Summary
포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 조직 샘플 (FFPE)에 관심사의 단백질을 측정 하는 수단으로 이미지 분석와 결합 하 여 면역 형광 조직학 유효성을 양적 immunoblotting 사용 하 여를 설명 합니다. 우리의 결과 일상적인 생 검 견본에 있는 바이오 마커 단백질의 상대적 수량을 ascertaining에 대 한 면역 형광 조직학의 유틸리티를 보여 줍니다.
Abstract
포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 조직 샘플 (FFPE)에 관심사의 단백질의 정량화는 임상에서 중요 한 응용 프로그램을 연구 하는 고. 정량화 하는 최적의 방법 정확 하 고 광범위 한 선형 동적 범위를가지고 개별 세포 유형의 식별 수 있도록 샘플의 구조적 무결성을 유지 합니다. Immunohistochemistry (IHC), 질량 분석 등 immunoblotting 현재 방법 각 그들의 범주 특성상 이러한 규정에 맞게 실패 또는 샘플을 균질 필요가 있다. 대체 방법으로 우리는 면역 형광 검사 (IF) 및 FFPE 조직에 관심사의 단백질의 관계 되는 풍부를 결정 하기 위해 이미지 분석의 사용을 제안 합니다. 여기이 방법은 쉽게 최적화 된 넓은 동적 범위를 산출 및 선형 양적 immunoblotting의 황금 표준에 비해 정량은 설명 합니다. 또한,이 메서드는 샘플의 구조적 무결성의 유지 관리를 허용 하 고 진단 응용 프로그램에 중요 한 있을 수 있습니다 다양 한 세포 유형의 구별 허용 합니다. 전반적으로,이 FFPE 샘플에 있는 단백질의 상대적 정량화에 대 한 강력한 방법 이며 임상 적응 하거나 요구를 연구에 쉽게 적용할 수 있습니다.
Introduction
포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 (FFPE) 조직 생 검 견본에 있는 단백질을 정할 필요가 많은 임상 분야에 존재 합니다. 예를 들어 일상적인 생 검 표본에서 바이오 마커 단백질의 정량화는 암 환자1에 대 한 치료 예 후를 명료 하 사용 됩니다. 그러나, 현재 메서드는 일반적으로 주관적 및 유효성 검사 부족.
Immunohistochemistry (IHC) 병 리 실험실에서 일상적으로 사용 되 고 일반적으로 1 차적인 항 체 대상 단백질에 지시 및 양 고추냉이 과산화 효소2등 효소 상표로 활용 된 이차 항 체에 따라 달라 집니다. 기존의 IHC 구분, 만들 수 있습니다 사용 분의 샘플링 하 고 그로 인하여 그것의 관련 조직학 컨텍스트 내에서 단백질 식의 평가 허용 하는 조직 샘플의 형태학 무결성을 보존 한다. 그러나, IHC에 의해 생성 된 비 신호 빼기 때문에, 그것은 상대적으로 좁은 동적 범위에서 겪고 있다 고 멀티플렉싱2,,34에 대 한 제한 된 잠재력을 제공. 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 질량 분석기 (MALDI-MSI) 이미징 형태학의 무결성을 유지 합니다. 그러나,이 개발 기술 겸손 형태학 해상도와 연결 하며 중요 한 보정 및 정규화, 일상 임상 사용5,,67에 대 한 그것의 타당성을 방해. 단백질 조직 샘플에서 계량을 대체 기술을 포함 immunoblotting8,11, 질량 분석의9,10,및 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)12, 각 이 무 균으로 시작의 샘플 조직의 lysate. 기본 조직 샘플은 다른 유형의 다양 한 세포 유형 포함. 따라서, 조직 샘플 수반 기법 암 세포 같은 관심의 특정 세포 인구에서 단백질의 정량화를 허용 하지 않습니다.
IHC, 만약에 작은 적용 됩니다 처럼 FFPE 샘플링 하 고 조직학 무결성13의 보존 합니다. 그러나, 덕분에 형광 신호, 첨가제 자연 경우 의무가 여러 기본 항 체와 형광 라벨의 응용 프로그램입니다. 따라서, 관심사의 단백질 특정 셀 또는 세포질 구획 (예를 들어 핵 및 세포질) 다른 항 체를 사용 하 여 정의 내에서 상대적으로 측정할 수 있습니다. 형광 신호는 또한 더 큰 동적 범위13,14의 이점을. 우수성, 재현성, 및의 멀티플렉싱 잠재력 FFPE 샘플에 적용 하는 경우 시연된13,,1415되었습니다.
여기 우리 골드 표준으로 설립된 셀 라인을 사용 하 여 만약에 관심사의 단백질의 관계 되는 풍부를 결정에서 컴퓨터 기반 이미지 분석의 양적 성격을 확인 하는 양적 immunoblotting의 사용 설명 FFPE 조직 샘플에서 조직학 섹션입니다. 우리는 성공적으로 임상 생 샘플16,,1718바이오 마커 단백질을 계량 하는 다중 접근에서이 메서드를 적용 했습니다.
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Protocol
기본 인간의 조직 샘플을 사용 하 여 승인 보건 복지부 산하 교육 병원 연구 윤리 위원회 (HSREB) 여왕의 대학에서 얻은 했다.
1. 건물 셀 라인 조직 Microarray (TMA)
- 수확 하 고 세포를 씻어.
참고:이 프로토콜 (예: 헬러, Jurkat, RCH ACV) 다양 한 설립된 불멸 하 게 셀 라인에서 테스트 되었습니다.- 부착 세포, 그들은 약 80 %confluency 도달 약 1.3 x 107 셀을 수확. 셀 라인에 대 한 적절 한 시 약을 사용 하 여 셀을 분리 합니다.
참고: Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)는 표면 단백질을 저하의 위험을 줄이기 위해 트립 신 이상으로 일반적으로 선호. 트립 신을 사용 하는 경우 셀 수확 직후 소 태아 혈 청 (FBS)를 사용 하 여 트립 신을 중화. - 현 탁 액 셀, 약 8 x 10의7 셀 로그-성장의 단계에서 수확.
- 50 mL 원뿔 튜브에 225 x g에 5 분 동안 centrifuging 여 수확/분리 된 세포를 수집 합니다.
- 가만히 따르다는 상쾌한 고 다시 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) X 1의 10 mL에 펠 릿을 중단. 225 x g에 5 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한 가만히 따르다.
참고: 1 X PBS 구성 137 mM NaCl, 2.7 m m KCl, 10mm 나2HPO4, 1.8 m m KH2포4 증류수; pH 7.4에 조정 합니다.
- 부착 세포, 그들은 약 80 %confluency 도달 약 1.3 x 107 셀을 수확. 셀 라인에 대 한 적절 한 시 약을 사용 하 여 셀을 분리 합니다.
- 포 르 말린에 셀을 해결 하 고 그들을 펠 렛.
- 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린 (NBF)의 10 ml 원뿔 관 내의 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다.
참고: NBF 9 ml 1 X PBS의 37% 포름알데히드 재고 솔루션의 1 mL를 희석 하 여 준비 될 수 있습니다.
주의: 포 르 말린 및 포름알데히드 처리 때 주의 사용 합니다. 연기 후드를 사용 하 여 포 르 말린 및 포름알데히드를 포함 하는 단계에 대 한. - 하룻밤 실 온에서 24 rpm (약 17 h) 로커에 셀을 품 어.
- PBS에서 낮은 융 점 agarose의 1% 솔루션 (0.01 g 당 1 mL PBS agarose의)을 준비 합니다.
- 충분히 500 µ L 셀 라인 샘플 당 agarose 솔루션의 준비.
- 80 ° C 물 목욕 또는 열 블록에서 2-5 분에 대 한 비정 기 혼합과 agarose를 녹. 일단 해산, 경화를 방지 하는 37 ° C 물 목욕 또는 열 블록에서 솔루션을 계속.
- 펠 릿에서 고정된 셀 225 x g.에서 5 분 동안 centrifuging 1.2.2 단계는 상쾌한을 제거 하 고 resuspend 1 x PBS의 500 µ L에 셀.
- 290 x g.는 상쾌한의 모든 Aspirate에 5 분 동안 centrifuging 여 1.5 mL microcentrifuge 튜브와 펠 릿으로 셀을 전송.
- 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린 (NBF)의 10 ml 원뿔 관 내의 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다.
- Agarose 셀 캐스팅.
- 셀을 포함 하는 각 관 (1.2.3 단계)에서 1 %agarose 솔루션의 ~ 500 µ L를 추가 합니다. 부드럽게, 그러나 빨리, P-1000 micropipette 혼합을 사용 하 여 위아래로 혼합 플라스틱.
참고: 조리개를 확대 하 여 거품을 형성 하지 않도록 피 펫 팁의 끝을 잘라. 경화를 방지 하기 위해 37 ° C 물 목욕에서 작업 agarose 솔루션을 유지. - 실 온에서 (5-10 분)을 강화 하기 위해 agarose 셀 솔루션을 수 있습니다. 각 microcentrifuge에 NBF 튜브 샘플을 포함 하 고 실내 온도에 파라핀 포함 (최대 24 시간)까지 10%의 1 mL를 추가 합니다.
- 셀을 포함 하는 각 관 (1.2.3 단계)에서 1 %agarose 솔루션의 ~ 500 µ L를 추가 합니다. 부드럽게, 그러나 빨리, P-1000 micropipette 혼합을 사용 하 여 위아래로 혼합 플라스틱.
- 파라핀 포함 agarose 플러그를 준비 합니다.
- 샘플에서 NBF에서 발음.
- Microcentrifuge 튜브, 플라스틱 조직 카세트 플러그를 삽입 하는 면도날을 사용 하 여 셀 플러그를 제거 합니다. 10%에서 카세트 저장 NBF 실내 온도에.
- 샘플을 처리 하거나 수동으로 하룻밤 또는 자동된 조직 프로세서를 사용 하 여 및 표준 조직학 방법을 사용 하 여 파라핀 왁 스에 포함.
참고: 피셔 외 예제에서는 프로토콜에 대 한 19 . - 특수화를 사용 하 여 "조직 arrayer" 악기, 추수는 파라핀에서 중복 0.6-m m 코어 각 셀 라인에서 차단 하 고, 행에서에 삽입할 셀 라인 TMA를 만들려면 빈 받는 사람 파라핀 블록.
참고: 표준 방법 등 표도르와 3 월20에 설명 된 사용 해야 합니다. - TMA에 양수 또는 음수 컨트롤로 2-3 추가 조직 유형 (예: 편도 선, 결 장, 고환, 등)을 나타내는 기본 샘플에서 코어를 통합 합니다. 관심사의 단백질에 대 한 적합 한 조직을 선택 합니다.
