Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Извлечение и анализ тайваньского зеленый прополиса

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58743
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University

Summary

Мы представляем протокол для использования этанола в качестве растворителя для извлечения и характеризуют Тайваньская зеленый прополис обладает антибактериальной активностью.

Abstract

Тайваньская зеленый Прополис богат prenylated флавоноиды и экспонаты широкий спектр биологических мероприятий, таких как антиоксидант, антибактериальные и противораковых те. Биоактивных соединений Тайваньская зеленый прополиса являются propolins, а именно C, D, F и G. Концентрация propolins в тайваньской зеленый Прополис варьируется в зависимости от сезона и географического расположения. Таким образом крайне важно для установления стандартной процедуры для определения качества Тайваньская зеленый прополиса. Здесь мы представляем протокол, использующий добычи на основе этанола, высокой производительности жидкостной хроматографии и анализ антибактериальной активности для характеристики качества Тайваньская зеленый прополис. Этот метод показывает, что 95% и 99,5% этанола извлечений добиться максимальной сухого вещества урожайности от тайваньской зеленый прополис, тем самым давая самые высокие концентрации propolins, имеют антибактериальные свойства. Согласно этим выводам настоящий Протокол считается надежные и повторяемые для определения качества Тайваньская зеленый прополиса.

Introduction

Прополис представляет собой естественный смолистый смесь, производимые виды пчела Apis mellifera. Прополис широко использовался с древних времен в народных лекарственных средств. Исследования недавно сообщили, что прополис является полезным для предотвращения микробной инфекции и воспаления1. Многочисленные исследования показали, что основными биологически активных соединений в прополис являются флавоноиды, фенольные кислоты эфиры, prenylated p-кумариновая кислоты и diterpenic кислоты2,3. На сегодняшний день, были определены 10 prenylated флаванонов производные от тайваньской зеленый Прополис через высокой производительности жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)4,5,6,7. Наиболее распространенными среди них являются propolins C, D, F и G5,7. Значительные биологические эффекты Тайваньская зеленый Прополис коррелируют с его высоким содержанием propolins8.

Концентрации биологически активных соединений в прополис различаются в зависимости от сезона и географического расположения, из которого получается прополиса. Европейский Прополис содержит главным образом флавоноид aglycone и фенольные кислоты9. Основными биологически активных соединений в прополис из Бразилии, prenylated p-кумариновая кислоты, такие как artepillin C10. Исследование показало, что сезон является критическим фактором для определения содержания всего propolin в тайваньской зеленый Прополис11. Содержание propolin в тайваньской зеленый Прополис является высоким в летнее время (Май - Июль) и низких в зима11. Антибактериальные свойства прополиса было широко считается показателем биологической активности. Как правило образцы прополис, собранных из различных регионов продемонстрировали аналогичные антибактериальные свойства; Например он обычно эффективен в отношении почти всех грамотрицательных бактерий и выставок ограниченное антибактериальный эффект против грамотрицательных бактерий10,12,13. Чтобы иметь антибактериальный эффект14были продемонстрированы синергического взаимодействия между флавоноиды в прополис. Аналогичным образом Тайваньская зеленый прополисом было сообщено иметь Антимикробный эффект против грамположительных бактерий15. Кроме того исследование также выявило Антимикробный эффект от взаимодействия propolins в тайваньской зеленый Прополис8.

Характеристика биологически активных соединений в прополис трудно, потому что его химический состав могут варьироваться в соответствии его источник происхождения. Таким образом необходимо установить осуществимым и повторяемые метод для определения качества Тайваньская зеленый прополиса. Однако стандартная процедура не была создана для извлечения Тайваньская зеленый прополис и последующих функционального анализа. Были предложены несколько методов, которые разнообразно применение органических и неорганических растворителей для Прополис извлечения16,,1718,19,20. Потому что прополис является смесью липофильных, исследования показали, что органические извлечения лучше чем неорганических извлечения8,18,19. Общая propolin концентрация в тайваньской зеленый прополис и его антибактериальные свойства являются ключевыми показателями качества Тайваньская зеленый прополиса. Таким образом цель настоящего исследования – представить протокол для использования этанола в качестве растворителя для извлечения и характеризуют антибактериальные свойства Тайваньская зеленый прополис.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка извлечено этанола соединений

  1. Вес 10 г замороженных Тайваньская зеленый прополиса, которая была собрана из ульев в Тайване с мая по Июль, и растереть его с помощью специй мельницы. Подтвердите, что целые куски Тайваньская зеленый Прополис измельчается в порошок без каких-либо крупных частиц.
  2. Добавьте 100 мл различных концентраций этанола (60%, 70%, 80%, 95% и 99,5%) и воды, чтобы отделить колбы и перемешать каждый концентрации с 10 г прополиса земли.
  3. Инкубировать при 25 ° C и встряхнуть колбу в 250 об/мин в течение 48 часов.
  4. Фильтр этанола экстракты через фильтр-бумаги с порами размером 25 мкм.
  5. Воссоздать фильтратами до их первоначального объема (100 мл) с 95% этанола с помощью объемной колбу.
  6. Хранить этанола выдержки при температуре-20 ° C.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.

