Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Extraktion och analys av taiwanesiska grön Propolis

doi: 10.3791/58743 Published: January 7, 2019

Summary

Vi presenterar ett protokoll för att extrahera och karakterisera taiwanesiska grön propolis som uppvisar antibakteriella aktiviteten med etanol som lösningsmedel.

Abstract

Taiwanesiska grön propolis är rik på prenylated flavonoider och uppvisar ett brett spektrum av biologiska aktiviteter, såsom antioxidant, antibakteriell, och mot cancer. De bioaktiva föreningarna av taiwanesiska grön propolis är propolins, nämligen C, D, F och G. Koncentrationen av propolins i taiwanesiska grön propolis varierar beroende på säsong och geografisk plats. Därför är det viktigt att upprätta en standard och repeterbar rutin för kvalitetsbestämning av taiwanesiska grön propolis. Här presenterar vi ett protokoll som använder etanol-baserat extraktion, högpresterande vätskekromatografi och en antibakteriell aktivitet analys för att karakterisera taiwanesiska grön propolis kvalitet. Denna metod visar att 95% och 99,5% etanol extraktioner uppnå maximala torrsubstans avkastningen från taiwanesiska grön propolis, vilket därmed ger de högsta koncentrationerna av propolins som har antibakteriella egenskaper. Enligt dessa resultat anses detta protokoll pålitliga och repeterbara för kvalitetsbestämning av taiwanesiska grön propolis.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Propolis är en naturligt hartsartade blandning som produceras av bee arten Apis mellifera. Propolis har använts sedan urminnes tider i diverse läkemedel. En studie rapporterade nyligen att propolis är fördelaktigt för förebygga mikrobiella infektioner och inflammation1. Ett flertal studier har visat att de viktigaste bioaktiva föreningarna i propolis är flavonoider, fenol syra estrar, prenylated p-coumaric syror och diterpenic syror2,3. Hittills har har 10 prenylated flavanon derivat från taiwanesiska grön propolis identifierats genom högpresterande vätskekromatografi (HPLC)4,5,6,7. Den vanligast förekommande bland dessa är propolins C, D, F och G5,7. De betydande biologiska effekterna av taiwanesiska grön propolis är korrelerade med dess höga innehåll av propolins8.

Koncentrationerna av bioaktiva föreningar i propolis varierar kraftigt beroende på säsong och geografisk plats som propolis är framställda. Europeiska propolis innehåller huvudsakligen flavonoid aglycone och fenol syror9. De stora bioaktiva föreningarna i propolis från Brasilien är prenylated p-coumaric syror, artepillin C10. En studie visade att säsongen är en kritisk faktor för bestämning av totala propolin innehållet i taiwanesiska grön propolis11. Propolin innehållet i taiwanesiska grön propolis är högst på sommaren (maj - juli) och lägst i vinter11. Egenskapen antibakteriella propolis har varit allmänt anses vara en indikator för biologisk aktivitet. Allmänhet, proverna av propolis som samlats in från olika regioner har ställt en liknande antibakteriella egendom; till exempel det är generellt effektivt mot nästan alla grampositiva bakterier och uppvisar en begränsad antibakteriell effekt mot gramnegativa bakterier10,12,13. Synergistiska interaktioner mellan flavonoider i propolis visades ha en antibakteriell effekt14. Dessutom rapporterades taiwanesiska grön propolis har en antimikrobiell effekt mot grampositiva bakterier15. Dessutom identifierat en studie också en antimikrobiell effekt från växelverkan mellan propolins i taiwanesiska grön propolis8.

Karakterisering av de bioaktiva föreningarna i propolis är svårt eftersom dess kemiska sammansättning kan variera beroende på dess källa ursprung. Det är därför nödvändigt att fastställa en genomförbar och upprepningsbar metod för kvalitetsbestämning av den taiwanesiska grön propolis. Dock har inget standard förfarande fastställts för taiwanesiska grön propolis utvinning och efterföljande funktionell analys. Flera metoder som omväxlande gäller organiska och oorganiska lösningsmedel har föreslagits för propolis utvinning16,17,18,19,20. Eftersom propolis är en lipofila blandning, har studier visat att ekologiska utvinning är bättre än oorganiska utvinning8,18,19. Totala propolin koncentrationen i taiwanesiska grön propolis och dess antibakteriella egenskaper är viktiga indikatorer för kvaliteten på taiwanesiska grön propolis. Således, syftet med denna studie är att presentera ett protokoll för att extrahera och karaktärisera den antibakteriella egenskaper av taiwanesiska grön propolis med etanol som lösningsmedel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. beredning av etanol-extraherade föreningar

  1. Väg 10 g av frysta taiwanesiska grön propolis, som samlades in från bikupor i Taiwan från maj till juli, och slipa den med spice kvarnen. Bekräfta att hela bitar av taiwanesiska grön propolis mals till ett fint pulver utan några stora partiklar.
  2. Tillsätt 100 mL av olika koncentrationer av etanol (60%, 70%, 80%, 95% och 99,5%) och vatten för att separera kolvar och blanda varje koncentration med 10 g av marken propolis.
  3. Inkubera vid 25 ° C och skaka kolven vid 250 rpm för 48 h.
  4. Filtrera de etanol extrakt genom filterpapper med en 25 μm porstorlek.
  5. Beredes filtraten till sin ursprungliga volym (100 mL) med 95% etanol med en mätkolv.
  6. Lagra etanol extrakt vid-20 ° C.
    Obs: Protokollet kan pausas här.

2. förberedelse av etanol extrakt för HPLC

  1. Koncentrera sig 10 mL etanol extrakt av vakuum avdunstning vid 40 ° C under 15 minuter.
  2. Grädda på torrsubstansen på 45 ° C under 24 h.
  3. Beredes på torrsubstansen med 10 mL 95% etanol.
  4. Filter 1 mL etanol extrakt med en steril spruta filter med porstorlek 0,45 µm.
  5. Filtrera om etanol extrakt med en steril spruta filter med en 0,22 µm porstorlek. Filtratet samlas och kan analyseras direkt med HPLC.

3. analys av Propolin innehållet med HPLC

  1. Inrättandet av standard kurvor av propolins
    1. Laga 1 L av den mobila fasen av 88.8:11.2 (v/v) metanol: vatten lösning.
    2. Bered seriella utspädningar av propolin standard (C, D, F och G) koncentrationer (15.625 mg/mL, 31.25 mg/mL, 62,5 mg/mL och 125 mg/mL, respektive) med den mobila fasen som lösningsmedel.
    3. Injicera 20 µL av propolin standard koncentrationer i kolumnen omvänd-fas sekventiellt från den låga koncentrationen i höga koncentrationen.
    4. Ange i HPLC-kolonnen vid 30 ° C och flödet till 1 mL/min.
    5. Ställ in våglängden av den UV-detektorn till 280 nm och inspelningstiden till 20 min.
    6. Analysera standarderna som minst 3 x.
    7. Rita mätning svaret (y-axeln) mot koncentrationen (x-axeln) med hjälp av beräkning ark programvara och skapa en standardkurva med ekvation och R-kvadrat värde.
  2. Analys av etanol extrakt s
    1. Injicera 20 µL etanol extrakt erhållits från steg 2.5 till kolonnen med omvänd fas.
    2. Ange i HPLC-kolonnen vid 30 ° C och flödet till 1 mL/min.
    3. Ställ in våglängden av den UV-detektorn till 280 nm och inspelningstiden till 20 min.
    4. Analysera standarderna som minst 3 x.
    5. Beräkna koncentrationen av propolin i etanolextrakt, med hjälp av ekvation för standardkurvan erhållits från steg 3.1.7 som använder topparean för varje propolin.

4. minsta hämmande koncentration och minsta baktericida koncentration analys

Obs: Metoden microdilution används för att utvärdera den antibakteriella effekten i etanol-extraherade propolins från taiwanesiska grön propolis.

  1. Beredning av testorganismer
    1. Tina de bakteriella stammarna, Staphylococcus aureus och Escherichia coli, och då kultur dem i tryptic soy buljong och näringsämne buljong, respektive vid 37 ° C under 24 h.
    2. Passage av S. aureus använder tryptic soy buljong och E. coli med näringsämne buljong för två generationer och sedan beräkna kolonibildande enheter genom att räkna enskilda kolonier på en agarplatta.
  2. Beredning av etanol extrakt för antibakteriell aktivitet testning
    1. Koncentrera sig etanol extrakt erhållits från steg 1,5 genom vakuum avdunstning vid 40 ° C under 15 minuter.
    2. Rekonstituera torrsubstansen med dimetyl sulfoxid (DMSO) och justera koncentrationen av utdraget till 12,8 mg/mL.
    3. Göra en seriell utspädning (koncentrationer: 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 och 640 µg/mL) etanol extrakt med buljongen.
  3. Minsta hämmande koncentration tester
    1. Tillsätt 10 µL utspädda etanol extrakt alltifrån 0,156 till 640,0 µg/mL till en platta med 96 brunnar.
    2. Använda buljong, justera volymen till 100 µL och behålla 5% DMSO i alla spädningarna.
    3. Inokulera 100 µL av bakterieodling (1 x 10-6/ml) i plattan med 96 brunnar.
    4. Kultur inokulum som innehåller olika koncentrationer av etanol extrakt vid 37 ° C för 48 h.
    5. Analysera den bakteriell tillväxten enligt grumlighet och använder optisk densitet (microplate reader) på 590 nm att bestämma den minsta hämmande koncentrationen (MIC).
  4. Minsta baktericida koncentration tester
    1. Inokulera 10 µL av flytande kultur från varje brunn testets MIC som uppvisade ingen tillväxt på en agarplatta.
    2. Inkubera vid 37 ° C under 24 h.
    3. Bestämma den bakteriedödande aktiviteten genom att identifiera den lägsta koncentration som avslöjade inga synliga bakterietillväxt. Den koncentration som helt eliminerar celltillväxt anses vara den minsta bakteriella koncentrationen (MBC).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Positiv representativa uppgifter för etanol utvinning presenteras i tabell 1. Torrsubstans avkastningen från taiwanesiska grön propolis var positivt associerade med koncentrationen av etanol. 95% och 99,5% etanol extrakt hade den högsta torrsubstansen avkastning från taiwanesiska grön propolis. Lägsta torrsubstans avkastningen från taiwanesiska grön propolis uppstod när vatten användes som av extraktionsmedel. Dessa resultat indikerar att ett organiskt lösningsmedel, såsom etanol, utför bästa för taiwanesiska grön propolis extraktion. Signalen från standard propolins C, D, F och G var identifieras och kvantifieras med hjälp av HPLC (figur 1a). Signalen från propolins i etanol extrakt präglades använda enskilda propolin standarder och HPLC (figur 1b). Koncentrationen av propolins (C, D, F och G) i taiwanesiska grön propolis är vanligtvis förknippas med etanol koncentrationen under extraktionen (tabell 1). Den högsta avkastningen av propolins i taiwanesiska grön propolis producerades i 95% och 99,5% etanol extrakt.

Positiv representativa uppgifter för antibakteriell effekt av etanol extrakt presenteras i tabell 2. Antibakteriell aktivitet mot S. aureus och E. coli i etanol extrakt undersöktes. Den genomsnittliga MIC och MBC av etanol extrakt för S. aureus var 10-20 µg/mL och 20 µg/mL, respektive (tabell 2). Vatten extrakt har inte antibakteriella effekter mot S. aureus (tabell 2). Observerades inga antibakteriella effekt på E. coli med antingen etanol eller vatten extrakt (tabell 2).

Figure 1
Figur 1: identifiering av propolins i taiwanesiska grön propolis. Dessa paneler visar (en) standarder för propolins och (b) mätning av propolins i taiwanesiska grön propolis med HPLC. Denna siffra har ändrats från Chen et al. 8. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Lösningsmedel * Avkastning (%) Propolin (C + D + F + G)
(mg/mL)
99,5% EtOH 66.75 ± 0,5en** 36.73 ± 0,80en
95% EtOH 66.25 ± 0,50en 37.55 ± 1,29en
80% EtOH 64.75 ± 0,96b 34.25 ± 0,71b
70% EtOH 63.25 ± 0,96c 31.53 ± 0,31c
60% EtOH 59,00 ± 1,41d 29.34 ± 1,59d
Vatten 7.00 ± 0,82e ND ***

Tabell 1: torka Materia avkastning (%) och propolin innehåll (mg/mL) i taiwanesiska grön propolis utvinns med hjälp av olika lösningsmedel. * 10 g propolis extraherades med 100 mL spädningsvätska och extrakt var slutligen beredas till 100 mL. ** Värdena är det medelvärde ± standardavvikelsen (SD). a-e Sätt inom en kolumn som har inga gemensamma upphöjd skiljer sig avsevärt (P < 0,05). ND = inte upptäckta. Den här tabellen har ändrats från Chen et al. 8.

Extrahera Staphylococcus aureus Escherichia coli
MIC (µg/mL) MBC (µg/mL) MIC (µg/mL)
99,5% EtOH 10 20 > 640
95% EtOH 10 20 > 640
80% EtOH 20 20 > 640
70% EtOH 10 20 > 640
60% EtOH 20 20 > 640
Vatten ND ND ND

Tabell 2: MIC och MBC (µg/mL) av olika extrakt mot S. aureus och E. coli. Den här tabellen har ändrats från Chen et al. 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En studie rapporterade att maceration, använder olika koncentrationer av etanol, skulle kunna användas för brasilianska propolis utvinning17; processen var dock tidskrävande17. Det tog minst 10 dagar för att extrahera de bioaktiva föreningarna, såsom fenolföreningar innehåll, från brasilianska propolis17. Alternativt, etanol utvinning i kombination med värme vid 37 ° C, 50 ° C eller 70 ° C i 30 min har föreslagits för att extrahera brasilianska propolis19,21,22. Det bestämdes att bioaktiva föreningar i brasilianska propolis differentially kunde extraheras beroende på andelen etanol19. Bioaktiva föreningar i propolis utvinning effektivitet kan variera på grund av olika kemiska sammansättningar av brasilianska propolis och taiwanesiska grön propolis. Här, tillhandahåller vi en pålitlig och repeterbar protokoll för att extrahera taiwanesiska grön propolis. De bioaktiva föreningarna i taiwanesiska grön propolis kunde skördas inom 2 dagar, använda etanol som lösningsmedel. En liknande slutsats stöder även protokollet presenteras här och fast besluten att propolins (C, D, F och G) från taiwanesiska grön propolis kan utvinnas med hjälp av 95% etanol i kombination med en 3-dagars utvinning23. En annan studie visade att 95% etanol i kombination med en 21 h utvinning kunde skörda propolins från taiwanesiska grön propolis24. Dock måste propolins exakta koncentration efter 21 h etanol utvinning verifieras. Forskare har föreslagit att uppvärmningsprocessen ökar utvinning effektivitet för brasilianska propolis19,21,22. Om propolins från taiwanesiska grön propolis kan extraheras genom upphettning måste undersökas.

De etanol extrakt från taiwanesiska grön propolis har antibakteriella effekter mot grampositiva patogener. Eftersom propolis är hydrofoba, har studier visat att ett organiskt lösningsmedel som etanol är lämpligt lösningsmedel för propolis utvinning8,16,17,18,19, 20. Studier har också visat att en ökad etanol koncentrationen leder till mer extraherade bioaktiva föreningar8,17,18,20. I detta protokoll, den maximala torrsubstans avkastningen av taiwanesiska grön propolis observeras i den 95% och 99,5% etanolen extrakt, samt den högsta koncentrationen av propolins och antibakteriell aktivitet.

Detta protokoll är utformad för taiwanesiska grön propolis extraktion med etanol och kvalitetsbedömningen görs på grundval av innehållet i propolins. Dock kan inte några olösliga i etanol bioaktiva föreningar i taiwanesiska grön propolis ordentligt isoleras med detta protokoll.

Den mest avgörande aspekten av metoden med avseende på befintliga metoder är att denna metod sparar tid i förhållande till metoder som föreslås i andra studier17,23. Dessutom uppvisade 95% och 99,5% etanol extrakt av taiwanesiska grön propolis en hög koncentration av propolins och antibakteriella aktivitet.

Detta tillvägagångssätt har direkta ansökningar för kännetecknar andra okända etanol-lösliga bioaktiva föreningar i taiwanesiska grön propolis. Etanol extrakt som innehåller propolins kan dessutom användas för att fastställa andra bioactivities.

En av de viktigaste experimentella rutiner är att säkerställa enhetligheten i det taiwanesiska grön propolis under slipningen (protokoll steg 1.1). Olämpliga slipning av taiwanesiska grön propolis kan leda till låga torrsubstans avkastning och propolin innehåll. Det är viktigt att använda en ordentlig slipning apparater, såsom en spice grinder, vävnad kvarnen eller Homogenisatorer, och att ta hand att propolis blir ett fint pulver utan några stora partiklar som återstår efter slipning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att deklarera.

Acknowledgments

Detta manuskript redigerades av Wallace akademiska redigering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ethanol Sigma-Aldrich E7023
Whatman no. 4 filter paper Sigma-Aldrich WHA1004125
methanol Sigma-Aldrich 34860
reverse phase RP-18 column Phenomenex Inc. 00G-0234-E0
Staphylococcus aureus ATCC BCRC 10780
Escherichia coli ATCC BCRC 10675
tryptic soy broth Sigma-Aldrich 22092
nutrient broth Sigma-Aldrich 70122
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
spice grinder Waring WSG60K
microplate Reader Molecular Devices EMAX PLUS
HPLC system Agilent 1200 Series
vacuum evaporation BÜCHI Rotavapor R-215

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zabaiou, N., et al. Biological properties of propolis extracts: Something new from an ancient product. Chemistry and Physics of Lipids. 207, (Pt B), 214-222 (2017).
  2. Bankova, V. B., De Castro, S. L., Marcucci, M. C. Propolis: Recent advances in chemistry and plant origin. Apidologie. 31, (1), 3-15 (2000).
  3. Park, Y. K., Alencar, S. M., Aguiar, C. L. Botanical origin and chemical composition of Brazilian propolis. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50, (9), 2502-2506 (2002).
  4. Chen, C. N., Wu, C. L., Shy, H. S., Lin, J. K. Cytotoxic prenylflavanones from Taiwanese propolis. Journal of Natural Products. 66, (4), 503-506 (2003).
  5. Chen, C. N., Weng, M. S., Wu, C. L., Lin, J. K. Comparison of radical scavenging activity, cytotoxic effects and apoptosis induction in human melanoma cells by Taiwanese propolis from different sources. Evidence-Based Complementary and Alternative. 1, (2), 175-185 (2004).
  6. Chen, C. N., Wu, C. L., Lin, J. K. Apoptosis of human melanoma cells induced by the novel compounds propolin A and propolin B from Taiwanese propolis. Cancer Letters. 24, (1-2), 218-231 (2007).
  7. Huang, W. J., et al. Propolin G, a prenylflavanone, isolated from Taiwanese propolis, induces caspase-dependent apoptosis in brain cancer cells. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55, (18), 7366-7376 (2007).
  8. Chen, Y. W., Ye, S. R., Ting, C., Yu, Y. H. Antibacterial activity of propolins from Taiwanese green propolis. Journal of Food and Drug Analysis. 26, (2), 761-768 (2018).
  9. Hegazi, A. G., Abd El Hady, F. K., Abd Allah, F. A. M. Chemical composition and antimicrobial activity of European propolis. Zeitschrift für Naturforschung. 55, (1-2), 70-75 (2000).
  10. Sforcin, J. M., Fernandes, A., Lopes, C. A. M., Bankova, V., Funari, S. R. C. Seasonal effect on Brazilian propolis antibacterial activity. Journal of Ethnopharmacology. 73, (1-2), 243-249 (2000).
  11. Chen, Y. W., et al. Characterization of Taiwanese propolis collected from different locations and seasons. Journal of the Science of Food and Agriculture. 88, (3), 412-419 (2008).
  12. Grange, J. M., Davey, R. W. Antibacterial properties of propolis (bee glue). Journal of the Royal Society of Medicine. 83, (3), 159-160 (1990).
  13. Kujumgiev, A., et al. Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis from different geographic origins. Journal of Ethnopharmacology. 64, (3), 235-240 (1999).
  14. Krol, W., Scheller, S., Shani, J., Pietsz, G., Czuba, Z. Synergistic effect of ethanol extract of propolis and antibiotics in the growth of Staphylococcus aureus. Drug Research. 43, (5), 607-609 (1993).
  15. Lu, L. C., Chen, Y. W., Chou, C. C. Antibacterial and DPPH free radical-scavenging activities of the ethanol extract of propolis collected in Taiwan. Journal of Food and Drug Analysis. 11, (4), 277-282 (2003).
  16. Tosi, B., Donini, A., Romagnoli, C., Bruni, A. Antimicrobial activity of some commercial extracts of propolis prepared with different solvents. Phytotherapy Research. 10, (4), 335-336 (1996).
  17. Cunha, I. B. S., et al. Factors that influence the yield and composition of Brazilian propolis extracts. Journal of the Brazilian Chemical Society. 15, (6), 964-970 (2004).
  18. Woo, S. O., Hong, I. P., Han, S. M. Extraction properties of propolis with ethanol concentration. Journal of Apicultural Research. 30, (3), 211-216 (2015).
  19. Park, Y. K., Ikegaki, M. Preparation of water and ethanolic extracts of propolis and evaluation of the preparations. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62, (11), 2230-2232 (1998).
  20. Ramanauskienė, K., Inkėnienė, A. M. Propolis oil extract: quality analysis and evaluation of its antimicrobial activity. Natural Product Research. 25, (15), 1463-1468 (2011).
  21. Machado, B. A., et al. Chemical composition and biological activity of extracts obtained by supercritical extraction and ethanolic extraction of brown, green and red propolis derived from different geographic regions in brazil. PLoS One. 11, (1), e0145954 (2016).
  22. Monroy, Y. M., et al. Brazilian green propolis extracts obtained by conventional processes and by processes at high pressure with supercritical carbon dioxide, ethanol and water. The Journal of Supercritical Fluids. 130, 189-197 (2017).
  23. Popova, M., Chen, C. N., Chen, P. Y., Huang, C. Y., Bankova, V. A validated spectrophotometric method for quantification of prenylated flavanones in pacific propolis from Taiwan. Phytochemical Analysis. 21, (2), 186-191 (2010).
  24. Chen, L. H., et al. Taiwanese green propolis ethanol extract delays the progression of type 2 diabetes mellitus in rats treated with streptozotocin/high-fat diet. Nutrients. 10, (4), e503 (2018).
Extraktion och analys av taiwanesiska grön Propolis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C. T., Chien, Y. H., Yu, Y. H., Chen, Y. W. Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis. J. Vis. Exp. (143), e58743, doi:10.3791/58743 (2019).More

Chen, C. T., Chien, Y. H., Yu, Y. H., Chen, Y. W. Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis. J. Vis. Exp. (143), e58743, doi:10.3791/58743 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter