Summary
Presenteren we een protocol voor het gebruik van ethanol als oplosmiddel te halen en karakteriseren van Taiwanese groene propolis dat antibacteriële activiteit vertoont.
Abstract
Taiwanese groene propolis is rijk aan prenylated flavonoïden en exposeert een breed scala van biologische activiteit, zoals anti-oxidant, antibacteriële, en antikanker ones. De biologische actieve stoffen van Taiwanese groene propolis zijn propolins, namelijk C, D, F en G. De concentratie van propolins in Taiwanese groene propolis is afhankelijk van het seizoen en de geografische locatie. Dus, is het essentieel om een standaard en herhaalbare methode voor het bepalen van de kwaliteit van de Taiwanese groene propolis. Hier presenteren we een protocol dat wordt gebruikt op basis van ethanol extractie, hoge-prestatie vloeistofchromatografie en een analyse van de antibacteriële activiteit te karakteriseren Taiwanese groene propolis kwaliteit. Deze methode geeft aan dat 95% en 99,5% ethanol extracties de maximale droge stof oogsten van Taiwanese groene propolis bereiken, waardoor de opbrengst van de hoogste concentraties van propolins die antibacteriële eigenschappen hebben. Volgens deze bevindingen, wordt dit protocol beschouwd als betrouwbare en herhaalbare voor het bepalen van de kwaliteit van de Taiwanese groene propolis.
Introduction
Propolis is een natuurlijke harsachtige mengsel geproduceerd door de bee soorten Apis mellifera. Propolis is wijd verbeid gebruikt sinds de oudheid in folk geneesmiddelen. Een studie heeft onlangs gemeld dat propolis is gunstig voor het voorkomen van microbiële infecties en ontstekingen1. Talrijke studies hebben aangetoond dat de belangrijkste bioactieve stoffen in propolis flavonoïden, fenolische esters van, prenylated p-coumaric zuren en diterpenic zuren2,3. Tot op heden, zijn 10 prenylated flavanone derivaten van Taiwanese groene propolis geïdentificeerd door middel van krachtige vloeibare chromatografie (HPLC)4,,5,,6,7. De meest voorkomende daaronder zijn propolins C, D, F en G5,7. De aanzienlijke biologische effecten van Taiwanese groene propolis zijn gecorreleerd met het hoge gehalte aan propolins8.
De concentraties van bioactieve stoffen in propolis variëren sterk afhankelijk van het seizoen en de geografische locatie waar de propolis is verkregen. Europese propolis bevat voornamelijk de flavonoïde aglyconen en phenolic zuren9. De grote bioactieve stoffen in propolis uit Brazilië zijn prenylated p-coumaric van zuren, zoals artepillin C10. Een studie aangetoond dat het seizoen een kritische factor is voor de vaststelling van de inhoud van de totale propolin in Taiwanese groene propolis11. De inhoud van de propolin in Taiwanese groene propolis is het hoogst in de zomer (mei - juli) en laagste in winter11. De antibacteriële eigendom van propolis heeft zijn algemeen beschouwd als een indicator van biologische activiteit. In het algemeen, de monsters van propolis verzameld uit verschillende regio's zijn tentoongesteld een vergelijkbare antibacteriële woning; bijvoorbeeld, het is in het algemeen effectief tegen bijna alle gram-positieve bacteriën en vertoont een beperkte antibacteriële werking tegen gram-negatieve bacteriën10,12,13. Synergetische interactie tussen de flavonoïden in propolis werden gedemonstreerd hebben een antibacteriële werking14. Taiwanese groene propolis werd ook gemeld te hebben een antimicrobiële werking tegen gram-positieve bacteriën15. Bovendien wordt in een studie ook gebleken dat een antimicrobiële werking van de interacties tussen propolins in Taiwanese groene propolis8.
De karakterisering van de bioactieve stoffen in propolis is moeilijk, omdat de chemische samenstelling kan variëren naar gelang de bron van oorsprong. Het is daarom noodzakelijk een haalbaar en herhaalbare methode voor het bepalen van de kwaliteit van de Taiwanese groene propolis vast te stellen. Echter is geen standaardprocedure opgezet voor de Taiwanese groene propolis extractie en de daaropvolgende functionaalanalyse. Verschillende methoden afwisselend organische en anorganische oplosmiddelen zijn voorgesteld voor propolis extractie16,17,18,19,20. Omdat propolis een lipofiele mengsel is, hebben studies aangetoond dat biologische extractie beter dan de anorganische extractie8,18,19 is. De concentratie van de totale propolin in Taiwanese groene propolis en de antibacteriële eigenschappen zijn belangrijke indicatoren van de kwaliteit van de Taiwanese groene propolis. Dus, is het doel van deze studie te presenteren van een protocol voor het gebruik van ethanol als oplosmiddel te halen en karakteriseren van de antibacteriële eigenschappen van Taiwanese groene propolis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van Ethanol-geëxtraheerde verbindingen
- Weeg 10 g van bevroren Taiwanese groene propolis, die werd bijeengezocht uit bijenkorven in Taiwan van mei tot juli, en met behulp van de molen kruid vermalen. Bevestigen dat hele stukken van Taiwanese groene propolis grond tot een fijn poeder zonder eventuele grote deeltjes.
- Voeg 100 mL van verschillende concentraties van ethanol (60%, 70%, 80%, 95% en 99,5%) en water te scheiden van de kolven en meng elke concentratie met 10 g van grond propolis.
- Incubeer bij 25 ° C staan en schud de kolf van 250 toeren per minuut gedurende 48 uur.
- Filter de extracten van ethanol door filterpapier met een poriegrootte 25 μm.
- Reconstrueren de filtraten naar hun oorspronkelijke volume (100 mL) met 95% ethanol met behulp van een maatkolf.
- Winkel die de ethanol bij-20 ° C. haalt
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
2. bereiding van extracten van Ethanol voor HPLC
- Concentreren 10 mL ethanol extracten door vacuüm verdamping bij 40 ° C gedurende 15 minuten.
- Bak de droge stof bij 45 ° C gedurende 24 uur.
- Het reconstrueren van de droge stof met 10 mL 95% ethanol.
- Filter 1 mL ethanol wordt geëxtraheerd met behulp van een steriele injectiespuit filter met een poriegrootte van 0,45 µm.
- Refilter de extracten van de ethanol met behulp van een steriele injectiespuit filter met een poriegrootte 0,22 µm. Het filtraat wordt verzameld en direct kan worden geanalyseerd met behulp van HPLC.
3. analyse van de inhoud van de Propolin met behulp van HPLC
-
Oprichting van standaard bochten van propolins
- 1 L van de mobiele fase van methanol: water-oplossing van 88.8:11.2 (v/v) voor te bereiden.
- Maak seriële verdunningen van propolin standaard (C, D, F en G) concentraties (15.625 mg/mL, 31.25 mg/mL, 62,5 mg/mL, en 125 mg/mL, respectievelijk) met behulp van de mobiele fase oplossing als oplosmiddel.
- Injecteren 20 µL van propolin standaard concentraties in de omgekeerde-fasekolom, sequentieel uit de lage concentratie aan de hoge concentratie.
- De HPLC-kolom instellen op 30 ° C en de stroomsnelheid naar 1 mL/min.
- De golflengte van de UV-detector ingesteld op 280 nm en de tijd van de recorder aan 20 min.
- Analyseren van de normen ten minste 3 x.
- De reactie van de meting (y-as) worden uitgezet tegen de concentratie (x-as) met berekening werkblad software, en het maken van een standaard curve met de vergelijking en het R-kwadraat waarde.
-
Analyse van ethanol extract s
- Injecteren 20 µL van de ethanol extracten stap 2.5 in de omgekeerde-fasekolom is verkregen.
- De HPLC-kolom instellen op 30 ° C en de stroomsnelheid naar 1 mL/min.
- De golflengte van de UV-detector ingesteld op 280 nm en de tijd van de recorder aan 20 min.
- Analyseren van de normen ten minste 3 x.
- Bereken de concentratie van propolin in het ethanolextract, met behulp van de vergelijking voor de kromme van het standaard stap 3.1.7 die gebruikmaakt van de piekoppervlakte voor elke propolin verkregen.
4. minimale remmende concentratie en Minimum bactericide concentratie analyse
Opmerking: De microdilution-methode wordt gebruikt ter beoordeling van de antibacteriële werkzaamheid van ethanol-geëxtraheerde propolins uit Taiwanese groene propolis.
-
Voorbereiding van de testorganismen
- Ontdooi de bacteriestammen, Staphylococcus aureus en Escherichia coli, en vervolgens cultuur hen in al soja Bouillon en nutriënten Bouillon, respectievelijk bij 37 ° C gedurende 24 uur.
- Passage van de S. aureus met al soja Bouillon en E. coli met behulp van nutriënten bouillon voor twee generaties en, vervolgens, kolonie-vormende eenheden berekenen door het tellen van afzonderlijke kolonies op een agarplaat.
-
Voorbereiding van ethanol extracten voor antibacteriële activiteit testen
- Het concentreren van de ethanol extracten verkregen stap 1.5 door vacuüm verdamping bij 40 ° C gedurende 15 minuten.
- Reconstrueren van de droge stof met dimethylsulfoxide (DMSO) en aanpassen van de concentratie van het extract tot 12,8 mg/mL.
- Maken van een seriële verdunning (concentraties: 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 en 640 µg/mL) van ethanol wordt geëxtraheerd met behulp van de Bouillon.
-
Minimale remmende concentratie proeven
- Voeg 10 µL van verdunde ethanol fragmenten, variërend van 0.156 tot 640.0 µg/mL in een 96-wells-plaat.
- Met Bouillon, stel het volume in op 100 µL, en onderhouden van 5% DMSO in alle de verdunningen.
- Inoculeer 100 µL van bacteriecultuur (1 x 106/mL) in de 96-wells-plaat.
- Cultuur entmateriaal met verschillende concentraties van ethanol extraheert bij 37 ° C gedurende 48 uur.
- Analyseren van de bacteriële groei volgens turbiditeit en met behulp van optische dichtheid (microplate-lezer) op 590 nm tot het bepalen van de minimale remmende concentratie (MIC).
-
Minimum bactericide concentratie proeven
- Inoculeer 10 µL van vloeibare cultuur van elk putje van de MIC-test die geen groei op een agarplaat tentoongesteld.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 24 uur.
- Bepaal de bactericide activiteit door het identificeren van de laagste concentratie die bleek geen zichtbare bacteriële groei. De concentratie die volledig celgroei elimineert wordt beschouwd als de minimale bacteriële concentratie (MBC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Positieve representatieve gegevens voor de winning van ethanol zijn opgenomen in tabel 1. De opbrengst van de droge stof van Taiwanese groene propolis werd positief geassocieerd met de concentratie van ethanol. De 95% en 99,5% ethanol extracten had de hoogste droge stof opleveren van Taiwanese groene propolis. De opbrengst van de laagste droge stof van Taiwanese groene propolis is opgetreden wanneer water werd gebruikt als de extractievloeistof. Deze resultaten wijzen erop dat een organisch oplosmiddel, zoals ethanol, best voor Taiwanese groene propolis extractie presteert. Het signaal van de standaard propolins C, D, F en G werd geïdentificeerd en gekwantificeerd aan de hand van HPLC (Figuur 1a). Het signaal van de propolins in de extracten van ethanol werd gekenmerkt met behulp van individuele propolin normen en HPLC (Figuur 1b). Normaal gesproken wordt de concentratie van propolins (C, D, F en G) in Taiwanese groene propolis positief geassocieerd met de ethanol concentratie tijdens de extractie (tabel 1). Het hoogste rendement van propolins in Taiwanese groene propolis werd geproduceerd in de 95% en 99,5% ethanol-extracten.
Positieve representatieve gegevens voor het antibacteriële effect van ethanol fragmenten worden weergegeven in tabel 2. Antibacteriële activiteit tegen S. aureus en E. coli in ethanol extracten werden onderzocht. De gemiddelde MIC en MBC van ethanol extracten van S. aureus waren 10-20 µg/mL en 20 µg/mL, respectievelijk (tabel 2). Water extracten had geen antibacteriële effecten tegen S. aureus (tabel 2). Geen enkel antibacteriële effect op E. coli werd waargenomen met ofwel de ethanol of water uittreksels (tabel 2).
Figuur 1: identificatie van propolins in Taiwanese groene propolis. Deze panelen vertonen (een) normen voor propolins en (b) het meten van propolins Taiwanese groene propolis, met behulp van HPLC. Dit cijfer is gewijzigd van Chen et al. 8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Oplosmiddel * | Rendement (%) | Propolin (C + D + F + G) |
| (mg/mL) | ||
| 99,5% EtOH | 66.75 ± 0,5een** | 36.73 ± 0,80een |
| 95% EtOH | 66.25 ± 0,50een | 37.55 ± 1.29een |
| 80% EtOH | 64.75 ± 0.96b | 34.25 ± 0.71b |
| 70% EtOH | 63.25 ± 0.96c | 31.53 ± 0.31c |
| 60% EtOH | 59.00 ± 1.41d | 29.34 ± 1,59d |
| Water | 7,00 ± 0.82e | ND *** |
Tabel 1: droge zaak rendement (%) en propolin inhoud (mg/mL) in Taiwanese groene propolis geëxtraheerd met behulp van verschillende oplosmiddelen. * 10 g van propolis was geëxtraheerd met behulp van 100 mL oplosmiddel en extracten werden ten slotte gereconstitueerd tot 100 mL. ** De waarden zijn de gemiddelde ± de standaarddeviatie (SD). a-e Middelen in een kolom die geen gemeenschappelijke superscript hebben aanzienlijk verschillen (P < 0,05). ND = niet gedetecteerd. Deze tabel is gewijzigd van Chen et al. 8.
| Extract | Staphylococcus aureus | Escherichia coli | |
| MIC (µg/mL) | MBC (µg/mL) | MIC (µg/mL) | |
| 99,5% EtOH | 10 | 20 | > 640 |
| 95% EtOH | 10 | 20 | > 640 |
| 80% EtOH | 20 | 20 | > 640 |
| 70% EtOH | 10 | 20 | > 640 |
| 60% EtOH | 20 | 20 | > 640 |
| Water | ND | ND | ND |
Tabel 2: MIC en MBC (µg/mL) van verschillende extracten tegen S. aureus en E. coli. Deze tabel is gewijzigd van Chen et al. 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een studie gemeld dat maceratie, met behulp van verschillende concentraties van ethanol, kan worden gebruikt voor Braziliaanse propolis extractie17; het proces was echter tijdrovend17. Het duurde ten minste 10 dagen de bioactieve stoffen, zoals fenolische inhoud, om uit te halen Braziliaanse propolis17. Als alternatief, ethanol extractie in combinatie met verwarming op 37 ° C, 50 ° C en 70 ° C gedurende 30 minuten heeft voorgesteld voor het extraheren van de Braziliaanse propolis19,21,22. Er werd vastgesteld dat biologische actieve stoffen in Braziliaanse propolis afhankelijk van het percentage van ethanol19differentieel kon worden geëxtraheerd. De extractie-efficiëntie van bioactieve stoffen in propolis variëren vanwege de verschillende chemische samenstelling van Braziliaanse propolis en Taiwanese groene propolis. Hier, bieden wij een betrouwbare en herhaalbare protocol voor het extraheren van de Taiwanese groene propolis. De biologische actieve stoffen in Taiwanese groene propolis kon worden geoogst binnen 2 dagen, met behulp van ethanol als oplosmiddel. Een soortgelijk zoeken ondersteunt ook het protocol hier gepresenteerd en bepaald dat propolins (C, D, F en G) van Taiwanese groene propolis kunnen worden geëxtraheerd met behulp van 95% ethanol in combinatie met een 3-daagse extractie23. Een andere studie aangetoond dat 95% ethanol in combinatie met een 21 h extractie was in staat om het propolins van Taiwanese groene propolis24oogsten. Echter, de exacte concentratie van propolins na de 21u ethanol extractie moet worden gecontroleerd. Onderzoekers hebben voorgesteld dat het verhittingsproces de extractie-efficiëntie voor Braziliaanse propolis19,21,22 verhoogt. Of propolins van Taiwanese groene propolis kunnen worden geëxtraheerd door verwarming moet worden onderzocht.
De ethanol extracten van Taiwanese groene propolis hebben antibacteriële effecten tegen gram-positieve ziekteverwekkers. Omdat propolis hydrofoob is, hebben studies aangetoond dat een organische oplosmiddelen zoals ethanol een geschikt oplosmiddel voor propolis extractie8,16,17,18,19is, 20. Studies hebben ook aangetoond dat een verhoogde ethanol concentratie tot meer uitgepakte bioactieve stoffen8,17,18,20 leidt. In het huidige protocol extracten maximale dedrogestof opbrengsten van Taiwanese groene propolis worden waargenomen in de 95% en 99,5% ethanol, evenals de hoogste concentratie van propolins en antibacteriële activiteit.
Dit protocol is ontworpen voor de Taiwanese groene propolis extractie met behulp van ethanol, en de beoordeling gebeurt op basis van de inhoud van propolins. Sommige ethanol oplosbare bioactieve stoffen in Taiwanese groene propolis kunnen echter goed geïsoleerd met behulp van dit protocol niet.
Het belangrijkste aspect van de methode met betrekking tot bestaande methoden is dat deze methode tijd ten opzichte van de methoden die in andere studies17,23worden voorgesteld bespaart. De 95% en 99,5% ethanol extracten van Taiwanese groene propolis tentoongesteld bovendien een hoge concentratie van propolins en antibacteriële activiteit.
Deze aanpak heeft direct aanvragen voor het karakteriseren van andere onbekende ethanol oplosbare bioactieve stoffen in Taiwanese groene propolis. Bovendien, kunnen ethanol extracten met propolins worden gebruikt voor de bepaling van andere bioactivities.
Een van de belangrijkste experimentele procedures is het waarborgen van de uniformiteit van de Taiwanese groene propolis tijdens het slijpen (protocol stap 1.1). Ongepast slijpen van Taiwanese groene propolis kan leiden tot lage droge stof opbrengsten en propolin inhoud. Het is essentieel voor het gebruik van een juiste schuurmachine apparaat, zoals een specerij grinder, weefsel grinder of homogenizer, en om te zorgen dat de propolis wordt een fijn poeder zonder eventuele grote deeltjes die overblijven na het slijpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te verklaren.
Acknowledgments
Dit manuscript werd uitgegeven door Wallace academische bewerken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Whatman no. 4 filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1004125 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| reverse phase RP-18 column | Phenomenex Inc. | 00G-0234-E0 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | BCRC 10780 | |
| Escherichia coli | ATCC | BCRC 10675 | |
| tryptic soy broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| nutrient broth | Sigma-Aldrich | 70122 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| spice grinder | Waring | WSG60K | |
| microplate Reader | Molecular Devices | EMAX PLUS | |
| HPLC system | Agilent | 1200 Series | |
| vacuum evaporation | BÜCHI | Rotavapor R-215 |
References
- Zabaiou, N., et al. Biological properties of propolis extracts: Something new from an ancient product. Chemistry and Physics of Lipids. 207 (Pt B), 214-222 (2017).
- Bankova, V. B., De Castro, S. L., Marcucci, M. C. Propolis: Recent advances in chemistry and plant origin. Apidologie. 31 (1), 3-15 (2000).
- Park, Y. K., Alencar, S. M., Aguiar, C. L. Botanical origin and chemical composition of Brazilian propolis. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50 (9), 2502-2506 (2002).
- Chen, C. N., Wu, C. L., Shy, H. S., Lin, J. K. Cytotoxic prenylflavanones from Taiwanese propolis. Journal of Natural Products. 66 (4), 503-506 (2003).
- Chen, C. N., Weng, M. S., Wu, C. L., Lin, J. K. Comparison of radical scavenging activity, cytotoxic effects and apoptosis induction in human melanoma cells by Taiwanese propolis from different sources. Evidence-Based Complementary and Alternative. 1 (2), 175-185 (2004).
- Chen, C. N., Wu, C. L., Lin, J. K. Apoptosis of human melanoma cells induced by the novel compounds propolin A and propolin B from Taiwanese propolis. Cancer Letters. 24 (1-2), 218-231 (2007).
- Huang, W. J., et al. Propolin G, a prenylflavanone, isolated from Taiwanese propolis, induces caspase-dependent apoptosis in brain cancer cells. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (18), 7366-7376 (2007).
- Chen, Y. W., Ye, S. R., Ting, C., Yu, Y. H. Antibacterial activity of propolins from Taiwanese green propolis. Journal of Food and Drug Analysis. 26 (2), 761-768 (2018).
- Hegazi, A. G., Abd El Hady, F. K., Abd Allah, F. A. M. Chemical composition and antimicrobial activity of European propolis. Zeitschrift für Naturforschung. 55 (1-2), 70-75 (2000).
- Sforcin, J. M., Fernandes, A., Lopes, C. A. M., Bankova, V., Funari, S. R. C. Seasonal effect on Brazilian propolis antibacterial activity. Journal of Ethnopharmacology. 73 (1-2), 243-249 (2000).
- Chen, Y. W., et al. Characterization of Taiwanese propolis collected from different locations and seasons. Journal of the Science of Food and Agriculture. 88 (3), 412-419 (2008).
- Grange, J. M., Davey, R. W. Antibacterial properties of propolis (bee glue). Journal of the Royal Society of Medicine. 83 (3), 159-160 (1990).
- Kujumgiev, A., et al. Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis from different geographic origins. Journal of Ethnopharmacology. 64 (3), 235-240 (1999).
- Krol, W., Scheller, S., Shani, J., Pietsz, G., Czuba, Z. Synergistic effect of ethanol extract of propolis and antibiotics in the growth of Staphylococcus aureus. Drug Research. 43 (5), 607-609 (1993).
- Lu, L. C., Chen, Y. W., Chou, C. C. Antibacterial and DPPH free radical-scavenging activities of the ethanol extract of propolis collected in Taiwan. Journal of Food and Drug Analysis. 11 (4), 277-282 (2003).
- Tosi, B., Donini, A., Romagnoli, C., Bruni, A. Antimicrobial activity of some commercial extracts of propolis prepared with different solvents. Phytotherapy Research. 10 (4), 335-336 (1996).
- Cunha, I. B. S., et al. Factors that influence the yield and composition of Brazilian propolis extracts. Journal of the Brazilian Chemical Society. 15 (6), 964-970 (2004).
- Woo, S. O., Hong, I. P., Han, S. M. Extraction properties of propolis with ethanol concentration. Journal of Apicultural Research. 30 (3), 211-216 (2015).
- Park, Y. K., Ikegaki, M. Preparation of water and ethanolic extracts of propolis and evaluation of the preparations. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (11), 2230-2232 (1998).
- Ramanauskienė, K., Inkėnienė, A. M. Propolis oil extract: quality analysis and evaluation of its antimicrobial activity. Natural Product Research. 25 (15), 1463-1468 (2011).
- Machado, B. A., et al. Chemical composition and biological activity of extracts obtained by supercritical extraction and ethanolic extraction of brown, green and red propolis derived from different geographic regions in brazil. PLoS One. 11 (1), e0145954 (2016).
- Monroy, Y. M., et al. Brazilian green propolis extracts obtained by conventional processes and by processes at high pressure with supercritical carbon dioxide, ethanol and water. The Journal of Supercritical Fluids. 130, 189-197 (2017).
- Popova, M., Chen, C. N., Chen, P. Y., Huang, C. Y., Bankova, V. A validated spectrophotometric method for quantification of prenylated flavanones in pacific propolis from Taiwan. Phytochemical Analysis. 21 (2), 186-191 (2010).
- Chen, L. H., et al. Taiwanese green propolis ethanol extract delays the progression of type 2 diabetes mellitus in rats treated with streptozotocin/high-fat diet. Nutrients. 10 (4), e503 (2018).