2. Подготовка этанола экстрактов для ВЭЖХ

  1. Концентрата 10 мл этанола экстрактов вакуумного испарения при 40 ° C на 15 мин.
  2. Выпекать сухого вещества на 45 ° C в течение 24 ч.
  3. Воссоздать сухого вещества с 10 мл этанола 95%.
  4. Фильтр 1 мл этанола выдержки, с помощью стерильного шприца фильтр с размером пор 0,45 мкм.
  5. Refilter экстракты этанол, с использованием стерильных шприцев фильтр с размером пор 0,22 мкм. Фильтрат собирается и могут непосредственно быть проанализированы с помощью ВЭЖХ.

3. анализ содержания Propolin, с помощью ВЭЖХ

  1. Создание стандартных кривых propolins
    1. Подготовка 1 Л мобильных фазы метанола: водный раствор 88.8:11.2 (v/v).
    2. Подготовить серийных разведений propolin стандарт (C, D, F и G) концентрации (15.625 мг/мл, 31,25 мг/мл, 62,5 мг/мл и 125 мг/мл, соответственно) с использованием мобильных фазы решения как растворитель.
    3. Придать 20 мкл propolin стандартной концентрации в столбце реверс фаза, последовательно от низкой концентрации в высокой концентрации.
    4. Задайте столбец ВЭЖХ на 30 ° C и скорости потока в 1 мл/мин.
    5. Установка длины волны УФ детектор до 280 Нм и рекордер время до 20 мин.
    6. Анализ стандартов по крайней мере 3 x.
    7. Участок измерения ответ (ось y) против концентрации (ось x) с помощью вычисления листа программного обеспечения и создать калибровочной кривой с помощью уравнения и значения R-квадрат.
  2. Анализ этанол экстракт s
    1. Придать 20 мкл этанола экстракты, полученные из шаг 2,5 в столбце реверс фаза.
    2. Задайте столбец ВЭЖХ на 30 ° C и скорости потока в 1 мл/мин.
    3. Установка длины волны УФ детектор до 280 Нм и рекордер время до 20 мин.
    4. Анализ стандартов по крайней мере 3 x.
    5. Рассчитайте концентрацию propolin в экстракте этанола, используя уравнение для стандартной кривой, полученные из шага 3.1.7, использующий площади пика для каждого propolin.

4. Минимальный тормозной концентрации и минимум бактерицидная концентрация анализ

Примечание: Метод microdilution используется для оценки антибактериальной эффективности этанол извлечь propolins из тайваньской зеленый прополис.

