Summary
Vi presentiamo un protocollo per l'utilizzo dell'etanolo come solvente per estrarre e caratterizzare Taiwanese propoli verde che esibisce l'attività antibatterica.
Abstract
Propoli verde taiwanese sono ricco di flavonoidi prenilato e presenta una vasta gamma di attività biologiche, come antiossidante, antibatterico e quelli anticancro. I composti bioattivi di propoli verde Taiwanese sono propolins, cioè C, D, F e G. La concentrazione di propolins in Taiwanese propoli verde varia a seconda della stagione e la posizione geografica. Pertanto, è fondamentale per stabilire una procedura standard ripetibile per la determinazione della qualità di propoli verde Taiwanese. Qui, presentiamo un protocollo che utilizza estrazione basata su etanolo, cromatografia liquida ad alte prestazioni e un'analisi di attività antibatterica per caratterizzare la qualità Taiwanese propoli verde. Questo metodo indica che le estrazioni di etanolo 95% e 99,5% raggiungere i rendimenti massima sostanza secca da Taiwanese propoli verde, producendo quindi le più alte concentrazioni di propolins che hanno proprietà antibatteriche. Secondo questi risultati, il presente protocollo è ritenuto affidabile e ripetibile per determinare la qualità di propoli verde Taiwanese.
Introduction
La propoli è una miscela resinosa naturale prodotta da specie di ape mellifera di Apis. Propoli sono stato ampiamente utilizzato sin dall'antichità in folk medicine. Uno studio recentemente riferito che propoli sono utile per prevenire le infezioni microbiche e infiammazione1. Numerosi studi hanno dimostrato che i principali composti bioattivi in propoli sono i flavonoidi, esteri di acidi fenolici, prenilato p-cumarico acidi e acidi diterpenici2,3. Fino ad oggi, sono state identificate 10 derivati di flavanone prenilato da Taiwanese propoli verde mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)4,5,6,7. I più abbondanti fra questi sono propolins C, D, F e G5,7. Gli effetti biologici considerevoli di propoli verde Taiwanese sono correlati con il suo alto contenuto di propolins8.
Le concentrazioni di composti bioattivi in propoli variano notevolmente a seconda della stagione e la posizione geografica da cui si ricava la propoli. Propoli europeo contiene principalmente il flavonoide aglicone e fenolica acidi9. I principali composti bioattivi propoli in Brasile sono prenilato p-cumarico acidi, ad esempio artepillin C10. Uno studio ha dimostrato che la stagione è un fattore critico per la determinazione del contenuto totale propolin in Taiwanese propoli verde11. Il contenuto di propolin in Taiwanese propoli verde è più alto in estate (maggio - luglio) e la più bassa in inverno11. La proprietà antibatterica della propoli è stato ampiamente considerata un indicatore di attività biologica. Generalmente, i campioni di propoli raccolti da varie regioni hanno esibito una simile proprietà antibatteriche; ad esempio, è generalmente efficace contro quasi tutti i batteri Gram-positivi ed esibisce un limitato effetto antibatterico contro batteri gram-negativi10,12,13. Interazioni sinergiche tra i flavonoidi nella propoli sono state dimostrate per avere un effetto antibatterico14. Allo stesso modo, propoli verde Taiwanese è stato segnalato per avere un effetto antimicrobico contro batteri Gram-positivi15. Inoltre, uno studio ha inoltre identificato un effetto antimicrobico dall'interazione di propolins in Taiwanese propoli verde8.
La caratterizzazione dei composti bioattivi di propoli è difficile perché la sua composizione chimica può variare secondo la sua fonte di provenienza. Pertanto, è necessario stabilire un metodo fattibile e ripetibile per determinare la qualità della propoli verde Taiwanese. Tuttavia, nessuna procedura standard è stato stabilito per l'estrazione di propoli verde Taiwanese e successiva analisi funzionale. Sono stati proposti diversi metodi che variamente applicano solventi organici ed inorganici per propoli estrazione16,17,18,19,20. Perché la propoli è un composto lipofilico, studi hanno dimostrato che estrazione biologica è meglio di estrazione inorganici8,18,19. La concentrazione totale propolin in Taiwanese propoli verde e le sue proprietà antibatteriche sono indicatori chiave della qualità della propoli verde Taiwanese. Così, lo scopo di questo studio è di presentare un protocollo per l'utilizzo dell'etanolo come solvente per estrarre e caratterizzare le proprietà antibatteriche del Taiwanese propoli verde.
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Protocol
1. preparazione di composti di etanolo-estratti
- Pesare 10 g di propoli verde Taiwanese congelati, che è stato raccolto dagli alveari in Taiwan da maggio a luglio, e macinatelo usando la smerigliatrice della Spezia. Confermare che pezzi interi di propoli verde Taiwanese sono macinati in polvere finissima senza eventuali particelle di grandi dimensioni.
