Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Kvantitativ Immunoblotting cellen linjer som Standard til å validere Immunofluorescence for kvantifisering biomarkør proteiner i rutinemessig vevsprøver

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58735

Summary

Vi beskriver bruken av kvantitative immunoblotting å validere immunofluorescence histology kombinert med bildeanalyser for kvantifisere et protein av interesse i formalin-fast, parafin-embedded (FFPE)-vevsprøver. Våre resultater viser nytten av immunofluorescence histology for konstatere relative antallet biomarkør proteiner i rutinemessig biopsi prøver.

Abstract

Kvantifisering av proteiner av interesse i formalin-fast, parafin-embedded (FFPE)-vevsprøver er viktig i klinisk og forskning programmer. En optimal metode for kvantifisering nøyaktig, har en rekke med lineær dynamiske og opprettholder den strukturelle integriteten for eksempel tillate for identifikasjon av personlige celletyper. Gjeldende metoder som immunohistochemistry (IHC), massespektrometri og immunoblotting hver ikke oppfyller disse bestemmelsene på grunn av deres kategoriske natur eller må homogenize prøven. Som en alternativ foreslår vi bruk av immunofluorescence (hvis) og bildeanalyse å bestemme den relative overfloden av et protein av interesse i FFPE vev. Her viser vi at denne metoden er enkelt optimalisert, gir et bredt dynamisk område og er lineært kvantifiserbare i forhold til gullstandarden av kvantitative immunoblotting. Videre, denne metoden tillater vedlikehold av den strukturelle integriteten av utvalget og tillater æren av ulike celletyper, som kan være avgjørende i diagnostiske programmer. Alt dette er en robust metode for den relative kvantifiseringen av proteiner i FFPE prøver og kan lett tilpasses passer klinisk eller forskning må.

Introduction

Behovet for å kvantifisere proteiner i formalin-fast, parafin-embedded (FFPE) biopsi vevsprøver finnes i mange klinisk felt. For eksempel brukes kvantifisering av biomarkør proteiner i rutinemessig biopsi prøver til å belyse prognose og informere behandling for kreft pasienter1. Imidlertid gjeldende metoder er vanligvis subjektive og mangler validering.

Immunohistochemistry (IHC) brukes rutinemessig i rutinelaboratorier og vanligvis avhenger en primær antistoff rettet mot målet protein og en sekundær antistoff konjugert med en enzymatisk etikett som pepperrot peroxidase2. Konvensjonelle IHC følsom, kan gjøre bruk av minutt prøver og beholder morfologiske integriteten av dermed tillater vurdering av protein uttrykk i relevante histologiske konteksten. Men fordi kromogent signalet generert av IHC subtraktiv, det lider et relativt lite dynamisk område og tilbyr begrenset potensial for multiplexing2,3,4. Matrix-assistert laser desorpsjon/ionisering massespektrometri imaging (MALDI-MSI) beholder morfologiske integritet. Men denne utvikle teknologien er forbundet med beskjedne morfologiske oppløsning og krever betydelig kalibrering og normalisering, svekker sine mulighetsstudie for rutinemessige klinisk bruk5,6,7. Alternative teknikker å kvantifisere protein i vevsprøver inkluderer immunoblotting8, massespektrometri9,10,11og enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA)12, hver av som begynner med en homogenisert lysate av prøven vev. Primære vevsprøver er heterogene ved at de inneholder en rekke celletyper. Derfor tillater teknikker som innebærer homogenisere prøvene ikke kvantifisering av et protein i en bestemt celle befolkning av interesse, slik som kreftceller.

Som IHC, hvis aktuelt for små FFPE prøver og tillater oppbevaring av histologiske integritet13. Men takket være additiv natur fluorescens signaler, hvis er mottakelig for anvendelse av flere primære antistoffer og fluorescerende etiketter. Dermed kan et protein av interesse være relativt kvantifisert i bestemte celler eller cellular avdelinger (for eksempel kjernen versus cytoplasma) defineres ved hjelp av andre antistoffer. Fluorescens signaler har også fordelen av en større dynamisk område13,14. Den overlegenhet, reproduserbarhet og multipleksing potensialet i har hvis FFPE prøver vært demonstrert13,14,15.

Her beskriver vi bruk av kvantitative immunoblotting med etablerte cellelinjer som en gullstandard for å fastslå kvantitative natur hvis kombinert med computer-assistert bildeanalyser å bestemme den relative overfloden av et protein av interesse histologiske inndelinger fra FFPE vevsprøver. Vi har brukt denne metoden i en multiplex tilnærming til kvantifisere biomarkør proteiner i klinisk biopsi prøver16,17,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Godkjenning for bruk primære menneskelige vevsprøver ble innhentet fra Health Sciences og tilknyttet undervisning sykehus forskning etikk Board (HSREB) ved Queen's University.

1. bygge et cellen linje vev Microarray (TMA)

  1. Harvest og vask celler.
    Merk: Denne protokollen er testet på ulike etablerte udødeliggjort cellelinjer (f.eks HeLa, Jurkat, RCH-ACV).
    1. For tilhenger celler, høste ca 1,3 x 107 celler når de når ca 80% confluency. Koble celler ved hjelp av en reagens passer for cellen linjen.
      Merk: Ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) er generelt foretrukket over trypsin å redusere risikoen for nedverdigende overflaten proteiner. Hvis bruker trypsin, nøytralisere trypsin bruke fosterets bovin serum (FBS) umiddelbart etter høsting cellene.
    2. For suspensjon celler, høste ca 8 x 107 celler i logg-vekstfase.
    3. Samle høstet/frittstående cellene av sentrifugering i 5 min på 225 x g i et 50 mL konisk rør.
    4. Dekanter nedbryting og å avbryte pellet 10 mL 1 X fosfat-bufret saltvann (PBS). Sentrifuge for 5 min på 225 x g og Dekanter nedbryting.
      Merk: 1 X PBS består av 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 i destillert vann; justere pH 7,4.
  2. Fastsette cellene i formalin og pellets dem.
    1. Avbryte celle pellet innen konisk røret 10 mL av 10% nøytral bufrede formalin (NBF).
      Merk: NBF kan tilberedes ved å fortynne 1 mL av 37% formaldehyd lagerløsning i 9 mL 1 X PBS.
      FORSIKTIG: Vær forsiktig når du håndterer formalin og formaldehyd. Bruk avtrekksvifte for foranstaltningene innvolvere formalin og formaldehyd.
    2. Inkuber cellene i en rocker på 24 rpm i romtemperatur over natten (ca 17 h).
    3. Forberede en 1% løsning av lavt Smeltepunkt agarose i PBS (0,01 g av agarose per 1 mL PBS).
      1. Forberede nok for 500 µL agarose løsning per celle linje prøve.
      2. Løs opp agarose i en 80 ° C vann bad eller varme blokk, med sporadiske blande i 2-5 min. Når oppløst, holde løsningen i en 37 ° C vann bad eller varme blokk å unngå herding.
    4. Pellet fast cellene fra trinn 1.2.2 for sentrifugering i 5 min på 225 x g. Fjern nedbryting og resuspend cellene i 500 µL av 1 x PBS.
    5. Overføre cellene i en 1,5 mL microcentrifuge rør og pellets ved sentrifugering i 5 min på 290 x g. leveringstanken av alle nedbryting.
  3. Felles celler i agarose.
    1. Legg ~ 500 µL av 1% agarose løsning (fra trinn 1.2.3) til hver tube som inneholder cellene. Forsiktig, men raskt, Pipetter blanding opp og ned med P-1000 brønnene for å blande.
      Merk: Klipp av slutten av pipette spissen forstørre blenderåpning og unngå danner bobler. Holde fungerende agarose løsning på 37 ° C vannbad å unngå herding.
    2. La agarose-celle løsningen å stivne (5-10 min) i romtemperatur. Legg 1 mL av 10% NBF hver microcentrifuge rør som inneholder en prøve og holde ved romtemperatur før parafinen innebygging (opptil 24 h).
  4. Forberede agarose pluggen parafin innebygging.
    1. Sug opp av NBF fra utvalget.
    2. Fjerne celle pluggen med et barberblad til å kutte microcentrifuge røret, plassere pluggen i plast vev kassett. Lagre kassetter i 10% NBF ved romtemperatur.
  5. Behandle prøvene overnatting enten manuelt eller bruke en automatisert vevsprosessor, og bygge inn i parafin voks bruke standard histology metoder.
    Merk: Se Fischer et al. 19 for en eksempel-protokollen.
  6. Bruke en spesialisert "vev arrayer" instrumentet, harvest like 0.6 mm kjerner fra parafinen blokk fra hver celle linje og sett dem i rader, til en tom mottaker parafin-blokk for å opprette en celle linje TMA.
    Merk: Standard metoder bør brukes som beskrevet i Fedor og De Marzo20.
  7. Innlemme kjerner fra primære utvalgene som representerer 2-3 flere vev typer (f.eks mandel, kolon, testiklene, etc.) som positive eller negative kontroller i TMA. Velg vev som passer for protein av interesse.
  8. Bruk en mikrotom for å forberede to histologiske deler, ca 4 til 6 µm tykk, av cellen linjen TMA. Montere delen på et histology lysbilde, tørk den og deparaffinize (som beskrevet i Fedor og De Marzo20).