  1. Подготовка испытания организмов
    1. Оттепель бактериальных штаммов, золотистый стафилококк и Escherichia coli и затем, культура их в tryptic соевый бульон и питательный бульон, соответственно, при 37 ° C в течение 24 ч.
    2. Проход S. aureus , используя tryptic соевый бульон и E. coli с помощью питательный бульон для двух поколений и, затем, рассчитать колонии формирование подразделений путем подсчета отдельных колоний на плите агар.
  2. Подготовка этанола экстракты для антибактериальная активность тестирование
    1. Концентрат экстрактов этанола, полученные на шаге 1.5 вакуумного испарения при 40 ° C на 15 мин.
    2. Воссоздания сухого вещества с диметилсульфоксида (ДМСО) и регулировка концентрации экстракта 12.8 мг/мл.
    3. Сделать последовательный разрежения (концентрации: 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 и 640 мкг/мл) этанола экстрактов с использованием бульон.
  3. Минимальная концентрация ингибирующее тесты
    1. 10 мкл разбавленного этанола экстрактов, начиная от 0,156 640.0 мкг/мл в плиту 96-луночных.
    2. С помощью бульон, отрегулируйте громкость до 100 мкл и сохранить 5% ДМСО в всех разведениях.
    3. Прививать 100 мкл бактериальной культуры (1 х 106/мл) в 96-луночных пластины.
    4. Посевные культуры, содержащие различные концентрации этанола выдержки при 37 ° C в течение 48 часов.
    5. Анализировать бактериальный рост зависимости мутности и с помощью оптической плотности (Считыватель микропланшетов) на 590 нм для определения минимальной концентрации тормозной (MIC).
  4. Бактерицидная концентрация минимум тесты
    1. Прививать 10 мкл жидкого культуры от каждой скважины MIC теста, которые выставлены не роста на агаре пластину.
    2. Инкубируйте при 37 ° C в течение 24 ч.
    3. Определите бактерицидной активности путем выявления низкие концентрации, которые показали без видимых роста бактерий. Концентрации, которая полностью исключает рост клеток считается минимальным бактериальных концентратов (МБК).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В таблице 1представлены положительные репрезентативных данных для извлечения этанола. Урожай сухой массы от тайваньской зеленый Прополис был положительно связаны с концентрацией этанола. Экстракты этанола 95% и 99,5% имели наивысший сухого вещества доходность от тайваньской зеленый прополис. Доходность низкая сухого вещества от тайваньской зеленый Прополис произошел, когда воды был использован в качестве экстракции растворителем. Эти результаты показывают, что органического растворителя, например этанола, выполняет лучше для извлечения Тайваньская зеленый прополис. Сигнал стандарта propolins, C, D, F и G была определена и количественно с помощью ВЭЖХ (рис. 1a). Сигнал propolins в экстрактах этанола характеризовался с использованием отдельных propolin стандартов и ВЭЖХ (рис. 1b). Как правило концентрация propolins (C, D, F и G) в тайваньской зеленый Прополис положительно связаны с концентрацией этанола во время извлечения (Таблица 1). Высокий урожай propolins в тайваньской зеленый Прополис был выпущен в экстрактах этанола 95% и 99,5%.

Позитивные репрезентативных данных для антибактериальный эффект этанола экстрактов представлены в таблице 2. Были изучены антибактериальная активность против S. aureus и E. coli в экстрактах этанола. Средняя MIC и МБК этанола экстрактов для S. aureus были 10-20 мкг/мл и 20 мкг/мл, соответственно (Таблица 2). Водные экстракты не имеют антибактериальное воздействие против S. aureus (Таблица 2). Не антибактериальный эффект на E. coli наблюдалось либо с этанолом или водных экстрактов (Таблица 2).

Figure 1
Рисунок 1: определение propolins в тайваньской зеленый прополис. Эти панели показывают () стандарты propolins и (b) измерение propolins в тайваньской зеленый Прополис с помощью ВЭЖХ. Этот показатель был изменен с Чэнь и др. 8. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Растворитель * Доходность (%) Propolin (C + D + F + G)
(мг/мл)
99,5% EtOH 66.75 ± 0,5** 36.73 ± 0,80
95% EtOH 66,25 ± 0,50 37.55 ± 1.29
80% EtOH 64.75 ± 0,96b 34,25 ± 0,71b
70% EtOH 63.25 ± 0,96c 31.53 ± 0.31c
60% EtOH 59.00 ± 1,41d 29.34 ± 1,59d
Воды 7.00 ± 0,82e ND ***

Таблица 1: сухие материи доходность (%) и содержание (мг/мл) propolin в тайваньский зеленый прополис, извлеченный с помощью различных растворителей. * 10 г прополиса было извлечено с помощью 100 мл растворителя, и экстракты были наконец восстановлена до 100 мл. ** Значения являются среднее ± стандартное отклонение (SD). a-e Средства в столбце, которые имеют без общих надстрочный значительно отличаются (P < 0,05). ND = не обнаружено. Эта таблица была изменена с Чэнь и др. 8.

Экстракт Золотистый стафилококк Кишечная палочка
MIC (мкг/мл) МБК (мкг/мл) MIC (мкг/мл)
99,5% EtOH 10 20 > 640
95% EtOH 10 20 > 640
80% EtOH 20 20 > 640
70% EtOH 10 20 > 640
60% EtOH 20 20 > 640
Воды ND ND ND

Таблица 2: микрофон и МБК (мкг/мл) различных экстрактов против S. aureus и E. coli. Эта таблица была изменена с Чэнь и др. 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Исследования сообщили, что мацерации, используя различные концентрации этанола, могут использоваться для извлечения бразильский Прополис17; Однако этот процесс был длительным17. Он взял по крайней мере 10 дней для извлечения биологически активных соединений, например, фенольные, бразильский Прополис17. Кроме того для извлечения бразильский Прополис19,,2122было предложено извлечения этанола в сочетании с нагрева при 37 ° C, 50 ° C или 70 ° C за 30 мин. Было установлено, что биологически активных соединений в Бразилии Прополис добывались дифференцировано в зависимости от доли этанола19. Эффективность извлечения биологически активных соединений в прополис может отличаться из-за различных химических составов бразильский прополис и Тайваньская зеленый прополиса. Здесь мы предоставляем надежные и повторяемые протокол для извлечения Тайваньская зеленый прополиса. Биологически активных соединений в тайваньской зеленый прополис может быть собрано в течение 2 дней, использование этанола в качестве растворителя. Аналогичный вывод также поддерживает протокол представлены здесь и определено, что propolins (C, D, F и G) от тайваньской зеленый Прополис могут быть извлечены с использованием 95% этанола в сочетании с 3 день извлечения23. Другое исследование показало, что 95% этиловом спирте в сочетании с 21 h извлечение смогла урожай propolins из Тайваня зеленый Прополис24. Однако точные концентрации propolins после извлечения этанола 21 h должны проверяться. Исследователи предложили, что процесс нагрева увеличивает эффективность извлечения для бразильской Прополис19,21,22. Ли propolins из Тайваня зеленый Прополис могут быть извлечены при нагревании должны быть расследованы.

Этанол выдержки из тайваньской зеленый Прополис имеют антибактериальное воздействие против грамположительных возбудителей. Потому что прополис гидрофобная, исследования показали, что органический растворитель например этанол является подходящего растворителя для Прополис извлечения8,16,,1718,19, 20. Исследования также показали, что увеличение этанола концентрации приводит к более извлечения биологически активных соединений8,,1718,20. В настоящем Протоколе максимальная сухого вещества, что урожайность Тайваньская зеленый Прополис наблюдаются в 95% и 99,5% этанола экстракты, а также самая высокая концентрация propolins и антибактериальной активностью.

Настоящий протокол предназначен для тайваньских зеленый Прополис выведения этанола, и оценки качества производится на основе содержания propolins. Однако некоторые этанола нерастворимые биологически активных соединений в тайваньской зеленый Прополис не может быть должным образом изолированы с помощью настоящего Протокола.

Наиболее важным аспектом метода в отношении существующих методов является, что этот метод экономит время относительно методов, предложенных в других исследованиях17,23. Кроме того 95% и 99,5% этанола экстракты Тайваньская зеленый Прополис выставлены высокую концентрацию propolins и антибактериальной активностью.

Этот подход имеет прямого применения характеризующих других неизвестных этаноле, растворим биологически активных соединений в тайваньской зеленый прополиса. Кроме того экстракты этанола, содержащие propolins может использоваться для определения других bioactivities.

Одна из ключевых экспериментальных процедур является обеспечение единообразия Тайваньская зеленый прополиса при шлифовании (протокол шаг 1.1). Неуместным шлифование Тайваньская зеленый прополис может привести к низкой сухого вещества урожайности и propolin содержание. Важно, чтобы использовать правильного шлифовальный аппарат, например spice Гриндер, ткани мясорубку или гомогенизатор и заботиться, что прополис становится мелкий порошок без каких-либо крупных частиц, оставшихся после шлифования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего объявить.

Acknowledgments

Этот манускрипт был отредактирован Уоллес академических редактирования.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ethanol Sigma-Aldrich E7023
Whatman no. 4 filter paper Sigma-Aldrich WHA1004125
methanol Sigma-Aldrich 34860
reverse phase RP-18 column Phenomenex Inc. 00G-0234-E0
Staphylococcus aureus ATCC BCRC 10780
Escherichia coli ATCC BCRC 10675
tryptic soy broth Sigma-Aldrich 22092
nutrient broth Sigma-Aldrich 70122
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
spice grinder Waring WSG60K
microplate Reader Molecular Devices EMAX PLUS
HPLC system Agilent 1200 Series
vacuum evaporation BÜCHI Rotavapor R-215

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zabaiou, N., et al. Biological properties of propolis extracts: Something new from an ancient product. Chemistry and Physics of Lipids. 207 (Pt B), 214-222 (2017).
  2. Bankova, V. B., De Castro, S. L., Marcucci, M. C. Propolis: Recent advances in chemistry and plant origin. Apidologie. 31 (1), 3-15 (2000).
  3. Park, Y. K., Alencar, S. M., Aguiar, C. L. Botanical origin and chemical composition of Brazilian propolis. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50 (9), 2502-2506 (2002).
  4. Chen, C. N., Wu, C. L., Shy, H. S., Lin, J. K. Cytotoxic prenylflavanones from Taiwanese propolis. Journal of Natural Products. 66 (4), 503-506 (2003).
  5. Chen, C. N., Weng, M. S., Wu, C. L., Lin, J. K. Comparison of radical scavenging activity, cytotoxic effects and apoptosis induction in human melanoma cells by Taiwanese propolis from different sources. Evidence-Based Complementary and Alternative. 1 (2), 175-185 (2004).
  6. Chen, C. N., Wu, C. L., Lin, J. K. Apoptosis of human melanoma cells induced by the novel compounds propolin A and propolin B from Taiwanese propolis. Cancer Letters. 24 (1-2), 218-231 (2007).
  7. Huang, W. J., et al. Propolin G, a prenylflavanone, isolated from Taiwanese propolis, induces caspase-dependent apoptosis in brain cancer cells. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (18), 7366-7376 (2007).
  8. Chen, Y. W., Ye, S. R., Ting, C., Yu, Y. H. Antibacterial activity of propolins from Taiwanese green propolis. Journal of Food and Drug Analysis. 26 (2), 761-768 (2018).
  9. Hegazi, A. G., Abd El Hady, F. K., Abd Allah, F. A. M. Chemical composition and antimicrobial activity of European propolis. Zeitschrift für Naturforschung. 55 (1-2), 70-75 (2000).
  10. Sforcin, J. M., Fernandes, A., Lopes, C. A. M., Bankova, V., Funari, S. R. C. Seasonal effect on Brazilian propolis antibacterial activity. Journal of Ethnopharmacology. 73 (1-2), 243-249 (2000).
  11. Chen, Y. W., et al. Characterization of Taiwanese propolis collected from different locations and seasons. Journal of the Science of Food and Agriculture. 88 (3), 412-419 (2008).
  12. Grange, J. M., Davey, R. W. Antibacterial properties of propolis (bee glue). Journal of the Royal Society of Medicine. 83 (3), 159-160 (1990).
  13. Kujumgiev, A., et al. Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis from different geographic origins. Journal of Ethnopharmacology. 64 (3), 235-240 (1999).
  14. Krol, W., Scheller, S., Shani, J., Pietsz, G., Czuba, Z. Synergistic effect of ethanol extract of propolis and antibiotics in the growth of Staphylococcus aureus. Drug Research. 43 (5), 607-609 (1993).
  15. Lu, L. C., Chen, Y. W., Chou, C. C. Antibacterial and DPPH free radical-scavenging activities of the ethanol extract of propolis collected in Taiwan. Journal of Food and Drug Analysis. 11 (4), 277-282 (2003).
  16. Tosi, B., Donini, A., Romagnoli, C., Bruni, A. Antimicrobial activity of some commercial extracts of propolis prepared with different solvents. Phytotherapy Research. 10 (4), 335-336 (1996).
  17. Cunha, I. B. S., et al. Factors that influence the yield and composition of Brazilian propolis extracts. Journal of the Brazilian Chemical Society. 15 (6), 964-970 (2004).
  18. Woo, S. O., Hong, I. P., Han, S. M. Extraction properties of propolis with ethanol concentration. Journal of Apicultural Research. 30 (3), 211-216 (2015).
  19. Park, Y. K., Ikegaki, M. Preparation of water and ethanolic extracts of propolis and evaluation of the preparations. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (11), 2230-2232 (1998).
  20. Ramanauskienė, K., Inkėnienė, A. M. Propolis oil extract: quality analysis and evaluation of its antimicrobial activity. Natural Product Research. 25 (15), 1463-1468 (2011).
  21. Machado, B. A., et al. Chemical composition and biological activity of extracts obtained by supercritical extraction and ethanolic extraction of brown, green and red propolis derived from different geographic regions in brazil. PLoS One. 11 (1), e0145954 (2016).
  22. Monroy, Y. M., et al. Brazilian green propolis extracts obtained by conventional processes and by processes at high pressure with supercritical carbon dioxide, ethanol and water. The Journal of Supercritical Fluids. 130, 189-197 (2017).
  23. Popova, M., Chen, C. N., Chen, P. Y., Huang, C. Y., Bankova, V. A validated spectrophotometric method for quantification of prenylated flavanones in pacific propolis from Taiwan. Phytochemical Analysis. 21 (2), 186-191 (2010).
  24. Chen, L. H., et al. Taiwanese green propolis ethanol extract delays the progression of type 2 diabetes mellitus in rats treated with streptozotocin/high-fat diet. Nutrients. 10 (4), e503 (2018).

Tags

Биохимия выпуск 143 антибактериальную активность этанол добыча propolins Тайвань зеленый прополис
Извлечение и анализ тайваньского зеленый прополиса
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C. T., Chien, Y. H., Yu, Y.… More

Chen, C. T., Chien, Y. H., Yu, Y. H., Chen, Y. W. Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis. J. Vis. Exp. (143), e58743, doi:10.3791/58743 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter