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Biochemistry

台湾グリーン プロポリスの抽出と分析

doi: 10.3791/58743 Published: January 7, 2019

Summary

抽出し抗菌活性を示す台湾産グリーンプロを特徴付ける溶媒としてエタノールを使用するためのプロトコルを提案します。

Abstract

台湾産グリーンプロ プレニル フラボノイドが豊富です、抗酸化、抗菌などの生物活性と抗がんものの広い範囲を展示します。台湾グリーン プロポリスの生理活性化合物、propolins、すなわち、C、D、F、および g.台湾グリーン プロポリスに含まれる propolins の濃度は、季節と地理的な場所によって異なります。したがって、台湾緑プロポリスの品質を決定するための標準および繰り返し可能な手順を確立する重要です。ここでは、台湾緑プロポリスの品質を特徴付けるに抗菌活性分析、高速液体クロマトグラフィー、エタノール ベースの抽出を使用するプロトコルを提案する.このメソッドは、95%、99.5% エタノール抽出が台湾緑プロポリス、抗菌特性を持つ propolins の最高濃度降伏から最大の乾物収量を達成することを示します。これらの調査結果によると現在のプロトコルは、信頼性と再現台湾緑プロポリスの品質を決めるのとみなされます。

Introduction

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プロポリス蜂種セイヨウミツバチによって生成される天然樹脂混合物であります。プロポリスは、古来より民間療法で広く使用されています。研究は、最近そのプロポリスは微生物感染症と炎症1を防止するために有益な報告。プロポリスに含まれる主な生理活性物質は、フラボノイド、フェノール酸エステル、プレニルp多数の調査は示した-クマル酸と diterpenic 酸2,3。日には、台湾緑プロポリスから 10 プレニル フラバノン誘導体は高速液体クロマトグラフィー (HPLC)4,5,6,7を介して識別されています。これらの中で最も豊富な propolins C、D、F、および G5,7です。台湾グリーン プロポリスのかなり生物学的効果は、propolins8の高いコンテンツに関連付けられます。

プロポリスに含まれる生理活性化合物の濃度は季節やプロポリスの取得元となる地理的な場所によって大きく異なります。ヨーロッパのプロポリスには、フラボノイドのアグリコンとフェノール酸9主に含まれています。ブラジル産プロポリスに含まれる主な生理活性物質は、プレニルp-クマル酸、アルテピリン C10など。研究は、シーズンがグリーンプロ ポリス台湾11で合計 propolin のコンテンツを決定する重要な要因であることを示した。台湾グリーン プロポリスの propolin の内容は、冬11夏 (7 月) および最下位最高です。プロポリスの抗菌特性は、広く生物学的活性の指標となると考えられています。一般に、様々 な地域から採取したプロポリスのサンプルと同様の抗菌プロパティを展示してたとえば、それは一般的にほぼすべてのグラム陽性菌に対して有効であるし、グラム陰性菌10,12,13に対して限定的な抗菌効果を展示します。プロポリスに含まれるフラボノイドの相乗的相互作用は、抗菌効果14を持っている示した。同様に、台湾の緑プロポリスは15グラム陽性菌に対する抗菌効果があると報じられました。さらに、研究には、台湾産グリーンプロ8の propolins の相互作用により抗菌効果も識別されます。

プロポリスに含まれる生理活性化合物の性状は、その化学組成は、その元のソースによって異なりますので難しいです。したがって、台湾緑プロポリスの品質を決めるため可能で再現可能な方法を確立する必要があります。ただし、標準的な手順が確立されていない台湾緑プロポリス抽出とその後の機能分析のため。プロポリス抽出16,17,18,19,20いろいろ有機および無機溶剤を適用するいくつかの方法を提案されています。プロポリスは脂溶性の混合物、有機抽出は無機抽出8,18,19より研究が示しています。台湾グリーン プロポリスとその抗菌特性で合計 propolin 濃度は、台湾緑プロポリスの品質の重要な指標です。したがって、本研究の目的は溶媒としてエタノールを使用して抽出し、台湾緑プロポリスの抗菌特性を特徴付けるのためのプロトコルを提示します。

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Protocol

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1. エタノール抽出化合物の調製

  1. 5 月から 7 月まで台湾でハチの巣から採取、冷凍の台湾緑プロポリスの 10 グラムの重量を量るし、スパイス グラインダーを使用してそれを挽きます。台湾グリーン プロポリスの全作品がなく任意の大きな粒子の細かい粉末状に地面であることを確認します。
  2. 各種濃度のエタノール (60%、70%、80%、95%、99.5%) と別のフラスコと地面プロポリスの 10 g の各濃度をミックスに水 100 mL を追加します。
  3. 25 ° C で、48 h の 250 rpm でフラスコを振る。
  4. エタノール抽出液 25 μ m 孔径のフィルター ペーパーをフィルター処理します。
  5. 95% エタノール、メスフラスコを使用して、元のボリューム (100 mL) にろ液を再構築します。
  6. -20 ° C のエタノール抽出物を保存します。
    注: プロトコルはここで一時停止することができます。

2. エタノール抽出物の高速液体クロマトグラフィーのための準備

  1. 40 ° C 15 分で真空蒸着法によるエタノール抽出物の 10 mL を集中します。
  2. 24 h 45 ° C で乾物を焼きます。
  3. 95% エタノール 10 mL で乾物を再構成します。
  4. フィルター 1 mL のエタノールは、0.45 μ m 孔サイズの滅菌シリンジ フィルターを使用して抽出します。
  5. 孔径 0.22 μ m の滅菌注射器フィルターを用いたエタノール抽出物を非します。濾液は、収集され、直接高速液体クロマトグラフィーを使用して分析することができます。

3. 高速液体クロマトグラフィーを使用して Propolin コンテンツの分析

  1. Propolins の標準曲線の確立
    1. 88.8:11.2 (v/v) メタノール: 水ソリューションの移動相の 1 L を準備します。
    2. 準備 propolin のシリアル希薄標準 (C、D、F、および G) の濃度 (15.625 mg/mL、31.25 mg/mL、62.5 mg/mL と 125 mg/mL、それぞれ) 移動相溶液を溶媒として用いた。
    3. 高濃度低濃度から順に、逆相カラムに propolin 標準的な濃度の 20 μ L を注入します。
    4. 30 の ° C および 1 mL/分の流量で HPLC カラムを設定します。
    5. 280 に UV 検出器の波長を設定 nm と 20 分時の記録。
    6. 分析基準の少なくとも 3 x。
    7. プロット測定応答 (y 軸) の濃度 (x 軸) に対して計算を使用してソフトウェアをシートし、方程式と R 二乗値標準曲線を作成します。
  2. 解析エタノール抽出s
    1. 逆相カラムに 2.5 ステップから得られるエタノール抽出物の 20 μ L を注入します。
    2. 30 の ° C および 1 mL/分の流量で HPLC カラムを設定します。
    3. 280 に UV 検出器の波長を設定 nm と 20 分時の記録。
    4. 分析基準の少なくとも 3 x。
    5. 各 propolin のピーク面積を使用するステップ 3.1.7 から得られる標準曲線の方程式を使って、エタノール抽出物の propolin の濃度を計算します。

4. 最小発育阻止濃度と最小殺菌濃度分析

注: 台湾緑プロポリスからエタノール抽出した propolins の抗菌効果を評価する微量液体希釈法を使用します。

  1. 試験菌の調製
    1. 黄色ブドウ球菌大腸菌、細菌の緊張を解凍し、文化にトリプシン醤油スープで栄養流体培養基、それぞれ、24 h の 37 ° C で。
    2. トリプシン大豆スープと 2 つの世代の栄養流体培養基を使用してE. 大腸菌を用いた黄色ブドウ球菌を通過し、その後、寒天版の個々 のコロニーをカウントすることによってコロニー形成単位を計算します。
  2. 調製されたエタノールの抽出抗菌活性試験
    1. 40 ° C で真空蒸着法による 15 分間の 1.5 ステップから得られるエタノール抽出物を集中します。
    2. ジメチルスルホキシド (DMSO) で乾物を再構成し、12.8 mg/ml の抽出液の濃度を調整します。
    3. シリアル希釈を行う (濃度: 5、10、20、40、80、160、320、640 μ g/mL) エタノールの抽出スープを使用します。
  3. 最小発育阻止濃度テスト
    1. 0.156 640.0 μ g/ml 96 ウェル プレートに至るまで希薄エタノール抽出液の 10 μ L を追加します。
    2. スープを使用すると、100 μ L にボリュームを調整し、すべての希釈液に 5 %dmso を維持します。
    3. 96 ウェル プレートに培養 (1 x 106/mL) 100 μ L を接種します。
    4. 各種濃度のエタノールを含む培養菌を 48 h の 37 ° C で抽出します。
    5. 濁度と 590 で光学濃度 (マイクロ プレート リーダー) を使用してによると細菌の増殖を分析最小発育阻止濃度 (MIC) を決定する nm。
  4. 最小殺菌濃度テスト
    1. 寒天プレート上に増殖しないマイク テストの各ウェルから液体培養の 10 μ L を接種します。
    2. 37 ° C 24 時間で孵化させなさい。
    3. 目に見える細菌の成長を明らかに最低濃度を識別することによって殺菌作用を決定します。細胞の増殖を完全に排除する濃度は、最小の細菌濃度 (MBC) と見なされます。

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Representative Results

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エタノール抽出のための肯定的な代表的なデータは、表 1に掲載されています。台湾グリーン プロポリスから乾物収量はエタノール濃度と積極的に関連付けられました。95%、99.5% エタノール抽出物は、台湾緑プロポリスから得られる最高の乾物を持っていた。台湾グリーン プロポリスから最低乾物収量は、水抽出溶媒として使用したときに発生しました。エタノールなどの有機溶剤が台湾緑プロポリス抽出のためベストを実行することが示唆されました。C、D、F、および G の標準的な propolins の信号は識別され、高速液体クロマトグラフィー (図 1 a) を用いて定量化します。エタノール抽出物の propolins の信号は、個々 の propolin 標準および高速液体クロマトグラフィー (図 1 b) を使用して特徴付けられました。通常、台湾緑プロポリスに含まれる propolins (C、D、F、および G) の濃度は (表 1) の抽出時にエタノール濃度と積極的に関連付けられました。台湾グリーン プロポリスに含まれる propolins の高い収率は 95%、99.5% エタノール エキスで生産されました。

エタノール抽出物の抗菌効果のための肯定的な代表的なデータは、表 2に掲載されています。エタノール抽出物の黄色ブドウ球菌大腸菌に対して抗菌活性を調べた。平均のマイクと黄色ブドウ球菌のエタノール抽出物の MBC が 10-20 μ G/ml と 20 μ g/mL、それぞれ (表 2)。水抽出液は、黄色ブドウ球菌(表 2) に対する抗菌効果を持っていませんでした。大腸菌に対する抗菌効果が認められなかったどちらかとエタノールまたは水抽出 (表 2)。

Figure 1
図 1: 台湾緑プロポリスに含まれる propolins の同定します。これらのパネルは、高速液体クロマトグラフィーを用いた台湾緑プロポリスで propolins の測定 propolins と (b) の () の基準を表示します。この図は、陳から変更されています。8.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

溶剤 * 利回り (%) Propolin (C + D + F + G)
(mg/mL)
99.5% エタノール 66.75 ± 0.5* * 36.73 ± 0.80
95% エタノール 66.25 ± 0.50 37.55 ± 1.29
80% エタノール 64.75 ± 0.96b 34.25 ± 0.71b
70% エタノール 63.25 ± 0.96c 31.53 ± 0.31c
60% エタノール 59.00 ± 1.41d 29.34 ± 1.59d
7.00 ± 0.82e ND * * *

表 1: 乾物収量 (%) と propolin コンテンツ (mg/mL) 台湾産グリーンプロ各種溶剤を使って抽出します。* 10 g プロポリスの抽出溶媒、100 mL を使用して、抽出された 100 mL に再構成された最後に。* * 値は、平均 ± 標準偏差 (SD) です。a ~ e一般的な上付き文字を持たない列内の意味が大幅に異なる (P 0.05 <)。ND = 検出されたではないです。このテーブルは、陳から変更されています。8

抽出 黄色ブドウ球菌 大腸菌
マイク (μ g/mL) MBC (μ g/mL) マイク (μ g/mL)
99.5% エタノール 10 20 > 640
95% エタノール 10 20 > 640
80% エタノール 20 20 > 640
70% エタノール 10 20 > 640
60% エタノール 20 20 > 640
ND ND ND

表 2: マイクと MBC (μ g/mL) に対して様々 なエキスの黄色ブドウ球菌大腸菌.このテーブルは、陳から変更されています。8

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Discussion

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研究報告ブラジル産プロポリス抽出17; 用のエタノールの濃度を使用して浸漬可能性があります。しかし、プロセスは、時間のかかる17でした。ブラジル産プロポリス17からフェノール含量などの生理活性物質を抽出するために少なくとも 10 日かかった。また、ブラジル産プロポリス19,21,22の抽出の 37 ° C、50 ° C、または 30 分の 70 ° C で加熱との組み合わせでエタノール抽出を提案されています。ブラジル産プロポリスの生理活性化合物がエタノール19の割合に応じて特異的抽出することが決定されました。プロポリスに含まれる生理活性化合物の抽出効率は、ブラジル産プロポリスと台湾緑プロポリスの化学組成の異なるため異なる場合があります。ここでは、台湾の緑プロポリスを抽出するため信頼性が高く、再現性のあるプロトコルを提供します。台湾グリーン プロポリスに含まれる生理活性化合物は、溶媒としてエタノールを使用して 2 日以内収穫でした。同様の所見は、またここで紹介し、台湾緑プロポリスから propolins (C、D、F、および G) は、3 日間抽出23との組み合わせで 95% エタノールを使用して抽出することができる決定のプロトコルをサポートします。別の調査は示したその 95% エタノール 21 h との組み合わせで抽出された台湾産グリーンプロ24から propolins を収穫することができます。しかし、21 h エタノール抽出後の propolins の正確な濃度を確認する必要があります。提案されている加熱処理にブラジル産プロポリス19,21,22の抽出効率が向上します。加熱による台湾緑プロポリスから propolins を抽出できるかどうかを調べる必要があります。

台湾グリーン プロポリスからエタノール抽出物はあるグラム陽性菌に対して抗菌効果です。プロポリス抽出8,16,17,18,19、適当な溶剤をエタノールなどの有機溶媒にはプロポリスは疎水性、研究が示しています。 20。研究はまた増加エタノール濃度がより抽出した生理活性化合物8,17,18,20につながることを実証しています。この議定書は、台湾緑プロポリスの収率は 95%、99.5% エタノールで観察される最大の乾物は、propolins と抗菌活性の最高濃度だけでなく、抽出します。

この議定書は台湾緑プロポリス抽出、エタノールを使用して設計され、品質評価、propolins の内容に基づいて行われます。ただし、台湾緑プロポリスに含まれるエタノール不溶性生理活性化合物は、現在のプロトコルを使用して分離正しくできません。

既存のメソッドに関するメソッドの最も重要な側面は、このメソッドが他研究17,23で提案した方法を基準にして時間を節約することです。また、台湾緑プロポリスの 95%、99.5% エタノール抽出物は、propolins および抗菌活性の高い濃度を出展しました。

このアプローチは、台湾緑プロポリスに含まれる他の不明なエタノール可溶性の生理活性物質の特性評価に直接アプリケーションをあります。さらに、propolins を含むエタノール抽出物は、他の生物活性を決定する使用できます。

キーの実験手順のいずれかは、(プロトコル手順 1.1) を研削中に台湾緑プロポリスの均一性を確保することです。台湾グリーン プロポリスの不適切な研削低乾物収量と propolin コンテンツにつながることができます。スパイス グラインダー、組織の粉砕機、ホモジナイザーなどの適切な研削装置を使用して研削した後、残りの大きな粒子なし微粉末をプロポリスになります世話をするために不可欠です。

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Disclosures

著者申告するものがあります。

Acknowledgments

この原稿は、ウォレス学術編集することによって編集されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ethanol Sigma-Aldrich E7023
Whatman no. 4 filter paper Sigma-Aldrich WHA1004125
methanol Sigma-Aldrich 34860
reverse phase RP-18 column Phenomenex Inc. 00G-0234-E0
Staphylococcus aureus ATCC BCRC 10780
Escherichia coli ATCC BCRC 10675
tryptic soy broth Sigma-Aldrich 22092
nutrient broth Sigma-Aldrich 70122
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
spice grinder Waring WSG60K
microplate Reader Molecular Devices EMAX PLUS
HPLC system Agilent 1200 Series
vacuum evaporation BÜCHI Rotavapor R-215

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References

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台湾グリーン プロポリスの抽出と分析
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Chen, C. T., Chien, Y. H., Yu, Y. H., Chen, Y. W. Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis. J. Vis. Exp. (143), e58743, doi:10.3791/58743 (2019).More

Chen, C. T., Chien, Y. H., Yu, Y. H., Chen, Y. W. Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis. J. Vis. Exp. (143), e58743, doi:10.3791/58743 (2019).

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