2. prøven farging av Immunofluorescence

  1. Optimalisere fortynning primære antistoff.
    Merk: Standardprotokoller finnes for optimalisering av IHC eller hvis FFPE vev inndelinger som i Kajimura et al. 21. en kort oversikt over tilnærmingen er skissert her.
    1. Forberede 4-5 fortynninger av primære antistoffer mot protein rundt guidet av produsentens instruksjoner.
    2. Identifisere en kontrolltype vev fra et dyr eller human som uttrykker protein interesse morphologically gjenkjennelig celle populasjoner. Forberede deler av vev og montere dem på et lysbilde etter standard immunohistochemistry-prosedyre som i Fedor og De Marzo20.
      Merk: Antall deler kreves er antall primære antistoff fortynninger pluss en ekstra.
    3. Bruke en automatisk eller manuell system for immunohistology, teste de primære antistoff fortynninger fra trinn 2.1.1 hver på et lysbilde fra trinn 2.1.2. Utelater programmet primære antistoff ekstra lysbildet og bruke den som en negativ kontroll.
    4. Under farging prosessen, flekk alle lysbilder med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) som en kjernefysisk counterstain og en fluorescently merket sekundære antistoff. Hvis større følsomhet, bruke en (pepperrotperoksidase) HRP-konjugert sekundære antistoff og tyramide-baserte signal forsterkning system (se Stack et al. 13).
      Merk: Når multipleksing primære antistoffer, brukes fluorescerende etiketten for hver protein.
    5. Skanne immunostained lysbildene bruker et riktig instrument kan generere en digital image arkiv benytter eksitasjon og oppdagelsen bølgelengder passer til fluorophores som ble brukt.
    6. Bruke egnet programvare til å vise de digitale bildene og empirisk velger den primære antistoff fortynning som optimaliserer signalet intensiteten i forhold til bakgrunnen fluorescens.
      Merk: Hvis du vil, dette optimalisering kan oppstå med et HRP-konjugerte sekundære antistoff, 3, 3-diaminobenzidine (DAB) og brightfield mikroskopi.
  2. Utføre hvis flekker på cellen linje TMA.
    1. Bruke en automatisk eller manuell system for immunohistology stain et lysbilde celle linjen TMA med optimalisert primære antistoff fortynning (som bestemmes i trinn 2.1). Utelater programmet primære antistoff det andre lysbildet, og bruke den som en negativ kontroll.
    2. Flekk alle lysbilder med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) som en kjernefysisk counterstain, og en sekundær antistoff og tyramide som i trinn 2.1.4 under farging prosessen.
    3. Skanne immunostained lysbildene bruker et riktig instrument kan generere en digital image arkiv benytter eksitasjon og oppdagelsen bølgelengder passer til fluorophores som ble brukt.
    4. Bruk en bildet analyse programvarepakke å identifisere mobilnettet rommet rundt (dvs. cytoplasma versus kjernen) og kvantifisere gjennomsnittlig fluorescens intensiteten (MFI) for hver celle linje.
      Merk: Ulike programvarepakker kan brukes til dette formålet og mange er omtalt i stakk et al. 13.

3. kvantitativ Immunoblotting av linjer

  1. Forberede lysates celler.
    1. Høste 2 millioner celler i hver celle linje, som beskrevet i trinnene 1.1.1 å 1.1.3.
    2. Nedspinning celler i 5 min på 650 x g i et 50 mL konisk rør. Dekanter nedbryting.
    3. Vask celler med 10 mL av iskalde PBS. Resuspend i 1 mL av iskalde PBS og overføre til en 1,5 mL microcentrifuge tube. Sentrifuge per trinn 3.1.2 Dekanter og la cellene på is.
    4. Legge til ca 200 µL av kalde radioimmunoprecipitation (RIPA) lyseringsbuffer med proteasehemmere (10 µL av 100 X hemmere per mL RIPA lyseringsbuffer) i cellene, vortex og Inkuber på isen i 15 min.
      Merk: Mengden lyseringsbuffer kreves for effektiv lysis varierer fra cellen linje og kan bestemmes empirisk. RIPA buffer består av 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, 1,0% NP-40, 0,5% natrium deoxycholate, 0,1% SDS i destillert vann.
    5. For å sikre relativt selv legge på immunoblots, kvantifisere totale protein i en 20 µL prøve hver lysate bruker en hensiktsmessig metode som Bradford analysen. Legge til ca 40 µL av 6 X Laemmli lyseringsbuffer resten (ca. 180 µL) av hver celle lysate og kok ved 100 ° C i en varme blokk eller vann bad for 5 min.
      Merk: 6 X Laemmli buffer består av 300 mM Tris-HCl (pH 6.8), 4% (w/v) SDS, 60% glyserol, 0,6% (w/v) bromophenol blå, 50 mM dithiothreitol (DTT) i destillert vann.
    6. Lagre samples ved 20 ° C i opptil to uker.
  2. Utføre en immunoblot av alle celler linjene til å bestemme hvilken celle linje har mest rikelig protein av interesse.
    Merk: Følg prosedyren beskrevet i Mahmood, T. og Yang, PC. 22, med følgende endringer.
    1. Aliquot celle lysate (forberedt i trinn 3.1) inneholder 10-50 µg protein (avhengig av overflod av protein av interesse) i microcentrifuge rør. Legge til 2,5 µL av 6 X Laemmli buffer og tilstrekkelig RIPA lyseringsbuffer å gjøre volumet til 15 µL.
    2. En 5% stabling og en passende konsentrasjon å løse (f.eks10% for proteiner mellom 15-100 kDa) SDS side gel med en protein stige og prøvene fra trinn 3.2.1. Legg 1 X Laemmli buffer i Tom brønner. Kjøre strømforsyningen med riktige innstillinger kan vanligvis 125 V i 80 minutter eller til bromophenol blå fargestoff når bunnen av platen.
    3. Utfør en semi-tørr protein overføring som beskrevet under Wiedemann et al. 23.
      Merk: For representant resultat en nitrocellulose membran (som ikke trenger å bli dynket i metanol), og kalde Bjerrum Schafer-Nielsen (BSN) overføring buffer ble brukt. BSN buffer består av 48 mM Tris, 39 mM glysin, 20% metanol i destillert vann.
    4. Etter overføring, bruk et barberblad til å kutte membranen vannrett for å skille delen som inneholder protein av interesse fra en passende internkontroll protein, for eksempel GAPDH.
    5. Fortsette å blokkere og antistoff incubations bruker blokkerer bufferen anbefalt av produsenten av primære antistoffer.
      Merk: Optimal primære antistoff fortynninger kan varierer dramatisk protein overflod og følsomhet. For representant resultatene nedenfor kreves antistoffer mot protein rundt en 1:1,000 fortynning mens kontrollen GAPDH kreves en 1:40,000 fortynning. Fortynning av sekundær antistoffer brukt var 1:3, 000.
    6. Etter antistoff incubations og vask av membranen, sett membran strimler i en klar plast slire som en sandwich bag.
    7. Forbered enchanced chemiluminescence (ECL) blanding følge instruksjonene fra produsenten. Bruk en P-1000 pipette dekke membranen med ECL blanding, lukke skjede og ruge membran strimler med blandingen i mørket ved romtemperatur for 1-2 min.
    8. Plassere skjede membran i en digital bildebehandling plattform. Bruk chemiluminescence og kolorimetrisk markør oppdagelsen for å ta ulike eksponeringer av membranen.
      Merk: Eksponeringstider vil variere basert på hvor mye protein lastet, overflod av målet protein, antistoff affinitet etc. begynner med en automatisk eksponering (vanligvis noen sekunder), og test eksponeringstider over og under i intervaller på noen sekunder.
    9. Empirisk, eller bruke analyseprogramvare, bestemme hvilken celle linje uttrykker de mål protein.
  3. Finne lineær dynamikkområdet hver primære antistoff ved hjelp av en seriell fortynning.
    1. Utføre trinn 3.2.1-3.2.8 hjelp av en rekke føljetong fortynninger fra cellen linje som uttrykker den høyeste konsentrasjonen av målet protein (identifisert i trinn 3.2.9).
    2. Bruk image analyseprogramvare som ImageJ for å utføre densitometry på eksponering bilder.
      1. For eksempel bruker ImageJ, bruk verktøyet Rektangulært utvalg for å velge første kjørefelt av gel å kvantifisere. Gå til analysere | Gels | Velg første Lane. Bruk musen til å flytte det resulterende rektanglet til neste kjørefelt. Gå til analysere | Gels | Velg neste Lane. Gjentatte ganger flytte rektangelet til neste kjørefelt og velg kjørefelt for resten av banene.
      2. Gå til analysere | Gels | Tegne baner. Bruk verktøyet Rett linje til å tegne linjer over grunnlaget for hver topp å fjerne bakgrunnsstøy. Bruk verktøyet tryllestaven til å velge hver topp, og samle tettheten av hver topp, heretter referert til som bandet intensitet, fra resultatvinduet .
    3. Bruk densitometry til å lage en scatterplot av det bandet intensitet versus beløpet av totale protein lastet for hver primære antistoff. Bruker en linje for beste tilpasning og visuell inspeksjon, avgjør hvor (intensitet område) lineær dynamikkområdet hver antistoff.
    4. Velg en protein konsentrasjon som genererer en verdi på høyere enden av lineær området skal konsentrasjonen fremover med alle linjer.
      Merk: Siden denne konsentrasjonen er under fargemetning i celle linje med den største mengden av dette proteinet, bør det være ingen fare for over utsette band for de andre linjene.
  4. Gjenta trinn 3.2.1-3.2.8 utføre en immunoblot med protein konsentrasjonen valgt i trinn 3.3.4 for alle linjer.
    1. Utføre densitometry på digital skanner som i trinn 3.3.2. Velg eksponeringer bildene som gir signaler innenfor lineær for hver antistoff identifisert i trinn 3.3.3.
    2. Bruker bandet intensitet signalene fra de ideelle eksponeringene fra 3.4.1, beregne forholdet mellom målintensitet protein bandet å laste kontroll bandet intensitet for hver celle linje. Disse forhold verdiene indikerer den relative overfloden av målet protein av interesse.
    3. Pearson korrelasjon teste (kan gjøres ved hjelp av en statistisk programvarepakke) å korrelere verdier Hentet fra bildeanalyser av hvis flekker (step 2.2) til dem fra immunoblotting (trinn 3.4.2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen ble brukt til å bekrefte hvis evnen til å bestemme det relative antallet anti-apoptotisk proteinet Bcl-2 i cellelinjer laget i FFPE vev blokker. Kvantifisere Bcl-2 selektivt i kreftcellene kan belyse kreftfremkallende mekanismer og kan være nyttig i patologisk diagnose og informere klinisk ledelse beslutninger24. Mer spesifikt, Bcl-2 spiller en rolle i riktig B-lymphocyte utvikling og uttrykket er vanligvis undersøkt i sammenheng med lymphoma25,26,27. Figur 1 viser trinnene involvert i protokollen. I en innledende Hvis optimalisering trinn, ble ulike fortynninger av det primære anti-Bcl-2 antistoffet testet på menneskelig mandel tissue benytter en automatisert immunohistology fargemaskin som beskrevet i trinn 2.1. Figur 2 viser bilder av flekker og skannede histology lysbilder av menneskelig mandel vev som hver fikk en annen fortynning av antistoff. Det kan sees at 1:50 er den optimale fortynning som gitt sterkt signal og litt bakgrunn fluorescens. Dette fortynning ble brukt på cellen linje TMA som beskrevet i trinn 2.2. TMA ble også farget bruker DAPI til å identifisere kjerner. En tyramide-baserte signal forsterkning kit ble brukt Merk Bcl-2 med en Cy5 fluorophore. Bildeanalyse ble brukt om å kvantifisere cytoplasmatiske Cy5 fluorescens signalet tilskrevet Bcl-2 i hver celle linje. Representant bilder av den flekker kan ses i Figur 3. De udødeliggjort cellelinjer valgt for dette eksperimentet inkludert en rekke lymfoid-avledet cellelinjer, nemlig 697, JeKo-1, Jurkat, RCH-ACV, Granta-519, ŒREH og Raji, i tillegg til jakten, avledet fra en cervical carcinoma. HeLa cellene er kjent for å uttrykke Bcl-2 på et svært lavt nivå28.

Basert på en første immunoblot av alle åtte linjer, ble Granta-519 bestemt å ha den største overfloden av Bcl-2 (vises ikke). Seriell fortynninger av Granta-519 lysate ble brukt i en etterfølgende immunoblot for å finne lineær dynamikkområdet Bcl-2 og GAPDH (lasting kontroll) signaler (figur 4A). Denne immunoblot ble utsatt skannerens digital for varierende lengde av tid. Densitometry bruker analyseprogramvare ble brukt om å kvantifisere signalet fra hvert band, og disse verdiene ble plottet mot mengden av protein lastet (figur 4B). Fra dataene i figur 4B-toppen, det dynamiske området for Bcl-2 i denne analysen strekker seg fra et band intensiteten av nesten null til 7500 (vilkårlig enheter, blå linje). De to høyere eksponeringstider passer en kvadratisk og ikke-lineær formel, antyder overeksponering og metning signal intensitet. Området for GAPDH er fra 3000 til 6500 (vilkårlig enheter, figur 4B-bunnen). Verdier under 3000 (vilkårlig enheter) falt bratt selv når du bruker en relativt lav eksponeringstid. Lang eksponering gir tydelig metning. Fra disse grafer, ble det fastslått at 12 µg ville være en rimelig mengde protein laste når du utfører immunoblot med alle linjer, siden denne mengden protein gitt Bcl-2 intensitetsverdiene innenfor lineær område for Granta-519 cellene, redusere risikoen for overeksponering for alle andre linjer.

En andre immunoblot av alle linjer ble deretter utført i trinn 3.4 og kan ses i figur 5A. Denne blotten var nødvendig siden de første blot inneholdt bandene med en signal intensitet utenfor lineær. Analyseprogramvare ble brukt til å bestemme signal intensiteten av hvert band i nye blot. Bare intensitetsverdiene som innenfor dynamisk bestemt ovenfor ble brukt. Pilene til høyre på figur 4B viser representant intensitetsverdiene som ble brukt og Vis hvor de passer innenfor de lineær. Forholdet mellom Bcl-2:GAPDH ble deretter beregnet for hver celle linje. Dette forholdet, sammen med fluorescens signalet fra hvis ses i figur 5B. En Pearson korrelasjon test viste at intensitet forholdstallene fra immunoblotting ble sterkt og positivt korrelert med intensitet målingene fra kvantitative hvis (r = 0.983, p < 0,001, se figur 5C).

Kvantitativt vurdere mengden Bcl-2 viste seg for å være spesielt vanskelig som det var en rekke uttrykk av dette proteinet over åtte testet celle linjene. Bruker en lang nok eksponering for å fange signalet fra de lave Bcl-2-uttrykke cellelinjer (> 1 s) gjorde det vanskelig å forbli i det dynamiske spekteret for høy Bcl-2-uttrykke celle linjene. I et forsøk på å kvantifisere svak bandene produsert av cellelinjer som HeLa og Raji, flere ulik eksponering ganger, fra 0,1 s 5 s, ble tatt for å finne den lengste eksponeringstiden som kan brukes mens resterende i det dynamiske området for celler som Granta -519 (se figur 6). Innholdet i denne immunoblotting teknikken begrenser nøyaktigheten av som en tilnærminger støy, tyder det brukes optimalt å kvantifisere proteiner som finnes på middels til høy uttrykk nivåer.

Figure 1
Figur 1 : Protokollen arbeidsflytdiagram. Immunofluorescence (hvis) på en celle linje vev microarray (TMA) var kjøre parallelt kvantitative immunoblotting (IB) av cellen linje. Signaler fra hver celle linje sammenlignes ved Pearson sammenheng å validere kvantitative evne til hvis protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Testing og optimalisering immunofluorescence (hvis) protokollen. Deler av mandel ble inkubert med forskjellige fortynninger av anti-Bcl-2 antistoff (1:50, 1: 100, og ingen primære antistoff). Lysbildene ble inkubert med HRP-konjugerte sekundære antistoff signalet ble forsterket ved hjelp av en tyramide-Cy5-konjugert og lysbildene var farget med DAPI. Lysbildene ble skannet på 20 X forstørrelse med filter angir passende til maksimal eksitasjon/utslipp toppene i 350/470 nm og 649/666 nm for DAPI og Cy5, henholdsvis. Respektive eksponeringstider var 160 ms og 200 ms. synsfelt midtstilles over samme lymfoide hårsekken, som forventes å være Bcl-2 negative i (sentral) germinal sentrum og positive i sonen (eksterne) kappe. 1:50 fortynning ga sterkere bestemt fluorescens signal uten å øke uspesifikke signalet ble derfor det brukt som fortynning fremover. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Immunofluorescence (hvis) bruker cellen linje vev microarray (TMA) deler. Deler av cellen linjen TMA ble tatt og inkubert med en 1:50 fortynning av anti-Bcl-2 eller ingen primære antistoff. Lysbildene ble inkubert med sekundær antistoff signalet ble forsterket ved hjelp av en tyramide-Cy5-konjugert og lysbildene var farget med DAPI. Lysbildene ble skannet på 20 X forstørrelse med filter angir passende til maksimal eksitasjon/utslipp toppene i 350/470 nm og 649/666 nm for DAPI og Cy5, henholdsvis. Respektive eksponeringstider var 250 ms og 625 ms. bildene representant indikerer at flekker var vellykket, og at det er et utvalg av Bcl-2 uttrykk over cellen linjene. "Ingen Bcl-2 antistoff" negativ kontroll lysbildet vise ikke alle Cy5 signal, som forventet. Representant bildet er fra 697 cellen linje. En kjerne av hyperplastic mandel vev på TMA viser en tilsvarende mønster som vist i figur 2. Mener fluorescens intensiteten (MFI) for hver celle linje ble bestemt av kvantifisere Cy5 fluorescens signalet ved hjelp av analyseprogramvare. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Å bestemme lineær dynamikkområdet immunoblot (IB) signaler. (A) IBs av føljetong fortynninger av Granta-519 lysate. Hver blott var utsatt for en rekke ganger å finne lineær dynamikkområdet. (B) Band intensitet for Bcl-2 (øverst) og GAPDH (nederst) versus mye total protein lastet for IB i (A). Bandet intensiteter kvantifisert ved hjelp av image analyseprogramvare ImageJ. For Bcl-2 (øverst), signalene forble lineær hele bandet intensiteter når en lav eksponeringstid (exp.) (0,2 s) ble brukt (intensiteter fra 0-7200) som støttes av en Pearson korrelasjonskoeffisient (r verdi) 0.994 (p < 0,001), men ikke for større eksponeringstider 1 s og 2 min. For GAPDH (nederst), data forble lineær over en intensitet av 3000 (vilkårlig enheter) for lav (0,2 s) og mediet (2.2 s) eksponeringstider som støttes av Pearson's r-verdier 0.994 (p < 0,001) og 0.992 (p < 0,001), henholdsvis, men ikke for en høy eksponering tid () 7 s). Pilene til høyre angir bandet intensiteten for bestemt celle linjen identifisert fra immunoblot i figur 5A. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Kvantitative immunoblotting (IB) udødeliggjort linjer og sammenligning til immunofluorescence (hvis). (A) IB av alle linjer. 12 µg totale protein ble lastet inn i hver brønn. (B) IB og hvis signalet intensiteter for hver celle linje. IB signalet er forholdet mellom Bcl-2:GAPDH band intensiteten fra blot i (A) som kvantifisert ved ImageJ. Hvis signalet er fluorescens intensiteten av hver celle linje kjerne på TMA (Figur 3) som bestemmes av bildeanalyse. (C) Scatterplot av hvis signalet versus IB signal. Hvert datapunkt representerer en gitt celle linje. De to metodene produsert lineært korrelert resultatene med Pearson r verdien av 0.984 (p < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Å finne optimale eksponeringstid for kvantitative immunoblotting (IB). IB av alle linjer vises. Tolv mikrogram protein er lastet inn i hver brønn. For hver IB, ble ulike eksponeringstider brukt til å ta et bilde der alle band forble i lineær dynamiske området. Eksponeringstider Bcl-2 og GAPDH strimler henholdsvis var: (A) 0,1 s og 0,1 s, (B) 1 s og 0,2 s, og (C) 5 s og 5 s. paneler A og C viser eksempler på eksponeringer hvor minst noen av feltene på blot var for svak eller for sterk, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrevet en metode som gjør bruk av kvantitative immunoblotting (IB) for å demonstrere nytten av immunofluorescence (hvis) for konstatere relative overflod av et mål protein i FFPE vevsprøver. Gjeldende protein kvantifisering metoder er begrenset av deres kategoriske natur, som kromogent IHC2,3, eller behovet for å homogenize prøver, forebygge etterforskning eksempel struktur og celle populasjoner, som IB og massespektrometri8,9,10,11. Kvantitativ hvis kan overskride disse begrensningene hvis metoden er godkjent og brukes med forsiktighet. Ved å sammenligne hvis readouts til kvantitative iIF udødeliggjort cellen linjer, kunne vi validere semi kvantitative natur hvis tilnærming.

Primære vevsprøver fra pasienter eller forsøksdyr er heterogene ved at de inneholder flere celletyper. Bruk av flere primære antistoffer i multiplex hvis tillater kvantifisering av én eller flere proteiner av interesse i spesifikke celletyper eller cellen rom4,13. Optimalisering og anvendelse av multiplex hvis er utenfor omfanget av denne artikkelen, men er beskrevet i de følgende papirer16,17,18,29. Bred filosofi er å etiketten celle populasjoner og bare kvantifisere protein rundt i ønsket celle rommet, for eksempel kjerner eller cytoplasma, i hvilken ønsket celle. Når kvantitative natur hvis med et bestemt antistoff har blitt bekreftet av kvantitative IB, kan protokollen bli oppskalert til å tillate rask, høy gjennomstrømming protein kvantifisering i klinisk prøver. Kliniske applikasjoner krever vanligvis bestemmelse av relativ, i stedet for absolutte, protein overflod. Hvis tilnærming kan imidlertid gjøres formelt kvantitative om nødvendig. For eksempel en løsning som inneholder renset rekombinant Bcl-2 protein kan være forberedt og kvantifisert ved hjelp av en standard biokjemiske metode. Seriell fortynninger kan deretter bli vurdert av kvantitative IB og en standardkurve generert beregne absolutt proteininnholdet per celle i hver celle linje.

Vi brukt vårt hvis protokollen TMA delene representerer biopsi prøver fra 66 tilfeller de novo diffus stor B-celle lymfom. Resultatene viste akseptabel Kjør bruk reproduserbarhet (Pearson r = 0.837) og forventet, sterk tilknytningen mellom "Bcl-2-positiv" status bestemt subjektivt av visuelle scoring av konvensjonelle IHC og forhøyet uttrykk bestemt objektivt av hvis (p < 0,001). Videre Bcl-2 overflod hvis korrelert med Bcl-2 mRNA overflod i samme prøvene (Spearman ρ = 0.69, p < 0,001) og var betydelig større i tilfeller med kopi nummer gevinster av BCL2 genet (p = 0.042) eller translokasjon av BCL2 til IGH locus (p = 0.004), som bestemmes av fluorescens i situ hybridisering. Vi oppnådd tilsvarende resultater i en separat kohort av tilfellene. Disse funnene gi ytterligere bevis som støtter hvis som en gyldig metode for å bestemme den relative overfloden av Bcl-2 i rutinemessige FFPE eksemplarer. Bruk av om å kvantifisere flere andre biomarkør proteiner i primære prøvene har vært beskrevet tidligere16,17.

Optimalisering av denne protokollen er en todelt prosess. Først om med primære antistoffer brukes må være optimalisert (trinn 2.1). Kommersielle antistoffer vanligvis foreslå fortynninger for IHC protokoller som skal brukes som utgangspunkt sammen med en fortynning eller to over og under denne (dvs. hvis 1: 100 anbefales, legge 1:50 og 1:150). Etter utfører hvis og skanning lysbildet, innebærer bestemme hvilke fortynning "optimal" visuell inspeksjon for å identifisere den primære antistoff fortynning som genererer det klareste signalet uten bakgrunn fluorescens. Den andre fasen av optimalisering innebærer å velge hvor mye protein laste for immunoblot å sikre at hvert band forblir i lineær området (trinn 3.4). For å sikre dette, utføres det en immunoblot med en seriell fortynning av cellen linjen som uttrykker største overflod av målet protein. Her kan bandet intensiteter versus protein beløpet tegnes å bestemme intensiteten områdene der signalet forblir lineær. Siden denne serien er etablert i celle linje med rikeste målet protein, for en gitt mengde protein vil alle andre linjer gi lavere signaler. Når du flytter til en immunoblot på alle linjer (trinn 3.4), brukes fortynning serien å informere et protein Beløp laste som vil gi sterke signaler uten risiko for overeksponering utenfor lineær rekkevidden.

Til tross for fordelene med denne protokollen, bruk av immunoblotting som bekreftelsesmåte kvantifisering har sine mangler. Hovedanliggende dreier av det store utvalget av uttrykk for ulike proteiner mellom eksemplarer. Det kan være vanskelig å holde alle prøver innenfor rammene av en lineær utvalg hvis noen prøver uttrykke protein av interesse for en mye større grad enn andre. Representant treff ovenfor, ble ulike eksponeringer tatt for å få et bilde der ekstreme (høy og lav) ligger begge innenfor lineær dynamikkområdet (figur 6). Større enn forventet hvis signaler sett for HeLa og Jurkat cellene i figur 5B kan tyde begge lavest mulig hvis signalet for dette systemet, eller at IB signaler har nådd bunnen av lineær deteksjon begrense og er mindre nøyaktige. Uansett, angir dette at hvis verdiene på dette området er mindre sannsynlighet for å være nøyaktig i dette systemet, og at teknikken er optimal for medium - til svært-uttrykt proteiner. I tillegg, er bruk av HRP-konjugerte sekundære antistoffer ikke optimal for kvantitative formål, som omtalt tidligere forhold til IHC2,3. Bruke fluorescently merket sekundære antistoffer for immunoblot vil gi en mer robust bekreftelse på at hvis er faktisk lineært kvantitative30,31, men Pearson r-verdien for 0.984 får den HRP-konjugerte antistoffer sekundær antistoffer i over protokollen var tilstrekkelig for dagens formål. Potensielle svakheter knyttet hvis, slik som autofluorescence og slukke varierer basert på enkelt laboratorium instrumentering, praksis og vev type, og kan reduseres ved ulike forebyggende tiltak32,33. En svært liten mengde autofluorescence i representant resultatene kan sees i noen Bcl-2 antistoff eksemplet i Figur 3, men dette beløpet er ubetydelig i forhold til de gjenværende hvis signaler.

Behovet for å tallfeste nøyaktig proteiner av interesse fra FFPE vevsprøver gjelder kliniske og forskning i mange biologiske områder. Protokollen presenteres her skisserer bruk av kvantitative hvis på FFPE vev deler og validerer sin semi kvantitative natur ved immunoblotting av udødeliggjort linjer. Denne metoden tillater kvantifisering over et bredt dynamisk område, samt vedlikehold av den strukturelle integriteten til vev utvalget, ikke beholdes i mange andre kvantifisering metoder3,8,11. I tillegg denne protokollen er lett tilpasses og kan brukes i forskning og klinisk innstillinger, spesielt for kreft relatert forskning og prognose.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet var delvis finansiert av Fredrick Banting og Charles Best Canada Graduate Scholarship (am).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
697 DSMZ ACC 42 Cell line
JeKo-1 ATCC CRL-3006 Cell line
Jurkat ATCC TIB-152 Cell line
RCH-ACV DSMZ ACC 548 Cell line
Granta-519 DSMZ ACC 342 Cell line
REH DSMZ ACC 22 Cell line
Raji ATCC CCL-86 Cell line
HeLa ATCC CCL-2 Cell line
Trypsin/EDTA solution Invitrogen R001100 For detaching adhesive cells
Fetal bovine serum (FBS) Wisent Inc. 81150 To neutralize trypsin
Neutral Buffered Formalin Protocol 245-684 For fixing cell pellets
UltraPure low melting point agarose Invitrogen 15517-022 For casting cell pellets
Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 Dako (Agilent) cat#: M088729-2, RRID: 2064429 To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786
Ventana Discovery XT Roche - For automation of immunofluorescence staining
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) Dako (Agilent) K4000 For immunofluorescence signal amplification
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) Dako (Agilent) K4002 For immunofluorescence signal amplification
Cyanine 5 tyramide reagent Perkin Elmer NEL745001KT For immunofluorescence signal amplification
Aperio ImageScope Leica Biosystems - To view scanned slides
HALO image analysis software Indica Labs - For quantification of immunofluorescence
Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) Thermo Scientific 1862209 To add to RIPA buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BioShop EDT001 For RIPA buffer
NP-40 BDH Limited 56009 For RIPA buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 For RIPA buffer
Glycerol FisherBiotech BP229 For Laemlli buffer
Bromophenol blue BioShop BRO777 For Laemlli buffer
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad 161-0611 For Laemlli buffer
Bovine serum albumin (BSA) BioShop ALB001 For immunoblot washes
Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) Bio-Rad 161-0374 For running protein gel
Filter paper (Extra thick blot paper) Bio-Rad 1703969 For blotting transfer
Nitrocellulose membrane Bio-Rad 162-0115 For blotting transfer
Trans-blot SD semi-dry transfer cell Bio-Rad 1703940 For semi-dry transfer
Skim milk powder (Nonfat dry milk) Cell Signaling Technology 9999S For blocking buffer
Tween 20 BioShop TWN510 For wash buffer
GAPDH rabbit monoclonal antibody Epitomics 2251-1 Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C)
Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody abcam cat#: ab6789, RRID: AB_955439 Secondary antibody for immunoblot
Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody abcam cat#: ab6721, RRID: AB_955447 Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5)
Clarity Western ECL substrates Bio-Rad 1705060 For immunoblot signal detection
Amersham Imager 600 GE Healthcare Life Sciences 29083461 For immunoblot signal detection
ImageJ software Freeware, NIH - For densitometry analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khoury, J. D., et al. Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).
  2. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).
  3. Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. Interpretation and quantification of immunostains. The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).
  4. Rimm, D. L. What brown cannot do for you. Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).
  5. Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).
  6. Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging? Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).
  7. Rzagalinski, I., Volmer, D. A. Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry – A tutorial review. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).
  8. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).
  9. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  10. Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).
  11. Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).
  12. Denburg, M. R., et al. Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).
  13. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  14. Peck, A. R., et al. Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).
  15. Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).
  16. AlJohani, N., et al. Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival. Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).
  17. Wood, B., et al. Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease. Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).
  18. Weberpals, J. I., et al. First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16. Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).
  19. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH protocols. , (2008).
  20. Fedor, H. L., Marzo, A. M. De Practical Methods for Tissue Microarray Construction. Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).
  21. Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).
  22. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  23. Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting. Nature Protocol Exchange. , (2013).
  24. Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies. Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).
  25. Bosch, M., et al. A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).
  26. Li, Y., et al. BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).
  27. Choi, Y. W., et al. High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy. International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).
  28. The Human Protein Atlas BCL2. , https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna (2018).
  29. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  30. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
  31. Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).
  32. Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment & Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).
  33. Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9 (1), 13 (2008).

Tags

Biologi problemet 143 Immunofluorescence formalin-fast parafin-innebygd kvantitativ immunoblot western blot patologi protein biomarkør histology immunohistology
Kvantitativ Immunoblotting cellen linjer som Standard til å validere Immunofluorescence for kvantifisering biomarkør proteiner i rutinemessig vevsprøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moore, A. M., Boudreau, L. R., Virk, More

Moore, A. M., Boudreau, L. R., Virk, S., LeBrun, D. P. Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples. J. Vis. Exp. (143), e58735, doi:10.3791/58735 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter