Summary
Presentamos un protocolo para usar etanol como solvente para extraer y caracterizar propóleos verde Taiwan que exhibe actividad antibacteriana.
Abstract
Taiwan propóleos verde es rico en flavonoides, prenylated y exhibe una amplia gama de actividades biológicas, como antioxidante, antibacteriano y contra el cáncer. Los compuestos bioactivos de propóleos verde Taiwan son propolins, es decir, C, D, F y G. La concentración de propolins en el propóleos verde Taiwan varía dependiendo de la temporada y ubicación geográfica. Por lo tanto, es fundamental establecer un procedimiento estándar y repetible para determinar la calidad del propóleos verde Taiwan. Aquí, presentamos un protocolo que utiliza la extracción de etanol, cromatografía líquida de alto rendimiento y un análisis de la actividad antibacteriana para caracterizar la calidad del propóleos verde taiwanés. Este método indica que la extracción de etanol de 95% y 99.5% alcanzar las producciones de materia seca máximo de propóleos verde Taiwan, lo que las concentraciones más altas de propolins que tienen propiedades antibacterianas. Según estos resultados, el presente Protocolo se considera confiables y repetibles para determinar la calidad del propóleos verde Taiwan.
Introduction
El propóleos es una mezcla resinosa natural producida por la especie de abeja Apis mellifera. El propóleos ha sido ampliamente utilizado desde la antigüedad en medicina popular. Un estudio divulgado recientemente que el propóleos es beneficioso para la prevención de las infecciones microbianas e inflamación1. Numerosos estudios han demostrado que los principales compuestos bioactivos en el propóleos son flavonoides, ésteres de ácidos fenólicos, prenylated p-ácidos hidroxicinámico y diterpenic ácidos2,3. Hasta la fecha, se han identificado 10 prenylated flavanone derivados propoleo verde Taiwan mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)4,5,6,7. El más abundante entre ellos es propolins de5,C, D, F y G7. Los considerables efectos biológicos de propóleos verde Taiwan se correlacionan con su alto contenido de propolins8.
Las concentraciones de compuestos bioactivos en el propóleos varían mucho dependiendo de la temporada y ubicación geográfica de la cual se obtiene el propóleos. Propóleos Europeo contiene principalmente flavonoides aglicona y fenólicos ácidos9. Los principales compuestos bioactivos en el propóleos de Brasil son prenylated p-cumárico ácidos, tales como artepillin C10. Un estudio demostró que la estación es un factor crítico para determinar el contenido total propolin en taiwanés propóleos verde11. El contenido de propolin en propóleos verde Taiwan es más alta en verano (mayo - julio) y la más baja en invierno11. La propiedad antibacteriana del propóleos se ha considerado extensamente para ser un indicador de actividad biológica. Generalmente, las muestras de propóleos recolectados de diversas regiones han exhibido una propiedad antibacteriana similar; por ejemplo, es generalmente eficaz contra casi todas las bacterias Gram-positivas y exhibe un limitado efecto antibacterial contra bacterias Gram-negativas10,12,13. Interacciones sinérgicas entre los flavonoides en el propóleos fueron demostradas para tener un efecto antibacteriano14. Del mismo modo, propóleos verde Taiwan informó tener un efecto antimicrobiano contra bacterias Gram-positivas15. Además, un estudio también identificó un efecto antimicrobiano de las interacciones de la propolins en taiwanés propóleos verde8.
La caracterización de los compuestos bioactivos en el propóleos es difícil porque su composición química puede variar según su fuente de origen. Por lo tanto, es necesario establecer un método factible y repetible para determinar la calidad de lo propóleos verde Taiwan. Sin embargo, se ha establecido ningún procedimiento estándar para la extracción de propóleos verde taiwanés y posterior análisis funcional. Se han propuesto varios métodos que se aplican diversamente solventes orgánicos e inorgánicos para propóleos extracción16,17,18,19,20. Ya que el propóleos es una mezcla lipofílica, estudios han demostrado que la extracción orgánica es mejor que inorgánicos extracción8,18,19. La concentración total propolin en Taiwan propóleo verde y sus propiedades antibacterianas son indicadores de la calidad del propóleos verde Taiwan. Así, el propósito de este estudio es presentar un protocolo para uso de etanol como solvente para extraer y caracterizar las propiedades antibacterianas del propóleo verde Taiwan.
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Protocol
1. preparación de compuestos extraídos de etanol
- Pesar 10 g de propóleo verde Taiwan congelado, que fue recogida de colmenas en Taiwan desde mayo a julio, y moler con la amoladora de la especia. Confirman que piezas enteras del Taiwan propóleos verde molido en un polvo fino sin partículas grandes.
- Añadir 100 mL de diferentes concentraciones de etanol (60%, 70%, 80%, 95% y 99.5%) y agua a los distintos matraces y mezcle cada concentración con 10 g de propóleo de la tierra.
- Incubar a 25 ° C y agitar el matraz a 250 rpm durante 48 h.
- Filtrar los extractos de etanol a través de papel filtro con un tamaño de poro de 25 μm.
- Reconstituir los filtrados en su volumen original (100 mL) con etanol al 95% utilizando un matraz aforado.
- Almacenar los extractos de etanol a-20 ° C.
Nota: El protocolo se puede detener aquí.
2. preparación de extractos de etanol para HPLC
- Concentrado de 10 mL de los extractos de etanol por evaporación al vacío a 40 ° C durante 15 minutos.
- Cocer la materia seca a 45 ° C por 24 h.
- Reconstituir con 10 mL de etanol al 95% materia seca.
- Filtro de 1 mL de etanol extractos utilizando un filtro de jeringa estéril con un tamaño de poro de 0.45 μm.
- Refilter los extractos de etanol con un filtro de jeringa estéril de un tamaño de poro de 0,22 μm. El filtrado se recoge y puede analizarse directamente mediante HPLC.
3. análisis del contenido Propolin utilizando HPLC
-
Establecimiento de curvas estándar de propolins
- Preparar 1 L de la fase móvil de la solución de metanol: agua 88.8:11.2 (v/v).
- Preparar diluciones seriadas de propolin estándar concentraciones (C, D, F y G) (15,625 mg/mL, 31,25 mg/mL, mL/62,5 mg y 125 mg/mL, respectivamente) con la solución de la fase móvil como solvente.
- Inyectar 20 μl de concentraciones estándar propolin en la columna de fase inversa, secuencialmente de la concentración baja a la alta concentración.
- Establecer la columna HPLC a 30 ° C y la velocidad de flujo de 1 mL/min.
- Establecer la longitud de onda del detector UV a 280 nm y el tiempo de la grabadora a 20 min.
- Analizar las normas por lo menos 3 x.
- Parcela la respuesta de la medición (eje y) contra la concentración (eje x) usando el cálculo software de la hoja y crear una curva estándar con la ecuación y el valor de R cuadrado.
-
Análisis de la Extracto en etanol s
- Inyectar 20 μl de los extractos etanólicos obtenidos de paso 2,5 en la columna de fase inversa.
- Establecer la columna HPLC a 30 ° C y la velocidad de flujo de 1 mL/min.
- Establecer la longitud de onda del detector UV a 280 nm y el tiempo de la grabadora a 20 min.
- Analizar las normas por lo menos 3 x.
- Calcular la concentración de propolin en el extracto de etanol, utilizando la ecuación para la curva estándar obtenida en el paso 3.1.7 que utiliza el área de pico para cada propolin.
4. mínima concentración inhibitoria y mínima concentración bactericida análisis
Nota: El método de microdilución se utiliza para evaluar la eficacia antibacteriana de propolins extraído de etanol de propóleos verde Taiwan.
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Preparación de organismos de prueba
- Descongelar las cepas de bacterias, Staphylococcus aureus y Escherichia coli y entonces, la cultura les en caldo de soja tríptica y caldo nutritivo, respectivamente, a 37 ° C durante 24 h.
- Pasajes S. aureus utilizando caldo de soja tríptica y e. coli utilizando caldo nutritivo durante dos generaciones y, a continuación, calcular unidades formadoras de colonias por recuento de colonias individuales sobre una placa de agar.
-
Preparación de etanol de extractos para pruebas de actividad antibacteriana
- Concentrar los extractos etanólicos obtenidos de paso 1.5 por evaporación al vacío a 40 ° C durante 15 minutos.
- Reconstituir la materia seca con dimetil sulfóxido (DMSO) y ajustar la concentración del extracto a 12,8 mg/mL.
- Hacer una dilución seriada (concentraciones: 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 y 640 μg/mL) de etanol extractos utilizando el caldo.
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Pruebas de concentración mínima inhibitoria
- Añadir 10 μl de los extractos de etanol diluido desde 0.156 a 640.0 μg/mL en una placa de 96 pocillos.
- Con caldo, ajustar el volumen a 100 μl y mantener 5% DMSO en todas las diluciones.
- Inocular 100 μl de cultivo bacteriano (1 x 106/ml) en la placa de 96 pocillos.
- Inóculo de cultivo con diferentes concentraciones de etanol extrae a 37 ° C durante 48 h.
- Analizar el crecimiento bacteriano según la turbidez y el uso de densidad óptica (lector de microplacas) a 590 nm para determinar la concentración mínima inhibitoria (MIC).
-
Concentración bactericida mínima pruebas de
- Inocular 10 μl de un cultivo líquido de cada pocillo de la prueba MIC que no crecimiento sobre una placa de agar.
- Incubar a 37 ° C durante 24 h.
- Determinar la actividad bactericida mediante la identificación de la concentración más baja que no hay crecimiento bacteriano visible. La concentración que elimina completamente el crecimiento de la célula se considera la concentración bacteriana mínima (CBM).
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Representative Results
Positivos datos representativos para la extracción de etanol se presentan en la tabla 1. El rendimiento de materia seca de propóleos verde Taiwan fue positivamente asociado a la concentración de etanol. Los extractos de etanol de 95% y 99.5% tuvieron la mayor materia seca rendimiento de propóleos verde Taiwan. El rendimiento de materia seca menor de propóleos verde Taiwan se produjo cuando se utilizó agua como solvente de extracción. Estos resultados indican que un solvente orgánico, tal como etanol, funciona mejor para la extracción de propóleos verde taiwanés. La señal de propolins estándar C, D, F y G se identificó y cuantificó usando HPLC (Figura 1a). La señal de propolins en los extractos de etanol fue caracterizada usando estándares individuales propolin y HPLC (Figura 1b). Normalmente, la concentración de propolins (C, D, F y G) en el propóleos verde Taiwan está positivamente asociada a la concentración de etanol durante la extracción (tabla 1). El rendimiento más alto de propolins en el propóleos verde Taiwan fue producido en los extractos de etanol de 95% y 99.5%.
Positivos datos representativos para el efecto antibacteriano de extractos etanólicos se presentan en la tabla 2. Actividad antibacteriana contra S. aureus y e. coli en los extractos de etanol fueron examinados. El MIC y MBC de extractos etanólicos de S. aureus promedio fueron de 10-20 μg/mL y 20 μg/mL, respectivamente (tabla 2). Extractos de agua no tuvo efectos antibacterianos contra S. aureus (tabla 2). Ningún efecto antibacterial sobre e. coli fue observado ya sea con etanol o agua extractos (tabla 2).
Figura 1: identificación de propolins en el Taiwan propóleos verde. Estos paneles muestran (a) normas de propolins y (b) la medición de propolins en el propóleos verde Taiwan mediante HPLC. Esta figura ha sido modificada desde Chen et al. 8. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solvente * | Rendimiento (%) | Propolin (C + D + F + G) |
| (mg/mL) | ||
| 99.5% EtOH | 66.75 ± 0,5una** | 36.73 ± 0,80un |
| 95% EtOH | 66.25 ± 0.50un | 37,55 ± 1.29un |
| 80% EtOH | 64.75 ± 0,96b | 34.25 ± 0.71b |
| 70% EtOH | 63,25 ± 0.96c | 31.53 ± 0.31c |
| 60% EtOH | 59.00 ± 1,41;d | 29.34 ± 1,59d |
| Agua | 7.00 ± 0,82e | ND *** |
Tabla 1: rendimiento (%) de la materia y contenido propolin (mg/mL) en el propóleos verde Taiwan extraído con varios solventes secos. * 10 g de propóleo fue extraída con 100 mL de solvente, y extractos fueron reconstituidos finalmente a 100 mL. ** Los valores son la media ± la desviación estándar (SD). a-e Medios dentro de una columna que no superíndice común difieren significativamente (P < 0,05). ND = no detectado. Esta tabla ha sido modificada de Chen et al. 8.
| Extracto de la | Staphylococcus aureus | Escherichia coli | |
| MIC (μg/mL) | MBC (μg/mL) | MIC (μg/mL) | |
| 99.5% EtOH | 10 | 20 | > 640 |
| 95% EtOH | 10 | 20 | > 640 |
| 80% EtOH | 20 | 20 | > 640 |
| 70% EtOH | 10 | 20 | > 640 |
| 60% EtOH | 20 | 20 | > 640 |
| Agua | ND | ND | ND |
Tabla 2: MIC y MBC (μg/mL) de varios extractos contra S. aureus y e. coli. Esta tabla ha sido modificada de Chen et al. 8.
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Discussion
Un estudio informó que la maceración, utilizando diferentes concentraciones de etanol, podría ser utilizado para extracción de propóleo brasileño17; sin embargo, el proceso fue largo17. Tardó menos de 10 días para extraer los compuestos bioactivos, tales como contenido fenólico, de propóleo brasileño17. Alternativamente, la extracción de etanol en combinación con la calefacción a 37 ° C, 50 ° C o 70 ° C durante 30 min se ha propuesto para la extracción de propóleo brasileño19,21,22. Se determinó que los compuestos bioactivos en el propóleos brasileño podrían extraerse diferencialmente dependiendo del porcentaje de etanol19. La eficiencia de la extracción de compuestos bioactivos en el propóleos puede variar debido a la diferente composición química del propóleo brasileño y del propóleos verde Taiwan. Presentamos un protocolo confiable y repetible para la extracción de propóleos verde Taiwan. Los compuestos bioactivos en el propóleos verde Taiwan podrían cosecharse dentro de 2 días, usando etanol como solvente. Un hallazgo similar también soporta el protocolo presentado aquí y determinó que propolins (C, D, F y G) de propóleos verde Taiwan podría extraerse con etanol al 95% en combinación con una extracción de 3 día23. Otro estudio demostró que 95% de etanol en combinación con un 21 h extracción pudo cosechar propolins del propóleos verde taiwanés24. Sin embargo, debe verificarse la concentración exacta de propolins después de la extracción de etanol de 21 h. Investigadores han propuesto que el proceso de calentamiento aumenta la eficiencia de la extracción de propóleo brasileño19,21,22. Si propolins de propóleo verde Taiwan puede extraerse por la calefacción debe ser investigado.
Los extractos etanólicos de propóleos verde Taiwan tienen efectos antibacterianos contra patógenos gram-positivos. Ya que el propóleos es hidrofóbico, los estudios han demostrado que un solvente orgánico como etanol es un solvente adecuado para8,de extracción de propóleos16,de18,de17,19, 20. Los estudios también han demostrado que una concentración de etanol mayor conduce a más compuestos bioactivos extraídos8,17,18,20. En el presente Protocolo, extractos de materia seca máximo rendimientos de propóleos verde Taiwan se observan en el 95% y 99.5% de etanol, así como la concentración más alta de propolins y actividad antibacteriana.
El presente Protocolo está diseñado para la extracción de propóleos verde taiwanés con etanol, y la evaluación de la calidad se hace sobre la base de los contenidos de propolins. Sin embargo, algunos compuestos bioactivos insoluble en etanol de propóleos verde Taiwan correctamente no se puede aisladas mediante el presente Protocolo.
El aspecto más crucial del método con respecto a los métodos existentes es que este método ahorra tiempo en comparación con los métodos propuestos en otros estudios17,23. Por otra parte, los extractos de etanol 95% y 99.5% de propóleos verde Taiwan exhiben una alta concentración de la actividad propolins y antibacteriano.
Este enfoque tiene aplicaciones directas para la caracterización de otros compuestos bioactivos soluble en etanol desconocidos en el propóleos verde Taiwan. Además, los extractos de etanol que contiene propolins podrían utilizarse para determinar otras bioactividades.
Uno de los procedimientos experimentales claves es asegurar la uniformidad de lo propóleos verde Taiwan durante el pulido (paso 1.1 del Protocolo). Rectificado inadecuado de propóleos verde Taiwan puede conducir a bajos de materia seca y contenido de propolin. Es esencial utilizar un aparato de pulido apropiado, como una amoladora de la especia, amoladora de tejido u homogeneizador y que el propóleo se convierte en un polvo fino sin partículas grandes restantes después de la molienda.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que declarar.
Acknowledgments
Este manuscrito fue editado por Wallace de edición académica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Whatman no. 4 filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1004125 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| reverse phase RP-18 column | Phenomenex Inc. | 00G-0234-E0 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | BCRC 10780 | |
| Escherichia coli | ATCC | BCRC 10675 | |
| tryptic soy broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| nutrient broth | Sigma-Aldrich | 70122 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| spice grinder | Waring | WSG60K | |
| microplate Reader | Molecular Devices | EMAX PLUS | |
| HPLC system | Agilent | 1200 Series | |
| vacuum evaporation | BÜCHI | Rotavapor R-215 |
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