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Biochemistry

Extraction et analyse des taïwanaise Propolis verte

doi: 10.3791/58743 Published: January 7, 2019

Summary

Nous présentons un protocole pour l’utilisation de l’éthanol comme solvant d’extraire et de caractériser la propolis verte taïwanaise qui présente une activité antibactérienne.

Abstract

Taïwanaise propolis verte est riche en flavonoïdes prénylés et présente un large éventail d’activités biologiques, comme antioxydant, antibactérien et les anticancéreux. Les composés bioactifs de propolis verte taïwanaise sont propolins, à savoir C, D, F et G. La concentration de propolins dans la propolis verte taïwanaise varie selon la saison et la localisation géographique. Ainsi, il est essentiel d’établir une procédure standard et reproductible pour la détermination de la qualité de la propolis verte taïwanaise. Nous présentons ici un protocole qui utilise l’extraction à base d’éthanol, chromatographie liquide à haute performance et une analyse de l’activité antibactérienne pour caractériser la qualité de la propolis verte taïwanais. Cette méthode indique que 95 % et 99,5 % des extractions de l’éthanol atteignent les rendements en matière sèche maximale de la propolis verte taïwanaise, réduisant ainsi aux plus fortes concentrations de propolins qui ont des propriétés antibactériennes. Selon ces résultats, le présent protocole est réputé fiable et reproductible pour la détermination de la qualité de la propolis verte taïwanaise.

Introduction

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La propolis est un mélange de résineux naturel produit par l’espèce d’abeille Apis mellifera. La propolis a été largement utilisée depuis l’antiquité en médecine folklorique. Une étude a récemment rapporté que la propolis est bénéfique pour prévenir les infections microbiennes et inflammation1. De nombreuses études ont démontré que les principaux composés bioactifs dans la propolis sont des flavonoïdes, des esters de l’acide phénoliques, prénylés p-coumarique acides et diterpenic acides2,3. A ce jour, 10 dérivés de flavanone prénylés de propolis verte taïwanaise ont été identifiés par chromatographie liquide à haute performance (HPLC)4,5,6,7. Les plus abondantes parmi ceux-ci sont propolins C, D, F et G5,7. Les effets biologiques considérables de propolis verte taïwanaise sont corrélés avec sa haute teneur de propolins8.

Les concentrations de composés bioactifs dans la propolis varient considérablement selon la saison et l’emplacement géographique d'où provient la propolis. La propolis européenne contient essentiellement des flavonoïdes aglycone et phénoliques acides9. Les principaux composés bioactifs dans la propolis du Brésil sont prénylés p-coumarique acides, tels qu’artepillin C10. Une étude a démontré que la saison est un facteur essentiel pour déterminer la teneur totale propolin taïwanais propolis verte11. Le contenu de propolin en taïwanais propolis verte est plus élevé en été (mai - juillet) et plus faible en hiver11. La propriété antibactérienne de la propolis a été considérée comme un indicateur de l’activité biologique. En général, les échantillons de la propolis provenant de diverses régions ont manifesté une propriété antibactérienne similaire ; par exemple, il est généralement efficace contre presque toutes les bactéries gram-positives et présente un effet antibactérien limité contre les bactéries gram-négatives10,12,13. Ont démontré que des interactions synergiques entre les flavonoïdes contenus dans la propolis ont un effet antibactérien14. De même, la propolis verte taïwanaise aurait ont un effet antimicrobien contre les bactéries gram-positives,15. En outre, une étude a également un effet antimicrobien de l’interaction de propolins en taïwanais propolis verte8.

La caractérisation des composés bioactifs dans la propolis est difficile parce que sa composition chimique peut varier selon sa source d’origine. Par conséquent, il est nécessaire d’établir une méthode faisable et reproductible pour la détermination de la qualité de la propolis verte taïwanaise. Cependant, aucune procédure standard n’a été établi pour l’extraction de la propolis verte taïwanais et analyse fonctionnelle. Plusieurs méthodes s’appliquant indifféremment des solvants organiques et inorganiques ont été proposées pour la propolis extraction16,17,18,19,20. Parce que la propolis est un mélange lipophile, les études ont démontré que l’extraction organique est mieux qu’extraction inorganiques8,18,19. La concentration totale propolin taïwanaise propolis verte et ses propriétés antibactériennes sont des indicateurs clés de la qualité de la propolis verte taïwanaise. Ainsi, le but de cette étude est de présenter un protocole pour l’utilisation d’éthanol comme solvant d’extraire et de caractériser les propriétés antibactériennes de propolis verte taïwanaise.

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Protocol

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1. préparation de l’extrait l’éthanol composés

  1. Peser 10 g de gelée propolis verte taïwanaise, qui ont été recueillie des ruches à Taïwan de mai à juillet, et les broyer à l’aide du moulin à épices. Confirmer qu’entiers morceaux de propolis verte taïwanaise est broyés en une fine poudre sans les particules volumineuses.
  2. Ajouter 100 mL de diverses concentrations d’éthanol (60 %, 70 %, 80 %, 95 % et 99,5 %) et de l’eau pour séparer les flacons et mélanger chaque concentration avec 10 g de la propolis au sol.
  3. Incuber à 25 ° C et agiter la fiole à 250 tr/min pendant 48 h.
  4. Filtrer les extraits à l’éthanol sur papier filtre avec une taille de pore de 25 μm.
  5. Reconstituer les filtrats de leur volume original (100 mL) avec de l’éthanol 95 % en utilisant un ballon jaugé.
  6. Magasin que l’éthanol extrait à-20 ° C.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.

2. préparation des extraits à l’éthanol pour HPLC

  1. Concentré de 10 mL d’éthanol extraits par évaporation sous vide à 40 ° C pendant 15 min.
  2. Cuire au four de la matière sèche à 45 ° C pendant 24 h.
  3. Reconstituer la matière sèche avec 10 mL d’éthanol à 95 %.
  4. Filtre 1 mL d’éthanol extrait à l’aide d’un filtre de seringue stérile avec une taille de pores de 0,45 µm.
  5. Refiltrer les extraits à l’éthanol en utilisant un filtre de seringue stérile avec une porosité de 0,22 µm. Le filtrat est recueilli et peut être analysé directement par CLHP.

3. analyse du contenu Propolin par CLHP

  1. Création de courbes standard de propolins
    1. Préparer 1 L de la phase mobile de solution de méthanol : eau 88.8:11.2 (v/v).
    2. Préparer des dilutions de propolin des concentrations (C, D, F et G) standards (15,625 mg/mL, 31,25 mg/mL, 62,5 mg/mL et 125 mg/mL, respectivement) à l’aide de la solution de la phase mobile comme solvant.
    3. Injecter 20 µL de propolin des concentrations standard dans la colonne de phase inverse, dans l’ordre de la faible concentration à la forte concentration.
    4. Affectez à la colonne HPLC à 30 ° C et le débit de 1 mL/min.
    5. Sélectionner la longueur d’onde du détecteur UV 280 nm et le temps de l’enregistreur à 20 min.
    6. Analyser les normes au moins 3 x.
    7. Tracer la réponse de mesure (axe y) contre la concentration (axe des x) à l’aide de calcul feuille de logiciel et créer une courbe standard avec l’équation et la valeur de R-carré.
  2. Analyse des extrait alcoolique s
    1. Injecter 20 µL de l’éthanol les extraits obtenus d’étape 2.5 dans la colonne de phase inverse.
    2. Affectez à la colonne HPLC à 30 ° C et le débit de 1 mL/min.
    3. Sélectionner la longueur d’onde du détecteur UV 280 nm et le temps de l’enregistreur à 20 min.
    4. Analyser les normes au moins 3 x.
    5. Calculer la concentration de propolin dans l’extrait par l’éthanol, à l’aide de l’équation de la courbe d’étalonnage obtenue à l’étape 3.1.7 qui utilise la surface du pic pour chaque propolin.

4. analyse de Concentration bactéricide Concentration minimale inhibitrice et Minimum

Remarque : La méthode de microdilution sert à évaluer l’efficacité antibactérienne du propolins de l’éthanol extrait de propolis verte taïwanaise.

  1. Préparation des organismes d’essai
    1. Décongeler les souches bactériennes, Staphylococcus aureus et Escherichia coli et puis, la culture eux à bouillon trypticase soja et bouillon nutritif, respectivement, à 37 ° C pendant 24 h.
    2. S. aureus à l’aide de bouillon trypticase soja et e. coli à l’aide de bouillon nutritif pour deux générations de passage et, puis, calculer unités formatrices de colonies par comptage des colonies individuelles sur une gélose.
  2. Préparation de l’éthanol extrait pour tests d’activité antibactérienne
    1. Concentrer les extraits à l’éthanol obtenus à l’étape 1.5 par évaporation sous vide à 40 ° C pendant 15 min.
    2. Reconstituer la matière sèche avec le diméthylsulfoxyde (DMSO) et ajuster la concentration de l’extrait à 12,8 mg/mL.
    3. Faire une dilution en série (concentration : 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 et 640 µg/mL) de l’éthanol extrait en utilisant le bouillon.
  3. Tests de concentration minimale inhibitrice
    1. Ajouter 10 µL d’éthanol dilué extraits allant de 0,156 640.0 µg/ml dans une plaque de 96 puits.
    2. En utilisant le bouillon, réglez le volume à 100 µL et maintenir 5 % DMSO dans toutes les dilutions.
    3. Ensemencer 100 µL de culture bactérienne (1 x 106/ml) dans la plaque à 96 puits.
    4. Extraits de l’inoculum de culture contenant différentes concentrations d’éthanol à 37 ° C pendant 48 h.
    5. Analyser la croissance bactérienne selon la turbidité et à l’aide de la densité optique (lecteur de microplaques) à 590 nm pour déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI).
  4. Concentration bactéricide minimum tests
    1. Ensemencer 10 µL de culture liquide de chaque puits du test MIC qui ne présentaient aucune croissance sur une gélose.
    2. Incuber à 37 ° C pendant 24 h.
    3. Déterminer l’activité bactéricide en identifiant la plus faible concentration qui a révélé aucune prolifération bactérienne visible. La concentration qui élimine complètement la croissance cellulaire est considérée être la concentration bactérienne minimale (MBC).

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Representative Results

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Résultats positifs des données représentatives pour l’extraction de l’éthanol sont présentées au tableau 1. Le rendement en matière sèche de la propolis verte taïwanais était corrélée positivement avec la concentration d’éthanol. Les extraits de l’éthanol 95 % et 99,5 % avaient la matière sèche plus élevée rendement de propolis verte taïwanaise. Le rendement en matière sèche plus faible de la propolis verte taïwanais s’est produite lorsque l’eau a été utilisé comme solvant d’extraction. Ces résultats indiquent qu’un solvant organique, comme l’éthanol, effectue le meilleur pour l’extraction de la propolis verte taïwanais. Le signal de propolins standard C, D, F et G a été identifié et quantifié par CLHP (Figure 1 a). Le signal de propolins dans les extraits de l’éthanol a été caractérisé en utilisant les normes individuelles propolin et HPLC (Figure 1 b). Normalement, la concentration de propolins (C, D, F et G) à la propolis verte taïwanaise est corrélée positivement avec la concentration d’éthanol lors de l’extraction (tableau 1). Le rendement le plus élevé de propolins dans la propolis verte taïwanaise a été produit dans les extraits d’éthanol 95 % et 99,5 %.

Des données représentatives positives pour l’effet antibactérien des extraits à l’éthanol sont présentées au tableau 2. Une activité antibactérienne contre Staphylococcus aureus et Escherichia coli dans les extraits de l’éthanol ont été examinés. Le moyen MIC et le MBC d’éthanol extraits de S. aureus étaient de 10 à 20 µg/mL et 20 µg/mL, respectivement (tableau 2). Extraits aqueux ne disposait pas des effets antibactériens contre Staphylococcus aureus (tableau 2). Aucun effet antibactérien sur e. coli a été observée avec soit de l’éthanol ou l’eau extraits (tableau 2).

Figure 1
Figure 1 : Identification des propolins dans la propolis verte taïwanaise. Ces panneaux montrentdes niveaux de propolins et (b) la mesure de propolins dans la propolis verte taïwanaise par CLHP. Ce chiffre a été modifié par Chen et al. 8. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Solvant * Rendement (%) Propolin (C + D + F + G)
(mg/mL)
99,5 % EtOH 66.75 ± 0,5un** 36.73 ± 0,80un
95 % EtOH 66.25 ± 0,50a 37.55 ± 1,29un
80 % EtOH 64,75 ± 0,96b 34.25 ± 0,71b
70 % EtOH 63.25 ± 0,96c 31.53 ± 0,31c
60 % EtOH 59.00 ± 1,41d 29.34 ± 1,59d
Eau 7,00 ± 0,82e ND ***

Tableau 1 : sécher rendement (%) de la matière et le contenu de propolin (mg/mL) en taïwanaise propolis verte extraite à l’aide de différents solvants. * 10 g de la propolis a été extraite à l’aide de 100 mL de solvant, et des extraits ont été finalement reconstitués à 100 mL. ** Les valeurs sont la moyenne ± l’écart-type (SD). a à e Qui s’offrent dans une colonne qui n’ont aucun exposant commune est significativement différentes (P < 0,05). ND = non détecté. Ce tableau a été modifié par Chen et al. 8.

Extrait Staphylococcus aureus Escherichia coli
MIC (µg/mL) MBC (µg/mL) MIC (µg/mL)
99,5 % EtOH 10 20 > 640
95 % EtOH 10 20 > 640
80 % EtOH 20 20 > 640
70 % EtOH 10 20 > 640
60 % EtOH 20 20 > 640
Eau ND ND ND

Tableau 2 : MIC et le MBC (µg/mL) des divers extraits contre Staphylococcus aureus et Escherichia coli. Ce tableau a été modifié par Chen et al. 8.

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Discussion

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Une étude a rapporté que macération, avec différentes concentrations d’éthanol, pourrait servir pour l' extraction de la propolis brésilienne17; Toutefois, le processus était long17. Il a fallu au moins 10 jours pour extraire les composés bioactifs, comme la teneur en composés phénoliques, de propolis brésilienne17. Par ailleurs, extraction de l’éthanol en combinaison avec chauffage à 37 ° C, 50 ° C ou 70 ° C pendant 30 min a été proposée pour l’extraction de la propolis brésilienne19,21,22. Il a été déterminé que les composés bioactifs dans la propolis brésilienne pourraient être extraite différemment selon le pourcentage d’éthanol19. L’efficacité de l’extraction des composés bioactifs dans la propolis peut varier en raison de la composition chimique différente de propolis brésilienne et la propolis verte taïwanaise. Ici, nous fournissons un protocole fiable et reproductible pour l’extraction de la propolis verte taïwanaise. Les composés bioactifs dans la propolis verte taïwanaise pourraient être récoltés en 2 jours, à l’éthanol comme solvant. Une conclusion similaire prend également en charge le protocole présenté ici et déterminé que propolins (C, D, F et G) de la propolis verte taïwanaise pourrait être extraite à l’aide de l’éthanol à 95 % en combinaison avec une extraction de 3 jour23. Une autre étude a démontré que l’éthanol 95 % en combinaison avec un h 21 extraction a pu récolter propolins du taïwanais propolis verte24. Cependant, il faut vérifier la concentration exacte de propolins après l’extraction de l’éthanol de 21 h. Les chercheurs ont proposé que le processus de chauffage augmente l’efficacité de l’extraction pour la propolis brésilienne19,21,22. Si propolins de propolis verte taïwanaise peuvent être extraites de chauffage doivent être étudiées.

L’éthanol extraits de propolis verte taïwanaise ont des effets antibactériens contre les pathogènes Gram-positifs. Parce que la propolis est hydrophobe, des études ont démontré qu’un solvant organique comme l’éthanol est un solvant approprié pour la propolis extraction8,16,17,18,19, 20. Des études ont également démontré qu’une concentration accrue d’éthanol conduit à plusieurs composés bioactifs extraits8,17,18,20. Dans le présent protocole, la matière sèche maximale des rendements de propolis verte taïwanaise sont observées dans l’éthanol 95 % et 99,5 % des extraits, ainsi que la plus forte concentration de propolins et activité antibactérienne.

Le présent protocole est conçu pour l’extraction de la propolis verte taïwanais à l’éthanol, et l’évaluation de la qualité est faite sur la base du contenu de propolins. Toutefois, certains composés bioactifs insolubles dans l’éthanol à la propolis verte taïwanaise ne peut pas être correctement isolés en utilisant le présent protocole.

L’aspect le plus crucial de la méthode en ce qui concerne les méthodes existantes, c’est que cette méthode fait gagner du temps par rapport aux méthodes proposées dans les autres études17,23. En outre, les extraits à l’éthanol 95 % et 99,5 % de propolis verte taïwanaise présentaient une forte concentration de l’activité propolins et antibactérien.

Cette approche a des applications directes pour caractériser d’autres composés bioactifs soluble dans l’éthanol inconnus dans la propolis verte taïwanaise. En outre, extraits à l’éthanol contenant propolins pourraient servir pour déterminer les autres bioactivités.

L’une des procédures expérimentales clés est d’assurer l’uniformité de la propolis verte taïwanaise pendant le broyage (étape 1.1 du protocole). Meulage inapproprié de propolis verte taïwanaise peut conduire à des rendements faibles de matière sèche et propolin contenu. Il est essentiel d’utiliser un appareil de broyage approprié, comme un moulin à épices, tissus moulin ou homogénéisateur et à veiller à ce que la propolis devient une poudre fine sans les particules volumineuses restant après le meulage.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à déclarer.

Acknowledgments

Ce manuscrit a été édité par Wallace édition académique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ethanol Sigma-Aldrich E7023
Whatman no. 4 filter paper Sigma-Aldrich WHA1004125
methanol Sigma-Aldrich 34860
reverse phase RP-18 column Phenomenex Inc. 00G-0234-E0
Staphylococcus aureus ATCC BCRC 10780
Escherichia coli ATCC BCRC 10675
tryptic soy broth Sigma-Aldrich 22092
nutrient broth Sigma-Aldrich 70122
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
spice grinder Waring WSG60K
microplate Reader Molecular Devices EMAX PLUS
HPLC system Agilent 1200 Series
vacuum evaporation BÜCHI Rotavapor R-215

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Extraction et analyse des taïwanaise Propolis verte
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Chen, C. T., Chien, Y. H., Yu, Y. H., Chen, Y. W. Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis. J. Vis. Exp. (143), e58743, doi:10.3791/58743 (2019).More

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