopsie Gewebeproben existiert in vielen klinischen Bereichen. Quantifizierung der Biomarker Proteine in Routine Gewebeproben wird beispielsweise zur aufzuklären Prognose und Behandlung für Krebs Patienten1zu informieren. Jedoch aktuelle Methoden sind in der Regel subjektiv und Validierung fehlt.
Immunhistochemie (IHC) dient routinemäßig in der Pathologie-Laboratorien und hängt im Allgemeinen von einer primären Antikörper gegen das Zielprotein und ein mit einem enzymatischen Label wie Meerrettich Peroxidase2konjugierten Sekundärantikörper. Konventionelle IHC ist empfindlich, kann Gebrauch von Minute Proben und bewahrt die morphologische Integrität von Gewebeproben, die dadurch bei schönem Bewertung der Proteinexpression in seinem entsprechenden histologischen Kontext. Jedoch weil das chromogene vom IHC erzeugte Signal subtraktiven ist, leidet unter einem relativ engen Dynamikbereich und bietet begrenzten Potential für multiplexing2,3,4. Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie imaging (MALDI-MSI) bleibt morphologischen Integrität. Allerdings diese entwickelnden Technologie ist verbunden mit einer bescheidenen morphologische Auflösung und erfordert erhebliche Kalibrierung und Normalisierung, beeinträchtigen seine Machbarkeit für klinische Routineanwendung5,6,7. Alternative Verfahren zur Quantifizierung von Protein in Gewebeproben gehören Immunoblotting8, Massenspektrometrie9,10,11und Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA)12, jedes Das beginnt mit einer homogenisierten Probe Gewebe lysate. Primäre Gewebeproben sind heterogen, weil sie eine Vielzahl von Zelltypen enthalten. Daher erlauben Techniken, die zur Folge haben, Homogenisieren der Proben keine Quantifizierung eines Proteins in einer bestimmten Zelle Bevölkerung von Interesse, wie Krebszellen.
Wie IHC, wenn gilt für kleine FFPE Proben und ermöglicht die Beibehaltung der histologischen Integrität13. Aber dank dem Additiven Charakter der Fluoreszenz Signale, wenn für die Anwendung von mehreren primären Antikörper und Fluoreszenzmarkierungen zugänglich ist. So kann ein Protein des Interesses relativ innerhalb bestimmter Zellen oder zellulären Kompartimenten (z. B. Zellkern und Zytoplasma) mit anderen Antikörpern definiert quantifiziert werden. Fluoreszenz-Signale haben auch den Vorteil eines größeren Dynamikbereich13,14. Die Überlegenheit, Reproduzierbarkeit und multiplexing Potential wurde wenn auf FFPE-Proben angewendet demonstriert13,14,15.
Hier beschreiben wir die Verwendung von quantitativen Immunoblotting mit etablierten Zelllinien als Goldstandard quantitative Artder festzustellen, ob in Verbindung mit computergestützten Bildanalyse bei der Bestimmung der relativen Fülle eines Proteins des Interesses an histologischen Abschnitte aus FFPE Gewebeproben. Wir haben diese Methode erfolgreich in einem Multiplex-Ansatz zur Quantifizierung der Biomarker Proteine in klinischen Biopsie Proben16,17,18angewandt.
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Protocol
Zulassung mit primären menschlichen Gewebeproben aus der Gesundheitswissenschaften und angegliedert Lehrkrankenhäuser Research Ethics Board (HSREB) an der Queens University ermittelt.
1. Aufbau einer Zelllinie Tissue Microarray (TMA)
- Ernten Sie und waschen Sie Zellen.
Hinweis: Dieses Protokoll wurde auf verschiedenen etablierten verewigt Zell-Linien (z. B. HeLa, Jurkat, RCH-ACV) getestet.- Ernten Sie für adhärente Zellen ca. 1,3 x 107 Zellen sobald sie ca. 80 % Konfluenz erreicht. Lösen Sie Zellen mit einer Reagenz für die Zell-Linie geeignet.
Hinweis: Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) ist zur Verringerung des Risikos von Oberflächenproteinen entwürdigend Trypsin im Allgemeinen vorzuziehen. Wenn Trypsin, neutralisieren Sie die Trypsin mit fetalen bovine Serum (FBS) sofort nach der Ernte der Zellen. - Ernten Sie für Aufhängung Zellen ca. 8 x 107 Zellen in Log-Phase des Wachstums.
- Sammeln Sie die Zellen geerntet/abgelöst durch Zentrifugieren für 5 min bei 225 X g in einem 50 mL konische Röhrchen.
- Abgießen Sie den Überstand und wieder auszusetzen Sie das Pellet in 10 mL 1 X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Für 5 min bei 225 X g Zentrifugieren Sie und dekantieren Sie des Überstandes.
Hinweis: 1 X PBS besteht aus 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO41,8 mM KH2PO4 in destilliertem Wasser; pH auf 7,4 einstellen.
- Ernten Sie für adhärente Zellen ca. 1,3 x 107 Zellen sobald sie ca. 80 % Konfluenz erreicht. Lösen Sie Zellen mit einer Reagenz für die Zell-Linie geeignet.
- Beheben Sie die Zellen in Formalin und pellet-sie.
- Die Zelle Pellet in das konische Rohr in 10 mL 10 % neutral gepuffertem Formalin (NBF) aussetzen.
Hinweis: NBF kann durch Verdünnen von 1 mL der Stammlösung 37 % Formaldehyd in 9 mL 1 X PBS hergestellt werden.
Achtung: Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit Formalin und Formaldehyd. Verwenden Sie eine Abzugshaube für Schritten, Formalin und Formaldehyd. - Inkubieren Sie die Zellen auf einer Wippe mit 24 u/min bei Raumtemperatur über Nacht (ca. 17 h).
- Bereiten Sie eine 1 % ige Lösung des niedrigen Schmelzpunktes Agarose in PBS (0,01 g Agarose pro 1 mL PBS).
- Genug für 500 µL Agarose-Lösung pro Linie Zellprobe vorzubereiten.
- Die Agarose in einem 80 ° C Wasser Bad oder Hitze-Block, mit gelegentlichen mischen für 2-5 min zu lösen. Wenn aufgelöst, halten Sie die Lösung in einem 37 ° C Wasser Baden oder Hitze Block um Härten zu vermeiden.
- Pellets die festen Zellen von 1.2.2 Schritt durch Zentrifugieren für 5 min bei 225 X g. entfernen den Überstand und Aufschwemmen der Zellen in 500 µL 1 X PBS.
- Übertragen Sie die Zellen in eine 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und Pellet durch Zentrifugieren für 5 min bei 290 X g. Aspirat alle des Überstands.
- Die Zelle Pellet in das konische Rohr in 10 mL 10 % neutral gepuffertem Formalin (NBF) aussetzen.
- Gegossen Sie Zellen in Agarose.
- Fügen Sie hinzu ~ 500 µL 1 % Agarose-Lösung (aus Schritt 1.2.3) für jedes Röhrchen enthält die Zellen. Sanft, aber schnell, pipette Mischung nach oben und unten mit einem P-1000 Mikropipette mischen.
Hinweis: Schneiden Sie das Ende der Pipettenspitze vergrößern die Blende und vermeiden Luftblasen. Halten Sie die Arbeitslösung Agarose im 37 ° C Wasserbad um Härten zu vermeiden. - Lassen Sie die Agarose-Zelle-Lösung (5-10 min) bei Raumtemperatur aushärten. Fügen Sie 1 mL 10 % NBF zu jeder Microcentrifuge Schlauch mit einer Probe und bei Zimmertemperatur aufbewahren, bis Paraffin einbetten (bis zu 24 h).
- Fügen Sie hinzu ~ 500 µL 1 % Agarose-Lösung (aus Schritt 1.2.3) für jedes Röhrchen enthält die Zellen. Sanft, aber schnell, pipette Mischung nach oben und unten mit einem P-1000 Mikropipette mischen.
- Bereiten Sie die Agarose-Stecker für das Paraffin einbetten.
- Aus der NBF aus der Probe Aspirieren.
- Abziehen Sie die Zelle-Stecker mit einer Rasierklinge geschnitten Microcentrifuge Schlauch, stecken Sie den Netzstecker in Kunststoff Gewebe Kassette. Bewahren Sie Kassetten an 10 % NBF bei Raumtemperatur.
- Die Proben zu verarbeiten Übernachtung entweder manuell oder mit einem automatisierten Gewebe-Prozessor und Einbettung in Paraffin-Wachs mit standard Histologie Methoden.
Hinweis: Siehe Fischer Et Al. 19 für ein Beispiel-Protokoll. - Mit einem spezialisierten "Tissue Arrayer" Instrument, Ernte doppelte 0,6 mm Kerne aus Paraffin verhindert jede Zelllinie und einfügen, in Reihen, eine leere Empfänger Paraffinblock um eine Zelllinie TMA zu schaffen.
Hinweis: Standard-Methoden sollte wie beschrieben in Fedor und De Marzo20verwendet werden. - Integrieren Sie Kerne von Primärproben 2-3 zusätzliche Gewebetypen (z. B. Tonsillen, Doppelpunkt, Hoden, etc.) als positive oder negative Kontrollen in der TMA darstellt. Wählen Sie Gewebe, die für das Protein des Interesses geeignet sind.
- Verwenden Sie ein Mikrotom, zwei histologische Abschnitte, ca. 4 bis 6 µm dick, der Zelllinie TMA vorzubereiten. Montieren Sie den Abschnitt auf einer Folie Histologie, trocknen, und deparaffinize (wie Fedor und De Marzo20beschrieben).
2. Beispiel Färbung durch Immunfluoreszenz
- Die Verdünnung der Primärantikörper zu optimieren.
Hinweis: Standard-Protokolle gibt es für die Optimierung des IHC oder, wenn für FFPE Gewebe Abschnitte wie in Kajimura Et al. 21. eine kurze Übersicht über die Vorgehensweise wird hier beschrieben.- Bereiten Sie 4-5 Verdünnungen der primären Antikörper gegen das Protein des Interesses, geleitet von den Anweisungen des Herstellers.
- Identifizieren Sie einen Steuerelementtyp Gewebe von einer tierischen oder menschlichen Quelle, die das Protein des Interesses an morphologisch erkennbare Zellpopulationen ausdrückt. Bereiten Sie Abschnitte des Gewebes aus und klebe sie auf einer Folie nach standard Immunohistochemistry Verfahren wie z. B. in Fedor und De Marzo20.
Hinweis: Die Anzahl der erforderlichen Abschnitte ist die Anzahl der primären Antikörper-Verdünnungen plus einen zusätzlichen. - Mit einem automatisierten oder manuellen System für Immunhistologie, testen Sie die Primärantikörper Verdünnungen von 2.1.1 jeden Schritt auf einer Folie aus Schritt 2.1.2. Lassen Sie die Anwendung des primären Antikörper aus der zusätzlichen Folie Weg und verwenden Sie es als Negativkontrolle.
- Färben Sie bei der Färbung alle Folien mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) als eine nukleare Gegenfärbung und Gewebekulturen tagged Sekundärantikörper. Wenn größere Sensibilität erforderlich ist, verwenden Sie eine HRP (Meerrettich-Peroxidase)-konjugierten Sekundärantikörper und Tyramide-basierte Signal Verstärkersystem (siehe Stack Et Al. ( 13).
Hinweis: Beim primären Antikörper multiplexing, wird ein anderes fluoreszierendes Label für jedes Protein verwendet. - Scannen Sie die Immunostained Folien mit einem geeigneten Instrument erzeugen eine digitale Bilddatei mit Erkennung und Erregung Wellenlängen angebracht, die Fluorophore, die verwendet wurden.
- Verwenden Sie entsprechenden Software, die digitalen Bilder anzeigen und empirisch wählen die Primärantikörper Verdünnung, die Signalintensität im Vergleich zu Hintergrundfluoreszenz optimiert.
Hinweis: Falls gewünscht, kann diese Optimierung auftreten mit einer HRP-konjugierten Sekundärantikörper, 3, 3'-Diaminobenzidine (DAB) und Hellfeld Mikroskopieren.
- Führen Sie aus, wenn auf der Zell-Linie TMA Färbung.
- Verwenden Sie eine automatische oder manuelle System für Immunhistologie, eine Folie der Zelllinie TMA mit der optimierten Primärantikörper Verdünnung (wie in Schritt 2.1 bestimmt) zu beflecken. Lassen Sie die Anwendung des primären Antikörper aus der zweiten Folie Weg und verwenden Sie es als Negativkontrolle.
- Färben Sie bei der Färbung alle Folien mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) als eine nukleare Gegenfärbung und eine sekundäre Antikörper und Tyramide wie in Schritt 2.1.4.
- Scannen Sie die Immunostained Folien mit einem geeigneten Instrument erzeugen eine digitale Bilddatei mit Erkennung und Erregung Wellenlängen angebracht, die Fluorophore, die verwendet wurden.
- Verwenden Sie eine Bild-Analyse-Software-Paket, um das zelluläre Fach von Interesse (z.B. Zytoplasma versus Zellkern) identifizieren und quantifizieren der mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für jede Zelllinie.
Hinweis: Verschiedene Software-Pakete für diesen Zweck verwendet werden und viele werden diskutiert in Stapel Et al. 13.
3. quantitative Immunoblotting Zell-Linien
- Bereiten Sie Lysaten von Zellen.
- 2 Millionen Zellen für jede Zelllinie zu ernten, wie 1.1.1 bis 1.1.3 beschrieben.
- Spin-down Zellen für 5 min bei 650 X g in einem 50 mL konische Röhrchen. Den Überstand abgießen.
- Waschen Sie Zellen mit 10 mL eiskaltem PBS. In 1 mL eiskaltem PBS und Transfer zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch aufzuwirbeln. Gemäß Schritt 3.1.2 Zentrifugieren, Dekantieren und Zellen auf dem Eis zu verlassen.
- Fügen Sie ca. 200 µL des kalten Tests (RIPA) Lysis Puffer mit Protease-Inhibitoren (10 µL 100 X Inhibitoren pro mL RIPA Lyse Puffer) an den Zellen, Wirbel und inkubieren Sie für 15 min auf Eis.
Hinweis: Die Höhe der Lyse Puffer erforderlich für wirksame Lyse variiert je nach Zelllinie und empirisch ermittelt werden. RIPA Puffer besteht aus 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, 1,0 % NP-40, 0,5 % Natrium Deoxycholate, 0,1 % SDS in destilliertem Wasser. - Dafür relativ gleichmäßige Belastung auf die Immunoblots quantifizieren Sie die gesamte-Protein in einer 20 µL Probe von jeder lysate mit einer geeigneten Methode wie der Bradford-Test. Der Rest (ca. 180 µL) jeder Zelle lysate ca. 40 µL 6 X Laemmli Lyse Puffer hinzu und bei 100 ° C in einem Hitze-Block oder Wasserbad für 5 min kochen.
Hinweis: 6 X Laemmli, die Puffer besteht aus 300 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4 % (w/V) SDS, 60 % Glycerin, 0,6 % (w/V) Bromophenol blue, 50 mM Dithiothreitol (DTT) in destilliertem Wasser. - Speichern Sie die Proben bei-20 ° C bis zu zwei Wochen.
- Führen Sie ein Immunoblot aller Zellen Linien um festzustellen welche Zelllinie hat die am häufigsten vorkommende Protein des Interesses.
Hinweis: Folgen Sie den beschriebenen Mahmood, T. und Yang, PC. 22, mit den folgenden Änderungen.- Aliquoten Zelle lysate (vorbereitet in Schritt 3.1) mit 10-50 µg Protein (abhängig von der Fülle des Proteins des Interesses) in Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie 2,5 µL 6 X Laemmli-Puffer und ausreichend RIPA Lysis Buffer, das Volumen bis zu 15 µL zu machen.
- Laden Sie eine 5 % ige stapeln und eine geeignete Konzentration (z.B.10 % für Proteine zwischen 15-100 kDa) Lösung SDS-PAGE Gel mit einer Protein-Leiter und die Proben aus dem Schritt 3.2.1. Laden Sie 1 X Laemmli-Puffer in leeren Brunnen. Führen Sie die Stromversorgung bei entsprechenden Einstellungen in der Regel 125 V, 80 min lang oder bis der Bromophenol blauen Farbstoff der Unterseite der Platte erreicht.
- Führen Sie eine halbtrockene Protein Übertragung wie in Wiedemann Et Al. beschrieben 23.
Hinweis: für die repräsentativen Ergebnisse, eine Nitrocellulose-Membran (die müssen nicht eingeweicht werden, Methanol), und kalte Bjerrum Schafer-Nielsen (BSN) Transfer Puffer dienten. BSN-Puffer besteht aus 48 mM Tris, 39 mM Glycin, 20 % Methanol in destilliertem Wasser. - Verwenden Sie nach der Übertragung eine Rasierklinge, schneiden Sie die Membran horizontal um den Teil mit dem Protein des Interesses aus eine entsprechende interne Kontrolle Protein, wie z. B. GAPDH zu trennen.
- Gehen Sie zu blockieren und Antikörper Inkubationen mit den blockierenden Puffer der vom Hersteller empfohlenen der primären Antikörper.
Hinweis: Optimale Primärantikörper Verdünnungen können dramatisch Protein Fülle und Empfindlichkeit abhängig. Für die repräsentativen Ergebnisse unten benötigt der Antikörper gegen das Protein des Interesses eine 1:1,000 Verdünnung, während das GAPDH-Steuerelement eine 1:40,000 Verdünnung erforderlich. Die Verdünnung der Sekundärantikörper verwendet wurde 1:3, 000. - Legen Sie nach Antikörper Inkubationen und Waschen der Membran die Membran-Streifen in einer durchsichtigen Hülle wie ein Sandwich-Beutel.
- Bereiten Sie Enchanced Chemilumineszenz (ECL) Mischung nach den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie eine Pipette P-1000 decken die Membran mit der ECL-Mischung, in der Nähe der Scheide und die Membran-Streifen mit der Mischung im Dunkeln bei Raumtemperatur für 1-2 min inkubieren.
- Legen Sie die Membran-Hülle in eine digitale imaging Plattform. Verwenden Sie Chemilumineszenz und farbmetrische Marker-Erkennung, um verschiedenen Belichtungen der Membran zu erfassen.
Hinweis: Belichtungszeiten variieren basierend auf der Menge des Proteins geladen, Fülle von Zielprotein, Antikörper Affinität etc. beginnen mit einer Belichtungsautomatik (in der Regel wenige Sekunden) und Test Belichtungszeiten oberhalb und unterhalb von ein paar Sekunden-Schritten. - Empirisch oder mit Bildanalyse-Software bestimmen welche Zelllinie das Zielprotein drückt.
- Finden Sie den linearen Dynamikbereich jeder primären Antikörper mit einem serielle Verdünnung.
- Führen Sie Schritte 3.2.1-3.2.8 mit einer Reihe von Verdünnungsreihen von der Zell-Linie, die die höchste Konzentration an das Zielprotein (identifiziert in Schritt 3.2.9) zum Ausdruck bringt.
- Verwenden Sie Bildanalyse-Software wie ImageJ Densitometrie auf die Exposition Bilder durchführen.
- Verwendung von ImageJ, z. B. das Rechteckige Auswahl -Werkzeug, wählen Sie die erste Spur des Gels zu quantifizieren. Gehen Sie zu analysieren | Gele | Wählen Sie die erste Spur. Verwenden Sie die Maus, um die resultierende Rechteck in die nächste Spur zu verschieben. Gehen Sie zu analysieren | Gele | Wählen Sie Next Lane. Immer wieder bewegen Sie das Rechteck in die nächste Spur und wählen Sie die Spur für den Rest der Fahrspuren.
- Gehen Sie zu analysieren | Gele | Plot-Bahnen. Verwenden Sie die Geraden Linien -Werkzeug zum Zeichnen von Linien über die Grundlagen der jede Spitze, Hintergrundgeräusche zu entfernen. Verwenden Sie das Zauberstab -Werkzeug, um jede Spitze auszuwählen, und sammeln Sie die Dichte der jede Spitze, im folgenden bezeichnet als Band Intensität, aus dem Ergebnisfenster .
- Verwenden Sie die Ausgabe in ein Streudiagramm von der Band Intensität gegen die Höhe der Gesamt-Protein für jedes Primärantikörper geladen erstellen Densitometrie. Mit einer Linie der beste Passform und Sichtprüfung, bestimmen Sie den Speicherort (Intensitätsbereich) der linearen Dynamikbereich von jeder Antikörper.
- Wählen Sie eine Proteinkonzentration, die einen Wert am oberen Ende des linearen Bereichs, der die Konzentration voran mit allen Zelllinien werden generiert.
Hinweis: Da diese Konzentration unterhalb der Sättigung in der Zell-Linie mit der größten Menge dieses Proteins ist, sollte keine Gefahr über Belichtung die Bands für die Zell-Linien sein.
- Führen Sie ein Immunoblot mit Konzentration des Proteins in Schritt 3.3.4 für alle Zelllinien ausgewählt und wiederholen Sie die Schritte 3.2.1-3.2.8.
- Durchführen Sie Densitometrie auf die digitale Scans wie in 3.3.2 Schritt. Wählen Sie die Aufnahmen Bilder, die Signale innerhalb der linearen Bereiche für jeden Antikörper identifiziert in Schritt 3.3.3 ergeben.
- Mit der Band Intensität Signale aus den idealen Engagements von 3.4.1, berechnen Sie das Verhältnis von Ziel Protein Band Intensität zu dem Laden von Kontrolle Band Intensität für jede Zelllinie. Diese Verhältniswerte zeigen die relative Häufigkeit des Zielproteins von Interesse.
- Pearson Korrelation Test durchführen (möglich ist mit einer statistischen Software), die Werte aus Bildanalyse von der IF Färbung (Schritt 2.2) zu den Ergebnissen von Immunoblotting (Schritt 3.4.2) zu korrelieren.
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Representative Results
Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Fähigkeit der IF, die relative Menge des Anti-apoptotischen Proteins Bcl-2 in Zelllinien hergestellt in FFPE Gewebe Blöcke bestimmen zu bestätigen. Bcl-2 in Krebszellen selektiv quantifizieren kann onkogene Mechanismen aufzuklären und kann nützlich sein, in der pathologischen Diagnostik und klinisches Management Entscheidungen24zu informieren. Genauer gesagt, Bcl-2 spielt eine Rolle in richtige zahlreiche Entwicklung und seinen Ausdruck wird häufig im Zusammenhang mit Lymphomen25,26,27untersucht. Abbildung 1 beschreibt die Schritte, die im Protokoll. In einem ersten IF Optimierungsschritt wurden verschiedene Verdünnungen des primären Antikörpers Anti-Bcl-2 auf menschlichen Tonsillen Gewebe mit einer automatisierten Immunhistologie Stainer wie unter Punkt 2.1 beschrieben getestet. Abbildung 2 enthält Bilder von gefärbten und gescannte Histologie Folien der menschlichen Tonsillen Gewebe, dass jeweils eine unterschiedliche Verdünnung der Antikörper erhalten. Es ist ersichtlich, dass 01:50 ist der optimale Verdünnung, die starkes Signal und wenig Hintergrundfluoreszenz ergab. Diese Verdünnung wurde dann auf die Zellinie TMA wie unter Punkt 2.2 beschrieben verwendet. Die TMA war auch gefärbt mit DAPI, um Kerne zu identifizieren. Eine Tyramide-basierte Signal-Verstärkung-Kit wurde verwendet, um die Bcl-2 mit einem Cy5 Fluorophore beschriften. Bildanalyse wurde verwendet, um den zytoplasmatischen Cy5 Fluoreszenzsignal zugeschrieben Bcl-2 in jede Zelllinie zu quantifizieren. Repräsentative Bilder der Färbung können in Abbildung 3dargestellt. Die immortalisierte Zelllinien gewählt für dieses Experiment enthalten eine Vielzahl von lymphatischen abgeleitet Zell-Linien, nämlich 697 JeKo-1, Jurkat RCH-ACV, Granta-519, REH und Raji, neben HeLa, abgeleitet von einer zervikalen Karzinom. Die HeLa-Zellen sind bekannt, Bcl-2 bei einem sehr niedrigen Niveau28zum Ausdruck zu bringen.
Basierend auf einer ersten Immunoblot alle acht Zelllinien, war Granta-519 entschlossen, der größte Reichtum der Bcl-2 (nicht dargestellt). Verdünnungsreihen Granta-519 lysate wurden in einem anschließenden Immunoblot zur linearen dynamischen Bereich der Bcl-2 und GAPDH (Ladekontrolle) Signale (Abb. 4A) zu finden. Diese Immunoblot wurde mit dem digitalen Scanner für unterschiedlich lange Zeit ausgesetzt. Densitometrie mit Bildanalyse-Software wurde verwendet, um das Signal von jedem Band zu quantifizieren, und diese Werte wurden aufgetragen gegen die Menge des Proteins geladen (Abbildung 4 b). Aus den Daten in Abbildung 4 b-Spitze, der Dynamikbereich für Bcl-2 in diesem Assay spannt sich von einer Band-Intensität von nahezu Null bis 7500 (willkürliche Einheiten, blaue Linie). Die beiden höheren Belichtungszeiten passen eine quadratische und nicht-lineare Gleichung, was darauf hindeutet, Überbelichtung und Sättigung der Signalintensität. Der Bereich für GAPDH reicht von 3000 bis 6500 (willkürliche Einheiten, Abbildung 4 b-unten). Werte unterhalb von 3000 (willkürliche Einheiten) sank jäh auch wenn Sie eine relativ geringe Belichtungszeit zu verwenden. Eine lange Belichtungszeit ergibt sich eindeutig in Sättigung. Aus diesen Diagrammen, es wurde festgestellt, dass 12 µg wäre eine angemessene Menge an Protein zu laden, bei der Durchführung der Immunoblot mit allen Zelllinien, da diese Menge des Proteins Bcl-2 Intensitätswerte innerhalb des linearen Bereichs für die Granta-519-Zellen verringern ergab das Risiko einer Überbelichtung für alle anderen Zelllinien.
Eine zweite Immunoblot alle Zelllinien erfolgte dann wie in Schritt 3.4 und in Abbildung 5Azu sehen. Dieser Fleck war seit den ersten Fleck enthaltenen Bands mit Signalstärke außerhalb des linearen Bereichs erforderlich. Bildanalyse-Software wurde verwendet, um die Signalstärke der einzelnen Bänder in die neue Fleck zu bestimmen. Nur die waren innerhalb der dynamischen Bereiche oben ermittelten Intensitätswerte wurden verwendet. Die Pfeile auf der rechten Seite von Abbildung 4 b zeigen repräsentative Intensitätswerte, die verwendet wurden und zeigen wo sie innerhalb des linearen Bereichs passen. Das Verhältnis von Bcl-2:GAPDH wurde dann für jede Zelllinie berechnet. Dieses Verhältnis, zusammen mit der Fluoreszenzsignal von IF ist in Abbildung 5 bersichtlich. Ein Pearson-Korrelation-Test bewiesen, dass Intensität Kennzahlen aus Immunoblotting stark und positiv mit der Intensität Lesungen von quantitativen IF korreliert waren (R = 0.983, p < 0,001; siehe Abbildung 5).
Quantitativ die Bemessung der Bcl-2 erwies sich als besonders schwierig erweisen, da gab es eine Vielzahl von Expression dieses Proteins über die acht getesteten Zelllinien. Verwenden eine lange genug ausgesetzt, um das Signal von der niedrigen Bcl-2 mit dem Ausdruck Zelllinien zu erfassen (> 1 s) machte es schwierig, im dynamischen Bereich für die hohe Bcl-2 mit dem Ausdruck Zelllinien zu bleiben. In einem Versuch, die schwache Bänder produziert von Zelllinien wie HeLa und Raji quantifizieren, mehrere unterschiedliche Belichtungszeiten, von 0,1 s, 5 s, wurden gefangen genommen, um die längste Belichtungszeit zu ermitteln, die verwendet werden könnten, während die übrigen in den Dynamikbereich für Zellen wie Granta -519 (siehe Abbildung 6). Die Natur dieser Immunoblotting Technik begrenzt die Genauigkeit der Signalerkennung als ein Ansätze Rauschen, was darauf hindeutet, dass es optimal verwendet wird, um Proteine auf mittleren bis hohen Ausdruck Ebenen zu quantifizieren.
Abbildung 1 : Protokoll Workflow Diagramm. Immunfluoreszenz (IF) auf eine Zelle Zeile Tissue Microarray (TMA) lief parallel zur quantitativen Immunoblotting (IB) die gleichen Zell-Linien. Pearson-Korrelation, die quantitative Fähigkeit des IF-Protokolls zu validieren werden Signale aus jeder Zelle Zeile miteinander verglichen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Erprobung und Optimierung von Immunfluoreszenz (IF) Protokoll. Abschnitte der Tonsillen wurden mit verschiedenen Verdünnungen von Anti-Bcl-2-Antikörper (01:50, 1: 100 und keine Primärantikörper) inkubiert. Die Folien wurden mit HRP-konjugierten Sekundärantikörper inkubiert, das Signal wurde verstärkt mit einem Tyramide-Cy5-Konjugat und Folien wurden mit DAPI gefärbt. Die Dias gescannt wurden bei 20 X Vergrößerung mit Filter setzt angebracht, die maximale Anregung/Emission Gipfel der 350/470 nm und 649/666 nm für DAPI und Cy5, beziehungsweise. Jeweiligen Belichtungszeiten waren 160 ms und 200 Ms. das Sichtfeld wird mittig über der gleichen lymphoide Follikel, das Bcl-2 werden voraussichtlich in der (zentralen) germinal Mitte negativ und positiv in der Mantelzone (periphere). Die 01:50 gab Verdünnung ein stärkeres spezifische Fluoreszenzsignal ohne eine Erhöhung der unspezifischen Signals diente es daher als die Verdünnung geht nach vorn. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Immunfluoreszenz (IF) Zelle Zeile Gewebeschnitte Microarray (TMA) mit. Abschnitte der Zelllinie TMA aufgenommen wurden und mit einer 01:50 inkubiert Verdünnung von Anti-Bcl-2 oder mit keine primären Antikörper. Die Folien wurden mit Sekundärantikörper inkubiert, das Signal wurde verstärkt mit einem Tyramide-Cy5-Konjugat und Folien wurden mit DAPI gefärbt. Die Dias gescannt wurden bei 20 X Vergrößerung mit Filter setzt angebracht, die maximale Anregung/Emission Gipfel der 350/470 nm und 649/666 nm für DAPI und Cy5, beziehungsweise. Jeweiligen Belichtungszeiten waren 250 ms und 625 Frau diese repräsentative Bilder zeigen, dass Flecken erfolgreich war, und gibt es ein Reihe von Bcl-2-Ausdruck über die Zell-Linien. "Keine Bcl-2-Antikörper" Negativkontrolle Folie hat keines Signal Cy5 nachgewiesen, wie erwartet. Das repräsentative Bild ist aus der 697 Zelllinie. Ein Kern der hyperplastische Tonsillen Gewebe enthalten auf der TMA zeigt eine entsprechende Muster in Abbildung 2gezeigt. Der mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für jede Zelllinie wurde durch Quantifizierung der Cy5 Fluoreszenzsignal mit Bildanalyse-Software bestimmt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Bestimmung den linearen Dynamikbereich der Immunoblot (IB) Signale. (A) IBs von Verdünnungsreihen Granta-519 lysate. Jeder Fleck war für eine Vielzahl von Zeiten den linearen Dynamikbereich finden ausgesetzt. (B) Band Intensität für Bcl-2 (oben) und GAPDH (unten) im Vergleich zu Höhe der Gesamt-Protein für IB (a) geladen. Band-Intensitäten wurden mit der Bildanalyse-Software ImageJ quantifiziert. Bcl-2 (oben), blieb die Signale über den gesamten Bereich der Band Intensitäten bei einer niedrigen Belichtungszeit (EXP) linear (0,2 s) wurde verwendet (Intensität von 0-7.200) wie von einem Pearson-Korrelationskoeffizient (R-Wert) unterstützt von 0.994 (p < 0,001), aber nicht für größere Belichtungszeiten von 1 s und 2 min. GAPDH (unten), blieb die Daten linear über eine Intensität von 3000 (willkürliche Einheiten) für Low (0,2 s) und Medium (2,2 s) Belichtungszeiten als von Pearsons R-Werte von 0.994 (p < 0,001) und 0.992 (p < 0,001), bzw. unterstützt, aber nicht für eine hohe Belichtung Zeit () 7 s). Pfeile auf der rechten Seite zeigen die Intensität der Band für die spezifische Zell-Linie aus dem Immunoblot in Abbildung 5Aidentifiziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Quantitative Immunoblotting (IB) der immortalisierte Zelllinien und Vergleich mit Immunfluoreszenz (IF). (A) IB alle Zell-Linien. 12 µg Gesamt-Protein wurde in jedes gut geladen. (B) IB und wenn signal Intensitäten für jede Zelllinie. Das IB-Signal ist das Verhältnis von Bcl-2:GAPDH Band Intensität vom Fleck in (A) wie von ImageJ quantifiziert. Das ZF-Signal ist der Fluoreszenzintensität von jeder Linie Zellkern auf die TMA (Abbildung 3), wie durch die Bildanalyse bestimmt. (C) Streudiagramm wenn Signal gegenüber IB-Signal. Jeder Datenpunkt repräsentiert eine bestimmten Zell-Linie. Die beiden Methoden zu Ergebnissen linear korreliert mit dem Pearson-R-Wert von 0.984 (p < 0,001). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Die optimale Belichtungszeit finden für quantitative Immunoblotting (IB). IB von allen Zelllinien wird angezeigt. In jede Vertiefung wurden zwölf Mikrogramm Protein geladen. Für jedes IB dienten verschiedene Belichtungszeiten zum Erfassen eines Abbilds wo alle Bänder innerhalb der linearen dynamischen Bereich blieb. Die Belichtungszeiten der Bcl-2 und GAPDH Streifen waren beziehungsweise: (A) 0,1 s und 0,1 s, (B) 1 s und 0,2 s und (C) 5 s und 5 S. Platten A und C zeigen Beispiele von Aufnahmen wo zumindest einige der Bands auf der Blot waren zu schwach oder zu stark, beziehungsweise. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Wir haben eine Methode beschrieben, dass der quantitativen Immunoblotting (IB) nutzt, um das Dienstprogramm Immunfluoreszenz (IF) zeigen für die Ermittlung der relativen Fülle an ein Zielprotein in FFPE Gewebeproben. Aktuelle Protein Quantifizierungsmethoden beschränken sich naturgemäß kategorische, z. B. chromogenen IHC2,3, oder durch die Notwendigkeit, Proben, Untersuchung der Beispielbeständen Struktur und Zelle zu verhindern, wie z. B. Homogenisieren mit IB und Massenspektrometrie8,9,10,11. Quantitative IF kann diese Grenzen zu überschreiten, wenn die Methode validiert und sorgfältig angewendet. Vergleicht man die IF-anzeigen zur quantitativen iIF immortalisierte Zelllinien, konnten wir die semi-quantitativer Natur des IF-Ansatzes zu validieren.
Primäre Gewebeproben von Patienten oder Versuchstiere sind heterogen, weil sie mehrere Zelltypen enthalten. Die Anwendung von mehreren primären Antikörper in Multiplex-wenn erlaubt die Quantifizierung von ein oder mehrere Proteine des Interesses an bestimmten Zelltypen oder Zelle Fächer4,13. Die Optimierung und Anwendung von multiplex IF sprengt den Rahmen dieses Artikels aber ist in die folgenden Papiere16,17,18,29beschrieben. Die breitere Philosophie soll Label Zellpopulationen und nur das Protein des Interesses in die gewünschte Zelle Fach, z. B. Kerne oder Zytoplasma, in die gewünschte Zelle Art zu quantifizieren. Sobald die quantitative Art if mit einem speziellen Antikörper durch quantitative IB überprüft worden ist, kann das Protokoll handwerklich werden, um schnelle, Hochdurchsatz-Protein Quantifizierung in klinischen Proben zu ermöglichen. Klinische Anwendungen erfordern in der Regel die Bestimmung der relativen, sondern als absolute, Protein Fülle. Jedoch kann das IF-Konzept formal quantitative bei Bedarf erfolgen. Beispielsweise eine Lösung mit gereinigtem rekombinanten Proteins Bcl-2 vorbereitet werden konnte und mit einer standard biochemische Methode quantifiziert. Verdünnungsreihen konnte dann durch quantitative IB ausgewertet werden und eine Standardkurve generiert, um den absolute Proteingehalt pro Zelle in jede Zelllinie zu schätzen.
TMA-Abschnitte, die Biopsie Proben aus 66 Fälle von de Novo diffuse große B-Zell-Lymphom haben wir unsere IF-Protokoll angewendet. Unsere Ergebnisse zeigten akzeptabel Reproduzierbarkeit von Ausführung zu Ausführung (Pearson R = 0.837) und die erwartete, starke Assoziation zwischen "Bcl-2-positiv" Status bestimmt subjektiv durch visuelle Bewertung der konventionellen IHC und erhöhte Expression bestimmt Objektiv von IF (p < 0,001). Darüber hinaus Bcl-2 Fülle von IF korreliert mit Bcl-2 mRNA Fülle in den gleichen Proben (Spearman ρ = 0,69, p < 0,001) und in Fällen mit Nummer Gewinne Kopie des Gens BCL2 deutlich größer war (p = 0,042) oder Translokation BCL2 zu den IGH -Locus (p = 0,004), wie durch Fluoreszenz in Situ Hybridisierung bestimmt. Wir erhalten gleichwertige Ergebnisse in einer separaten Gruppe von Fällen. Diese Ergebnisse liefern weiteren Beweise, der dass wenn als eine gültige Methode zur Bestimmung der relativen Fülle von Bcl-2 in Routine FFPE-Proben unterstützt. Die Verwendung von IF, mehrere andere Biomarker-Proteine in Einzelproben zu quantifizieren wurde zuvor beschriebenen16,17.
Optimierung dieses Protokolls ist ein zwei-Fach-Prozess. Erstens, wenn mit primären Antikörper verwendet muss optimiert werden (Schritt 2.1). Kommerzielle Antikörper häufig vorschlagen Verdünnungen für IHC-Protokolle, die als Ausgangspunkt zusammen mit einer Verdünnung oder zwei oben und unten das verwendet werden soll (d.h., wenn 1: 100 empfohlen, addieren 01:50 und 1: 150). Nach Durchführung der IF und das Dia scannen, Bestimmung, welche Verdünnung "optimal" ist mit sich bringt Sichtprüfung die Primärantikörper Verdünnung zu identifizieren, die die hellsten Signal erzeugt, ohne Hintergrundfluoreszenz zu erhöhen. Die zweite Stufe der Optimierung ist die Menge an Protein zu laden für den Immunoblot um sicherzustellen, dass jedes Band im linearen Bereich (Schritt 3.4) bleibt die Wahl. Um dies zu gewährleisten, erfolgt ein Immunoblot über eine serielle Verdünnung der Zelllinie, die der größte Reichtum des Zielproteins ausdrückt. Von hier aus kann die Band Intensitäten im Vergleich zu Eiweiß Menge geplottet werden, um die Intensitätsbereiche festzustellen, wodurch das Signal linear bleibt. Da dieser Bereich in die Zell-Linie mit den am häufigsten vorkommenden Zielprotein hergestellt wird, werden alle anderen Zelllinien für eine gegebene Menge an Protein niedriger Signale ergeben. Beim Umstieg auf ein Immunoblot alle Zell-Linien (Schritt 3.4) dient der Verdünnungsreihe, viel Protein zu laden, die starke Signale erbringt, ohne dass die Gefahr der Überbelichtung außerhalb des linearen Bereichs zu informieren.
Trotz der Vorteile dieses Protokolls hat die Verwendung von Immunoblotting als eine Quantifizierung Überprüfungsmethode seine Mängel. Das primäre Anliegen dreht sich um die große Bandbreite des Ausdrucks für verschiedene Proteine zwischen Proben. Es kann schwierig sein, alle Proben im Rahmen einer linearen Bereich halten, wenn einige Proben des Proteins des Interesses in viel stärkerem Maße als andere zum Ausdruck bringen. In die repräsentativen Ergebnisse oben gezeigt wurden unterschiedliche Belichtungen gefangen genommen, um ein Bild zu bekommen, wo sind die extreme (hoch und niedrig) sowohl innerhalb der linearen Dynamikbereich (Abbildung 6). Desto größer als erwartet, wenn Signale für die HeLa und Jurkat Zellen in Abbildung 5 b gesehen könnte entweder das niedrigste mögliche ZF-Signal für dieses System, oder, das der IB signalisiert der Unterseite der linearen Nachweisgrenze erreicht haben und sind weniger genau. In beiden Fällen bedeutet dies, dass wenn Werte in diesem Bereich weniger wahrscheinlich sind, genau in diesem System zu sein, und die Technik optimal für Medium-hoch-zum Ausdruck gebracht, Proteine ist. Darüber hinaus ist die Verwendung von HRP-konjugierten Sekundärantikörper nicht optimal quantitativen Zwecken, wie bereits erwähnt in Bezug auf IHC2,3. Mit Gewebekulturen tagged Sekundärantikörper für die Immunoblot würde eine robustere Bestätigung vorsehen, dass die IF ist in der Tat linear quantitative30,31, jedoch der Pearson-R-Wert von 0.984 unter Verwendung der HRP-konjugierten sekundäre Antikörper im obigen Protokoll wurde für die aktuellen Zwecke ausreichend. Mögliche Schwachstellen zugeordnet wird, wie z. B. Autofluoreszenz und abschrecken variieren basierend auf einzelnen Labor Instrumentierung, Praktiken und Gewebetyp und können durch verschiedene vorbeugende Maßnahmen32,33minimiert werden. Eine sehr kleine Menge der Autofluoreszenz in die repräsentativen Ergebnisse in keine Bcl-2-Antikörper-Beispiel in Abbildung 3zu sehen, aber dieser Betrag im Vergleich zu den restlichen IF trivial ist signalisiert.
Die Notwendigkeit, die Proteine des Interesses aus FFPE Gewebeproben exakt quantifizieren bezieht sich auf klinische und wissenschaftliche Zwecke über viele biologische Felder. Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt die Nutzung von quantitativen IF FFPE Gewebe Abschnitte und seine semi-quantitativer Natur durch Immunoblotting immortalisierte Zelllinien überprüft. Diese Methode ermöglicht Quantifizierung über einen breiten dynamischen Bereich, sowie die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität der Gewebeprobe, die nicht in vielen anderen Quantifizierung Methoden3,8,11erhalten ist. Darüber hinaus ist dieses Protokoll ist leicht anpassbar und kann angewendet werden, in der Forschung und klinischen Einrichtungen, vor allem für Krebsforschung und Prognose.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch Fredrick Banting und Charles Best Kanada Graduate Stipendium (Uhr) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | - | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | - | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | - | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | - | For densitometry analysis |
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