Summary

Proteína quinasa c-Delta inhibidor péptido formulación usando nanopartículas de oro

Published: March 09, 2019
doi:

Summary

Anteriormente hemos utilizado un híbrido de péptido nanopartículas de oro para entregar por vía intravenosa un péptido sintético, inhibidor de proteína cinasa C-delta, que reduce la lesión pulmonar aguda inducida por isquemia-reperfusión. A continuación os mostramos el protocolo detallado de la formulación de la droga. Otros péptidos intracelulares pueden ser formuladas de manera similar.

Abstract

Inhibidores de proteína quinasa c-Delta (PKCδi) es un fármaco prometedor para evitar lesiones de órgano inducida por isquemia-reperfusión. Generalmente se conjuga a un penetración de célula péptido, TAT, para la entrega intracelular. Sin embargo, TAT ha mostrado actividad biológica no específica. Nanopartículas de oro (SPNG) pueden utilizarse como portadores de drogas entrega sin toxicidad reconocida. Por lo tanto, hemos utilizado un híbrido de GNP/péptido para entregar PKCδi. Dos cortos péptidos (P2: CAAAAE y P4: CAAAAW), en una proporción de 95: 5, fueron utilizados para modificar las propiedades superficiales del PNB. SPNG conjugado con PKCδi (GNP/PKCi) es estables en agua destilada 0,9% NaCl y el tampón fosfato salino (PBS) con albúmina sérica bovina o suero bovino fetal. La inyección intravenosa de GNP-PKCi fue demostrada previamente para evitar lesiones de isquemia-reperfusión pulmonar. Este artículo describe un protocolo para GNP/PKCi de formular y evaluar las propiedades fisicoquímicas de GNP/PKCi. Hemos utilizado métodos similares para formular otros fármacos basados en péptidos con el PIB. Este artículo que sacarán más atención a esta tecnología de entrega de nuevas drogas intracelular y sus aplicaciones en vivo.

Introduction

Trasplante de pulmón guarda a pacientes con fase final pulmón enfermedad1. Sin embargo, complicaciones serias después de trasplante de pulmón siguen siendo un obstáculo. En las primeras etapas después del trasplante del pulmón, la disfunción primaria del injerto es la complicación más perjudiciales1, y su principal causa es la isquemia-reperfusión (IR)-inducida de lesión pulmonar aguda2.

Bajo conservación en frío, el metabolismo en el pulmón de un donante es restringido a un nivel muy bajo. Sin embargo, la síntesis de óxido nítrico y especies reactivas de oxígeno se activan debido a la cesación del flujo de sangre3. Después del trasplante, se restablece la circulación de la sangre, y especies reactivas del oxígeno y el óxido nítrico generado durante la isquemia fría mejoran la inflamación y muerte celular, dando por resultado la lesión del tejido.

Para evitar lesiones de IR, se ha utilizado un inhibidor de proteína cinasa Cδ (PKCδi) en el corazón, cerebro y pulmón4,5,6,7,8. Estos estudios demostraron que el PKCδi disminuido la inflamación y la apoptosis durante la reperfusión. También ha impedido pulmonar lesiones IR en ratas y en un modelo de trasplante pulmonar6. PKCδi generalmente se conjuga con un penetración celular péptido, TAT, para la entrega intracelular. Sin embargo, se ha demostrado que el péptido de TAT solo tiene efectos biológicos no específicos, incluyendo la promoción de la angiogénesis, apoptosis y la inhibición de múltiples citoquinas9,10,11. Nanopartículas, pequeñas partículas que van desde 1 a 100 nm de diámetro12, han sido exploradas como candidatos en la facilitación de entrega de drogas13. En particular, nanopartículas de oro (SPNG) son consideradas como no invasiva y no tóxico. Por lo tanto, hemos desarrollado SPNG como portadores de entrega de medicamentos de fármacos basados en péptidos14,15.