- 조직학의 두 섹션, 약 4 ~ 6 µ m 두께, 셀 라인 TMA 준비 하는 톰을 사용 합니다. 조직학 슬라이드에 섹션을 탑재, 건조, 그리고 deparaffinize (표도르와 3 월20에서 같이).
2입니다. 면역 형광에 의해 얼룩 샘플
- 1 차적인 항 체의 희석을 최적화 합니다.
참고: Kajimura 그 외 여러분 에서 같은 FFPE 직물 단면도 IHC 또는 경우의 최적화에 대 한 존재 하는 표준 프로토콜 21. 방법의 간략 한 개요는 여기에 설명 된.- 제조업체의 지침에 의해 유도 하는 관심사의 단백질을 기본 항 체의 4-5 희석을 준비 합니다.
- 형태학 상으로 인식할 수 있는 세포 인구에 있는 관심사의 단백질을 표현 하는 동물이 나 인간의 소스에서 제어 조직 형식을 식별 합니다. 조직 섹션을 준비 하 고 표도르와 3 월20에 같은 표준 immunohistochemistry 절차 다음 슬라이드에 탑재.
참고: 필요한 섹션의 수 주 항 체 희석 더하기 하나는 추가의 수가입니다. - Immunohistology에 대 한 자동 또는 수동 시스템을 사용 하 여 1 차적인 항 체 희석 단계 2.1.2에서에서 슬라이드에 2.1.1 각 단계에서 테스트 합니다. 추가 슬라이드에서 기본 항 체의 응용 프로그램을 생략 하 고 부정적인 제어로 사용.
- 착 색 과정에서 모든 슬라이드와 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 핵 counterstain 및 붙일 태그가 이차 항 체로 서 얼룩. HRP (양 고추냉이 과산화 효소)을 사용 하 여 감도 향상이 필요한 경우-활용 된 이차 항 체 및 tyramide 기반 신호 증폭 시스템 (참조 스택 외. 13)입니다.
참고: 기본 항 체를 멀티플렉싱 때 다른 형광 라벨 각 단백질에 대 한 사용 됩니다. - 사용 된 fluorophores에 적절 한 구동 및 검출 파장을 사용 하 여 디지털 이미지 파일을 생성할 수 있는 적절 한 악기를 사용 하 여 immunostained 슬라이드를 검사 합니다.
- 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 디지털 이미지를 볼 하 고 경험적으로 선택 배경 형광 상대적 신호 강도 최적화 하는 1 차적인 항 체 희석.
참고: 원하는 경우,이 최적화 발생할 수 있습니다는 HRP 활용 된 이차 항 체, 3, diaminobenzidine (DAB)-3'와 명시 야 현미경을 사용 하 여.
- 셀 라인 TMA에 얼룩 경우 수행 합니다.
- Immunohistology에 대 한 자동 또는 수동 시스템을 사용 하 여 최적화 된 기본 항 체 희석 (으로 단계 2.1에서에서 결정)으로 셀 라인 TMA의 슬라이드를 얼룩. 두 번째 슬라이드에서 기본 항 체의 응용 프로그램을 생략 하 고 부정적인 제어로 사용.
- 착 색 과정에서 모든 슬라이드 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 핵 counterstain로와 이차 항 체 및 tyramide 단계 2.1.4로 얼룩.
- 사용 된 fluorophores에 적절 한 구동 및 검출 파장을 사용 하 여 디지털 이미지 파일을 생성할 수 있는 적절 한 악기를 사용 하 여 immunostained 슬라이드를 검사 합니다.
- 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 (즉, 세포질 및 핵)의 세포질 구획을 식별 하 고 각 셀 라인에 대 한 평균 형광 강도 (MFI) 계량.
참고:이 목적을 위해 다양 한 소프트웨어 패키지를 사용할 수 있습니다 그리고 많은 스택 외. 에서 설명 13.
3. 양적 Immunoblotting 셀 라인의
- 셀의 lysates 준비.
- 1.1.1에서 1.1.3 단계에 설명 된 대로 각 셀 라인의 2 백만 세포를 수확.
- 50 mL 원뿔 튜브에 650 x g에 5 분에 대 한 셀 아래로 회전 합니다. 상쾌한을 가만히 따르다.
- 얼음 처럼 차가운 PBS의 10 mL로 세포 세척. 1 ml의 얼음 처럼 차가운 PBS와 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 resuspend. 단계 3.1.2에 의하여 centrifuge, 가만히 따르다, 그리고 얼음 세포를 떠나.
- 셀, 프로 테아 제 억제제 (RIPA 세포의 용 해 버퍼의 mL 당 100 X 억제제의 10 µ L)와 찬 radioimmunoprecipitation (RIPA) 세포의 용 해 버퍼의 약 200 µ L를 추가 소용돌이 15 분 동안 얼음에 품 어.
참고: 효과적인 세포에 필요한 세포의 용 해 버퍼의 양을 셀 선으로 변화 하 고 실험적으로 결정 될 수 있다. RIPA 버퍼는 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, 1.0 %NP-40, 0.5% 나트륨 deoxycholate, 0.1 %SDS 증류수에 구성 됩니다. - 상대적으로 심지어는 immunoblots에 로드 되도록 각 lysate 메서드를 사용 하는 적절 한 Bradford 분석 실험 등에서 20 µ L 샘플에서 총 단백질 계량. 각 세포 lysate의 나머지 (약 180 µ L) 6 X Laemmli 세포의 용 해 버퍼의 약 40 µ L을 추가 하 고 5 분 동안 열 블록 또는 물 욕조에 100 ° C에서 비등.
참고: 6 X Laemmli 버퍼 300 mM Tris HCl (pH 6.8), 4% (w/v) SDS, 60% 글리세롤, 블루, 0.6% (w/v) bromophenol의 구성에 50 m m dithiothreitol (DTT) 증류수. - 2 주 동안-20 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
- 모든 셀 라인 셀 줄은 관심의 가장 풍부한 단백질 결정의 immunoblot을 수행 합니다.
참고: 마흐무드, T. 및 양, PC에 설명 된 절차를 따릅니다. 22, 다음 수정입니다.- 약 수 microcentrifuge 튜브 lysate (에서 준비 단계 3.1) 포함 10-50 µ g (관심사의 단백질 풍부)에 따라 단백질의 세포. 6 X Laemmli 버퍼 및 15 µ L까지 볼륨에 충분 한 RIPA 세포의 용 해 버퍼의 2.5 µ L를 추가 합니다.
- 스태킹 5% 고 해결 (예, 15-100 kDa 사이의 단백질에 대 한 10%)는 적절 한 농도 로드 단백질 사다리와 단계 3.2.1에서에서 샘플 SDS 페이지 젤. 빈 우물에 1 X Laemmli 버퍼를 로드 합니다. 적절 한 설정, 일반적으로 125 V, 80 분 또는 bromophenol 파랑 염료에 접시의 바닥을 도달할 때까지 전원 공급 장치를 실행 합니다.
- Wiedemann 외 에 설명 된 대로 세미 드라이 단백질 전송을 수행합니다 23.
참고: 결과 위해 대표, 니트로 막 (이 메탄올에 배어 있이 필요 하지 않습니다), 찬 Bjerrum Schafer 닐슨 (BSN) 전송 버퍼 사용 했다. BSN 버퍼 48 mM Tris, 39mm 글리신, 증류수에 20% 메탄올 구성 됩니다. - 전송 후 가로로 GAPDH 같은 적절 한 내부 통제 단백질에서 관심사의 단백질을 포함 하는 부분을 분리 하는 막 잘라 면도날을 사용 합니다.
- 주 항 체의 제조 업체에서 권장 하는 블로킹 버퍼를 사용 하 여 차단 하 고 항 체 외피를 진행 합니다.
참고: 최적의 기본 항 체 희석 단백질 풍부 및 감도 따라 크게 달라질 수 있습니다. 아래의 대표 결과 대 한 관심사의 단백질에 항 체 GAPDH 컨트롤 필수 1:40,000 희석 1:1,000 희석이 필요 합니다. 사용 하는 이차 항 체의 희석 1:3, 000 이었다. - 항 체 외피 막의 세척 후에, 샌드위치 가방 같은 투명 한 플라스틱 칼 집에서 막 스트립을 놓습니다.
- 제조업체의 지침에 따라 enchanced 화학 (ECL) 혼합물을 준비 합니다. P-1000 피 펫을 사용 하 여을 ECL 혼합 막 커버, 칼 집, 1-2 분 동안 실내 온도에 어둠 속에서 혼합 된 멤브레인 스트립을 품 어.
- 디지털 이미징 플랫폼에 막 칼을 놓습니다. 화학 및 색도계 마커 검출에 사용 하 여 캡처하는 막의 다양 한 노출.
참고: 노출 시간 로드 단백질의 금액에 따라 달라 집니다, 그리고 대상 단백질의 풍부, 항 체 친 화력 등 몇 초 단위로 자동 노출 (일반적으로 몇 초), 및 테스트 노출 시간 위와 아래 시작. - 경험적으로, 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 가장 대상 단백질을 표현 하는 셀 줄 결정 또는.
- 직렬 희석을 사용 하 여 각 1 차 항 체의 선형 동적 범위를 찾아.
- 수행 단계 3.2.1-3.2.8 (단계 3.2.9에서에서 확인) 대상 단백질의 높은 농도 표현 하는 셀 라인에서 직렬 희석의 시리즈를 사용 하 여.
- ImageJ 같은 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 노출 이미지에 densitometry 수행.
- 예를 들어 ImageJ를 사용 하 여 사각형 선택 도구를 사용 선택할 계량 하 젤의 첫 번째 레인. 이동 분석 | 젤 | 첫 번째 차선을 선택. 마우스를 사용 하 여 다음 차선에 결과 사각형 위로 이동. 이동 분석 | 젤 | 다음 차선을 선택. 반복적으로 다음 차선에는 사각형을 이동 하 고 레인의 나머지 부분에 대 한 차선을 선택 합니다.
- 이동 분석 | 젤 | 플롯 레인. 직선 도구를 사용 하 여 배경 소음을 제거 하려면 각 피크의 기지를 통해 라인을 그릴. 자동 선택 도구 사용 하 여 각 피크를 선택 하 고 이제부터 라고도 밴드 강도, 결과 창에서 각 피크의 밀도 수집 합니다.
- Densitometry 만들려고 scatterplot는 밴드 강도 대 의 총 단백질의 양을 각 1 차 항 체에 대 한 로드 출력을 사용 합니다. 최적 및 육안 검사의 라인을 사용 하 여 각 항 체의 선형 동적 범위의 위치 (강도 범위)을 결정 합니다.
- 모든 셀 라인으로 앞으로 이동 하는 농도 되도록 선형 범위의 높은 끝에 값을 생성 하는 단백질 농도 선택 합니다.
참고:이 농도이 단백질의 가장 큰 금액으로 셀 라인에서 채도 수준 때문에, 거기 이상 되어야 합니다의 위험 노출 다른 셀 라인에 대 한 밴드.
- immunoblot 단계 3.3.4 모든 셀 라인에서에서 선택 단백질 농도 사용 하 여 수행 하 고 단계 3.2.1-3.2.8를 반복 합니다.
- 3.3.2 단계에서 디지털 스캔 densitometry를 수행 합니다. 3.3.3 단계에서 식별 된 각 항 체에 대 한 선형 범위 내에서 신호를 생성 하는 노출 이미지를 선택 합니다.
- 3.4.1에서 이상적인 노출에서 밴드 강도 신호를 사용 하 여 각 셀 라인에 대 한 컨트롤 밴드 강도 로드 하는 대상 단백질 밴드 강렬의 비율을 계산 합니다. 이 비율 값은 관심의 대상 단백질의 관계 되는 풍부를 나타냅니다.
- 피어슨 상관 관계 테스트 수행 (할 수 있는 통계 소프트웨어 패키지를 사용 하 여) immunoblotting (3.4.2 단계)에서 얻은 그 단계의 경우 얼룩 (2.2) 이미지 분석에서 얻은 값을 연결할.
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Representative Results
이 프로토콜 FFPE 직물 구획으로 만든 셀 라인에서 안티-apoptotic 단백질 Bcl-2의 상대 수량을 결정 하는 경우의 기능 확인을 위해 사용 되었다. 암 세포에 선택적으로 측정 Bcl-2 종양 메커니즘을 명료 하 게 수 고 병 적인 진단 및 임상 관리 결정24알리는에서 유용할 수 있습니다. 좀 더 구체적으로, Bcl-2 적절 한 B-lymphocyte 개발에 역할 그리고의 식은 일반적으로 림프 종25,,2627의 맥락에서 조사. 그림 1 프로토콜에 관련 된 단계를 설명합니다. 초기 면 최적화 단계에서 기본 안티-Bcl-2 항 체의 다양 한 희석 단계 2.1에에서 설명 된 대로 자동된 immunohistology 염색기를 사용 하 여 인간의 편도 선 조직에서 테스트 되었습니다. 그림 2 에 각 항 체의 다른 희석 받은 인간의 편도 선 직물의 스테인드 및 스캔 조직학 슬라이드의 이미지가 포함 되어있습니다. 그것은 볼 수 있습니다 그 1시 50분은 강한 신호 및 작은 배경 형광 나왔고 최적의 희석. 이 희석 다음 셀 선 TMA 2.2 단계에 설명 된 대로 사용 되었다. TMA는 또한 핵 식별 DAPI를 사용 하 여 얼룩이 진다. Tyramide 기반 신호 증폭 키트와 Cy5 fluorophore Bcl-2 라벨을 사용 되었다. 이미지 분석 각 셀 라인에서 Bcl-2에 기인 하는 세포질 Cy5 형광 신호를 계량에 사용 되었다. 그림 3에 얼룩의 대표 이미지를 볼 수 있습니다. 이 실험을 위해 선택 하는 불멸 하 게 셀 라인 림프 파생 셀 라인, 즉 697, JeKo-1, Jurkat, RCH ACV, Granta-519, REH와 들의 삶 문의 헬러, 자 궁 경부 암 종에서 파생 된 외의 다양 한 포함 되어 있습니다. HeLa 세포는 매우 낮은 레벨28에서 Bcl-2를 표현으로 알려져 있습니다.
모든 8 개의 세포 라인의 초기 immunoblot에 따라, Granta-519 Bcl-2 (표시 되지 않음)의 가장 큰 풍부를 결정 했다. Granta-519 lysate의 직렬 희석 Bcl-2 및 GAPDH (컨트롤 로드) 신호 (그림 4A)의 선형 동적 범위를 찾기 위해 후속 immunoblot에 사용 되었다. 이 immunoblot 디지털 스캐너를 사용 하 여 시간의 다양 한 길이 대 한 노출 됐다. Densitometry 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 각 밴드에서 신호를 측정 하는 데 사용 했다 하 고 이러한 값 단백질 로드 (그림 4B)의 금액에 대 한 표시 했다. 그림 4B에서 데이터-상단,이 분석 결과에서 Bcl-2에 대 한 동적 범위에 걸쳐 거의 제로 7500 (임의의 단위, 블루 라인)의 밴드 강도에서. 두 개의 높은 노출 시간 맞는 비-선형 방정식, 과도 및 채도 신호 강도의 제안 이차. 6500에 3000에서 GAPDH 범위는 (임의의 단위, 그림 4B-하단). 3000 (임의의 단위) 아래 값 상대적으로 낮은 노출 시간을 사용 하는 경우에 급격히 떨어졌다. 긴 노출 채도 명확 하 게 발생합니다. 이 그래프에서 그것은 결정 하는 12 µ g 단백질 때문에 단백질의이 양을 굴복 Bcl-2 강도 값 감소 Granta-519 셀에 대 한 선형 범위 내에서 모든 셀 라인 immunoblot 수행할 때 로드의 합리적인 금액을 될 것 이라고 다른 모든 셀 라인에 대 한 노출 과도의 위험.
모든 셀 라인의 두 번째 immunoblot 3.4 단계에서 수행한 다음 고 그림 5A에서 볼 수 있습니다. 이 오 선형 범위 신호 강도 포함 된 초기 오 밴드부터 필요 했다. 이미지 분석 소프트웨어는 새로운 오에 각 대역의 신호 강도 확인 하기 위해 사용 되었다. 위에 결정 하는 동적 범위 안에 있던 강도 값에만 사용 되었다. 그림 4B 의 오른쪽에 있는 화살표는 쇼 그들은 선형 범위 내에서 맞는 어디 사용 된 대표적인 강도 값을 보여 줍니다. Bcl의 비율-2:GAPDH 다음 각 셀 라인에 대 한 계산. 이 비율에서에서 형광 신호 함께 그림 5B에서 볼 수 있습니다. 피어슨 상관 관계 테스트 시연는 immunoblotting에서 강도 비율 했다 강력 하 고 긍정적으로 연관 양적 면에서 강도 읽기 (r = 0.983, p < 0.001; 그림 5C참조).
Bcl-2 양의 양적 평가 8 개의 테스트 셀 라인에 걸쳐 다양 한 단백질이 표현 되면서 특히 어려운 것으로 판명. 충분히 노출 낮은 Bcl-2 표현 셀 라인의 신호를 캡처를 사용 하 여 (> 1 s) 높은 Bcl 2 표현 하는 세포 라인에 대 한 동적 범위에 유지 하기가 어려웠습니다. 희미 한 밴드 들의 삶 문의 헬러 등 셀 라인에 의해 생산 계량을 시도, 몇 가지 다른 노출 시간, 0.1에서 5 s s, Granta 같은 셀에 대 한 동적 범위에 남아 있는 하는 동안 사용할 수 있는 가장 긴 노출 시간을 결정 하 고 캡처된 -519 ( 그림 6참조). 이 immunoblotting 기술의 자연 한 접근 소음, 높은 중간 식 수준에서 발견 단백질을 계량 하는 데 사용 최적의 제안으로 신호 탐지의 정확도 제한 합니다.
그림 1 : 프로토콜 워크플로 다이어그램. 면역 형광 검사 (IF) 셀 라인 조직 microarray (TMA)에 동일한 셀 라인의 양적 immunoblotting (IB)을 병렬로 실행 되었습니다. 각 셀에서에서 신호는 피어슨 상관 관계 유효성을 검사할 경우 프로토콜의 양적 능력으로 비교 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 테스트 및 면역 형광 검사 (IF) 프로토콜 최적화. 편도 안티-Bcl-2 항 체 (1시 50분, 1: 100, 그리고 아무 1 차적인 항 체)의 다른 희석으로 알을 품 했다. 슬라이드 했다 HRP 활용 된 이차 항 체와 인 큐베이 팅 하 고 신호 tyramide Cy5 켤레를 사용 하 여 증폭 되었다 슬라이드 DAPI 물 했다. 슬라이드 스캔 했다 확대 필터를 사용 하 여 20 X 350/470의 최대한 여기/방출 봉우리에 적절 한 설정 및 649/666 nm DAPI와 Cy5, 각각. 각 노출 시간 160 ms 되었고 200 양 시야의 가운데는 Bcl-2 될 것으로 예상 된다 같은 림프 여 포에 (중앙) 어린 싹 센터에 부정적이 고 (주변) 맨 틀 영역에서 긍정적인. 1:50 희석 일반적인 신호 증가 없이 강한 특정 형광 신호를 했다 따라서 그것은 앞으로 희석으로 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 면역 형광 (경우) 셀 라인 조직 microarray (TMA) 섹션을 사용 하 여. 셀 라인 TMA의 섹션 촬영 되었고 1:50 incubated 희석 없이 1 차적인 항 체 또는 안티-Bcl-2의. 슬라이드 했다 이차 항 체와 인 큐베이 팅 하 고 신호 tyramide Cy5 켤레를 사용 하 여 증폭 되었다 슬라이드 DAPI 물 했다. 슬라이드 스캔 했다 확대 필터를 사용 하 여 20 X 350/470의 최대한 여기/방출 봉우리에 적절 한 설정 및 649/666 nm DAPI와 Cy5, 각각. 각 노출 시간 250 ms 되었고 625 양 이러한 대표 이미지 표시 얼룩 되었는지, 그리고 셀 라인에 걸쳐 범위의 Bcl-2 식입니다. 예상 대로 "Bcl-2 항 체" 부정적인 컨트롤 슬라이드 어떤 Cy5 신호를 설명 하지 않았다. 697 셀 라인에서 대표 이미지가입니다. TMA에 포함과 편도 선 조직 핵심에서는 그림 2에 표시 된 해당 패턴을 보여 줍니다. 각 셀 라인에 대 한 평균 형광 강도 (MFI) 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 Cy5 형광 신호를 측정 하 여 결정 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : Immunoblot (IB) 신호 선형 동적 범위 결정. Granta-519 lysate의 직렬 희석의는 (A) IBs 각 오 선형 동적 범위를 찾기 위해 시간을 다양 한 접했습니다. (B) 밴드 강도 Bcl-2 (맨 위) 및 GAPDH (아래) 대 양의 총 단백질 (A)에 IB에 대 한 로드. 밴드 농도 ImageJ의 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 정량 했다. Bcl-2 (맨 위), 신호 하면 낮은 노출 (exp.) 밴드 농도의 범위에 걸쳐 선형 유지 (0.2 s) 했지만 사용된 (0-7200에서 농도)는 피어슨 상관 계수 (r 값)에서 지 원하는 0.994 (p < 0.001)의 하지에 대 한 더 큰 1 s와 2 분의 노출 번입니다. GAPDH (아래)에 대 한 데이터 유지 3000 (임의의 단위) 낮은 강도 위에 선형 (0.2 s)와 매체 (2.2 s)으로 노출 시간 0.994 (p < 0.001) 및 0.992 (p < 0.001), Pearson의 r 값에 의해 지원 되는 각각, 하지만 하지 높은 노출에 대 한 시간 ( 7 s). 오른쪽 화살표는 그림 5A에서 immunoblot에서 식별 된 특정 셀 라인 밴드 강도를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 불멸 하 게 세포 및 면역 형광 검사 (경우)를 비교의 양적 immunoblotting (IB). (A) 모든 셀 라인의 IB. 총 단백질의 12 µ g 각 우물에 로드 되었습니다. (B) IB 및 IF 신호 각 셀 라인에 대 한 농도. IB 신호는 Bcl의 비율-(a) ImageJ로 계량으로 오에서 2:GAPDH 밴드 강도. IF 신호는 TMA (그림 3)에 각 셀 라인 코어의 형광 강도 이미지 분석에 의해 결정 됩니다. (C) IB 대 Scatterplot의 IF 신호 신호. 각 데이터 요소는 특정된 셀 라인을 나타냅니다. 두 가지 방법 0.984 (p < 0.001)의 피어슨 r 값으로 선형 상관 관계가 지정 된 결과 생산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 양적 immunoblotting (IB)에 대 한 최적의 노출 시간 찾기. 모든 셀 라인의 IB 표시 됩니다. 12 마이크로 그램 단백질의 각 음에 로드 되었습니다. 각 IB에 대 한 다양 한 노출 시간 선형 동적 범위 내에서 모든 밴드에 남아 있던 이미지를 캡처하는 데 사용 되었다. Bcl-2와 GAPDH 스트립의 노출 시간 각각 있었다: (A) 0.1 s와 0.1 s, (B) 1 s와 0.2 s, 그리고 (C) 5 s와 A 와 C 5 s. 패널 쇼 노출의 예 이상 오 점에 밴드 중 일부는 너무 희미 했다 또는 너무 강한, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
메서드를 설명 하는 우리가 사용 하는 양적 immunoblotting (IB)의 면역 형광 검사 (면)의 유틸리티를 보여 FFPE 조직 샘플에서 대상 단백질의 관계 되는 풍부를 ascertaining에 대 한. 현재 단백질 정량화 방법 비 IHC2,3, 등 그들의 명백한 자연 또는 균질 샘플, 샘플 구조와 세포 인구에 대 한 조사와 같은 방지 하는 필요에 의해 제한 됩니다. IB 및 질량 분석8,9,,1011. 양이 많은 경우 메서드는 유효성을 검사 하 고 신중 하 게 적용 하는 경우 이러한 한계를 초월 수 있습니다. 불멸 하 게 세포의 양적 iIF IF 정보를 비교 하 여 반 정량적 성격의 경우 접근 유효성을 검사할 수 있었습니다.
환자 또는 실험 동물에서 기본 조직 샘플은 유형이 다른 여러 세포 유형을 포함. 멀티플렉스 경우에 몇 가지 기본 항 체의 응용 프로그램 특정 셀 또는 셀 구획4,13의 하나 이상의 단백질의 정량화를 허용합니다. 최적화 및 다중 IF의 응용 프로그램은이 문서의 범위를 벗어납니다 하지만 다음 논문16,17,,1829에서 설명 하는. 광범위 한 철학 레이블 셀 인구 이며만 원하는 셀 구획, 핵 또는 세포질, 원하는 셀 형식에서 관심사의 단백질을 정량. 특정 항 체와 면의 양적 자연 양적 IB에 의해 확인 되었습니다, 일단 프로토콜 신속 하 고 높은 처리량 단백질 정량화 임상 샘플에 대 한 있도록 upscaled 수 있습니다. 임상 응용 프로그램은 일반적으로 보다는 절대, 상대, 단백질 풍부의 결정 필요. 그러나, IF 접근 필요한 경우 공식적으로 양적 만들 수 있습니다. 예를 들어 순화 된 재조합 Bcl-2 단백질을 포함 하는 솔루션 준비 수 하 고 표준 생 화 확 적인 방법을 사용 하 여 계량. 직렬 희석 수 다음 양적 IB에 의해 평가 되 고 각 셀 라인 셀 당 절대 단백질 함량을 추정 하는 표준 곡선 생성.
우리가 우리의 경우 프로토콜 드 노 보 확산 큰 B-세포 림프 종의 66 사례에서 생 검 견본을 대표 하는 TMA 섹션에 적용 됩니다. 우리의 결과 시연 허용 실행-실행 재현성 (Pearson r = 0.837) 비주얼 채 점 하 여 주관적으로 결정 하는 "Bcl-2-긍정적인" 상태 사이 예상, 강한 협회 기존의 IHC와 높은 식 결정 경우에 의해 객관적으로 (p < 0.001). 또한, if Bcl-2 풍부 Bcl-2 같은 샘플에서 mRNA 풍부 연관 (Spearman ρ = 0.69, p < 0.001) BCL2 유전자의 복사 번호 이득 갖는 경우에 상당히 큰 했다 (p = 0.042) 또는 BCL2의 전 고등학교 로커 스에 (p = 0.004), 형광 제자리에서 교 잡에 의해 결정. 우리는의 경우 별도 코 호트에서 동일한 결과를 얻었다. 이러한 결과 경우 유효한 방법으로 일상적인 FFPE 표본 Bcl-2의 상대 풍부를 결정 하기 위한 지 원하는 추가 증거를 제공 합니다. 기본 샘플에 다른 여러 가지 바이오 마커 단백질을 계량 하는 경우의 사용16,17위에서 설명한.
이 프로토콜의 최적화는 두 배 과정 이다. 첫째, 만약 사용 하는 기본 항 체와 낙관 되어야 한다 (단계 2.1). 상업 항 체는 일반적으로 희석 희석 또는 두 위 및 아래 시작 지점으로 사용 해야 하는 IHC 프로토콜에 대 한 제안 (즉, 1: 100, 추천 하는 경우 추가 1시 50분, 1:150). IF 실행 후 슬라이드를 스캔는 희석은 "최적의" 결정 배경 형광 증가 없이 밝은 신호를 생성 하는 기본 항 체 희석 식별 검사를 수반 한다. 최적화의 두 번째 단계는 각 밴드 (3.4 단계)의 선형 범위에 남아 있도록 immunoblot에 대 한 로드 단백질의 양을 선택 하는 작업이 포함 됩니다. 이 되도록 한 immunoblot 대상 단백질의 가장 큰 풍요를 표현 하는 셀 라인의 직렬 희석을 사용 하 여 수행 됩니다. 여기에서 단백질 양은 대 밴드 농도는 신호 선형 유지 강도 범위를 결정 하기 위해 그릴 수 있습니다. 이 범위는 설립 이래 가장 풍부한 대상 단백질으로 셀 라인, 단백질의 주어진된 금액에 대 한 다른 모든 셀 라인 얻을 것입니다 낮은 신호. 모든 셀 라인 (3.4 단계)의 immunoblot에 이동할 때 희석 시리즈는 로드를 단백질 양을 보장할 수 강한 신호 선형 범위를 넘어 과도의 위험을 실행 하지 않고 알려 하는 데 사용 됩니다.
이 프로토콜의 장점에도 불구 하 고 정량화 확인 방법으로 immunoblotting 사용 하 여 단점이 있다. 주요 관심사는 표본 간의 다양 한 단백질에 대 한 언론의 넓은 범위 돌아가지. 그것은 다른 사람 들 보다 훨씬 더 큰 정도로 관심의 단백질을 표현 하는 일부 샘플 하는 경우 선형 범위 내에서 모든 샘플을 계속 어려울 수 있습니다. 위에 표시 된 대표적인 결과 다양 한 노출 어디 (높고 낮음) 극단은 모두 선형 동적 범위 (그림 6)에서 이미지를 캡처 했다. 경우 신호는 그림 5B 에서 헬러과 Jurkat 세포에 대 한 본 가장 낮은 가능한 경우 신호가이 시스템에 대 한을 나타낼 수 있습니다 또는 IB 신호 선형 감지의 하단에 도달 했습니다 예상 보다 큰 제한 하 고 덜 정확 하다. 어느 쪽이 든,이 나타냅니다 그 범위에서 값이이 시스템에서 정확 하 게 될 가능성이 있으며 그 기술은 중간-높은-로 표현 단백질에 대 한 최적의. IHC2,3에 대해 앞에서 설명한 대로 또한, HRP 활용 된 이차 항 체를 사용 하 여 양적 목적에 적합 하지 않습니다. 그러나 IF는 실제로 선형 양적30,31,, HRP 활용을 사용 하 여 얻은 0.984 피어슨 r 값 보다 강력한 확인 제공 하는 것은 immunoblot에 붙일 태그가 2 차 항 체를 사용 하 여 위의 프로토콜에 2 차 항 체는 현재 목적을 위해 충분 했다. Autofluorescence 및 냉각 다를 경우와 관련 된 잠재적인 단점 개별 실험실 계측, 관행 및 조직 유형, 그리고 다양 한 예방 대책32,33에 의해 극소화 될 수 있다. 그러나 아주 작은 양의 대표 결과에 autofluorescence 아무 Bcl-2 항 체 샘플 그림3에서에서 볼 수 있습니다, 그리고이 금액은 나머지 경우에 비해 사소한 신호.
정확 하 게 계량 FFPE 조직 샘플에서 관심사의 단백질을 필요 임상에 관련 된 그리고 많은 생물학 분야에 걸쳐 연구 목적. 여기에 제시 된 프로토콜 FFPE 직물 단면도에 양적 IF의 사용을 설명 하 고 불멸 하 게 세포의 immunoblotting 여 반 정량적 자연의 유효성을 검사. 이 메서드는 많은 다른 정량화 방법3,,811에서 유지 되지 않습니다 조직 샘플의 구조적 무결성의 유지 관리 뿐만 아니라 넓은 동적 범위를 정량화를 수 있습니다. 또한,이 프로토콜 쉽게 적응 이며 연구 및 임상 설정, 특히 암 관련 연구와 예 후에 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 프레드릭 밴팅과 찰스 베스트 캐나다 대학원 장학금 (오전)에 의해 부분적으로 투자 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | - | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | - | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | - | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | - | For densitometry analysis |
References
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