- Aggiungere 100 mL di varie concentrazioni di etanolo (60%, 70%, 80%, 95% e 99,5%) e acqua per beute separate e mescolare ogni concentrazione con 10 g di propoli di terra.
- Incubare a 25 ° C ed agitare il matraccio a 250 giri/min per 48 h.
- Filtrare gli estratti di etanolo attraverso carta da filtro con un diametro dei pori 25 μm.
- Ricostituire i filtrati al loro volume originale (100 mL) con etanolo al 95% utilizzando un matraccio.
- Conservare gli estratti dell'etanolo a-20 ° C.
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
2. preparazione degli estratti dell'etanolo per HPLC
- Concentrato 10 mL di etanolo estratti per evaporazione sotto vuoto a 40 ° C per 15 min.
- Cuocere in forno la sostanza secca a 45 ° C per 24 h.
- Ricostituire la sostanza secca con 10 mL di etanolo al 95%.
- Filtro 1 mL di etanolo estrae utilizzando un filtro siringa sterile con un diametro dei pori da 0,45 µm.
- Refilter gli estratti di etanolo con un filtro siringa sterile con un diametro dei pori da 0,22 µm. Il filtrato viene raccolto e possa essere analizzato direttamente mediante HPLC.
3. analisi del contenuto Propolin facendo uso di HPLC
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Creazione di curve standard di propolins
- Preparare 1 L della fase mobile della soluzione di metanolo: acqua di 88.8:11.2 (v/v).
- Preparare diluizioni seriali del propolin concentrazioni standard (C, D, F e G) (15,625 mg/mL, 31,25 mg/mL, 62,5 mg/mL e 125 mg/mL, rispettivamente) utilizzando la soluzione di fase mobile come un solvente.
- Iniettare 20 µ l di propolin concentrazioni standard nella colonna fase inversa, in modo sequenziale dalla bassa concentrazione ad alta concentrazione.
- Impostare la colonna HPLC a 30 ° C e portata del flusso a 1 mL/min.
- Impostare la lunghezza d'onda del rilevatore UV a 280 nm e il tempo di registratore a 20 min.
- Analizzare le norme almeno 3 x.
- Tracciare la risposta di misurazione (asse y) contro la concentrazione (asse x) usando calcolo foglio software e creare una curva standard con l'equazione e il valore R-quadrato.
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Analisi di Estratto di etanolo s
- Iniettare 20 µ l di etanolo estratti ottenuti dal passo 2.5 nella colonna a fase inversa.
- Impostare la colonna HPLC a 30 ° C e portata del flusso a 1 mL/min.
- Impostare la lunghezza d'onda del rilevatore UV a 280 nm e il tempo di registratore a 20 min.
- Analizzare le norme almeno 3 x.
- Calcolare la concentrazione di propolin nell'estratto dell'etanolo, usando l'equazione per la curva standard ottenuta dal punto 3.1.7 che utilizza l'area dei picchi per ogni propolin.
4. minima concentrazione inibente e minima concentrazione battericida analisi
Nota: Il metodo di microdilution è utilizzato per valutare l'efficacia antibatterica di propolins etanolo-estratti da propoli verde Taiwanese.
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Preparazione degli organismi di prova
- Scongelare i ceppi batterici, Staphylococcus aureus ed Escherichia coli e quindi, cultura li in brodo di soia triptico e brodo nutritivo, rispettivamente, a 37 ° C per 24 h.
- Passaggio di S. aureus utilizzando brodo di soia triptico ed e. coli utilizzando brodo nutritivo per due generazioni e, quindi, calcolare unità formanti colonie contando diverse colonie su una piastra di agar.
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Preparazione di etanolo estratti per test di attività antibatterica
- Concentrare gli estratti dell'etanolo ottenuti dal passaggio 1.5 per evaporazione sotto vuoto a 40 ° C per 15 min.
- Ricostituire la sostanza secca con solfossido dimetilico (DMSO) e regolare la concentrazione dell'estratto di 12,8 mg/mL.
- Preparare una diluizione seriale (concentrazioni: 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 e 640 µ g/mL) di etanolo estratti utilizzando il brodo.
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Prove di concentrazione minima inibente
- Aggiungere 10 µ l di etanolo diluito estratti che vanno da 0,156 a 640.0 µ g/mL in una piastra a 96 pozzetti.
- Utilizzando il brodo, regolare il volume a 100 µ l e mantenere 5% DMSO in tutte le diluizioni.