La superficie de PNB puede ser manipulada para aplicaciones específicas como el reconocimiento molecular16,17, sensores químicos18, imagen19y entrega de la droga. Se ha desarrollado un sistema híbrido de GNP/péptido, que contiene 20 nm SPNG y dos péptidos cortos (P2: CAAAAE y P4: CAAAAW) en una proporción de 95: 5, para modificar las propiedades superficiales de PNB. El péptido de la P2, con el cargado negativa el ácido glutámico (E) al final, estabiliza el SPNG en una solución acuosa, y el péptido de P4, con el triptófano hidrofóbico (W) al final, ayuda a PNB entrada en células14. El residuo de cisteína (C) en el término de N de estos péptidos contiene un grupo tiol que puede conjugar a las superficies del oro14. Este híbrido de péptido y PNB se utilizó más para entregar PKCδi (CSFNSYELGSL). La relación molar optimizada de P2:P4 a PKCδi es 47.5:2.5:50. SPNG conjugado con PKCδi (GNP/PKCi) son estables en agua destilada, 0.9% NaCl y PBS con albúmina bovina o suero bovino fetal14. La inyección intravenosa de GNP/PKCi se ha demostrado para prevenir lesiones de isquemia-reperfusión del pulmón15. Este artículo describe un método para formular GNP/PKCi y describe cómo evaluar las propiedades fisicoquímicas de GNP/PKCi. Hemos utilizado métodos similares para formular otros fármacos basados en péptidos conjugados a GNP20,21,22. Esperamos que este artículo dibuja más atención a esta formulación novedosa para la entrega intracelular de la droga.

Protocol

1. preparación de soluciones de péptido Recuperar los péptidos (P2: CAAAAE, P4: CAAAAW, PKCδi: CSFNSYELGSL) del congelador de-20 ° C y descongelar a temperatura ambiente (RT).Nota: Mantenga el frasco cerrado para evitar que la humedad de condensación en los péptidos. Pesar 0.01 g de cada péptido en una microescala. Poner cada péptido en un tubo cónico de 50 mL separadas. Añadir 18,74 mL de agua desionizada (DI) al tubo de P2. Añadir 16,93 mL de agua desionizada al t…

Representative Results

Se debe evaluar las propiedades biofísicas del GNP/PKCi híbrido, como GNP tiende a agregado de solvente. Cuando se agrega GNP, el color de la solución cambia de color de rosa a púrpura (Figura 1a). Espectrofotómetro UV-Vis es capaz de detectar los cambios más sensible. Si GNP/PKCi no se agrega el pico de absorción debe ser en 525 nm (Figura 1b). Si se agrega el PNB, el pico de absorción se desplazan hacia la derecha. Como…

Discussion

Para garantizar la formulación correcta, es crucial que la solución de δPKCi sufre el paso de sonicación en 1.6. ΔPKCi secuencia de péptido contiene moléculas hidrofóbicas, por lo que un sonicador ayuda a disolver PKCi en la solución de 50% acetonitrilo. Además, es muy importante mezclar el solvente meticulosamente, como se indica en el paso 2.7.  El híbrido de GNP/PKCi no se bien formularán si estos pasos no se realizan correctamente, debido a la agregación del péptido δPKCi23.<br…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo es apoyado por becas de investigación de los institutos canadienses de investigación en salud (PJT-148847), Ministerio de investigación e innovación de Ontario (RE-08-029) y Canadá primer investigación de excelencia del programa, medicina por diseño en la Universidad de Toronto. Dr. Mingyao Liu es James y María Davie Cátedra de lesión pulmonar, la reparación y la regeneración.

Materials

negatively charged glutamic acid peptide (P2) CanPeptide Sequence: CAAAAE-NH2
Length: 6aa
Modification: C-terminal amidation
Quantity: 50mg
Purity: >95%
hydrophobic tryptophan peptide (P4) CanPeptide Sequence: CAAAAW-NH2
Length: 6aa
Modification: C-terminal amidation
Quantity: 50mg
Purity: >95%
δPKCi peptide CanPeptide Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2
Length: 11aa
Modification: C-terminal amidation
Quantity: 50mg
Purity: >95%
Conical tube(50ml) Corning Life Sciences 3582070
Conical tube(15ml) Corning Life Sciences 3582096
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004-100ML
Sonicator Branson Ultrasonics Corp. Branson 2510MTH
Microtube Diamed.ca AD 150-N
Gold nanoparticle solution Ted Pella 15705-5 A particle size is 20nm
Rocking Platform shaker VWR international 40000-304 
Microcentrifuge Eppendorf 5417R
Acryl cuvette SARSREDT 67.758
UV-Vis spectrophotometer Agilent Caty 60 UV-Vis

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Konoeda, H., Yang, H., Yang, C., Gower, A., Xu, C., Zhang, W., Liu, M. Protein Kinase C-delta Inhibitor Peptide Formulation using Gold Nanoparticles. J. Vis. Exp. (145), e58741, doi:10.3791/58741 (2019).

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