Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

एक मानक के रूप में सेल लाइनों की मात्रात्मक Immunoblotting नियमित ऊतक नमूनों में इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए अचिह्नित प्रोटीन को प्रमाणित करने के लिए

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58735
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,2
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Division of Cancer Biology and Genetics, Queen's Cancer Research Institute, 3Queen's Laboratory for Molecular Pathology, Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University

Summary

हम मात्रात्मक immunoblotting के उपयोग का वर्णन करने के लिए formalin में ब्याज की एक प्रोटीन को बढ़ाता है के रूप में छवि विश्लेषण के साथ युग्मित इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल मांय-फिक्स्ड, आयल-एंबेडेड (FFPE) ऊतक के नमूने । हमारे परिणाम इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल की उपयोगिता नियमित बायोप्सी नमूनों में विमार्कर प्रोटीन के सापेक्ष मात्रा का पता लगाने के लिए प्रदर्शन करते हैं ।

Abstract

formalin-फिक्स्ड, आयल-एंबेडेड (FFPE) ऊतक नमूनों में रुचि के प्रोटीन की ठहराव नैदानिक और अनुसंधान अनुप्रयोगों में महत्वपूर्ण है । ठहराव का एक इष्टतम विधि सटीक है, एक व्यापक रैखिक गतिशील रेंज है और अलग-अलग सेल प्रकार की पहचान के लिए अनुमति देने के लिए नमूने की संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखता है । ऐसे immunohistochemistry (आइएचसी), मास स्पेक्ट्रोमेट्री, और immunoblotting के रूप में मौजूदा तरीकों को अपने स्पष्ट प्रकृति या नमूना homogenize की जरूरत के कारण इन शर्तों को पूरा करने में विफल । एक वैकल्पिक विधि के रूप में, हम इम्यूनोफ्लोरेसेंस के उपयोग का प्रस्ताव (IF) और छवि विश्लेषण के लिए FFPE ऊतकों में ब्याज की एक प्रोटीन के सापेक्ष बहुतायत निर्धारित करते हैं । इस के साथ साथ हम प्रदर्शन है कि इस विधि को आसानी से अनुकूलित है, एक व्यापक गतिशील रेंज पैदावार, और रैखिकता quantifiable है के रूप में मात्रात्मक immunoblotting के सोने के मानक की तुलना में । इसके अलावा, इस विधि नमूने के संरचनात्मक अखंडता के रखरखाव परमिट और विभिंन प्रकार के सेल के भेद के लिए अनुमति देता है, जो नैदानिक अनुप्रयोगों में महत्वपूर्ण हो सकता है । कुल मिलाकर, यह FFPE नमूनों में प्रोटीन के सापेक्ष ठहराव के लिए एक मजबूत तरीका है और आसानी से नैदानिक या अनुसंधान की जरूरत के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

formalin-फिक्स्ड, आयल-एंबेडेड (FFPE) ऊतक बायोप्सी के नमूनों में प्रोटीन यों को बढ़ाता है कई नैदानिक क्षेत्रों में मौजूद है । उदाहरण के लिए, नियमित बायोप्सी नमूनों में ठहराव के लिए एक मार्की प्रोटीन का पूर्वानुमान स्पष्ट और कैंसर के रोगियों के लिए उपचार को सूचित करने के लिए प्रयोग किया जाता है1. हालांकि, वर्तमान विधियाँ व्यक्तिपरक और कमी सत्यापन सामांयतया हैं ।

Immunohistochemistry (आइएचसी) विकृति प्रयोगशालाओं में नियमित रूप से प्रयोग किया जाता है और आम तौर पर एक प्राथमिक लक्ष्य प्रोटीन और संयुग्मित एंजाइमी2जैसे सहिजन लेबल के साथ एक माध्यमिक एंटीबॉडी peroxidase पर निर्देशित एंटीबॉडी पर निर्भर करता है । पारंपरिक आइएचसी संवेदनशील है, मिनट के नमूनों का उपयोग कर सकते है और ऊतक नमूनों की रूपात्मक अखंडता को बरकरार रखता है जिससे इसके प्रासंगिक ऊतकवैज्ञानिक संदर्भ में प्रोटीन अभिव्यक्ति के आकलन की अनुमति । हालांकि, क्योंकि आइएचसी द्वारा उत्पंन chromogenic संकेत बाधक है, यह एक अपेक्षाकृत संकीर्ण गतिशील रेंज से ग्रस्त है और मल्टीप्लेक्स2,3,4के लिए सीमित क्षमता प्रदान करता है । मैट्रिक्स असिस्टेड लेजर desorption/ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग (मालदी-MSI) रूपात्मक अखंडता को बरकरार रखता है । हालांकि, इस विकासशील प्रौद्योगिकी मामूली रूपात्मक संकल्प के साथ जुड़ा हुआ है और महत्वपूर्ण अंशांकन और सामान्यीकरण की आवश्यकता है, नियमित नैदानिक उपयोग के लिए अपनी व्यवहार्यता बिगड़ना5,6,7. वैकल्पिक तकनीक ऊतक नमूनों में प्रोटीन यों तो immunoblotting8, मास स्पेक्ट्रोमेट्री9,10,11, और एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा)12शामिल हैं, प्रत्येक जो की एक नमूना ऊतक के homogenized lysate के साथ शुरू होता है । प्राथमिक ऊतक के नमूनों में विषम है कि वे कोशिका प्रकार के एक भीड़ शामिल हैं । इसलिए, तकनीकों कि नमूनों अनुमन्य करने की अनुमति नहीं है एक प्रोटीन के ठहराव के एक विशेष सेल में कैंसर की कोशिकाओं के रूप में ब्याज की आबादी ।

आइएचसी की तरह, अगर छोटे FFPE नमूनों के लिए लागू है और ऊतकवैज्ञानिक अखंडता13के प्रतिधारण परमिट । हालांकि, प्रतिदीप्ति संकेतों के additive प्रकृति के लिए धंयवाद, यदि कई प्राथमिक एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट लेबल के आवेदन के लिए उत्तरदाई है । इस प्रकार, ब्याज की एक प्रोटीन विशिष्ट कोशिकाओं या सेलुलर डिब्बों के भीतर अपेक्षाकृत quantified हो सकता है (उदाहरण के लिए, नाभिक बनाम कोशिका द्रव्य) अंय एंटीबॉडी का उपयोग कर परिभाषित । प्रतिदीप्ति संकेतों को भी एक बड़ा गतिशील रेंज13,14का लाभ है । यदि FFPE नमूनों पर लागू की गई श्रेष्ठता, reproducibility और division क्षमता का प्रदर्शन13,14,15को किया गया है ।

इस के साथ साथ हम मात्रात्मक immunoblotting के प्रयोग का वर्णन एक सोने के मानक के रूप में स्थापित सेल लाइनों का उपयोग करने के लिए यदि कंप्यूटर के साथ युग्मित की मात्रात्मक प्रकृति का पता लगाने में ब्याज की एक प्रोटीन के सापेक्ष बहुतायत निर्धारण में छवि विश्लेषण की सहायता FFPE ऊतक नमूनों से ऊतकवैज्ञानिक वर्गों । हम एक मल्टीप्लेक्स दृष्टिकोण में इस पद्धति को सफलतापूर्वक लागू किया है नैदानिक बायोप्सी नमूने16,17,18में मार्कर प्रोटीन यों तो ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

प्राथमिक मानव ऊतक नमूनों का उपयोग करने के लिए स्वीकृति महारानी विश्वविद्यालय में स्वास्थ्य विज्ञान और संबद्ध शिक्षण अस्पतालों अनुसंधान नैतिकता बोर्ड (HSREB) से प्राप्त किया गया था ।

1. निर्माण एक सेल लाइन ऊतक Microarray (TMA)

  1. फसल और धोने कोशिकाओं ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल विभिंन स्थापित अमर सेल लाइनों (जैसे हेला, Jurkat, RCH-ACV) पर परीक्षण किया गया है ।
    1. अनुयाई कोशिकाओं के लिए, फसल लगभग १.३ x 107 कोशिकाओं को एक बार वे लगभग ८०% प्रवाह तक पहुंचने । उस कक्ष पंक्ति के लिए उपयुक्त एक रिएजेंट का उपयोग करके कक्षों को अलग ।
      नोट: Ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) आम तौर पर पसंद है trypsin पर अपमानजनक सतह प्रोटीन के जोखिम को कम करने के लिए । यदि trypsin का उपयोग कर, trypsin भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) का उपयोग कर तुरंत कोशिकाओं कटाई के बाद बेअसर ।
    2. निलंबन कोशिकाओं के लिए, फसल लगभग 8 x 107 कोशिकाओं में प्रवेश के विकास के चरण ।
    3. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में २२५ x g पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा काटा/अलग कोशिकाओं को इकट्ठा ।
    4. supernatant और पुनः खिचड़ी भाषा 1x फॉस्फेट के 10 मिलीलीटर-खारा (पंजाब) में गोली निलंबित । २२५ x जी में 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक और supernatant खिचड़ी भाषा ।
      नोट: 1x पंजाबियों १३७ मिमी NaCl, २.७ मिमी KCl, 10 मिमी न2HPO4, १.८ मिमी KH2पीओ4 आसुत जल में से बना है; ७.४ के लिए पीएच समायोजित करें ।
  2. formalin में कोशिकाओं को ठीक करें और उन्हें गोली ।
    1. 10% तटस्थ बफर formalin (NBF) के 10 मिलीलीटर में शंकु ट्यूब के भीतर सेल गोली निलंबित ।
      नोट: NBF 1x पंजाब के 9 मिलीलीटर में ३७% formaldehyde शेयर सॉल्यूशन के कमजोर 1 मिलीलीटर द्वारा तैयार किया जा सकता है ।
      चेतावनी: formalin और formaldehyde संभाल जब सावधानी का प्रयोग करें । formalin और formaldehyde से जुड़े कदमों के लिए एक धुएं डाकू का प्रयोग करें ।
    2. रात के तापमान (लगभग 17 घंटे) में 24 rpm पर एक झूली कुरसी पर कोशिकाओं को गर्मी ।
    3. पंजाब में कम पिघलने बिंदु agarose का 1% समाधान तैयार करें (०.०१ ग्राम प्रति 1 मिलीलीटर पंजाबियों के agarose) ।
      1. सेल लाइन नमूना प्रति agarose समाधान के ५०० µ l के लिए पर्याप्त तैयार करें ।
      2. एक ८० ° c जल स्नान या गर्मी ब्लॉक में agarose भंग, सामयिक मिश्रण के साथ 2-5 मिनट के लिए । एक बार भंग, एक ३७ ° c पानी स्नान या गर्मी ब्लॉक में समाधान रखने के लिए सख्त को रोकने के ।
    4. गोली से 1.2.2 कदम से तय की कोशिकाओं 5 मिनट के लिए २२५ एक्स जी पर केंद्रापसारक द्वारा supernatant निकालें और ५०० µ में कोशिकाओं resuspend 1x पंजाबियों के एल ।
    5. एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब और गोली में २९० एक्स जी महाप्राण बंद supernatant के सभी पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं स्थानांतरण ।
  3. agarose में कास्ट सेल ।
    1. जोड़ें ~ ५०० µ एल 1% agarose समाधान (से कदम 1.2.3) कोशिकाओं से युक्त प्रत्येक ट्यूब के लिए । धीरे, लेकिन जल्दी, पिपेट मिश्रण ऊपर और एक पी १००० micropipette मिश्रण का उपयोग कर नीचे ।
      नोट: एपर्चर विस्तार और बुलबुले बनाने से बचने के लिए पिपेट टिप के अंत में कटौती । ३७ ° c पानी स्नान में काम agarose समाधान रखने के लिए सख्त को रोकने के ।
    2. कमरे के तापमान पर कठोर (5-10 मिनट) के लिए agarose-सेल समाधान की अनुमति दें । एक नमूना युक्त प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब के लिए 10% NBF की 1 मिलीलीटर जोड़ें और तेल embedding (अप करने के लिए 24 घंटे) तक कमरे के तापमान पर रखें ।
  4. आयल embedding के लिए agarose प्लग तैयार करें ।
    1. महाप्राण से NBF के नमूने लिए ।
    2. microcentrifuge ट्यूब कटौती करने के लिए एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर सेल प्लग निकालें, प्लास्टिक ऊतक कैसेट में प्लग जगह है । कमरे के तापमान पर 10% NBF में स्टोर कैसेट ।
  5. नमूने प्रक्रिया रातोंरात या तो मैंयुअल रूप से या एक स्वचालित ऊतक प्रोसेसर का उपयोग कर, और आयल मोम में एंबेड मानक प्रोटोकॉल तरीकों का उपयोग कर ।
    नोट: फिशर एट अलदेखें । 19 एक उदाहरण के लिए प्रोटोकॉल ।
  6. एक विशेष "ऊतक सरणी" साधन का उपयोग करना, प्रत्येक सेल लाइन से आयल ब्लॉक से ०.६ मिमी कोर फसल और उंहें डालने, पंक्तियों में, एक खाली प्राप्तकर्ता तेल ब्लॉक में क्रम में एक सेल लाइन TMA बनाने के लिए ।
    नोट: मानक तरीकों ऐसे Fedor और De Marzo20में वर्णित के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
  7. TMA में सकारात्मक या नकारात्मक नियंत्रण के रूप में 2-3 अतिरिक्त ऊतक प्रकार (जैसे, tonsil, बृहदांत्र, testes, आदि) का प्रतिनिधित्व प्राथमिक नमूनों से कोर शामिल । ऊतकों कि ब्याज की प्रोटीन के लिए उपयुक्त है चुनें ।
  8. दो ऊतकवैज्ञानिक सेक्शन तैयार करने के लिए एक microtome का प्रयोग करें, लगभग 4 से 6 µm मोटी, सेल लाइन TMA की । एक प्रोटोकॉल स्लाइड पर खंड माउंट, यह शुष्क, और deparaffinize (के रूप में वर्णित Fedor और De Marzo20) ।

2. नमूना इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा दाग

  1. प्राथमिक एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने का अनुकूलन ।
    नोट: मानक प्रोटोकॉल आइएचसी के अनुकूलन के लिए मौजूद है या यदि FFPE ऊतक वर्गों के लिए ऐसे Kajimura एट अल में के रूप में । 21. दृष्टिकोण का एक संक्षिप्त सिंहावलोकन यहां उल्लिखित है ।
    1. निर्माता के निर्देश द्वारा निर्देशित ब्याज की प्रोटीन के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के 4-5 कमजोर पड़ने की तैयारी करें ।
    2. एक पशु या मानव स्रोत है कि आकृति विज्ञान पहचानने योग्य कोशिका आबादी में रुचि के प्रोटीन व्यक्त से एक नियंत्रण ऊतक प्रकार की पहचान । ऊतक के वर्गों को तैयार करें और मानक immunohistochemistry प्रक्रिया जैसे Fedor और De Marzo20में निम्न स्लाइड पर उन्हें माउंट ।
      नोट: आवश्यक वर्गों की संख्या प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के अलावा एक अतिरिक्त की संख्या है ।
    3. immunohistology के लिए एक स्वचालित या मैनुअल प्रणाली का उपयोग करना, चरण 2.1.1 से कदम 2.1.2 से एक स्लाइड पर प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने का परीक्षण. अतिरिक्त स्लाइड से प्राथमिक एंटीबॉडी के अनुप्रयोग छोड़ें और इसे एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करें ।
    4. धुंधला प्रक्रिया के दौरान, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) एक परमाणु counterstain और एक फ्लोरोसेंट टैग माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में के साथ सभी स्लाइड दाग । यदि अधिक संवेदनशीलता की आवश्यकता है, एक एचआरपी (सहिजन peroxidase) का उपयोग करें-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी और tyramide-आधारित सिग्नल प्रवर्धन प्रणाली (देखें स्टैक एट अल । 13).
      नोट: जब मल्टीप्लेक्स प्राथमिक एंटीबॉडी, एक अलग फ्लोरोसेंट लेबल प्रत्येक प्रोटीन के लिए प्रयोग किया जाता है ।
    5. उपयोग किए गए fluorophores के लिए उपयुक्त उत्तेजना और खोज तरंग दैर्ध्य का उपयोग कर एक डिजिटल छवि फ़ाइल जनरेट करने में सक्षम एक उपयुक्त साधन का उपयोग करते हुए immunostained स्लाइड स्कैन करें ।
    6. डिजिटल छवियों को देखने के लिए उपयुक्त सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें और empirically प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने कि पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के सापेक्ष संकेत तीव्रता का अनुकूलन का चयन.
      नोट: यदि वांछित, इस अनुकूलन एक एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी, 3, 3 '-diaminobenzidine (ढाब) और brightfield माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए हो सकता है ।
  2. यदि सेल लाइन TMA पर दाग प्रदर्शन ।
    1. immunohistology के लिए एक स्वचालित या मैनुअल प्रणाली का प्रयोग करें अनुकूलित प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के साथ सेल लाइन TMA की एक स्लाइड दाग (के रूप में २.१ कदम में निर्धारित) । दूसरी स्लाइड से प्राथमिक एंटीबॉडी के अनुप्रयोग को छोड़ दें और इसे एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करें ।
    2. धुंधला होने की प्रक्रिया के दौरान, एक परमाणु counterstain के रूप में 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के साथ सभी स्लाइड दाग, और एक माध्यमिक एंटीबॉडी और tyramide के रूप में कदम 2.1.4 के साथ ।
    3. उपयोग किए गए fluorophores के लिए उपयुक्त उत्तेजना और खोज तरंग दैर्ध्य का उपयोग कर एक डिजिटल छवि फ़ाइल जनरेट करने में सक्षम एक उपयुक्त साधन का उपयोग करते हुए immunostained स्लाइड स्कैन करें ।
    4. एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करने के लिए ब्याज की सेलुलर डिब्बे की पहचान (यानी, कोशिका द्रव्य बनाम नाभिक) और प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) यों तो ।
      नोट: विभिंन सॉफ्टवेयर संकुल इस प्रयोजन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और कई स्टैक एट अल में चर्चा कर रहे हैं । 13.

3. सेल लाइनों की मात्रात्मक Immunoblotting

  1. कक्षों की lysates तैयार करें.
    1. फसल २,०००,००० प्रत्येक कोशिका लाइन के कोशिकाओं, के रूप में 1.1.3 के लिए 1.1.1 चरणों में वर्णित है ।
    2. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में ६५० x जी में 5 मिनट के लिए नीचे स्पिन कोशिकाओं । supernatant को नहीं ।
    3. आइस-कोल्ड पंजाबियों की 10 मिलीलीटर वाली कोशिकाओं को धो लें । बर्फ ठंडा पंजाबियों के 1 मिलीलीटर में resuspend और एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण । 3.1.2 कदम के रूप में, खिचड़ी भाषा, और बर्फ पर कोशिकाओं को छोड़ के रूप में केंद्रापसारक ।
    4. के बारे में २०० µ l के बारे में जोड़ें शीत radioimmunoprecipitation (RIPA) lysis बफर के साथ चिढ़ाना अवरोधकों (µ 100X बफर की एमएल प्रति RIPA अवरोधकों के 10 lysis एल) के लिए कोशिकाओं, भंवर और बर्फ पर गर्मी के लिए 15 मिनट ।
      नोट: प्रभावी lysis के लिए आवश्यक lysis बफ़र की मात्रा सेल लाइन से भिन्न होता है और empirically निर्धारित किया जा सकता है । RIPA बफर १५० मिमी NaCl, 5 मिमी EDTA, ५० मिमी Tris, १.०% NP-४०, ०.५% सोडियम deoxycholate, ०.१% एसडीएस आसुत जल में से बना है ।
    5. immunoblots पर अपेक्षाकृत भी लोड हो रहा है सुनिश्चित करने के लिए, प्रत्येक lysate से एक 20 µ एल नमूना में कुल प्रोटीन यों तो ब्रैडफोर्ड परख के रूप में एक उचित विधि का उपयोग कर । के बारे में ४० µ एल जोड़ें 6X Laemmli lysis बफर के शेष (लगभग १८० µ एल) प्रत्येक कोशिका lysate के लिए और एक गर्मी ब्लॉक या जल स्नान में १०० ° c पर फोड़ा 5 मिनट के लिए ।
      नोट: 6X Laemmli बफर ३०० मिमी Tris-एचसीएल (पीएच ६.८), 4% (डब्ल्यू/वी) एसडीएस, ६०% ग्लिसरॉल, ०.६% (डब्ल्यू/वी) bromophenol ब्लू, ५० मिमी dithiothreitol (डीटीटी) आसुत जल में से बना है ।
    6. दो सप्ताह के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान ।
  2. जो सेल लाइन ब्याज की सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन है यह निर्धारित करने के लिए सभी कक्ष लाइनों के एक immunoblot प्रदर्शन ।
    नोट: महमूद, टी और यांग, पीसी में वर्णित प्रक्रिया का पालन करें । 22, निंनलिखित संशोधनों के साथ ।
    1. Aliquot सेल lysate (३.१ कदम में तैयार) 10-50 µ ग्राम प्रोटीन युक्त (ब्याज की प्रोटीन की बहुतायत पर निर्भर करता है) microcentrifuge ट्यूबों में । 6X Laemmli बफर के २.५ µ l को जोड़ें और वॉल्यूम को 15 lysis l तक बनाने के लिए पर्याप् त RIPA µ बफर
    2. लोड एक 5% स्टैकिंग और एक उपयुक्त एकाग्रता हल (उदा, 15-100 केडीए के बीच प्रोटीन के लिए 10%) एसडीएस एक प्रोटीन सीढ़ी और कदम 3.2.1 से नमूनों के साथ पृष्ठ जेल । खाली कुओं में 1x Laemmli बफर लोड । उपयुक्त सेटिंग्स पर बिजली की आपूर्ति चलाने के लिए, आमतौर पर १२५ V, ८० मिनट के लिए या जब तक bromophenol नीले रंग थाली के नीचे पहुंचता है ।
    3. Wiedemann एट अल में वर्णित के रूप में एक अर्द्ध शुष्क प्रोटीन हस्तांतरण करते हैं । 23.
      नोट: प्रतिनिधि परिणामों के लिए, एक nitrocellulose झिल्ली (जो मेथनॉल में लथपथ होने की जरूरत नहीं है), और कोल्ड Bjerrum शेफर-नीलसन (BSN) हस्तांतरण बफर इस्तेमाल किया गया । BSN बफर ४८ मिमी Tris, ३९ मिमी glycine, आसुत जल में 20% मेथनॉल से बना है ।
    4. स्थानांतरण के बाद, एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग करने के लिए क्षैतिज झिल्ली में कटौती करने के लिए एक उपयुक्त आंतरिक नियंत्रण प्रोटीन, जैसे GAPDH से ब्याज की प्रोटीन युक्त भाग अलग ।
    5. ब्लॉकिंग और प्राथमिक एंटीबॉडी के निर्माता द्वारा अनुशंसित अवरुद्ध बफर का उपयोग कर एंटीबॉडी गर्मी के लिए आगे बढ़ें ।
      नोट: इष्टतम प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने नाटकीय रूप से प्रोटीन बहुतायत और संवेदनशीलता के आधार पर भिंन हो सकते हैं । नीचे प्रतिनिधि परिणाम के लिए, ब्याज की प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी एक 1:1000 कमजोर पड़ने की आवश्यकता है जबकि GAPDH नियंत्रण एक 1:40000 कमजोर पड़ने की आवश्यकता है । इस्तेमाल किया माध्यमिक एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने 1:3000 था ।
    6. एंटीबॉडी की गर्मी और झिल्ली की धुलाई के बाद, झिल्ली स्ट्रिप्स एक स्पष्ट प्लास्टिक म्यान में ऐसी सैंडविच बैग के रूप में जगह है ।
    7. निर्माता के निर्देशों का पालन enchanced chemiluminescence (ECL) मिश्रण तैयार करें । ECL मिश्रण के साथ झिल्ली को कवर करने के लिए एक पी-१००० पिपेट का प्रयोग करें, म्यान को बंद करें, और 1-2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में मिश्रण के साथ झिल्ली स्ट्रिप्स गर्मी ।
    8. झिल्ली म्यान को एक डिजिटल इमेजिंग मंच में रखें । झिल्ली के विभिन्न जोखिम पर कब्जा करने के लिए chemiluminescence और वर्णमिति मार्कर का पता लगाने का उपयोग करें ।
      नोट: एक्सपोजर बार प्रोटीन की मात्रा, लक्ष्य प्रोटीन की प्रचुरता, एंटीबॉडी संबध आदि के आधार पर भिंन हो जाएगा एक स्वत: जोखिम के साथ शुरू (आमतौर पर कुछ सेकंड), और परीक्षण के ऊपर और नीचे कुछ सेकंड की वृद्धि द्वारा जोखिम बार ।
    9. Empirically, या छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, निर्धारित कौन सा सेल लाइन सबसे लक्ष्य प्रोटीन व्यक्त करता है ।
  3. एक धारावाहिक कमजोर पड़ने का उपयोग कर प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी के रैखिक गतिशील रेंज का पता लगाएं ।
    1. कदम 3.2.1-3.2.8 लक्ष्य प्रोटीन की उच्चतम एकाग्रता व्यक्त करता है जो सेल लाइन से धारावाहिक कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला का उपयोग कर (चरण 3.2.9 में पहचान) प्रदर्शन करते हैं ।
    2. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें जैसे ImageJ प्रदर्शन छवियों पर densitometry करने के लिए ।
      1. उदाहरण के लिए, ImageJ का उपयोग करते हुए, का उपयोग करने के लिए जेल के पहले लेन का चयन करने के लिए आयताकार चयन उपकरण का प्रयोग करें । विश्लेषण करने के लिए जाओ । जैल । पहले लेन का चयन करें। अगले लेन करने के लिए परिणामी आयत पर ले जाने के लिए माउस का उपयोग करें । विश्लेषण करने के लिए जाओ । जैल । अगला लेन चुनें। बार अगले लेन के लिए आयत हटो और गलियों के शेष के लिए लेन का चयन करें ।
      2. विश्लेषण करने के लिए जाओ । जैल । प्लाट गलियाँ. पृष्ठभूमि शोर को दूर करने के लिए प्रत्येक चोटी के अड्डों भर लाइनों आकर्षित करने के लिए सीधी रेखा उपकरण का उपयोग करें । प्रत्येक चोटी का चयन करने के लिए छड़ी उपकरण का प्रयोग करें, और परिणाम खिड़की से, फिर से बैंड तीव्रता के रूप में संदर्भित, प्रत्येक चोटी के घनत्व इकट्ठा ।
    3. प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए लोड किए गए कुल प्रोटीन की मात्रा बनाम बैंड तीव्रता का scatterplot बनाने के लिए densitometry आउटपुट का उपयोग करें । सबसे अच्छा फिट और दृश्य निरीक्षण की एक पंक्ति का उपयोग करना, प्रत्येक एंटीबॉडी के रैखिक गतिशील रेंज के स्थान (तीव्रता रेंज) का निर्धारण ।
    4. एक प्रोटीन एकाग्रता है कि रैखिक सीमा के उच्च अंत पर एक मूल्य उत्पंन करने के लिए एकाग्रता सभी सेल लाइनों के साथ आगे बढ़ रहा है चुनें ।
      नोट: चूंकि यह एकाग्रता इस प्रोटीन की सबसे बड़ी राशि के साथ सेल लाइन में संतृप्ति के स्तर से नीचे है, वहां के अंय सेल लाइनों के लिए बैंड को उजागर पर कोई खतरा नहीं होना चाहिए ।
  4. सभी कक्ष रेखाओं के लिए चरण 3.3.4 में चुने गए प्रोटीन एकाग्रता का उपयोग करके एक immunoblot निष्पादित करें और चरण 3.2.1-3.2.8 दोहराएं ।
    1. densitometry में चरण 3.3.2 के रूप में डिजिटल स्कैन पर निष्पादित करें । जोखिम छवियां है कि प्रत्येक चरण 3.3.3 में पहचान एंटीबॉडी के लिए रैखिक पर्वतमाला के भीतर संकेत उपज चुनें ।
    2. 3.4.1 से आदर्श निवेश से बैंड तीव्रता संकेतों का उपयोग करना, प्रत्येक सेल लाइन के लिए नियंत्रण बैंड तीव्रता लोड करने के लिए लक्ष्य प्रोटीन बैंड तीव्रता के अनुपात की गणना । ये अनुपात मूल्य ब्याज की लक्ष्य प्रोटीन के सापेक्ष बहुतायत से संकेत मिलता है ।
    3. एक पियरसन सहसंबंध परीक्षण प्रदर्शन (एक सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग किया जा सकता है) के छवि विश्लेषण से प्राप्त मूल्यों सहसंबंधी बनाना यदि धुंधला (चरण २.२) immunoblotting (चरण 3.4.2) से प्राप्त उन लोगों के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने की क्षमता की पुष्टि करने के लिए अगर विरोधी अपोप्तोटिक प्रोटीन Bcl-2 सेल लाइनों में FFPE ऊतक ब्लॉकों में किए गए की सापेक्ष मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया था । Bcl को बढ़ाता है-2 कैंसर कोशिकाओं में चुनिंदा oncogenic तंत्र स्पष्ट कर सकते है और रोग निदान में उपयोगी हो सकता है और नैदानिक प्रबंधन24निर्णय बताए में । अधिक विशेष रूप से, Bcl-2 उचित B-लिम्फोसाइट विकास में एक भूमिका निभाता है और इसकी अभिव्यक्ति सामांयतः लिंफोमा25,26,27के संदर्भ में जांच की है । आरेख 1 प्रोटोकॉल में शामिल चरणों को रेखांकित करता है । एक प्रारंभिक में यदि अनुकूलन कदम, प्राथमिक विरोधी Bcl-2 एंटीबॉडी के विभिंन कमजोर पड़ने मानव tonsil ऊतक पर परीक्षण किया गया एक स्वचालित immunohistology दाग के रूप में २.१ कदम में वर्णित का उपयोग कर । चित्रा 2 मानव tonsil ऊतक के सना हुआ और स्कैन प्रोटोकॉल स्लाइड की छवियों को शामिल किया गया है कि प्रत्येक एंटीबॉडी के एक अलग कमजोर पड़ने प्राप्त किया । यह देखा जा सकता है कि 1:50 इष्टतम कमजोर पड़ने कि मजबूत संकेत और थोड़ा पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति उपज है । इस कमजोर पड़ने के बाद सेल लाइन TMA पर इस्तेमाल किया गया के रूप में चरण २.२ में वर्णित है । TMA भी नाभिक की पहचान करने के लिए DAPI का उपयोग दाग था । एक tyramide आधारित संकेत प्रवर्धन किट एक Cy5 fluorophore के साथ Bcl-2 लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । छवि विश्लेषण cytoplasmic Cy5 प्रतिदीप्ति संकेत यों तो प्रत्येक कोशिका लाइन में Bcl-2 के लिए जिंमेदार ठहराया जाता था । दाग की प्रतिनिधि छवियों चित्रा 3में देखा जा सकता है । इस प्रयोग के लिए चुनी गई अमर कोशिका रेखाओं में लसीकावत्-व्युत्पन्न कोशिका रेखाएं, अर्थात् ६९७, JeKo-1, Jurkat, RCH-ACV, Granta-५१९, रेह, और ्ज् के अलावा कई प्रकार शामिल हैं, जो गर्भाशय के कार्सिनोमा से व्युत्पंन हैं । हेला कोशिकाओं को एक बहुत ही निम्न स्तर28पर Bcl-2 व्यक्त करने के लिए जाना जाता है ।

सभी आठ सेल लाइनों की एक प्रारंभिक immunoblot के आधार पर, Granta-५१९ के लिए Bcl-2 की सबसे बड़ी बहुतायत है निर्धारित किया गया था (नहीं दिखाया गया है) । Granta के सीरियल कमजोर पड़ने-५१९ lysate एक अनुवर्ती immunoblot में इस्तेमाल किया गया Bcl-2 और GAPDH के रैखिक गतिशील रेंज खोजने के लिए (नियंत्रण लोड हो रहा है) संकेतों (4a आंकड़ा) । इस immunoblot समय की लंबाई बदलती के लिए डिजिटल स्कैनर का उपयोग कर उजागर किया गया था । Densitometry छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रत्येक बैंड से संकेत यों तो इस्तेमाल किया गया था, और इन मूल्यों के खिलाफ प्लॉट किए गए प्रोटीन की मात्रा (चित्रा 4B) भरी हुई । चित्रा 4B-शीर्ष में डेटा से, इस परख में Bcl-2 के लिए गतिशील रेंज लगभग शूंय की एक बैंड तीव्रता से ७५०० (मनमाना इकाइयों, ब्लू लाइन) तक फैला है । दो उच्च जोखिम बार एक द्विघात और गैर रेखीय समीकरण फिट, अधिक जोखिम और संकेत तीव्रता के संतृप्ति का सुझाव । GAPDH के लिए रेंज ३००० से ६५०० (मनमाने ढंग से इकाइयों, चित्रा 4B-नीचे) है । ३००० नीचे मान (मनमाने ढंग से इकाइयों) precipitously गिरा भी जब एक अपेक्षाकृत कम जोखिम समय का उपयोग कर । एक लंबे समय जोखिम स्पष्ट रूप से संतृप्ति में परिणाम है । इन रेखांकन से, यह निर्धारित किया गया था कि 12 µ g प्रोटीन का एक उचित मात्रा में जब सभी सेल लाइनों के साथ immunoblot प्रदर्शन कर लोड करने के लिए, प्रोटीन की यह मात्रा Bcl-2 Granta-५१९ कोशिकाओं के लिए रैखिक सीमा के भीतर तीव्रता मूल्यों उपज, के बाद से कम अंय सभी सेल लाइनों के लिए जोखिम का खतरा ।

सभी कक्ष पंक्तियों की दूसरी immunoblot चरण ३.४ में के रूप में किया गया था और चित्र 5में देखा जा सकता है । इस दाग के बाद से आवश्यक था प्रारंभिक दाग रैखिक रेंज के बाहर एक संकेत तीव्रता के साथ बैंड निहित । छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर नए ब्लाट में प्रत्येक बैंड के संकेत तीव्रता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । ऊपर निर्धारित डायनेमिक श्रेणियों में थे केवल तीव्रता मान उपयोग किए गए थे । चित्रा 4B के अधिकार पर तीर का उपयोग किया गया है कि प्रतिनिधि तीव्रता मूल्यों का प्रदर्शन और वे रैखिक रेंज के भीतर फिट जहां दिखा. Bcl-2: GAPDH का अनुपात तब प्रत्येक कक्ष पंक्ति के लिए परिकलित किया गया था । यह अनुपात, साथ प्रतिदीप्ति संकेत के साथ अगर चित्रा 5Bमें देखा जा सकता है । एक पियरसन सहसंबंध परीक्षण प्रदर्शन किया है कि immunoblotting से तीव्रता अनुपात थे दृढ़ता से और सकारात्मक मात्रा से तीव्रता रीडिंग के साथ संबंधित यदि (r = ०.९८३, p < ०.००१; चित्र 5Cदेखें) ।

मात्रात्मक Bcl-2 की मात्रा का आकलन करने के लिए विशेष रूप से मुश्किल साबित के रूप में वहां आठ परीक्षण सेल लाइनों के पार इस प्रोटीन की अभिव्यक्ति की एक विस्तृत श्रृंखला थी । कम Bcl-2-एक्सप्रेस सेल लाइनों (> 1 s) के संकेत को कैप्चर करने के लिए एक लंबा पर्याप्त एक्सपोज़र का उपयोग करना यह कठिन उच्च Bcl-2-एक्सप्रेस कक्ष रेखाओं के लिए डायनेमिक श्रेणी में रहने के लिए बनाया है । एक को बेहोश हेला और ्ज् के रूप में सेल लाइनों द्वारा उत्पादित बैंड यों तो, कई अलग जोखिम बार, ०.१ s से 5 एस, के लिए सबसे लंबे समय तक जोखिम समय है कि इस तरह के रूप में कोशिकाओं के लिए गतिशील रेंज में शेष इस्तेमाल किया जा सकता है निर्धारित कैप्चर किया गया Granta -५१९ ( चित्रा 6देखें) । इस immunoblotting तकनीक की प्रकृति एक दृष्टिकोण शोर के रूप में संकेत का पता लगाने की सटीकता सीमा, सुझाव यह इष्टतम उच्च अभिव्यक्ति के स्तर के लिए मध्यवर्ती पर पाया प्रोटीन यों तो इस्तेमाल किया जाता है.

Figure 1
चित्रा 1 : प्रोटोकॉल वर्कफ़्लो आरेख । एक सेल लाइन ऊतक microarray (TMA) पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस (IF) एक ही सेल लाइनों के मात्रात्मक immunoblotting (आईबी) के समांतर में चलाया गया था । प्रत्येक सेल लाइन से संकेत पियरसन सहसंबंध की तुलना में यदि प्रोटोकॉल की मात्रात्मक क्षमता को मांय कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : परीक्षण और ऑप्टिमाइज़िंग इम्यूनोफ्लोरेसेंस (IF) प्रोटोकॉल । tonsil के वर्गों विरोधी Bcl-2 एंटीबॉडी (1:50, 1:100, और कोई प्राथमिक एंटीबॉडी) के विभिंन कमजोर पड़ने के साथ मशीन थे । स्लाइड एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन थे, संकेत एक tyramide-Cy5 संयुग्मी का उपयोग कर परिलक्षित किया गया था, और स्लाइड DAPI के साथ दाग थे । स्लाइड 350/470 एनएम और DAPI और Cy5, क्रमशः के लिए 649/666 एनएम के अधिक से अधिक उत्तेजना/उत्सर्जन चोटियों के लिए उपयुक्त फिल्टर सेट का उपयोग कर 20X आवर्धन पर स्कैन किया गया । संबंधित जोखिम बार थे १६० ms और २०० ms. देखने के क्षेत्र में एक ही लसीकावत् कूप पर केंद्रित है, जो (केंद्रीय) कीटाणु केंद्र में Bcl-2 नकारात्मक होने की उंमीद है और (परिधीय) मेंटल जोन में सकारात्मक । 1:50 कमजोर पड़ने के कारण विशिष्ट संकेत बढ़ाने के बिना एक मजबूत विशिष्ट प्रतिदीप्ति संकेत दिया है इसलिए यह कमजोर पड़ने आगे जा के रूप में इस्तेमाल किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : इम्यूनोफ्लोरेसेंस (IF) सेल लाइन ऊतक microarray (TMA) वर्गों का उपयोग कर। सेल लाइन TMA के वर्गों लिया और विरोधी Bcl-2 या कोई प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ एक 1:50 कमजोर पड़ने के साथ तैयार किया गया । स्लाइड माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन थे, संकेत एक tyramide-Cy5 संयुग्मी का उपयोग कर परिलक्षित किया गया था, और स्लाइड DAPI के साथ दाग थे । स्लाइड 350/470 एनएम और DAPI और Cy5, क्रमशः के लिए 649/666 एनएम के अधिक से अधिक उत्तेजना/उत्सर्जन चोटियों के लिए उपयुक्त फिल्टर सेट का उपयोग कर 20X आवर्धन पर स्कैन किया गया । संबंधित जोखिम बार थे २५० ms और ६२५ ms. इन प्रतिनिधि छवियों संकेत मिलता है कि धुंधला सफल रहा था, और है कि Bcl की एक सीमा है-2 सेल लाइनों में अभिव्यक्ति । "no Bcl-2 एंटीबॉडी" नकारात्मक नियंत्रण स्लाइड किसी भी Cy5 संकेत, के रूप में अपेक्षित प्रदर्शित नहीं किया । प्रतिनिधि छवि ६९७ कक्ष पंक्ति से है । hyperplastic tonsil ऊतक के एक कोर TMA पर शामिल है कि चित्रा 2में दिखाया गया है कि एक समकक्ष पैटर्न दर्शाता है । मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए Cy5 प्रतिदीप्ति छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर संकेत को बढ़ाता द्वारा निर्धारित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : immunoblot (आईबी) संकेतों के गतिशील रेखीय रेंज का निर्धारण । (क) Granta के धारावाहिक कमजोर पड़ने के आईबीएस-५१९ lysate. प्रत्येक दाग कई बार रैखिक गतिशील रेंज खोजने के लिए उजागर किया गया था । (ख) Bcl के लिए बैंड तीव्रता-2 (ऊपर) और GAPDH (नीचे) बनाम कुल प्रोटीन की मात्रा (ए) में आईबी के लिए लोड । बैंड तीव्रता छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर ImageJ का उपयोग कर quantified थे । Bcl-2 (ऊपर) के लिए, सिग्नल बैंड तीव्रता की सीमा भर में रैखिक रहे जब एक कम जोखिम (exp ।) समय (०.२ s) का उपयोग किया गया था (पियरसन के सहसंबंध गुणांक (r मान) ०.९९४ (p < ०.००१) के द्वारा समर्थित के रूप में (0-7200 से तीव्रता), लेकिन अधिक के लिए नहीं 1 एस और 2 मिनट के एक्सपोजर टाइंस । GAPDH (नीचे) के लिए, डेटा कम (०.२ s) और मध्यम (२.२ s) के लिए ३००० (मनमाना इकाइयों) की तीव्रता से ऊपर रैखिक रहे पियरसन के रूप में ०.९९४ के आर मूल्यों (पी < ०.००१) और ०.९९२ (पी < ०.००१), क्रमशः, लेकिन नहीं के लिए एक उच्च जोखिम समय के लिए जोखिम बार ( 7 एस) । सही पर तीर विशिष्ट सेल लाइन चित्रा 5में immunoblot से पहचान के लिए बैंड तीव्रता से संकेत मिलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : मात्रात्मक immunoblotting (आईबी) के अमर सेल लाइनों और इम्यूनोफ्लोरेसेंस की तुलना (यदि) । (क) सभी सेल लाइनों की आईबी । कुल प्रोटीन की 12 µ जी प्रत्येक कुआं में भरी हुई थी । (ख) आईबी और यदि प्रत्येक सेल लाइन के लिए संकेत तीव्रता । आईबी संकेत Bcl-2: GAPDH बैंड तीव्रता के (ए) में दाग से quantified के रूप में ImageJ द्वारा अनुपात है । यदि संकेत TMA (चित्रा 3) पर प्रत्येक कोशिका लाइन कोर के प्रतिदीप्ति तीव्रता के रूप में छवि विश्लेषण द्वारा निर्धारित है । (C) यदि संकेत बनाम आईबी सिग्नल का Scatterplot । प्रत्येक डेटा बिंदु किसी दिए गए कक्ष पंक्ति का प्रतिनिधित्व करता है । पियरसन r मान ०.९८४ (p < ०.००१) के साथ रेखीय संबंधित परिणाम दो विधियों का उत्पादन किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : मात्रात्मक immunoblotting (आईबी) के लिए इष्टतम जोखिम समय ढूँढना. सभी सेल लाइंस की आइबी को दिखाया गया है । प्रत्येक कुआं में बारह माइक्रोग्राम प्रोटीन भरा हुआ था । प्रत्येक आईबी के लिए, विभिन्न एक्सपोज़र बार एक छवि कैप्चर करने के लिए उपयोग किए गए थे जहां सभी बैंड रेखीय डायनेमिक श्रेणी में बने रहे. Bcl-2 और GAPDH स्ट्रिप्स के एक्सपोजर बार क्रमशः थे: (A) ०.१ s और ०.१ s, (B) 1 s और ०.२ s, और (c) 5 s और 5 s. पैनलों एक और सी प्रदर्शन के उदाहरण है जहां कम से कम ब्लाटर पर बैंड के कुछ भी बेहोश हो गए या बहुत मजबूत, क्रमशः । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हम एक तरीका है कि मात्रात्मक immunoblotting (आईबी) के उपयोग के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस की उपयोगिता प्रदर्शित करता है वर्णन किया है (यदि) FFPE ऊतक नमूनों में एक लक्ष्य प्रोटीन के सापेक्ष बहुतायत का पता लगाने के लिए । वर्तमान प्रोटीन ठहराव तरीके उनके स्पष्ट प्रकृति द्वारा सीमित हैं, जैसे chromogenic आइएचसी2,3, या नमूनों को homogenize करने की आवश्यकता द्वारा, नमूना संरचना और सेल की आबादी में जांच को रोकने, जैसे आईबी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री8,9,10,11के साथ । गुणात्मक यदि विधि मान्य है और ध्यान से लागू किया गया है, तो इन सीमाओं को पार कर सकते हैं । यदि readouts के मात्रात्मक iIF करने के लिए की तुलना में अमर कोशिका लाइनों, हम अगर दृष्टिकोण के अर्द्ध मात्रात्मक प्रकृति को मांय करने में सक्षम थे ।

रोगियों या प्रयोगात्मक पशुओं से प्राथमिक ऊतक नमूने है कि वे कई प्रकार के सेल में विषम हैं । मल्टीप्लेक्स में कई प्राथमिक एंटीबॉडी के आवेदन अगर विशिष्ट सेल प्रकार या सेल कंपार्टमेंट4,13में ब्याज की एक या अधिक प्रोटीन के ठहराव परमिट । मल्टीप्लेक्स का ऑप्टिमाइज़ेशन और अनुप्रयोग यदि इस आलेख के दायरे से बाहर है लेकिन निम्नलिखित पत्रों में उल्लिखित है16,17,18,29. व्यापक दर्शन के लिए सेल की आबादी लेबल है और केवल वांछित कोशिका डिब्बे में ब्याज की प्रोटीन, उदाहरण के लिए नाभिक या कोशिका द्रव्य, इच्छित कक्ष प्रकार में मात्रा है । एक बार की मात्रात्मक प्रकृति अगर एक विशेष एंटीबॉडी के साथ मात्रात्मक आईबी द्वारा सत्यापित किया गया है, प्रोटोकॉल नैदानिक नमूनों में तेजी से, उच्च प्रवाह प्रोटीन ठहराव के लिए अनुमति देने के लिए बढ़ाया जा सकता है. नैदानिक अनुप्रयोगों आम तौर पर सापेक्ष के निर्धारण, बजाय निरपेक्ष, प्रोटीन बहुतायत की आवश्यकता होती है । हालांकि, यदि आवश्यक हो तो दृष्टिकोण को औपचारिक रूप से मात्रात्मक बनाया जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक समाधान युक्त शुद्ध रिकॉमबिनेंट Bcl-2 प्रोटीन तैयार किया जा सकता है और एक मानक जैव रासायनिक विधि का उपयोग कर quantified । धारावाहिक कमजोर पड़ने के बाद मात्रात्मक आईबी द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है और एक मानक वक्र प्रत्येक सेल लाइन में प्रति सेल निरपेक्ष प्रोटीन सामग्री का अनुमान उत्पंन ।

हम TMA de के ६६ मामलों से बायोप्सी नमूनों का प्रतिनिधित्व वर्गों के लिए हमारे अगर प्रोटोकॉल लागू बड़े बी सेल लिंफोमा । हमारे परिणाम स्वीकार्य रन-टू-रन reproducibility (पियरसन r = ०.८३७) और अपेक्षित, "Bcl-2-सकारात्मक" स्थिति के बीच मजबूत संघ निर्धारित रूपसे पारंपरिक आइएचसी और ऊंचा अभिव्यक्ति निर्धारित की दृश्य स्कोरिंग द्वारा प्रदर्शित IF (p < ०.००१) द्वारा होना चाहए. इसके अलावा, Bcl-2 बहुतायत से अगर एक ही नमूने में Bcl-2 mRNA बहुतायत के साथ संबंधित (स्पीमरन दर्षाया = ०.६९, पी < ०.००१) और काफी BCL2 जीन (पी = ०.०४२) या translocation की नकल संख्या लाभ के साथ मामलों में अधिक था ि्ग लोकस (पी = ०.००४) के लिए, के रूप में सीटू संकरण में प्रतिदीप्ति द्वारा निर्धारित है । हम मामलों के एक अलग पलटन में समकक्ष परिणाम प्राप्त की । इन निष्कर्षों अतिरिक्त सबूत है कि अगर Bcl के सापेक्ष बहुतायत निर्धारित करने के लिए एक वैध विधि के रूप में समर्थन करता है प्रदान-2 दिनचर्या में FFPE नमूनों । के उपयोग के लिए यदि प्राथमिक नमूनों में कई अंय उपमार्कर प्रोटीन की मात्रा को बढ़ाता है पहले वर्णित किया गया है16,17।

इस प्रोटोकॉल का अनुकूलन एक दो-गुना प्रक्रिया है । पहले, अगर प्राथमिक उपयोग एंटीबॉडी के साथ अनुकूलित किया जाना चाहिए (चरण २.१) । वाणिज्यिक एंटीबॉडी सामांयतः आइएचसी प्रोटोकॉल जो एक कमजोर पड़ने के साथ एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए और इसके बाद के संस्करण के लिए कमजोर पड़ने का सुझाव (यानी, अगर 1:100 की सिफारिश की, जोड़ने के 1:50 और 1:150) । प्रदर्शन के बाद अगर और स्लाइड स्कैनिंग, निर्धारण जो कमजोर पड़ने "इष्टतम" दृश्य निरीक्षण जरूरत है प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने की पहचान करने के लिए कि बढ़ती पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के बिना चमकदार संकेत उत्पंन करता है । अनुकूलन के दूसरे चरण immunoblot के लिए लोड करने के लिए प्रोटीन की मात्रा का चयन शामिल प्रत्येक बैंड सुनिश्चित करने के लिए रैखिक रेंज में रहता है (३.४ कदम) । यह सुनिश्चित करने के लिए, एक immunoblot सेल लाइन है कि लक्ष्य प्रोटीन की सबसे बड़ी बहुतायत व्यक्त की एक धारावाहिक कमजोर पड़ने का उपयोग किया जाता है । यहां से, प्रोटीन राशि बनाम बैंड तीव्रता पर्वतमाला के माध्यम से जो संकेत रैखिक रहता है निर्धारित करने के लिए साजिश रची जा सकता है । चूंकि इस रेंज में सबसे प्रचुर मात्रा में लक्ष्य प्रोटीन के साथ सेल लाइन में स्थापित किया गया है, प्रोटीन की दी गई राशि के लिए अंय सभी सेल लाइनों कम संकेतों उपज जाएगा । जब सभी सेल लाइनों (चरण ३.४) के एक immunoblot करने के लिए चलती है, कमजोर पड़ने श्रृंखला के लिए एक प्रोटीन राशि है कि लोड करने के लिए सूचित करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि मजबूत संकेतों के बिना जोखिम के रैखिक सीमा से परे चल रहा निकलेगा ।

इस प्रोटोकॉल के लाभों के बावजूद, एक ठहराव सत्यापन विधि के रूप में immunoblotting के उपयोग में अपनी कमियों है । प्राथमिक चिंता नमूनों के बीच विभिंन प्रोटीन के लिए अभिव्यक्ति की बड़ी रेंज के आसपास घूमती है । यह एक रैखिक श्रेणी की सीमाओं के भीतर सभी नमूनों रखना मुश्किल हो सकता है अगर कुछ नमूने दूसरों की तुलना में एक बहुत अधिक डिग्री के लिए ब्याज की प्रोटीन व्यक्त करते हैं । प्रतिनिधि परिणाम में ऊपर दिखाए गए, अलग जोखिम एक छवि है जहां चरम (उच्च और कम) दोनों रैखिक गतिशील रेंज (चित्रा 6) के भीतर है पर कब्जा कर लिया गया । यदि आरेख 5B में हेला और Jurkat कक्षों के लिए देखे गए संकेतों की अपेक्षा से अधिक है, तो इस सिस्टम के लिए संकेत या तो निंनतम संभव संकेत हो सकता है, या कि आईबी सिग्नल रेखीय खोज सीमा के नीचे पहुंच गए है और कम सटीक हैं । किसी भी तरह से, यह इंगित करता है कि यदि उस श्रेणी में मान कम इस प्रणाली में सही होने की संभावना है, और है कि तकनीक के लिए इष्टतम है मध्यम से अत्यधिक व्यक्त प्रोटीन । इसके अतिरिक्त, एचआरपी के उपयोग-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी मात्रात्मक प्रयोजनों के लिए इष्टतम नहीं है, आइएचसी2,3के संबंध में पहले चर्चा के रूप में. immunoblot के लिए फ्लोरोसेंट टैग माध्यमिक एंटीबॉडी का प्रयोग एक और अधिक मजबूत पुष्टि है कि अगर वास्तव में रैखिक मात्रात्मक30,31है प्रदान करेगा, तथापि, ०.९८४ के पियरसन आर मूल्य एचआरपी का उपयोग कर प्राप्त-संयुग्मित उपर्युक्त प्रोटोकॉल में द्वितीयक एंटीबॉडी वर्तमान प्रयोजनों के लिए पर्याप्त था । संभावित कमियों के साथ जुड़े अगर, जैसे autofluorescence और शमन व्यक्तिगत प्रयोगशाला इंस्ट्रूमेंटेशन, प्रथाओं और ऊतक के प्रकार पर आधारित बदलती हैं, और विभिंन preventative उपायों३२,३३द्वारा कम किया जा सकता है । प्रतिनिधि परिणामों में autofluorescence की एक बहुत छोटी राशि चित्रा 3में कोई Bcl-2 एंटीबॉडी नमूना में देखा जा सकता है, लेकिन यह राशि शेष अगर संकेतों की तुलना में तुच्छ है ।

सही FFPE ऊतक नमूनों से ब्याज की प्रोटीन यों की जरूरत है कई जैविक क्षेत्रों में नैदानिक और अनुसंधान प्रयोजनों से संबंधित है । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल FFPE ऊतक वर्गों पर अगर मात्रात्मक के उपयोग की रूपरेखा और अमर सेल लाइनों के immunoblotting द्वारा अपने अर्द्ध मात्रात्मक प्रकृति की पुष्टि । इस विधि एक व्यापक गतिशील रेंज भर में ठहराव की अनुमति देता है, साथ ही ऊतक नमूना है, जो कई अंय ठहराव तरीकों3,8,11में संरक्षित नहीं है की संरचनात्मक अखंडता के रखरखाव । इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल आसानी से अनुकूलनीय है और अनुसंधान और नैदानिक सेटिंग्स में लागू किया जा सकता है, विशेष रूप से कैंसर से संबंधित अनुसंधान और पूर्वानुमान के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम आंशिक रूप से Fredrick बंटिंग और चार्ल्स सर्वश्रेष्ठ कनाडा स्नातक छात्रवृत्ति (A.M.) द्वारा वित्त पोषित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
697 DSMZ ACC 42 Cell line
JeKo-1 ATCC CRL-3006 Cell line
Jurkat ATCC TIB-152 Cell line
RCH-ACV DSMZ ACC 548 Cell line
Granta-519 DSMZ ACC 342 Cell line
REH DSMZ ACC 22 Cell line
Raji ATCC CCL-86 Cell line
HeLa ATCC CCL-2 Cell line
Trypsin/EDTA solution Invitrogen R001100 For detaching adhesive cells
Fetal bovine serum (FBS) Wisent Inc. 81150 To neutralize trypsin
Neutral Buffered Formalin Protocol 245-684 For fixing cell pellets
UltraPure low melting point agarose Invitrogen 15517-022 For casting cell pellets
Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 Dako (Agilent) cat#: M088729-2, RRID: 2064429 To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786
Ventana Discovery XT Roche - For automation of immunofluorescence staining
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) Dako (Agilent) K4000 For immunofluorescence signal amplification
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) Dako (Agilent) K4002 For immunofluorescence signal amplification
Cyanine 5 tyramide reagent Perkin Elmer NEL745001KT For immunofluorescence signal amplification
Aperio ImageScope Leica Biosystems - To view scanned slides
HALO image analysis software Indica Labs - For quantification of immunofluorescence
Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) Thermo Scientific 1862209 To add to RIPA buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BioShop EDT001 For RIPA buffer
NP-40 BDH Limited 56009 For RIPA buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 For RIPA buffer
Glycerol FisherBiotech BP229 For Laemlli buffer
Bromophenol blue BioShop BRO777 For Laemlli buffer
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad 161-0611 For Laemlli buffer
Bovine serum albumin (BSA) BioShop ALB001 For immunoblot washes
Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) Bio-Rad 161-0374 For running protein gel
Filter paper (Extra thick blot paper) Bio-Rad 1703969 For blotting transfer
Nitrocellulose membrane Bio-Rad 162-0115 For blotting transfer
Trans-blot SD semi-dry transfer cell Bio-Rad 1703940 For semi-dry transfer
Skim milk powder (Nonfat dry milk) Cell Signaling Technology 9999S For blocking buffer
Tween 20 BioShop TWN510 For wash buffer
GAPDH rabbit monoclonal antibody Epitomics 2251-1 Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C)
Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody abcam cat#: ab6789, RRID: AB_955439 Secondary antibody for immunoblot
Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody abcam cat#: ab6721, RRID: AB_955447 Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5)
Clarity Western ECL substrates Bio-Rad 1705060 For immunoblot signal detection
Amersham Imager 600 GE Healthcare Life Sciences 29083461 For immunoblot signal detection
ImageJ software Freeware, NIH - For densitometry analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khoury, J. D., et al. Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).
  2. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).
  3. Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. Interpretation and quantification of immunostains. The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).
  4. Rimm, D. L. What brown cannot do for you. Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).
  5. Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).
  6. Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging? Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).
  7. Rzagalinski, I., Volmer, D. A. Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry – A tutorial review. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).
  8. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).
  9. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  10. Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).
  11. Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).
  12. Denburg, M. R., et al. Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).
  13. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  14. Peck, A. R., et al. Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).
  15. Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).
  16. AlJohani, N., et al. Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival. Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).
  17. Wood, B., et al. Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease. Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).
  18. Weberpals, J. I., et al. First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16. Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).
  19. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH protocols. , (2008).
  20. Fedor, H. L., Marzo, A. M. De Practical Methods for Tissue Microarray Construction. Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).
  21. Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).
  22. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  23. Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting. Nature Protocol Exchange. , (2013).
  24. Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies. Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).
  25. Bosch, M., et al. A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).
  26. Li, Y., et al. BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).
  27. Choi, Y. W., et al. High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy. International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).
  28. The Human Protein Atlas BCL2. , https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna (2018).
  29. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  30. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
  31. Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).
  32. Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment & Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).
  33. Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9 (1), 13 (2008).

Tags

जीव विज्ञान अंक १४३ इम्यूनोफ्लोरेसेंस formalin-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड मात्रात्मक immunoblot पश्चिमी दाग विकृति विज्ञान प्रोटीन मार्कर प्रोटोकॉल immunohistology
एक मानक के रूप में सेल लाइनों की मात्रात्मक Immunoblotting नियमित ऊतक नमूनों में इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए अचिह्नित प्रोटीन को प्रमाणित करने के लिए
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moore, A. M., Boudreau, L. R., Virk, … More

Moore, A. M., Boudreau, L. R., Virk, S., LeBrun, D. P. Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples. J. Vis. Exp. (143), e58735, doi:10.3791/58735 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter