Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

तंत्रिका विज्ञान में नमूना TEM के एक निष्पक्ष दृष्टिकोण

Published: April 13, 2019 doi: 10.3791/58745
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4,5, 4, 4, 4, 4, 2, 1, 1, 1
1Department of Cell Biology, Histology and Embryology, Gottfried Schatz Research Center, Medical University of Graz, 2Department of Pharmacology, Otto Loewi Research Center, Medical University of Graz, 3Division of General Neurology, Department of Neurology, Medical University of Graz, 4Institute of Pathology, Medical University of Graz, 5Department of Pathology, Medical Faculty, Otto von Guericke University Magdeburg

Summary

हम मस्तिष्क ऊतक के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी जांच के लिए एक उपंयास कार्यप्रवाह परिचय । विधि उपयोगकर्ता एक निष्पक्ष फैशन में न्यूरोनल सुविधाओं की जांच करने के लिए अनुमति देता है । मौलिक विश्लेषण के लिए, हम भी एक स्क्रिप्ट है कि यादृच्छिक नमूना के लिए कार्यप्रवाह के अधिकांश automatizes मौजूद हैं ।

Abstract

न्यूरॉन्स की अल्ट्रास्ट्रक्चरल विशेषताओं और उनके synapses की जांच केवल इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ संभव हैं । विशेष रूप से घनत्व और ऐसी सुविधाओं के वितरण में परिवर्तन के तुलनात्मक अध्ययन के लिए, एक निष्पक्ष नमूना प्रोटोकॉल विश्वसनीय परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है । यहां, हम मस्तिष्क के नमूनों की छवि अधिग्रहण के लिए एक कार्यप्रवाह प्रस्तुत करते हैं । कार्यप्रवाह एक परिभाषित मस्तिष्क क्षेत्र के भीतर व्यवस्थित वर्दी यादृच्छिक नमूना की अनुमति देता है, और छवियों एक disector का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है. इस तकनीक धारावाहिक वर्गों की व्यापक परीक्षा की तुलना में बहुत तेजी से है, लेकिन अभी भी एक व्यवहार्य दृष्टिकोण को घनत्व और ultrastructure सुविधाओं के वितरण का अनुमान प्रस्तुत करता है । Embedding से पहले, दाग vibratome वर्गों जांच के तहत मस्तिष्क क्षेत्र की पहचान करने के लिए एक संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया गया, जो समग्र नमूना तैयारी की प्रक्रिया को गति में मदद की । इस दृष्टिकोण के तुलनात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था एक समृद्ध आवास पर्यावरण के प्रभाव की जांच माउस मस्तिष्क में कई ultrastructural मापदंडों पर । कार्यप्रवाह के सफल उपयोग के आधार पर, हम इसे मस्तिष्क के नमूनों के मौलिक विश्लेषण के उद्देश्य के लिए अनुकूलित । हम उपयोगकर्ता-बातचीत के समय के संदर्भ में प्रोटोकॉल अनुकूलित । खुला स्रोत सॉफ्टवेयर SerialEM के लिए एक स्क्रिप्ट संकलन द्वारा सभी समय लेने वाले कदम स्वचालित उपयोगकर्ता मौलिक नक्शे प्राप्त करने के मुख्य काम पर ध्यान केंद्रित करने में मदद करता है । मूल कार्यप्रवाह में के रूप में, हम निष्पक्ष नमूनाकरण दृष्टिकोण करने के लिए विश्वसनीय परिणाम की गारंटी के लिए ध्यान दिया ।

Introduction

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में, यह अक्सर वर्गों के भीतर नमूना प्रतिनिधि क्षेत्रों के लिए चुनौतीपूर्ण है । हम, एक पर्यवेक्षक के रूप में, अक्सर विशिष्ट नमूने की विशेषताओं से हमारे ध्यान के लिए तैयार क्षेत्रों को देखने के पक्षपाती हैं, एक अच्छी तरह से वितरित, निष्पक्ष नमूने को रोकने । नमूना पूर्वाग्रह केवल अगर ब्याज के क्षेत्र के हर भाग को एक इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मालेख1में समाप्त होने का एक ही मौका हो जाता है से बचा जा सकता है । यह एक सॉफ्टवेयर समाधान के बिना नमूना पूर्वाग्रह से बचने के लिए संभव है, उदाहरण के लिए, छवि को देखने के बिना मैन्युअल रूप से माइक्रोस्कोप के ट्रैकबॉल धक्का द्वारा, ताकि जहां भी मंच बंद हो जाता है नमूना क्षेत्रों का चयन करने के लिए. लेकिन कड़ाई से बोल रहा हूं, यह एक यादृच्छिक प्रक्रिया नहीं है, क्योंकि, होशपूर्वक या subconsciously, उपयोगकर्ता मंच के आंदोलन पर एक प्रभाव हो सकता है, और, इसके अलावा, यह नमूना क्षेत्रों का चयन करने का एक परिष्कृत तरीका नहीं है । यादृच्छिक नमूना विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो जाता है अगर वर्गों के जोड़े एक निश्चित मात्रा में संरचनाओं की संख्या का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए, stereology1के लिए, जो वर्गों के जोड़े की आवश्यकता है, एक ज्ञात दूरी के अलावा. यह भी केवल एक ही खंड पर देखने के लिए और विशिष्ट संरचनाओं2की संख्या का अनुमान करने के लिए संभव होगा, लेकिन इस दृष्टिकोण के साथ जांचकर्ताओं बड़े संरचनाओं के संख्यात्मक घनत्व आँके करने के लिए करते हैं, जब तक संरचनाओं में बहुत छोटे हैं अनुभाग मोटाई की तुलना । वैकल्पिक दृष्टिकोण के लिए धारावाहिक वर्गों से ऊतक के संस्करणों का पुनर्निर्माण कर रहे है और इस तरह वांछित डेटा3मिलता है । लेकिन यह बहुत समय लगता है और (बड़ा) तुलनात्मक अध्ययन के लिए एक व्यवहार्य दृष्टिकोण नहीं है ।

इन समस्याओं को दूर करने के लिए, हमने एक कार्यप्रवाह विकसित किया है जो शोधकर्ता को अल्ट्रा-थिन अनुभागों के भीतर नियमित रिक्ति पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ प्राप्त करने के लिए स्वचालित रूप से नमूनों का चयन करने की अनुमति देता है । इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ की स्थिति यादृच्छिक है, निष्पक्ष नमूनाकरण की अनुमति. दृष्टिकोण दोनों संरचनाओं के संख्यात्मक घनत्व का निर्धारण करने के लिए उपयुक्त है (उदाहरण के लिए, एक निश्चित न्यूरोपिल मात्रा4,5के भीतर synapses), और संरचनात्मक सुविधाओं के आयाम (उदाहरण के लिए, synapses फांक की चौड़ाई, या postsynaptic घनत्व के व्यास4,5) ।

कार्यप्रवाह कस्टम-मेड रैंडम पॉइंट सैंपलिंग (RPS) सॉफ़्टवेयर का उपयोग करता है (हमारे माइक्रोस्कोप के साथ आपूर्ति किए गए स्क्रिप्टिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके जावा स्क्रिप्ट में लिखा जाता है) जो कि स्वचालित रूप से एक अल्ट्रा-थिन अनुभाग में ब्याज के पूर्वनिर्धारित क्षेत्र में ग्रिड स्थितियों का परिकलन करती है । आर पी एस सॉफ्टवेयर इन पूर्वनिर्धारित बिंदुओं पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप की अवस्था को ले जाता है, ताकि प्रत्येक बिन्दु पर एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ बनाया जा सके । सबसे पहले, उपयोगकर्ता पतली अनुभाग के भीतर ब्याज के एक क्षेत्र को परिभाषित करता है । अगले, RPS सॉफ्टवेयर इस क्षेत्र के भीतर ग्रिड की स्थिति की गणना करता है । पहली स्थिति के एक्स/वाई निर्देशांक बेतरतीब ढंग से बनाए जाते हैं, और शेष पदों को पहली स्थिति के संबंध में नियमित रूप से ग्रिड अंतराल पर रखा जाता है । क्योंकि ब्याज के क्षेत्र के हर भाग की जांच की जा रही है की एक ही मौका है, यह ंयूनतम डेटा संग्रह की अनुमति देता है । नमूना के इस दृष्टिकोण भी व्यवस्थित वर्दी यादृच्छिक नमूना कहा जाता है (देखें संदर्भ6,7 अधिक जानकारी के लिए).

संरचनाओं के संख्यात्मक घनत्व का निर्धारण करने के लिए, हम वर्गों है कि एक ज्ञात दूरी के अलावा कर रहे है के जोड़े के साथ काम करते हैं । पूर्व निर्धारित पदों में से एक में पहले खंड से एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ प्राप्त करने के बाद, TEM धारावाहिक अनुभाग सॉफ्टवेयर (हमारे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ आपूर्ति सॉफ्टवेयर पैकेज का एक हिस्सा) दूसरे खंड में इसी बिंदु पर ले जाता है, ताकि इसी स्थान का इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ प्राप्त करें । यह पूर्व निर्धारित ग्रिड में हर स्थान के लिए दोहराया जाता है । हमारे दृष्टिकोण में, एक द्विक्षेत्रक इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ8,9के प्रत्येक जोड़ी में कणों की संख्या की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है । एक disector गिनती फ्रेम की एक जोड़ी के होते हैं, प्रत्येक धारा के लिए एक8,9। वस्तुओं का संख्यात्मक घनत्व केवल प्रथम खंड (या संदर्भ अनुभाग) पर दिखाई देने वाले वस्तुओं की गणना के द्वारा निर्धारित किया जाता है, लेकिन दूसरे अनुभाग (या लुकअप अनुभाग) पर नहीं. यह एक तेज और कुशल तरीके से वस्तुओं के संख्यात्मक घनत्व का अनुमान लगाने के लिए अनुमति देता है8,9. इसके अतिरिक्त एकल वर्गों पर, दो आयामी संरचनात्मक सुविधाओं मापा जा सकता है ।

हम इस कार्यप्रवाह सफलतापूर्वक लागू किया है के लिए एक मानक वातावरण (एसई) आवास की स्थिति की तुलना में समृद्ध पर्यावरण (EE) आवास शर्तों को उजागर चूहों के हिप्पोकैम्पस में synapse संख्या में अंतर का आकलन करने के लिए4,5, और भी जंगली प्रकार के बीच ultrastructural मतभेदों का मूल्यांकन करने के लिए (WT) चूहों और neuropeptide वाई (एनएपी) KO चूहों एसई और EE5के तहत रखा. हमारा उद्देश्य ंयूरॉंस के संरचनात्मक सुविधाओं पर विशेष रूप से देखने के लिए, इस तरह के संख्यात्मक synaptic घनत्व के रूप में, क्रॉस में सक्रिय क्षेत्र की लंबाई वर्गों और postsynaptic घनत्व, synaptic फांक की चौड़ाई, और synaptic पीव की संख्या, विभिन्न प्रायोगिक स्थितियों के बीच न्यूरोनल कनेक्टिविटी और सक्रियण में परिवर्तन का आकलन करने के लिए. इसके अतिरिक्त, हम न्यूरॉन्स में घने कोर पीव (dcv) के संख्यात्मक घनत्व में रुचि रखते थे एक निश्चित मस्तिष्क क्षेत्र में संग्रहीत neuropeptides की मात्रा निर्धारित करने के लिए.

ऊपर वर्णित अध्ययन के लिए हमारे दृष्टिकोण की सफलता के आधार पर, हमारे अगले कदम में, हम मानव मस्तिष्क के नमूनों के भीतर निष्पक्ष मौलिक विश्लेषण के लिए क्षेत्रों का चयन करने के लिए हमारे कार्यप्रवाह अनुकूलित किया है । यह छवि लोहा है, जो दोनों ंयूरॉंस और glial कोशिकाओं में ferritin अणुओं में संग्रहित किया जाता है । इस के लिए, हम एक स्क्रिप्ट है कि हम एक परिभाषित क्षेत्र में मस्तिष्क वर्गों के एक यादृच्छिक स्क्रीनिंग प्रक्रिया के लिए आपरेशन के सबसे स्वचालित करने की अनुमति दी संकलित ।

Protocol

आस्ट्रिया गणराज्य के संघीय विज्ञान और अनुसंधान मंत्रालय में एक नैतिक समिति द्वारा सभी प्रयोगों (BMWF-80.104/2-BrGT/2007 और BMWF-66.010/0037-II/3b/2013), या ग्राज़ के चिकित्सा विश्वविद्यालय के एथिक्स कमीशन, संख्या 28-549 ex द्वारा अनुमोदित किया गया था 15/16, और यूरोपीय समुदाय परिषद के 24 नवंबर के निर्देश के अनुसार आयोजित १९८६ (86/609/EEC) और यूरोपीय संसद और परिषद के 22 September2010 के निर्देश (2010/63/ईयू) । पशु प्रयोगों डिजाइन और इस तरह से प्रदर्शन किया है कि इस्तेमाल किया जानवरों की संख्या कम किया गया था ।

1. विच्छेदन और ऊतक का निर्धारण

  1. चूहों (21 सप्ताह पुरानी, महिला C57BL/6J चूहों और C57BL/6J चूहों; एक मिश्रित C57BL/6:129/SvJ (1:1) पृष्ठभूमि पर क्रमशः) पुरुष डब्ल्यूटी और एनएपी KO चूहों के इंजेक्शन द्वारा १५० मिलीग्राम/किलो पेंटोबारबिटल intraperitoneally ।
  2. खोपड़ी से दिमाग निकालें और तुरंत उंहें आधे में कटौती (दाएं गोलार्द्ध से छोड़ दिया अलग)-एक स्केलपेल का उपयोग कर ।
  3. तुरंत 2% formaldehyde के साथ कांच के कंटेनर में हिस्सों प्लेस और ०.१ मीटर cacodylate बफर (CH3)2एएसओ 2 Na · 3h2ओ में २.५% ग्लूटारऐल्डिहाइड, पीएच के साथ समायोजित करने के लिए ७.४ 1m nacl), 4 डिग्री सेल्सियस पर पीएच ७.४ ।
    चेतावनी: fixatives विषाक्त कर रहे है और महान देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए । केवल सुरक्षात्मक दस्ताने के साथ और धूआं हुड के नीचे का उपयोग करें ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए मस्तिष्क हिस्सों ठीक है और एक ही बफर में कम से 24 एच के लिए, भी 4 डिग्री सेल्सियस पर कुल्ला । बफर की मात्रा नमूना मात्रा के बारे में दस गुना होना चाहिए ।

2. माउस मस्तिष्क एटलस से संदर्भ वर्गों के साथ Vibratome वर्गों की तुलना करके मस्तिष्क के भीतर ब्याज के क्षेत्र की पहचान10

  1. मस्तिष्क के नमूने को एक vibratome पर रखें । सुनिश्चित करें कि मस्तिष्क के उंमुखीकरण सही है (इस मामले में, एक कोरोनल अभिविंयास हिप्पोकैम्पस के लिए चुना गया था) ।
  2. ट्रिम कर दीजिए जब तक मस्तिष्क में ब्याज (ROI) के क्षेत्र तक पहुंच गया है । एक बड़ी मोटाई पर वर्गों में कटौती (जैसे, १०० μm) जब तक ब्याज के क्षेत्र के साथ मस्तिष्क के भाग तक पहुंच गया है और हर वर्ग फेंक देते हैं ।
  3. रॉय के साथ मस्तिष्क भाग की शुरुआत में 20 μm मोटाई के साथ vibratome वर्गों में कटौती और एक गिलास स्लाइड पर vibratome वर्गों जगह शुरू करते हैं । उन्हें दाग (Nissl दाग) सोडियम एसीटेट बफर में वर्गों ०.०५% thionine एसीटेट में रखकर, 1 मिनट के लिए ४.२ पीएच (चित्रा 1ऐ) ।
  4. माउस मस्तिष्क एटलस के साथ दाग वर्गों की तुलना एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर और काटने जारी है और धुंधला जब तक वांछित मस्तिष्क निर्देशांक तक पहुंच रहे हैं ।

3. Embedding के लिए एक नमूना क्षेत्र प्राप्त करना

  1. जैसे ही सही क्षेत्र की पहचान की है, vibratome के साथ १५० μm मोटाई में एक खंड काटने शुरू करते हैं ।
  2. स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत एक रेगर ब्लेड के साथ इस vibratome अनुभाग Microdissect. दूर रॉय के आसपास भागों कट । अनुभाग में संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) (1 x 1 मिमी2से बड़ा नहीं) के लिए निम्नलिखित तैयारी चरणों के लिए एक उपयुक्त आकार होना चाहिए ।

4. TEM तैयारी-Embedding, अल्ट्रा पतली Sectioning और धुंधला

  1. एम्बेडिंग
    1. कमरे के तापमान (आरटी) पर 2% आज़मियम टेट्रॉक्साइड में 2 एच के लिए पोस्ट-फिक्स । नमूना मात्रा के साथ नमूने को कवर करने के लिए एक खंड का उपयोग करें, लेकिन अनावश्यक विषाक्त अपशिष्ट को रोकने के लिए अतिरिक्त फिक्सेटिव का उपयोग करने से बचें ।
      चेतावनी: osmium टेट्रॉक्साइड अत्यधिक विषाक्त है और महान देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए । केवल सुरक्षात्मक दस्ताने के साथ और धूआं हुड के नीचे का उपयोग करें ।
    2. 20 मिनट के चरणों में EM ग्रेड शराब का उपयोग कर dehydrate । पिछले चरण (५०%, ७०%, ८०%, ९६% और १००% एथेनॉल) की तुलना में अधिक मात्रा का उपयोग करें ।
    3. प्रोपाईलीन ऑक्साइड में ४० मिनट के लिए जगह पर प्रोपाईलीन ऑक्साइड का मिश्रण में जगह/(1:2) आर टी पर 2 एच के लिए और 1:3 रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर राल ।
      सावधानी: Propylene ऑक्साइड अत्यधिक विषाक्त है और महान देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए । केवल सुरक्षात्मक दस्ताने के साथ और धूआं हुड के नीचे का उपयोग करें ।
    4. १००% राल में नमूनों को ६० मिनट के बाद राल बदलकर 2 बार और एक बार ९० मिनट के बाद (सभी ४५ डिग्री सेल्सियस पर) एंबेड करें ।
    5. अंत में, उचित molds में नमूने प्लेस और दो 3 दिनों के लिए ९० डिग्री सेल्सियस पर राल polymerize (चित्रा 1aii) ।
  2. एक ultramicrotome पर Trimming और Sectioning ।
    1. ब्लॉक छांटो, सुनिश्चित करना है कि पक्षों के रूप में वर्गों के लिए संभव के रूप में एक दूसरे का पालन करने के लिए चिकनी है (चित्रा 1aiii) ।
    2. उत्पादन ५५ एनएम अल्ट्रा पतली धारावाहिक वर्गों (सिल्वर ग्रे होना चाहिए) एक ultramicrotome का उपयोग कर । एक स्लॉट ग्रिड (स्लॉट चौड़ाई 1 x 2 मिमी) pioloform के साथ लेपित का उपयोग करें (चित्रा 1aiv).
  3. काउंटर पर अल्ट्रा पतली वर्गों स्लॉट ग्रिड पर 30 मिनट के लिए 2% यूरेनिल एसीटेट का उपयोग कर और 30 के लिए नेतृत्व साइट्रेट आरटी पर s (यह मानक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विधि11है).
    चेतावनी: Uranyl एसीटेट अत्यधिक विषाक्त है और किसी भी सीधे संपर्क से बचना चाहिए । केवल सुरक्षात्मक दस्ताने के साथ संभाल । सीसा नाइट्रेट विषाक्त है अगर निगल लिया या सांस और महान देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए ।

5. सॉफ्टवेयर संकुल के साथ उनि पर संदर्भ और लुक-अप अनुभागों पर इसी रोिी की इमेजिंग

  1. एक कम आवर्धन का उपयोग कर के साथ ग्रिड पर वर्गों की जांच (वर्गों के आकार के आधार पर) अभिविन्यास के लिए और वर्गों की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए.
  2. शुरू सॉफ्टवेयर (एक पैकेज के TEM छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर, या TIA, माइक्रोस्कोप के साथ आपूर्ति की) वर्गों के कोने अंक भंडारण द्वारा आभासी छवियों को उत्पंन करने के लिए । कि सॉफ्टवेयर प्रत्येक अनुभाग पर रॉय की इसी स्थिति को खोजने के लिए अनुमति देता है ।
    1. अनुभाग पर जाएं और संदर्भ और लुक-अप अनुभाग के लिए कोने बिंदुओं को जोड़ने के लिए संमिलित करें चुनें । पॉप-अप विंडो के निर्देशों का पालन करें । संदर्भ अनुभाग के साथ प्रारंभ करें, और उसके बाद लुक-अप अनुभाग के साथ जारी रखें । सुनिश्चित करें कि खंड के किनारे जो अगले खंड के समांतर अंक 1 और 2 (चित्र 1द्वि) के रूप में दर्ज किए गए हैं ।
    2. ब्याज के क्षेत्र की पहचान करने के लिए कम आवर्धन के तहत संदर्भ अनुभाग कल्पना और रॉय की एक रूपरेखा बनाने के लिए रॉय के कई कोने अंक के लिए संदर्भ अनुभाग पर TIA का उपयोग कर माइक्रोस्कोप चरण चाल ।
    3. Rps सॉफ्टवेयर का उपयोग कर परिणामी बहुभुज के निर्देशांक रिकॉर्ड. इसके लिए, अनुभाग में ROI को बाह्यरेखांकित करने के लिए आवश्यक बहुभुज के प्रत्येक बिंदु पर Rps सॉफ़्टवेयर के संवाद बॉक्स में निर्देशांक जोड़ें दबाएँ (चित्र 1bii).
    4. परिभाषित करने और Rps सॉफ्टवेयर में क्षेत्रों के बीच नमूनाकरण क्षेत्रों और दूरी के लिए एक उपयुक्त आकार दर्ज करें (प्रस्तुत अध्ययन में, नमूना क्षेत्रों का आकार 7 μm है और उनके बीच की दूरी 20 μm है, जिसके परिणामस्वरूप कम से 20 नमूने क्षेत्रों के भीतर ROI). प्रेस raster की गणना, तो सॉफ्टवेयर नमूना क्षेत्र बहुभुज के भीतर micrograph की स्थिति के लिए एक व्यवस्थित वर्दी यादृच्छिक फैशन में निर्देशांक उत्पन्न करता है (चित्रा 1biii).
      नोट: बेहतर उंमुखीकरण के लिए, बहुभुज और बहुभुज के भीतर नमूना क्षेत्रों rps सॉफ्टवेयर (चित्रा 1biv) द्वारा प्रदर्शित किया जा सकता है ।
  3. Rps सॉफ़्टवेयर और TEM सीरियल अनुभाग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके संदर्भ और लुक-अप अनुभाग पर नमूनाकरण बिंदुओं को संग्रहीत करें. ये montages जो बाद में11दर्ज कर रहे है के निर्देशांक हैं ।
    1. RPS सॉफ्टवेयर में, प्रेस संदर्भ अनुभाग में प्रत्येक नमूना क्षेत्र के एक्स/वाई निर्देशांक करने के लिए माइक्रोस्कोप चरण ले जाने के लिए अगली स्थिति पर जाएँ । संदर्भ अनुभाग में सॉफ़्टवेयर में इन निर्देशांकों को आयात करने के लिए स्थान पर जाएं और संमिलित करें । सभी निर्देशांक के लिए यह दोहराएं ।
    2. संदर्भ अनुभाग से निर्देशांक को लुक-अप अनुभाग पर प्रतिबिंबित करने के लिए, अनुभाग पर जाएँ और अनुभाग पर जाएँदबाएँ. संवाद विंडो में लुक-अप अनुभाग (सामांयत: ' 2 ') की संख्या दर्ज करें ।
    3. Montages की रिकॉर्डिंग के लिए (अगला चरण देखें), पहले बताए गए अनुसार संदर्भ और लुक-अप अनुभाग के बीच स्विच करें और स्थान के साथ संदर्भ अनुभाग पर स्थिति बदलें और संख्या पर जाएँ. संवाद विंडो में अगला समंवय चुनें ।
    4. प्रत्येक नमूना समंवय पर SerialEM montages के लिए, फ़ाइल के लिए जाना है और ड्रॉप-डाउन मेनू से नई असेंबल का चयन करें । टाइल की सही संख्या और संवाद विंडो में ओवरलैप का प्रतिशत का चयन करें । वर्तमान अध्ययन के लिए, 5000X का इज़ाफ़ा अध्ययन के तहत synaptic सुविधाओं को पहचानने के लिए पर्याप्त है, लेकिन सीसीडी कैमरा के दृश्य के सीमित क्षेत्र 2 x 2 छवियों के montages बनाने की आवश्यकता है । Montages सीरियलएम के साथ बना रहे हैं ।
    5. प्रत्येक असेंबल रिकॉर्डिंग से पहले, ध्यान (या, यदि संभव हो तो, रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर में autofocus विकल्प को सक्रिय) सुधारने । असेंबल फ़ाइल को बचाने के लिए फ़ोल्डर चुनें और SerialEM में बाईं तरफ असेंबल सबमेनू में शुरू दबाने से असेंबल की रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं ।

6. Imagej के साथ Ultrastructural सुविधाओं दस्तावेज़ के लिए TEM छवियों का विश्लेषण ।

नोट: इसके लिए, संदर्भ और लुक-अप अनुभाग से कोई संरेखित छवि स्टैक बनाने के लिए महत्वपूर्ण है ।

  1. Imagej छवियों के साथ छवि जोड़े कंवर्ट करने के लिए एक स्टैक फ़ाइल में ढेर और stackreg के साथ छवियों को संरेखित करें (के लिए बड़ी epfl http://sites.imagej.net/BIG-EPFL/से स्थापित किया जाना है; वर्तमान मामले में, एल्गोरिथ्म affine था प्रयुक्त) । सेलुलर संरचनात्मक सुविधाओं के संख्यात्मक घनत्व प्राप्त करने के लिए, कस्टम बनाया ImageJ मैक्रो Disector एक यादृच्छिक कोण के साथ छवि पर बेतरतीब ढंग से रखा ५.५ x ५.५ μm का एक आकार के साथ एक गिनती फ्रेम उत्पन्न करता है.
  2. मैक्रो Disector प्रारंभ करें ( imagej मेनू में स्थान जहां इसे सहेजा जाता है निर्देशिका पर निर्भर करता है) और पैरामीटर (गिनती फ़्रेम का आकार, खंडों की संख्या) आवश्यकतानुसार (चित्रा 1Cii) परिभाषित ।
  3. द्विक्षेत्रक का उपयोग करके synapse/μm2 की संख्या की गणना । प्रत्येक synapse गणना फ़्रेम में दिख रहा है जो संदर्भ अनुभाग में, लेकिन लुकअप अनुभाग में दृश्यमान नहीं है । उन synapses है कि दो disector के 'निषिद्ध लाइनों' के साथ काटना omit; लेकिन ' विपरीतस्वीकृति लाइनों' पर synapses गिनती करते हैं । इसके लिए, Multipoint उपकरण में स्थित Toolsbar में imagej (चित्रा 2A, चित्रा 2B) का उपयोग करें ।
  4. Synapse पैरामीटर्स को मापने के लिए, केवल synapse एक synapse फांक के साथ का चयन करें (संदर्भ अनुभाग पर) क्रॉस अनुभाग में उंमुख विदर disector के लिए उपयोग किया गया एक ही छवि फ़्रेम के भीतर ।
    1. शुरू प्लगइन Objectj से imagej में ड्रॉप डाउन मेनू (चित्रा 2ए) Plugins के माध्यम से । विश्लेषण। ObjectJ ड्रॉप-डाउन संवाद से कोई नया प्रोजेक्ट खोलें । यह एक खिड़की है कि उपयोगकर्ता की रूपरेखा और मार्कर उपकरण (चित्रा 2बी, लाल वृत्त) के साथ संरचनाओं को चिह्नित करने की अनुमति देता है खुल जाएगा । यहाँ प्रस्तुत प्रयोगों के लिए प्रयुक्त होने वाले सिंपैटिक पैरामीटर्स निम्न चरणों में बताए गए हैं.
    2. मार्कर उपकरण (चित्रा 2बी, लाल वृत्त) का उपयोग कर संरचना के साथ एक लाइन ड्राइंग द्वारा presynaptic झिल्ली और Postsynaptic घनत्व लंबाई की लंबाई को मापने ।
    3. एक बहुभुज दोनों को कवर करने के द्वारा synaptic फांक की औसत चौड़ाई प्राप्त करें पूर्व और postsynaptic झिल्ली, सीधे समानांतर पक्षों और एक खंडित लाइन मिडवे, दोनों झिल्ली के लिए समान दूरी के साथ.
    4. डॉक्ड पीव की संख्या का निर्धारण करने के लिए, सभी पीव कि एक आशय व्यास या कम की presynaptic झिल्ली से एक अधिकतम दूरी की गणना ।
    5. अनडॉक्ड पुटिका की संख्या का निर्धारण करने के लिए, एक ही synapse पर डॉक या अन्य अनडॉक्ड पीव से एक आशय व्यास की एक अधिकतम दूरी के साथ उन पीव गिनती.

7. उत्पादन अर्द्ध-प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए पतली वर्गों के दस्तावेज़ को स्थूल सुविधाओं (वर्तमान मामले में सेल संख्या) एक ही रॉय के भीतर के रूप में TEM जांच के लिए चुना ।

  1. तत्काल के लिए अल्ट्रा पतली वर्गों को काटने के बाद, दो अर्द्ध पतली वर्गों, ०.५ μm मोटी और तुरंत एक दूसरे से सटे काट । एक गिलास स्लाइड पर रखें और उन्हें ०.५% tolआइडी ब्लू समाधान का उपयोग दाग । वर्गों पर एक आवरण पर्ची प्लेस (DPX बढ़ते माध्यम के साथ, distyrene, एक plasticizer (tricresyl फॉस्फेट), और xylene से मिलकर) । इन दो अनुभागों का उपयोग कक्ष संख्याओं की गणना करने के लिए किया जाता है ।
  2. प्रकाश सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग करते हुए कम आवर्धन पर अर्ध-तनु खंडों का फोटोग्राफ ।
    नोट: जांच के तहत संरचनाओं छवियों में पहचाने जाने योग्य होना चाहिए । वर्तमान अध्ययन में, 20X आवर्धन का उपयोग कोशिका निकायों की पहचान करने के लिए किया गया था । यदि आवश्यक हो, एकाधिक छवियों एक साथ एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर के साथ सिले जा सकता है ।
  3. एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर (उदाहरणके लिए, imagej) के साथ दो लगातार अर्द्ध पतले वर्गों के जोड़े संरेखित करें ।
    नोट: रोटेशन और आकार के अंतर (संपीडन प्रक्रिया द्वारा प्रस्तुत संपीड़न कलाकृतियों के कारण हो सकता है) दो वर्गों के एक परिपूर्ण ओवरले के लिए समायोजित किया जाना चाहिए.
  4. प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवि पर रॉय की सीमा को चिह्नित करें । रॉय को TEM छवियों के लिए उपयोग की गई ROI के अनुरूप होना चाहिए । इस उद्देश्य के लिए, Imagej में छवियों को लोड और toolsbar से बहुभुज चयन चुनें (चित्रा 2ए) ।
  5. पूरी छवि पर एक ग्रिड उत्पंन विश्लेषण खोलने के द्वारा ImageJ का उपयोग कर । उपकरण । ग्रिड और मापदंडों की जरूरत के रूप में निर्धारित किया है ।
  6. ब्याज और अनुभाग मोटाई के क्षेत्र के भीतर ग्रिड अंक की संख्या से बहुभुज के क्षेत्र और मात्रा की गणना (मात्रा = एनसीएस * एकजी एस * एचअनुसूचित जनजाति ; NCS = क्रॉस अनुभागों को गिना जाता है; एकजी एस = ग्रिड आकार; hST = धारा मोटाई) ।
  7. यदि वे केवल एक अनुभाग पर मौजूद हैं, तो ROI के भीतर न्यूरोनल सेल निकायों से नाभिक की संख्या की गणना. Toolsbar से Imagej में Multipoint उपकरण चुनें और कोशिकाओं को चिह्नित । प्रत्येक अनुभाग पर कक्षों की गणना करने के बाद, प्रति वॉल्यूम कक्षों की संख्या परिकलितEquation 1करें (; Cघनत्व = कोशिका घनत्व; Ccount = कक्ष गणना) ।
  8. Objectj परिणाम विंडो में सभी माप रिकॉर्ड (चित्रा 2सी) । निर्यात और आगे उपयोग के लिए उन्हें बचाने के लिए ।

8. के साथ संयोजन में मस्तिष्क के नमूनों में मौलिक विश्लेषण का अनुकूलन करने के लिए SerialEM स्क्रिप्ट का उपयोग DigitalMicrograph (डीएम, इमेजिंग फिल्टर के साथ आपूर्ति).

  1. इमेजिंग फ़िल्टर (GIF) की ट्यूनिंग ।
    1. TEM में नमूना लोड और ट्रैकबॉल या माइक्रोस्कोप के जॉयस्टिक का उपयोग कर GIF ट्यूनिंग के लिए नमूने में एक छेद करने के लिए जाना.
    2. डीएम सॉफ्टवेयर/डीएम में और चयन सीसीडी कैमरा में ऊर्जा फ़िल्टर्ड ( eftem) में स्विच डीएम ।
    3. तात्विक विश्लेषण के लिए आवर्धन चुनें (आवर्धन, ब्याज की संरचना/क्षेत्र पर निर्भर करता है; वर्तमान स्थिति में, आवर्धन ७६ k से १२५ k तक) सेट है । ०.००१ s और प्रारंभ दृश्यके लिए एक्सपोज़र समय सेट करें ।
    4. बीम ध्यान केंद्रित जब तक किनारों को देखा जा सकता है और छवि में बीम केंद्र । C2/उद्देश्य एपर्चर को तब तक कम करें जब तक एपर्चर के किनारों को दिखाई न दे और बीम के लिए ट्रैकबॉल के साथ किरण केंद्र ।
    5. बीम Defocus (लगभग C2 ४६.२%, ट्यूनिंग के लिए जोखिम समय के आसपास ०.०५ s होना चाहिए) और zlp बटन दबाने से शूंय हानि पीक (zlp) लगता है । पूर्ण ट्यून बटन दबाकर ट्यूनिंग प्रक्रिया प्रारंभ करें ।
  2. अधिग्रहण के यादृच्छिक अंक मिलता है ।
    1. TEM इमेजिंग मोड के लिए वापस स्विच और कैमरे का चयन करें और आवर्धन 10 k पर ध्यान की जांच (z-अक्ष समायोजित करें और शूंय करने के लिए defocus सेट) ।
    2. चुनें LM 75X आवर्धन और जांच अगर कैमरा नहीं डाला है (अंयथा यह SerialEM सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित नहीं किया जा सकता है) ।
    3. सीरियलएम शुरू करें और एक नया प्रोजेक्ट खोलें ।
    4. नेविगेटर खोलें । कैमरा &Amp; स्क्रिप्ट नियंत्रणों ( दृश्य और रिकॉर्डके लिए) और प्रारंभ दृश्य (कैमरा स्वचालित रूप से संमिलित किया गया है) में कैमरे के लिए सेटिंग्स जांचें ।
    5. अल्ट्रा के एक कोने नक्शा-पतली अनुभाग बनाने के लिए, नेविगेटर विंडो में अंक जोड़ें चुनें ।
      1. एक अल्ट्रा पतली अनुभाग के किनारों पर कोने अंक सेट करें । दाएं-माउस-कुंजी को दबाए रखकर स्टेज को किसी कोने पॉइंट पर ले जाएं । जब अनुभाग का कोई कोना पहुंच जाता है, तो बाएं-माउस-क्लिक के साथ एक कोना बिंदु जोड़ें । 3 और कोने अंक जोड़ने के लिए प्रक्रिया को दोहराएं । सुनिश्चित करें कि नेविगेटर विंडो में कोने अंक के लिए बॉक्स सी संग्रहीत अंक के लिए टिक है ।
      2. कोने असेंबल शुरू करने के लिए (आवर्धन एल एम ७५ में बेहतर), SerialEM मेनू पट्टी में नेविगेटर के पास जाओ और ड्रॉप-डाउन मेनू से montaging &Amp; ग्रिड और सेटअप कॉर्नर असेंबल चुनें ।
        नोट: चुने गए रिकॉर्ड पैरामीटर्स के लिए श्रेष्ठ फिटिंग सेटिंग्स प्रदर्शित की जाती हैं । यदि जरूरत हो तो उन्हें बदलें । वर्तमान मामले में, केवल ओवरलैप प्रतिशत 20% करने के लिए बदल गया था ।
    6. असेंबल छवि पर अनुभाग/ नेविगेटर विंडो में बहुभुज जोड़ें चुनें और एकाधिक दाएँ-माउस-क्लिक के साथ अनुभाग को बाह्यरेखांकित करें. नेविगेटर ड्रॉप-डाउन मेनू में अंकों की ग्रिड जोड़ें चुनें और बिंदुओं के बीच दूरी निर्धारित करें (दूरी प्रायोगिक प्रश्न पर निर्भर करती है; उदाहरणके लिए, 10 Μm, चित्रा 3) ।
    7. स्क्रिप्ट आदेश का पालन करें । नेविगेटर में दिखाए गए के रूप में ग्रिड बिंदुओं की संख्या दर्ज करें और अर्जन बिंदुओं की संख्या दर्ज करें (उदा., 20).
    8. इतनी है कि स्क्रिप्ट ग्रिड सलाखों से बच सकते है रोशनी सीमा निर्धारित करें । स्क्रिप्ट आदेशों का पालन करें और ग्रिड-पट्टी के साथ एक तिमाही से दृश्य के क्षेत्र को कवर करने के लिए मैंयुअल रूप से चरण को ले जाएं । प्रदर्शित मूल्य के अनुसार, एक थ्रेशोल्ड प्रदीप्ति मान दर्ज करें (प्रदर्शित मान से अधिक होना चाहिए) ।
    9. प्राप्ति के लिए पॉइंट्स चयनित होने तक प्रतीक्षा करें और खाना पकाने की दिनचर्या समाप्त हो गई है ।
      नोट: यह एक लंबा समय लगता है और रातोंरात किया जा सकता है; स्क्रिप्ट खाना पकाने दिनचर्या खत्म करने के बाद अतिरिक्त में माइक्रोस्कोप भेजता है; खाना पकाने दिनचर्या इलेक्ट्रॉन बीम में वर्गों को स्थिर करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  3. एनर्जी फ़िल्टर्ड उनि (EFTEM) तात्त्विक विश्लेषण
    1. TIA में Eftem मोड चुनें / डीएम और डीएममें सीसीडी कैमरा का चयन करें ।
    2. बीम केंद्र और प्रत्येक नमूना समंवय करने के लिए मंच कदम होगा कि स्क्रिप्ट आज्ञाओं का पालन करें ।
      नोट: उपयोगकर्ता अगर मंच अगले समंवय करने के लिए ले जाया जाना चाहिए पूछा जाएगा ।
    3. शूंय हानि पीक (ZLP) संरेखित करें और C2 से ~ ४६.२% सेट करें ।
    4. ६० eV में ऊर्जा सेट (इस मामले में, मूल्य Fe M-edge का पता लगाने के लिए सेट किया गया है), पर 10 eV और एक्सपोजर समय में भट्ठा ०.४ s. भट्ठा डालें और C2 सेट करने के लिए ~ ४३.९%.
    5. देखें और छवि को ध्यान केंद्रित करें ।
    6. C2 को ४६.२% पर सेट करें, zlp को संरेखित करें और c2 को ४३.९% पर वापस सेट करें ।
    7. मौलिक विशिष्ट सेटिंग्स के साथ मौलिक नक्शा प्राप्त.
      नोट: डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स अर्जन संवाद में उपयोग किया जा सकता है, लेकिन यह इन पहले से परीक्षण करने के लिए अनुशंसित है, यदि संभव हो तो; उदाहरण फ़िल्टर की गई छवियां चित्र 4में दिखाई जाती हैं ।
    8. C2 सेट करने के लिए ४६.२% और मोटाई नक्शा प्राप्त.
    9. सभी निर्धारित अर्जन बिंदुओं (Step 8.3.2-8.3.12) के लिए दोहराएं ।
    10. स्क्रिप्ट के निर्देशों का पालन करें और एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ या अधिग्रहण अंक की montages मिलता है । आवर्धन चुनें ताकि सभी (अल्ट्रा) संरचनात्मक जानकारी दिखाई दे रही है/
    11. सहेजें लॉग फ़ाइल, नेविगेटर और परिणाम विंडो और भट्ठा हटा दें ।
    12. वाल्व बंद करें, नमूना हटाने और नीचे TEM बंद ।

Representative Results

यहाँ, हम एक स्वचालित और निष्पक्ष तरीके से TEM के लिए क्षेत्रों का चयन करने के लिए एक कार्यप्रवाह का वर्णन. उपयोगकर्ता एक अल्ट्रा के भीतर ब्याज के क्षेत्र का चयन करता है, TEM के तहत पतली अनुभाग, और हमारे Rps सॉफ्टवेयर है कि स्वचालित रूप से 20 के क्षेत्र के भीतर नमूना क्षेत्रों के निर्देशांक की गणना सहित कार्यप्रवाह के लिए कई सॉफ्टवेयर समाधान का उपयोग ब्याज. फिर, यह मंच फोटोग्राफी के लिए प्रत्येक नमूना क्षेत्र में ले जाया जाता है । यह दोनों एकल वर्गों के विश्लेषण के लिए और वर्गों, एक ज्ञात दूरी के अलावा, जो अन्वेषक के पूर्वाग्रह के बिना इमेजिंग के लिए क्षेत्रों का चयन करने की अनुमति देता है के जोड़े का विश्लेषण करने के लिए संभव है ।

यह कार्यप्रवाह मूल्यवान साबित जब माउस मस्तिष्क वर्गों4,5में ultrastructural सुविधाओं का दस्तावेजीकरण । इन अध्ययनों में डेंटेट गाइरस (DGpl) के पॉलीमोर्फ सेल लेयर को ब्याज के एक क्षेत्र के रूप में जांचा गया । हमारी विधि महानिदेशक की जांच के लिए उपयुक्त साबित हुई, क्योंकि पृष्ठीय डीजी (Bregma − १.३) का एक कोरोनल सेक्शन एक अल्ट्रा-थिन सेक्शन में फिट बैठता है और इसकी रूपरेखा को कम आवर्धन पर आसानी से पहचाना जाता है । यदि अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों की जांच की जानी थी, तो प्रयोगों की योजना बनाने से पहले उनके आकार और भेद की विशेषताओं की जाँच करना महत्वपूर्ण होगा.

यहां वर्णित कार्यप्रवाह लागू करने से पता चला कि EE आवास महत्वपूर्ण DGpl4में synaptic फांक की चौड़ाई बढ़ जाती है, मानक आवास की स्थिति के संबंध में । इसके अलावा, घने कोर पीव की संख्या में काफी कमी आई थी ई घर में पशु4, neuropeptides के घर में परिवर्तन का संकेत है । जब डब्ल्यूटी और एनएपी पीटकर चूहों को EE शर्तों के तहत रखा गया तो डीजीपीएल में न्यूरॉन्स/μm ³ की संख्या में वृद्धि हुई जबकि डीसीवी का घनत्व एसई-हाउसिंग5के संबंध में कम हुआ । इसके विपरीत, npy नॉकआउट रिजर्व पूल में synaptic पीव की एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई (undocked synaptic पीव) आवास शर्तों के स्वतंत्र5। Synaptic फांक की चौड़ाई पर EE का प्रभाव एनएपी को ई के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर में जिसके परिणामस्वरूप समूह में उलट गया था WT और एनएपी KO चूहों5। WT और NPY पीटकर पशुओं के व्यवहार के अध्ययन के साथ एक साथ लिया आवास शर्तों के दोनों प्रकार के तहत आयोजित की, यह EE5के neurobiological प्रभाव के लिए एनएपी की एक महत्वपूर्ण भूमिका को दर्शाता है ।

मानव मस्तिष्क में संग्रहीत लोहा visualizing के लिए, एक स्क्रिप्ट serialem सॉफ्टवेयर के लिए बेतरतीब ढंग से एक पूरे ultrathin अनुभाग के भीतर से अधिग्रहण के अंक का चयन करने के लिए संकलित किया गया था, एक ऊर्जा प्राप्त करने के उद्देश्य से इन बिंदुओं में से प्रत्येक पर इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मालेख फ़िल्टर्ड . इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में अनुभाग लोड करने के बाद, स्क्रिप्ट खंड के स्थिरीकरण प्रदर्शन (यानी, नमूना ' खाना पकाने ' दिनचर्या) रातोंरात । स्क्रिप्ट तो बेतरतीब ढंग से अंक 3में एक कसा के साथ चिह्नित उन लोगों से उपयोगकर्ता द्वारा पूर्वनिर्धारित अंकों के एक नंबर का चयन किया । एक परीक्षण सूक्ष्मालेख उत्पादन और अपने ग्रे स्तर की जांच करके, स्क्रिप्ट की जांच अगर चुना अंक अनुभाग के एक दृश्य भाग पर स्थित थे, अंक है कि ग्रिड सलाखों पर उतरा खारिज । कार्यप्रवाह के अधिकांश उपयोगकर्ता की ंयूनतम बातचीत के साथ स्क्रिप्ट द्वारा संभाला गया था । हालांकि, यह संभव नहीं था स्वचालित रूप से रिकॉर्ड ऊर्जा फ़िल्टर्ड माइक्रोग्राफ (इस स्थापना के साथ), के रूप में वहां serialem के autofocus दिनचर्या के लिए बहुत कम प्रकाश था । इसलिए, हम डीएम सॉफ्टवेयर के लिए बंद के रूप में स्क्रिप्ट के रूप में ही प्रत्येक बिंदु पर मंच चला गया था, हाथ से ध्यान समायोजित, और लोहे की एक EFTEM छवि बना दिया । पोस्टमार्टम मानव मस्तिष्क से एक EFTEM लोहे की छवि के लिए एक उदाहरण चित्रा 4में दिखाया गया है ।

Figure 1
चित्रा 1. वर्कफ़्लो का रेखांकन । (क) नमूना तैयार करने के मुख्य कदम (तीर की दिशा में) दर्शाए गए हैं: vibratome वर्गों (i), embedding (ii), अर्द्ध पतली और अल्ट्रा पतली वर्गों (iii) काटने, और तांबे ग्रिड (चतुर्थ) पर अल्ट्रा पतली वर्गों के जोड़ों को पकड़ने । (ख) नमूना क्षेत्र निर्देशांक बनाने के लिए माइक्रोस्कोप आपूर्तिकर्ता के सॉफ्टवेयर और कस्टम-निर्मित आरपीएस सॉफ्टवेयर दोनों का उपयोग जो रिकॉर्डिंग साइटों का निर्धारण करता है । वर्गों के कोने अंक माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर में जमा हो जाती है और रॉय को रेखांकित किया जाता है (अर्ध की मदद से पहचाना-पतली वर्गों) (i); नमूना क्षेत्रों के एक ग्रिड रॉय पर उत्पंन होता है, एक यादृच्छिक बदलाव (लाल तीर) एक्स और वाई में पेश किया है । बदलाव नमूना क्षेत्रों के बीच की दूरी से छोटा है, (काले तीर), ताकि काले चौकों, जो कोई बदलाव नहीं है के बजाय, नीले चौकों, जो बेतरतीब ढंग से स्थानांतरित कर रहे हैं, रिकॉर्डिंग साइटों का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया जाता है (द्वितीय); रॉय की सीमाओं के भीतर ही नमूनाकरण क्षेत्रों (काले और नीले चौकों के रूप में तैयार) रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग किया जाता है. Micrographs दोनों संदर्भ अनुभाग में (काले चौकों) और लुकअप अनुभाग (नीला चौकों) (iii) में इसी स्थान में किया जाता है । (ग) प्रत्येक नमूना क्षेत्र में पर्याप्त आवर्धन पर माइक्रोग्राफ दिया जाता है; एक असेंबल कई विलय छवियों से मिलकर किया जाता है अगर (इस मामले में, 2 x 2 छवियों को एक साथ विलय कर दिया गया था) (i); एक गिनती फ्रेम उत्पन्न होता है और छवि में एक ओवरले के रूप में दिखाया गया है, फ्रेम के भीतर और संरचनाओं पर 'स्वीकृति लाइनों' (डैश्ड फ्रेम लाइनें) गिना जाएगा, लेकिन उन पर नहीं 'निषिद्ध लाइनों' (ठोस फ्रेम लाइनों) (ii). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 . एक निष्पक्ष गिनती फ्रेम के साथ अल्ट्रा पतली वर्गों की एक जोड़ी पर ultrastructural मापदंडों को मापने. (क) सेलुलर संरचनाओं की गणना और विश्लेषण करने के लिए प्रयुक्त इमेजेज विंडोज़ का ओवरव्यू । बाएँ हाथ की ओर एक ओवरले के रूप में गिनती फ्रेम के साथ इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मालेख से पता चलता है. दाईं ओर: ड्रॉप-डाउन मेनू (ऊपर) और उपकरण पट्टी (नीचे) के साथ ImageJ उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस (नीला आयत); Objectj ऑब्जेक्ट संपादक (हरा आयत); Objectj उपकरण विंडो (नारंगी आयत) जहां मापने के लिए उपकरण का चयन किया जा सकता है और objectj परिणाम विंडो (काला आयत) जहां सभी माप दर्ज़ हैं । (ख) इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ पर चिह्नित synapses (दोनों वर्गों पर synapses-तीर; केवल लुकअप अनुभाग-ऐरोहेड पर synapses) दर्शाने वाला विवरण । उन में उपकरण पट्टी से multipoint-उपकरण (लाल वृत्त) का उपयोग कर चिह्नित कर रहे है imagej । (ग) सिनाप्टिक विशेषताओं के नाम और माप पैरामीटरों को Objectj उपकरणोंके प्रयोग से परिभाषित किया गया है । मार्कर-उपकरण और ब्याज की सुविधा का चयन कर रहे है और रूपरेखा के साथ छोड़ दिया माउस-क्लिक द्वारा छवि में खींचा बाह्यरेखा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3. ऊर्जा फ़िल्टर संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए एक रॉय के भीतर मौलिक मानचित्रण के लिए नमूना क्षेत्रों का चयन. SerialEM रुचि के एक क्षेत्र का चयन करने के लिए और एक नियमित रूप से रिक्ति में नमूना क्षेत्रों की एक उच्च संख्या का सुझाव देने के लिए प्रयोग किया जाता है (गुलाबी पार छवियों ए और बी में) । एक स्क्रिप्ट तो बेतरतीब ढंग से (इन पूर्वनिर्धारित निर्देशांक से) अधिग्रहण के लिए नमूना क्षेत्रों का चयन करता है । गरीब रोशनी के साथ नमूना क्षेत्रों ग्रिड सलाखों से बचने और स्क्रिप्ट के रूप में जल्द ही बंद हो जाता है के रूप में 20 अच्छी तरह से प्रबुद्ध नमूना क्षेत्रों रॉय के भीतर चुना गया है अस्वीकार कर दिया है । (क) एक बहुभुज द्वारा उल्लिखित ब्याज के पूरे क्षेत्र का ओवरव्यू, एक्स के साथ चिह्नित संभावित नमूनाकरण क्षेत्रों की एक उच्च संख्या के साथ. (B) यादृच्छिक चयन से पहले नमूनाकरण क्षेत्रों को दर्शाने का विवरण. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4. तात्त्विक मानचित्र (EFTEM) प्राप्ति का उदाहरण. (क) अधिग्रहण बिन्दु के आस-पास के क्षेत्र का उज्ज्वल क्षेत्र, माइक्रोग्राफ । एक बेतरतीब ढंग से चयनित क्षेत्र एक मौलिक नक्शा प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था और एक काले आयत द्वारा चिह्नित है । (ख) बेतरतीब ढंग से चयनित क्षेत्र में बनाई गई eftem प्री-एज विंडो इमेज । (ग) इसी क्षेत्र में बनाई गई एफटीईटम पोस्ट-एज विंडो इमेज । (घ) इसी क्षेत्र के लोहे का तात्विक नक्शा (एम-एज). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहां प्रस्तुत कार्यप्रवाह एक निष्पक्ष फैशन में ultrastructural सुविधाओं पर डेटा प्राप्त करने के लिए शोधकर्ता की अनुमति देता है । यह बहुत कम समय के धारावाहिक वर्गों से मात्रा की जांच से खपत है । इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए कई विभिंन अनुप्रयोगों का उपयोग किया जाता है । सबसे पहले, हमारे कस्टम निर्मित Rps सॉफ्टवेयर (उपलब्धता के बारे में जानकारी के लिए, कृपया इसी लेखक से संपर्क करें) के लिए एक यादृच्छिक स्टेज-बदलाव का चयन करने के लिए नमूना क्षेत्र निर्देशांक परिचय का प्रयोग किया जाता है । यह रॉय की एक व्यवस्थित वर्दी यादृच्छिक नमूना की अनुमति देता है । अगले, विशिष्ट संरचनाओं की गिनती के लिए, हम disector विधि, जहां ज्ञात दूरी के साथ लगातार 2 वर्गों की तुलना कर रहे है अनुकूलित, एक उपंयास तरह से पिछले13,14,15 की तुलना में हम इस्तेमाल के रूप में हमारे व्यवस्थित वर्दी यादृच्छिक नमूना के लिए कस्टम निर्मित आर पी एस सॉफ्टवेयर. यह 3 डी की तुलना में समय बचाता है-धारावाहिक वर्गों से पूरे संस्करणों reconstructing । कस्टम निर्मित आर पी एस सॉफ्टवेयर विशेष रूप से माइक्रोस्कोप के एक प्रकार के लिए विकसित किया गया है जो कार्यप्रवाह के पुनर्उत्पादन के लिए एक सीमित कारक है । इस विशिष्ट सॉफ्टवेयर से एक विकल्प है कि पटकथा की अनुमति देता है और अंय माइक्रोस्कोप मॉडल के साथ संगत है एक आवेदन किया जाएगा ।

हम सफलतापूर्वक हमारे तुलनात्मक अध्ययन के लिए इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया4,5। न्यूरोनल ऊतक के अल्ट्रा पतली वर्गों पर, ब्याज के क्षेत्र रेखांकित किया गया था और छवियों को इस क्षेत्र के भीतर व्यवस्थित वर्दी यादृच्छिक नमूना द्वारा लिया गया । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ब्याज के क्षेत्र, डेंटेट gyrus के बहुरूपक परत, एक जगह छोटे क्षेत्र की जांच जो हमारे दृष्टिकोण के लिए फायदेमंद हो सकता है । एक बेतरतीब ढंग से रखा disector के भीतर, हम DCV की संख्या और वयस्क के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वयस्क WT चूहों बनाम वयस्क NPY पीटकर चूहों के वयस्कों के DGpl में synapses के कई ultrastructural सुविधाओं का मूल्यांकन किया । हमारे दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, एकत्र आंकड़ों में कुछ जांच मापदंडों में परिवर्तन दिखाया । इन निष्कर्षों में किशोर पशु2में इसी तरह के अध्ययन से लोगों की पुष्टि की ।

इस कार्यप्रवाह के प्रयोगात्मक उपयोग की एक खामी यह हो सकता है कि इस बहु-अनुप्रयोग दृष्टिकोण उपयोगकर्ता मित्रता के संदर्भ में आदर्श नहीं है, के रूप में उपयोगकर्ताओं को विभिंन उपयोगकर्ता के साथ आराम से मिल-इंटरफेस की जरूरत है (हमारे मामले में, उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस, TEM धारावाहिक अनुभाग , RPS सॉफ्टवेयर, और SerialEM सॉफ्टवेयर) । सीखना एक कुशल तरीके से सभी आवेदनों को संभालने के लिए समय लगता है और खाते में लिया जाना चाहिए । हालांकि, इस कार्यप्रवाह का उपयोग करने के लिए सीखने में समय निवेश अभी भी धारावाहिक अनुभाग TEM के साथ पूरे संस्करणों का विश्लेषण करने की जरूरत है जो समय पर स्पष्ट रूप से अनुकूल है. ब्याज के क्षेत्र में व्यवस्थित एकसमान यादृच्छिक नमूनाकरण द्वारा रखे गए डाइसेक्टर का उपयोग करने की विधि, उच्च मात्रा के अनुभागों/वॉल्यूम की जांच करने की आवश्यकता के बिना विश्वसनीय डेटा1 प्रस्तुत करने के लिए पर्याप्त है ।

हमारे अध्ययन में परिणाम को अधिकतम करने के लिए, यह नमूना तैयारी के दौरान अच्छी देखभाल करने के लिए महत्वपूर्ण था, ऊतक के संरक्षण के रूप में और संरचनाओं संरचनात्मक सुविधाओं का मूल्यांकन करने के लिए ही महत्वपूर्ण नहीं है, लेकिन यह भी हित के क्षेत्र की पहचान करने के लिए असंदिग्ध. एक निर्णायक कारक है, और शायद इस विधि का एक और दोष, यह है कि अल्ट्रा के एक उच्च गुणवत्ता-पतली वर्गों जोड़े की आवश्यकता है: कोई छेद या झुर्रियों कि अनुभाग के या तो में जांच के तहत क्षेत्र को कवर किया जाना चाहिए, और अनुभाग मोटाई होना चाहिए सजातीय बनाए रखा । शोधकर्ता को अत् तरक् ट्रोटॉमी में अच् छी तरह प्रशिक्षित किया जाना चाहिए । यह भी ध्यान रखना है कि जब धारा में अनुभाग इमेजिंग, इलेक्ट्रॉन बीम क्षति के लिए संवेदनशील है और आसानी से अलग आंसू कर सकते हैं । इसके अलावा, यह रॉय में नमूना क्षेत्रों की सही संख्या का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है । प्रायोगिक उद्देश्य पर निर्भर करता है, इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ के आवर्धन ध्यान से सेट किया जाना है । हमारे प्रयोगों के लिए विशेष रूप से, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में synapses गिनती, ३०.२५ μm2 के क्षेत्र के साथ एक वर्ग पर ब्याज के 20 क्षेत्रों इष्टतम हैं । यह सवाल में सुविधाओं को पहचानने में अच्छी तरह से कर्मियों को प्रशिक्षित करने की सलाह दी है (हमारे मामले synapses में, synapses सुविधाओं और DCV) विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए । Synapses की पहचान करने के लिए, synapses पीव पहचाने जाने योग्य होना चाहिए और इस के एक संकल्प की आवश्यकता है 10 एनएम. इसके लिए, 5000X का इज़ाफ़ा इष्टतम था, लेकिन यह ध्यान देने योग्य है कि इज़ाफ़ा इस तरह के कैमरों के प्रकार और स्थिति के रूप में हार्डवेयर मानकों पर निर्भर करता है और अंय माइक्रोस्कोप और के लिए अनुकूलित किया जा करने की आवश्यकता होगी/ यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रोटोकॉल एक TEM के लिए विशिष्ट अनुप्रयोगों का उपयोग करता है और अंय मॉडलों के साथ उपयोगकर्ताओं को सेटअप में मतभेदों पर विचार किया है ।

हमारा मानना है कि हमारे कार्यप्रवाह न केवल तंत्रिका विज्ञान में कई अंय अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, लेकिन जैविक विज्ञान और भी सामग्री विज्ञान के एक विस्तृत क्षेत्र में (जब एक TEM की उच्च संकल्प की जरूरत है) जब भी अनुसंधान प्रश्न एक व्यवस्थित वर्दी की मांग यादृच्छिक नमूना और नमूनों की मात्रा की जांच की जा विश्लेषण का एक समय कुशल तरीका के लिए पूछता है । उदाहरण के लिए, हम वर्तमान में मानव मस्तिष्क में आयरन स्टोर स्थानीयकृत में रुचि रखते हैं । इसके लिए, हमने हाल ही में अपने कार्यप्रवाह को अनुकूलित किया है, बेतरतीब ढंग से चुने गए क्षेत्रों में अल्ट्रा-थिन अनुभागों पर मौलिक विश्लेषण सक्षम करने के लिए । आदेश में अनुप्रयोगों है कि कार्यप्रवाह के लिए आवश्यक है की संख्या को कम करने के लिए, हम केवल SerialEM सॉफ्टवेयर का उपयोग कर लागू करने के उद्देश्य से, क्योंकि यह पूर्व के लिए चरण कदम क्रमादेशित किया जा सकता है सेट अंक है कि एक यादृच्छिक फैशन में चुना जा सकता है । हम पूरी तरह से कार्यप्रवाह automatizing के उद्देश्य से, TEM को नियंत्रित करने के लिए अनुकूलित लिपियों बनाया. यह फ़िल्टर्ड इमेजिंग मोड, जो संतोषजनक परिणाम नहीं उपज में autofocusing के अलावा संभव साबित कर दिया । हम इस प्रकार ध्यान केंद्रित करने के लिए और ऊर्जा फ़िल्टर्ड छवियों को प्राप्त करने के लिए डीएम सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया ।

सारांश में, हम सॉफ्टवेयर समाधान है कि एक निष्पक्ष तरीके से इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ प्राप्त करने में मदद वर्तमान ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

ऑस्ट्रिया के विज्ञान कोष, FWF, परियोजना संख्या पी २९३७० B27 द्वारा वित्त पोषित

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pentobarbital SigmaAldrich P3761
Formaldehyde Merck 1040051000 1kg
Glutardialdehyde Science Services E 16210 25%; 100ml; EM grade
cacodylate buffer Merck C4945 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate
Thionine acetate/Ceristain Merck 861340
acetic acid Merck 1000631000 1 L
Sodium hydroxide Merck 1064951000 1 kg, pellets
osmium tetraoxide Science Services E 19110 10x1g
TAAB embedding resin Science Services TAT001 500g
DMP-30 Science Services TAD024 100g
DDSA Science Services TAD025 500g
Uranyl acetate dihydrate Plano GmbH 19481 depleted, 25g
Ultrastain 2 Leica 16707235 Lead citrate
Toluidine blue solution Agar Scientific AGR1727 10g
Pioloform Plano GmbH R1275 10g Powder
Proylenoxide SigmaAldrich 82320-1L 1L
DPX embedding medium Plano GmbH R1320 embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml
Vibratome, Leica VT 1000 Leica Microsystems, Vienna, Austria
Leica Ultracut UCT, ultramicrotom Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Tecnai G2 20 FEI,Eindhoven, Netherlands
Megaview wide angle camera Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany
US 1000 digital camera Gatan, Pleasanton, USA
TEM Imaging Analysis Software FEI,Eindhoven, Netherlands
FEI Serial Section Software FEI,Eindhoven, Netherlands
Fiji, ImageJ 1.52e National Institute of Health, USA
SPSS 20.0 SPSS Inc., Chicago, IL, USA
SerialEM Regents of the University of Colorado
RPS (random point sampling) software 0.9a custom-made
Disector v1.0.2 (ImageJ macro) custom-made
EFTEMSerialEM (SerialEM script) custom-made

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Howard, V., Reed, M. Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. , BIOS Scientific Publishers. Oxford. (1998).
  2. Nakamura, H., Kobayashi, S., Ohashi, Y., Ando, S. Age-changes of brain synapses and synaptic plasticity in response to an enriched environment. Journal of Neuroscience Research. 56 (3), 307-315 (1999).
  3. Landers, M. S., Knott, G. W., Lipp, H. P., Poletaeva, I., Welker, E. Synapse formation in adult barrel cortex following naturalistic environmental enrichment. Neuroscience. 199, 143-152 (2011).
  4. Reichmann, F., et al. A novel unbiased counting method for the quantification of synapses in the mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 240, 13-21 (2015).
  5. Reichmann, F., et al. Environmental enrichment induces behavioural disturbances in neuropeptide Y knockout mice. Scientific Report. 6, 28182 (2016).
  6. Mayhew, T. M. Taking Tissue Samples from the Placenta: An Illustration of Principles and Strategies. Placenta. 29, 1-14 (2008).
  7. Ferguson, S., Steyer, A. M., Mayhew, T. M., Schwab, Y., Lucocq, J. M. Quantifying Golgi structure using EM: combing volume-SEM and stereology for higher throughput. Histochemistry and Cell Biology. 147, 653-669 (2017).
  8. Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. Journal of Microscopy. 134 (2), 127-136 (1984).
  9. Gundersen, H. J., et al. The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (10), 857-881 (1988).
  10. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier/Academic Press. (2008).
  11. Lewis, P. R., Knight, D. P. Staining Methods for Sectioned Material. , Elsevier/North-Holland Biomedical Press. (1988).
  12. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J Struct Biol. 152 (1), can be downloaded from http://bio3d.colorado.edu/SerialEM 36-51 (2005).
  13. Rampon, C., Tang, Y. P., Goodhouse, J., Shimizu, E., Kyin, M., Tsien, J. Z. Enrichment induces structural changes and recovery from nonspatial memory deficits in CA1 NMDAR1-knockout mice. Nature Neuroscience. 3 (3), 238-244 (2000).
  14. Xu, X., Ye, L., Ruan, Q. Environmental enrichment induces synaptic structural modification after transient focal cerebral ischemia in rats. Experimental Biology and Medicine. 234 (3), 296-305 (2009).
  15. Lonetti, G., et al. Early environmental enrichment moderates the behavioral and synaptic phenotype of MeCP2 null mice. Biological Psychiatry. 67 (7), 657-665 (2010).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक १४६ Disector निष्पक्ष नमूना इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्वचालित कार्यप्रवाह मौलिक विश्लेषण न्यूरोनल ultrastructure पर्यावरण संवर्धन
तंत्रिका विज्ञान में नमूना TEM के एक निष्पक्ष दृष्टिकोण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wernitznig, S., Reichmann, F., Sele, … More

Wernitznig, S., Reichmann, F., Sele, M., Birkl, C., Haybäck, J., Kleinegger, F., Birkl-Töglhofer, A., Krassnig, S., Wodlej, C., Holzer, P., Kummer, D., Bock, E., Leitinger, G. An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience. J. Vis. Exp. (146), e58745, doi:10.3791/58745 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter