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Biochemistry

추출 및 대만 그린 프로 폴리스의 분석

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58743
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University

Summary

우리는 용 매로 에탄올을 사용 하 여 추출 하 고 대만 그린 프로 폴리스 항균 활동을 전시 하는 특성에 대 한 프로토콜을 제시.

Abstract

대만 그린 프로 폴리스 prenylated 플 라 보노 이드에 풍부 하 고 생물학 등과, 항 산화, 항균, 항 암 제 들의 광범위 한 범위를 전시. 대만 그린 프로 폴리스의 생리 활성 화합물은 propolins, 즉 C, D, F, 및 g. 대만 그린 프로 폴리스에 propolins의 농도 계절과 지역에 따라 다릅니다. 따라서, 그것은 대만 그린 프로 폴리스의 품질을 결정 하기 위한 표준과 반복 가능한 절차를 설정 하는 중요 한입니다. 여기, 우리가 현재 에탄올 기반 추출, 고성능 액체 착 색 인쇄기, 항균 활동 분석 대만 그린 프로 폴리스의 품질 특성에 사용 하는 프로토콜. 이 메서드는 99.5%와 95% 에탄올 추출 대만 그린 프로 폴리스, 그로 인하여 떨어졌다는 항균 속성이 있는 propolins의 높은 농도에서 최대 건조 문제 수율 달성을 나타냅니다. 이러한 연구 결과 현재 프로토콜 신뢰할 수 있는 고 대만 그린 프로 폴리스의 품질을 결정 하기 위한 반복 가능한 간주 됩니다.

Introduction

프로 폴리스 Apis mellifera꿀벌 종에 의해 생성 하는 자연 수 지 혼합물 이다. 프로 폴리스는 민속 약에 고 대부터 널리 사용 되었다. 연구는 최근 그 프로 폴리스는 미생물 감염 및 염증1방지 하기 위한 유익한 했다. 수많은 학문은 설명 했다 주요 생리 활성 화합물 프로 폴리스에는 플 라 보노 이드, 페 놀 산 에스테 르, prenylated p-coumaric 산 및 diterpenic 산2,3. 날짜 하려면, 대만 그린 프로 폴리스에서 10 prenylated flavanone 파생 상품-고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)4,5,,67통해 확인 되었습니다. 이 중 가장 풍부한는 propolins C, D, F, G5,7. 대만 그린 프로 폴리스의 상당한 생물학적 효과 propolins8의 그것의 높은 콘텐츠와 상관 된다.

프로 폴리스에 생리 활성 화합물의 농도 계절과는 프로 폴리스를 얻은 지리적 위치에 따라 크게 다릅니다. 유럽 프로 폴리스에는 플 라 보노 이드 aglycone 및 페 놀 산9주로 포함 되어 있습니다. 브라질에서 프로 폴리스의 주요 생리 활성 화합물은 prenylated p-coumaric 산 artepillin C10등. 연구는 시즌11대만 그린 프로 폴리스에서 총 propolin 콘텐츠를 결정 하기 위한 중요 한 요소는 설명 했다. 대만 그린 프로 폴리스에 propolin 콘텐츠 이며 높은 여름 (5 월-7 월)에 가장 낮은 겨울11에. 프로 폴리스의 항균 속성 수 생물 학적 활동의 지표로 널리 간주 되었습니다. 일반적으로, 다양 한 지역에서 수집 하는 프로 폴리스의 샘플 전시가 비슷한 항균 재산; 예를 들어 일반적으로 거의 모든 그람 양성 세균에 대해 효과적 이며 그람 음성 세균10,,1213에 대 한 제한 된 항균 효과 전시. 프로 폴리스에는 플 라 보노 이드 간의 상호 시너지 작용 항균 효과14를 시연 했다. 마찬가지로, 대만 그린 프로 폴리스15그람 양성 세균 대 한 항균 효과가 보고 되었다. 또한, 연구는 또한 대만 그린 프로 폴리스8propolins의 상호 작용에서 항균 효과 확인.

프로 폴리스에 생리 활성 화합물의 특성은 화학 성분의 근원의 그것의 소스에 따라 달라질 수 있습니다 때문에 어렵습니다. 따라서, 그것은 대만 그린 프로 폴리스의 품질을 결정 하기 위한 가능 하 고 반복 가능한 방법을 확립 하는 데 필요한입니다. 그러나, 아무 표준 절차는 대만 그린 프로 폴리스 추출 및 이후의 기능 분석에 대 한 설립 되었습니다. 프로 폴리스 추출16,17,18,,1920각종 유기 및 무기 용 제를 적용 하는 여러 가지 방법은 제안 되었습니다. 프로 폴리스는 질 성 혼합물 이므로 연구 유기 추출 무기 추출8,,1819보다 낫다는 것을 증명 하고있다. 대만 그린 프로 폴리스의 항균 속성에 총 propolin 농도 대만 그린 프로 폴리스의 품질의 주요 지표. 따라서,이 연구의 목적은 용 매로 에탄올을 사용 하 여 추출 하 고 대만 그린 프로 폴리스의 항균 속성 특성에 대 한 프로토콜을 제시 하는 것 이다.

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Protocol

1입니다. 에탄올 추출 화합물의 준비

  1. 냉동된 대만 그린 프로 폴리스는 5 월에서 7 월 대만에 벌 통에서 수집 된의 10 g의 무게 그리고 향미료 분쇄기를 사용 하 여 그것을 갈기. 대만 그린 프로 폴리스의 모든 조각을 어떤 큰 입자 없이 정밀한 분말에 지상은 확인 합니다.
  2. 에탄올 (60%, 70%, 80%, 95%, 및 99.5%)과 물 플라스 크를 분리 하 여 지상 프로 폴리스의 각 농도 10 g을 혼합의 다양 한 농도의 100 mL를 추가 합니다.
  3. 25 ° C에서 품 어와 48 h에 대 한 250 rpm에서 플라스 크를 흔들어.
  4. 에탄올 추출 물 25 μ m 기 공 크기 필터 종이 통해 필터링.
  5. 부피 측정 플라스 크를 사용 하 여 95% 에탄올과 그들의 원래 볼륨 (100 mL)에 filtrates를 다시 구성.
  6. -20 ° c.에 에탄올 추출 물 저장
    참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.

2입니다. HPLC의 에탄올 추출 물 준비

  1. 15 분 동안 40 ° C에서 진공 증발에 의해의 에탄올 추출 물 10 mL를 집중.
  2. 24 h에 대 한 45 ° C에서 건조 문제를 구워.
  3. 95% 에탄올 10 mL와 건조 문제 reconstitute
  4. 필터 1 mL의 에탄올 0.45 μ m 기 공 크기와 무 균 주사기 필터를 사용 하 여 추출 합니다.
  5. 0.22 μ m 기 공 크기와 무 균 주사기 필터를 사용 하 여 에탄올 추출 물 refilter filtrate 수집 이며 HPLC를 사용 하 여 직접 분석할 수 있습니다.

3. HPLC를 사용 하 여 Propolin 콘텐츠 분석

  1. Propolins의 표준 곡선의 설립
    1. 88.8:11.2 (v/v) 메탄올: 물 솔루션의 모바일 단계 1 리터를 준비 합니다.
    2. 준비 propolin의 직렬 희석 (C, D, F, 및 G) 표준 농도 (15.625 mg/mL, 31.25 mg/mL, 62.5 mg/mL, 및 125 mg/mL, 각각)를 용 매로 모바일 단계 솔루션을 사용 하 여.
    3. 높은 농도에 낮은 농도에서 순차적으로 역 상 열에 propolin 표준 농도의 20 µ L을 주입.
    4. 30 ° C를 1 mL/min 흐름 속도에서 HPLC 열을 설정 합니다.
    5. 자외선 검출기의 파장 280 설정 및 레코더 시간 20 분을.
    6. 적어도 3 표준 분석 x.
    7. 농도 (x 축)에 대 한 측정 응답 (y 축)를 플롯 소프트웨어, 시트 계산을 사용 하 고 수식 및 R-제곱 값과 표준 곡선을 만듭니다.
  2. 분석 에탄올 추출 s
    1. 2.5 역 상 열에 단계에서 얻은 에탄올 추출 물 20 µ L을 주입.
    2. 30 ° C를 1 mL/min 흐름 속도에서 HPLC 열을 설정 합니다.
    3. 자외선 검출기의 파장 280 설정 및 레코더 시간 20 분을.
    4. 적어도 3 표준 분석 x.
    5. 각 propolin에 대 한 피크 영역을 사용 하는 단계 3.1.7에서에서 얻은 표준 곡선을 위한 방정식을 사용 하 여 에탄올 추출 물에서 propolin의 농도 계산 합니다.

4. 최소 억제 농도 최소 살 균 농도 분석

참고: microdilution 메서드는 에탄올 추출 propolins에서 대만 그린 프로 폴리스의 항균 효능을 평가 하기 위해 사용 됩니다.

  1. 시험 생물의 준비
    1. 황색 포도상구균 및 대장균, 세균성 긴장을 해 동 하 고, 문화 그들 tryptic 간장 국물과 영양 국물에 각각 24 h에 대 한 37 ° C에서.
    2. S. 구 균 tryptic 간장 국물과 대장균 영양 국물을 사용 하 여 2 세대를 사용 하 여 통과 하 고, 다음, 한 천 배지에서 개별 식민지를 계산 하 여 콜로 니 형성 단위를 계산.
  2. 에탄올의 준비에 대 한 추출 항균 활동 테스트
    1. 15 분 동안 40 ° C에서 진공 증발 하 여 1.5 단계에서 얻은 에탄올 추출 물 집중.
    2. 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)와 건조 문제를 다시 구성 하 고 추출 12.8 mg/ml의 농도 조정 합니다.
    3. 직렬 희석을 만드는 (농도: 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 그리고 640 µ g/mL) 에탄올의 국물을 사용 하 여 추출.
  3. 최소 억제 농도 테스트
    1. 96 잘 접시에 0.156에서 640.0 µ g/mL에 이르기까지 희석된 에탄올 추출 물의 10 µ L를 추가 합니다.
    2. 국물을 사용 하 여 100 µ L 볼륨을 조정 하 고 모든 희석에 5 %DMSO 유지.
    3. 96 잘 접시로 100 µ L 세균성 문화 (1 x 106/mL)의 예방.
    4. 에탄올의 다양 한 농도 포함 하는 문화 inoculum 48 h에 대 한 37 ° C에서 추출 합니다.
    5. 탁도 및 590에서 광학 밀도 (microplate 리더)를 사용 하 여 세균의 성장을 분석 결정 최소 억제 농도 (MIC) nm.
  4. 최소 살 균 농도 테스트
    1. 한 천 배지 위에 성장이 전시 마이크 테스트의 각 우물에서 액체 문화 10 µ L 예방
    2. 24 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.
    3. 아니 볼 수 세균성 성장 밝혀 최저 농도 파악 하 여 살 균 활동을 확인 합니다. 농도 세포의 성장을 완전히 제거 될 최소 세균 농도 (MBC)으로 간주 됩니다.

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Representative Results

에탄올 추출에 대 한 긍정적인 대표적인 데이터는 표 1에 표시 됩니다. 대만 그린 프로 폴리스에서 건조 문제 항복 에탄올의 농도와 긍정적으로 연관 되었다. 95%, 99.5% 에탄올 추출 물 높은 마른 물질 대만 그린 프로 폴리스에서 항복 했다. 물 추출 용 매로 사용 되었다 대만 그린 프로 폴리스에서 가장 낮은 건조 문제 항복 발생 했습니다. 이러한 결과 에탄올 등 유기 용 매, 대만 그린 프로 폴리스 추출에 대 한 최고의 수행을 나타냅니다. C, D, F, G 표준 propolins의 신호 확인 되었다 고 HPLC (그림 1a)를 사용 하 여 계량. 에탄올 추출 물에서 propolins의 신호는 개별 propolin 표준 및 HPLC (그림 1b)를 사용 하 여 특징 이었다. 일반적으로, 대만 그린 프로 폴리스에 propolins (C, D, F, 및 G)의 농도 긍정적으로 추출 (표 1) 중 에탄올 농도와 연결 됩니다. 대만 그린 프로 폴리스에 propolins의 높은 수율 95%, 99.5% 에탄올 추출 물에서 제작 되었다.

에탄올 추출 물의 항균 효과 대 한 긍정적인 대표적인 데이터는 표 2에 표시 됩니다. 에탄올 추출 물에서 미 균 및 대장균 에 대 한 항균 활동 시험 되었다. 평균 마이크 및 S. 구 균 에 대 한 에탄올 추출의 MBC는 10-20 µ g/mL와 20 µ g/mL, 각각 (표 2). 물 추출 물 미 균 (표 2)에 대 한 항균 효과 없 었 어 요. 대장균 에 항균 효과가 없습니다 에탄올도 관찰 되었다 또는 물 추출 (표 2).

Figure 1
그림 1: 대만 그린 프로 폴리스에 propolins의 Id. 이러한 패널 표시 propolins 및 (b)의 (a) 표준 propolins의 측정 HPLC를 사용 하 여 대만 그린 프로 폴리스. 이 그림에서 첸 그 외 수정 되었습니다. 8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

용 매 * 수익률 (%) Propolin (C + D + F + G)
(mg/mL)
99.5 %EtOH 66.75 ± 0.5는는* * 36.73 ± 0.80는는
95 %EtOH 66.25 ± 0.50는를 37.55 ± 1.29는는
80 %EtOH 64.75 ± 0.96b 34.25 ± 0.71b
70 %EtOH 63.25 ± 0.96c 31.53 ± 0.31c
60 %EtOH 59.00 ± 1.41d 29.34 ± 1.59d
물 7.00 ± 0.82e ND * * *

표 1: 문제 생산량 (%) 및 propolin 콘텐츠 (mg/mL) 다양 한 용 매를 사용 하 여 추출 하는 대만 그린 프로 폴리스에서 건조. * 프로 폴리스의 10 g은 100 mL의 용 매를 사용 하 여 추출 하 고 추출 물 100 mL를 마지막으로 재구성 했다. * * 값은 평균 ± 표준 편차 (SD). -e 아니 일반적인 위 첨자 있는 열 내에서 의미는 크게 다른 (P < 0.05). ND = 검색. 이 테이블에서 첸 그 외 수정 되었습니다. 8.

추출 황색 포도상구균 대장균
마이크 (µ g/mL) MBC (µ g/mL) 마이크 (µ g/mL)
99.5 %EtOH 10 20 > 640
95 %EtOH 10 20 > 640
80 %EtOH 20 20 > 640
70 %EtOH 10 20 > 640
60 %EtOH 20 20 > 640
물 ND ND ND

표 2: 마이크와 MBC (µ g/mL)에 대 한 다양 한 추출 물 S. 구 균 및 대장균. 이 테이블에서 첸 그 외 수정 되었습니다. 8.

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Discussion

연구 보고는 단식, 에탄올, 다양 한 농도 사용 하 여 브라질 프로 폴리스 추출17; 사용 될 수 있습니다. 그러나, 과정은 시간이 많이 걸리는17. 그것은 적어도 10 일 브라질 프로 폴리스17에서 생리 활성 화합물, 페 놀 등을 추출 했다. 또는, 37 ° C, 50 ° C, 또는 30 분 동안 70 ° C에서 난방과 함께에서 에탄올 추출 추출 하는 브라질 프로 폴리스19,,2122제안 되었습니다. 그것은 브라질 프로 폴리스 있는 생리 활성 화합물 차동 에탄올19의 비율에 따라 추출 될 수 있는 결정 했다. 프로 폴리스에 생리 활성 화합물의 추출 효율 브라질 프로 폴리스와 대만 그린 프로 폴리스의 다른 화학 성분으로 인해 달라질 수 있습니다. 여기, 우리는 대만 그린 프로 폴리스를 추출 하기 위한 안정적이 고 반복 가능한 프로토콜을 제공 합니다. 대만 그린 프로 폴리스에 생리 활성 화합물 용 매로 에탄올을 사용 하 여 2 일 이내에 수확 될 수 있습니다. 유사한 찾는 또한 여기 제시 하 고 대만 그린 프로 폴리스에서 propolins (C, D, F, 및 G) 3 일간 추출23와 함께에서 95% 에탄올을 사용 하 여 추출 될 결정 프로토콜을 지원 합니다. 또 다른 연구 결과 증명을 95% 에탄올 추출 21 h와 함께에서 대만 그린 프로 폴리스24에서 propolins을 수확 수 있었다. 그러나, 21 h 에탄올 추출 후 propolins의 정확한 농도 확인 해야 합니다. 연구팀은 난방 과정 브라질 프로 폴리스19,,2122에 대 한 추출 효율 증가 제안 했다. 대만 그린 프로 폴리스에서 propolins가 열에 의해 추출 될 수 있다 여부 조사 해야 합니다.

대만 그린 프로 폴리스는 에탄올 추출 물 그람 양성 균에 대 한 항균 효과가 있다. 프로 폴리스 소수 성 때문에, 학문은 설명 했다 에탄올 등 유기 용 매 프로 폴리스 추출8,,1617,18,19, 적당 한 용 매 이다 20. 연구는 또한 증가 에탄올 농도 더 많은 추출된 생리 활성 화합물8,17,,1820리드 설명 했다. 현재 프로토콜에서 대만 그린 프로 폴리스의 수율 95%, 99.5% 에탄올에서 관찰 된다 최대 건조 물질 추출, propolins 및 항균 활동의 높은 농도 뿐만 아니라 합니다.

현재 프로토콜은 대만 그린 프로 폴리스 추출 에탄올를 사용 하 여 설계 되었습니다 그리고 품질 평가 propolins의 내용을 바탕으로 이루어집니다. 그러나, 대만 그린 프로 폴리스에 일부 에탄올 불용 성 생리 활성 화합물을 제대로 현재 프로토콜을 사용 하 여 격리 될 수 없습니다.

기존의 방법에 관하여 방법의 가장 중요 한 점은이 방법은 다른 연구17,23에서 제안 된 방법 기준으로 시간을 절약 한다. 또한, 대만 그린 프로 폴리스의 95%, 99.5% 에탄올 추출 물 propolins와 항균 활동의 높은 농도 전시.

이 이렇게 특성화 대만 그린 프로 폴리스에 다른 알 수 없는 에탄올 수용 성 생리 활성 화합물에 대 한 직접적인 응용 프로그램 있다. 또한, 에탄올 추출 물 propolins를 포함 하는 다른 bioactivities를 결정 하는 데 사용 될 수 있습니다.

(프로토콜 단계 1.1)을 연마 하는 동안 대만 그린 프로 폴리스의 균일성을 보장은 주요 실험 절차 중 하나. 대만 그린 프로 폴리스의 부적 절 한 연 삭 낮은 건조 물질의 수율 및 propolin 콘텐츠 발생할 수 있습니다. 양념 분쇄기, 조직 분쇄기, 균질 화기, 등 적절 한 분쇄 장치를 사용 하 고는 프로 폴리스 연 삭 후 남은 어떤 큰 입자 없이 정밀한 분말을 되 돌이 필수적입니다.

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Disclosures

저자는 선언할 수 없다.

Acknowledgments

이 원고는 월 러 스 학술 편집 편집 했습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ethanol Sigma-Aldrich E7023
Whatman no. 4 filter paper Sigma-Aldrich WHA1004125
methanol Sigma-Aldrich 34860
reverse phase RP-18 column Phenomenex Inc. 00G-0234-E0
Staphylococcus aureus ATCC BCRC 10780
Escherichia coli ATCC BCRC 10675
tryptic soy broth Sigma-Aldrich 22092
nutrient broth Sigma-Aldrich 70122
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
spice grinder Waring WSG60K
microplate Reader Molecular Devices EMAX PLUS
HPLC system Agilent 1200 Series
vacuum evaporation BÜCHI Rotavapor R-215

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References

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