- Inoculare 100 µ l di coltura batterica (1 x 106/ml) nella piastra a 96 pozzetti.
- Inoculo di coltura contenenti varie concentrazioni di etanolo estrae a 37 ° C per 48 h.
- Analizzare la crescita batterica secondo la torbidità e l'utilizzo di densità ottica (lettore di micropiastre) a 590 nm per determinare la concentrazione minima inibente (MIC).
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Concentrazione battericida minima test
- Inoculare 10 µ l di cultura liquido da ciascun pozzetto del test MIC che ha esibito alcuna crescita su una piastra di agar.
- Incubare a 37 ° C per 24 h.
- Determinare l'attività battericida identificando la concentrazione più bassa che ha rivelato nessun visibile crescita batterica. La concentrazione che elimina completamente la crescita delle cellule è considerata essere la minima concentrazione batterica (MBC).
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Representative Results
Positivi dati rappresentativi per l'estrazione di etanolo sono presentati nella tabella 1. La resa di sostanza secca da propoli verde Taiwanese è stata associata positivamente con la concentrazione di etanolo. Gli estratti di etanolo 95% e 99,5% avevano la sostanza secca più alta rendimento da propoli verde Taiwanese. Il rendimento più basso secca da propoli verde Taiwanese si è verificato quando l'acqua è stata usata come il solvente di estrazione. Questi risultati indicano che un solvente organico, come l'etanolo, le migliori prestazioni per l'estrazione di propoli verde Taiwanese. Il segnale di propolins standard C, D, F e G è stato identificato e quantificato mediante HPLC (Figura 1a). Il segnale di propolins negli estratti dell'etanolo è stato caratterizzato utilizzando singoli propolin standard e HPLC (Figura 1b). Normalmente, la concentrazione di propolins (C, D, F e G) in Taiwanese propoli verde è associata positivamente con la concentrazione di etanolo durante l'estrazione (tabella 1). La resa massima di propolins in Taiwanese propoli verde è stato prodotto negli estratti di etanolo 95% e 99,5%.
Dati positivi rappresentativi per l'effetto antibatterico di estratti di etanolo sono presentati nella tabella 2. Attività antibatterica contro lo Staphylococcus aureus ed Escherichia coli negli estratti dell'etanolo sono stati esaminati. La media MIC e MBC di estratti di etanolo per S. aureus erano 10-20 µ g/mL e 20 µ g/mL, rispettivamente (tabella 2). Gli estratti dell'acqua non hanno avuto effetti antibatterici contro lo Staphylococcus aureus (tabella 2). Nessun effetto antibatterico su Escherichia coli è stato osservato sia con l'etanolo o acqua estratti (tabella 2).
Figura 1: identificazione di propolins in Taiwanese propoli verde. Questi pannelli mostrano (un) standard di propolins e (b) la misura della propolins in Taiwanese propoli verde mediante HPLC. Questa figura è stata modificata da Chen et al. 8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Solvente * | Rendimento (%) | Propolin (C + D + F + G) |
| (mg/mL) | ||
| 99,5% EtOH | 66.75 ± 0,5un* * | 36,73 ± 0.80un |
| 95% EtOH | 66.25 ± 0.50una | 37.55 ± 1.29un |
| 80% EtOH | 64.75 ± 0.96b | 34,25 ± 0.71b |
| 70% EtOH | 63.25 ± 0.96c | 31.53 ± 0.31c |
| 60% EtOH | 59.00 ± 1,41d | 29.34 ± 1,59d |
| Acqua | 7.00 ± 0,82e | ND * * * |
Tabella 1: secco questione rendimento (%) e propolin contenuto (mg/mL) in Taiwanese propoli verde estratto utilizzando vari solventi. * 10 g di propoli è stata estratta con 100 mL di solvente, e gli estratti sono stati infine ricostituiti a 100 mL. * * I valori sono la media ± la deviazione standard (SD). a-e Significa all'interno di una colonna che non hanno nessun apice comune è significativamente differenti (P < 0,05). ND = non rilevato. Questa tabella è stata modificata da Chen et al. 8.
| Estrarre | Stafilococco aureo | Escherichia coli | |
| MIC (µ g/mL) | MBC (µ g/mL) | MIC (µ g/mL) | |
| 99,5% EtOH | 10 | 20 | > 640 |
| 95% EtOH | 10 | 20 | > 640 |
| 80% EtOH | 20 | 20 | > 640 |
| 70% EtOH | 10 | 20 | > 640 |
| 60% EtOH | 20 | 20 | > 640 |
| Acqua | ND | ND | ND |
Tabella 2: MIC e MBC (µ g/mL) di vari estratti contro S. aureus ed Escherichia coli. Questa tabella è stata modificata da Chen et al. 8.
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Discussion
Uno studio ha riferito che la macerazione, utilizzando le varie concentrazioni di etanolo, poteva essere utilizzati per propoli brasiliano estrazione17; Tuttavia, il processo è stato molto tempo17. Ci sono voluti almeno 10 giorni per estrarre i composti bioattivi, ad esempio contenuto fenolico, dal propoli brasiliano17. In alternativa, estrazione di etanolo in combinazione con il riscaldamento a 37 ° C, 50 ° C o 70 ° C per 30 min è stato proposto per l'estrazione di propoli brasiliano19,21,22. È stato determinato che i composti bioattivi in propoli brasiliano potrebbero essere estratta differenzialmente a seconda della percentuale di etanolo19. L'efficienza di estrazione di composti bioattivi in propoli può variare a causa di differenti composizioni chimiche di propoli brasiliano e propoli verde Taiwanese. Qui, forniamo un protocollo affidabile e ripetibile per l'estrazione di propoli verde Taiwanese. I composti bioattivi in Taiwanese propoli verde potrebbero essere raccolte entro 2 giorni, utilizzando etanolo come solvente. Una simile individuazione supporta anche il protocollo presentato qui e determinato che propolins (C, D, F e G) da propoli verde Taiwanese potrebbe essere estratta con etanolo al 95% in combinazione con un 3 giorno estrazione23. Un altro studio ha dimostrato che l'etanolo 95% in combinazione con un h 21 estrazione fu in grado di raccogliere propolins dal Taiwanese propoli verde24. Tuttavia, deve essere verificata l'esatta concentrazione di propolins dopo l'estrazione di etanolo 21h. I ricercatori hanno proposto che il processo di riscaldamento aumenta l'efficienza di estrazione per propoli brasiliano19,21,22. Se propolins da Taiwanese propoli verde può essere estratta mediante riscaldamento deve essere indagata.
Gli estratti di etanolo da Taiwanese propoli verde hanno effetti antibatterici contro i patogeni Gram-positivi. Perché la propoli è idrofobica, gli studi hanno dimostrato che un solvente organico come l'etanolo è un solvente adatto per propoli estrazione8,16,17,18,19, 20. Gli studi hanno anche dimostrato che una concentrazione di etanolo aumento conduce a più composti bioattivi estratti8,17,18,20. Nel presente protocollo, la sostanza secca massima rendimenti di Taiwanese propoli verde sono stati osservati in etanolo 95% e 99,5% estratti, così come la più alta concentrazione di propolins e attività antibatterica.
Il presente protocollo è progettato per l'estrazione di propoli verde Taiwanese usando etanolo, e la valutazione della qualità è effettuata sulla base del contenuto di propolins. Tuttavia, alcune sostanze bioattive insolubile in etanolo in Taiwanese propoli verde correttamente non possono essere isolati utilizzando il presente protocollo.
L'aspetto più cruciale del metodo per quanto riguarda i metodi esistenti è che questo metodo consente di risparmiare tempo rispetto a metodi proposti in altri studi17,23. Inoltre, gli estratti di etanolo 95% e 99,5% di propoli verde Taiwanese ha esibito un'alta concentrazione di attività antibatteriche e propolins.
Questo approccio ha applicazioni dirette per la caratterizzazione di altri composti bioattivi solubili in etanolo sconosciuti in Taiwanese propoli verde. Inoltre, gli estratti dell'etanolo contenente propolins potrebbero essere utilizzati per determinare altre bioattività.
Una delle procedure sperimentali chiave consiste nel garantire l'uniformità della propoli verde Taiwanese durante la macinazione (passo 1.1 del protocollo). Macinazione inappropriato di Taiwanese propoli verde può portare a rendimenti bassi materia secca e propolin contenuto. È essenziale utilizzare un adeguato apparato rettifica, come una macina spezie, smerigliatrice di tessuto o omogeneizzatore e di prendersi cura che la propoli diventa una polvere fine senza qualsiasi grandi particelle restanti dopo la macinazione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Acknowledgments
Questo manoscritto è stato modificato da Wallace accademico Editing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Whatman no. 4 filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1004125 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| reverse phase RP-18 column | Phenomenex Inc. | 00G-0234-E0 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | BCRC 10780 | |
| Escherichia coli | ATCC | BCRC 10675 | |
| tryptic soy broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| nutrient broth | Sigma-Aldrich | 70122 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| spice grinder | Waring | WSG60K | |
| microplate Reader | Molecular Devices | EMAX PLUS | |
| HPLC system | Agilent | 1200 Series | |
| vacuum evaporation | BÜCHI | Rotavapor R-215 |
References
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