Summary
Introduserer vi en ny arbeidsflyt for elektronmikroskop undersøkelser av hjernevev. Metoden tillater brukeren å undersøke neuronal funksjoner på en objektiv måte. For grunnleggende analyse presenterer vi også et skript som automatisk de fleste av arbeidsflyten for randomisert prøvetaking.
Abstract
Undersøkelser av ultrastructural funksjoner av nevroner og deres synapser er bare mulig med elektronmikroskop. Spesielt for komparative studier av endringene i tettheter og distribusjoner av slike funksjoner er en upartisk prøvetaking protokoll avgjørende for pålitelige resultater. Her presenterer vi en arbeidsflyt for bildeopptak av hjernen prøver. Arbeidsflyten kan systematisk uniform stikkprøvekontroll innenfor et definert hjernen område, og bildene kan analyseres ved hjelp av en disector. Denne teknikken er mye raskere enn omfattende undersøkelse av seriell deler, men fortsatt presenterer en mulig tilnærming for å beregne tettheter og distribusjoner ultrastructure funksjoner. Før embedding, ble farget vibratome deler brukt som referanse for å identifisere hjernen regionen under etterforskning, som hjalp fremskynde samlede prøven utarbeidelsen prosessen. Denne tilnærmingen ble brukt komparative studier undersøke effekten av en beriket-bolig miljøet på flere ultrastructural parametere i musen hjernen. Basert på vellykket bruk av arbeidsflyten, tilpasset vi det for grunnleggende analyse av hjernen prøver. Vi optimalisert protokollen i form av bruker-interaksjon. Automatisere alle tidkrevende skritt ved å samle et skript for åpen kildekode-programvare SerialEM hjelper brukeren å fokusere på det viktigste arbeidet for grunnleggende kart. Som opprinnelige arbeidsflyten betalt vi oppmerksomhet til upartisk prøvetaking tilnærming garantere pålitelige resultater.
Introduction
I elektronmikroskop er det ofte utfordrende å prøve representative områdene i delene. Vi, partisk som observatør, ofte for å se på bestemte områder trukket oppmerksomme av iøynefallende funksjoner av prøven, hindre et godt fordelt, upartiske utvalg. Prøvetaking skjevhet kan bare unngås hvis alle deler av regionen rundt får samme mulighet for å havne i en elektron mikroskop-bilde1. Det er mulig å unngå prøvetaking bias uten en programvareløsning, for eksempel ved å trykke styrekulen av mikroskopet manuelt uten å se på bildet, slik som å velge prøvetaking regioner hvor scenen stopper. Men dette er strengt tatt ikke en tilfeldig prosedyre, fordi, bevisst eller ubevisst, brukeren kan ha innflytelse på bevegelsen av scenen, og videre, dette er ikke en sofistikert måte for å velge prøvetaking regioner. Stikkprøvekontroll blir spesielt viktig hvis parene deler brukes til å vurdere hvor mange strukturer i et bestemt volum, for eksempel for stereology1, som krever par seksjoner, en kjent avstand. Det vil også være mulig å se bare på ett enkelt avsnitt og beregne antall spesifikke strukturer2, men med denne tilnærmingen etterforskere pleier å overvurdere numeriske tettheten av større strukturer, med mindre strukturer er svært små i sammenligning til snittykkelsen. Alternative tilnærminger er å rekonstruere volumer av føljetong deler og dermed få ønskede data3. Men dette er svært tidkrevende og ikke en mulig tilnærming for (større) komparative studier.
For å overvinne disse problemene, har vi utviklet en arbeidsflyt som gjør forskeren automatisk velge eksempler for å få elektron micrographs til regelmessig mellomrom i ultra tynne snitt. De elektron micrographs er tilfeldig, slik at upartiske prøvetaking. Tilnærmingen er egnet både for å fastslå numeriske tettheter av strukturer (for eksempel synapser innenfor et bestemt neuropil volum4,5), og dimensjonene på strukturelle funksjoner (for eksempel bredden på den synaptiske kløften, eller diameteren til postsynaptic tetthet4,5).
Arbeidsflyten bruker en skreddersydd tilfeldig punkt prøvetaking (RPS) programvare (skrevet i Java script bruker skripting-programvaren som følger med vår mikroskop) som automatisk beregner rutenettet stillinger innenfor et forhåndsdefinert område av interesse i en ultratynn del. RPS programvaren flytter scenen av elektronmikroskop til disse forhåndsdefinerte poeng, slik at et elektron mikroskop-bilde gjøres på hvert punkt. Først definerer du et område av interesse i delen tynn. Deretter beregner programmet RPS rutenettet stillinger i denne regionen. X / y koordinatene til første posisjon opprettes tilfeldig, og de gjenværende stillingene er plassert på regulært rutenett intervaller i forhold til første posisjon. Fordi alle deler av regionen rundt har samme sjanse til undersøkt, gir dette minimalt datainnsamling. Denne tilnærmingen av prøvetaking kalles også systematisk uniform stikkprøvekontroll (se referanser6,7 for mer informasjon).
For å bestemme de numeriske tettheter av strukturer, arbeider vi med parene deler som er en kjent avstand. Etter innhente et elektron mikroskop-bilde fra den første delen i en av de forutbestemte stillingene, flyttes TEM føljetong delen programvare (del av programvarepakken leveres med våre elektronmikroskop) til et tilsvarende punkt i den andre delen, for å få et elektron mikroskop-bilde av den tilsvarende plasseringen. Dette gjentas for hver plassering i forhåndsbestemte rutenettet. I vår tilnærming, en disector til å telle antall partikler i hvert par av elektron micrographs8,9. En disector består av et par counting rammer, én for hvert avsnitt8,9. Numerisk tettheten av objekter bestemmes bare telle objekter vises på den første delen (eller referansedelen) men ikke på den andre delen (eller oppslag delen). Kan beregne de numeriske tettheter av objekter i en rask og effektiv måte8,9. I tillegg på enkelt deler, kan todimensjonal strukturfunksjonene måles.
Vi har brukt denne arbeidsflyten klarer å vurdere forskjeller i synapse tall prefiks mus utsatt for berike omgivelsene (EE) boliger forhold sammenlignet med standard miljø (SE) boliger forhold4,5, og også for å evaluere ultrastructural forskjellene mellom wild type (WT) mus og neuropeptide Y (NPY) KO mus holdt under SE og EE5. Målet vårt var å se spesielt på strukturelle funksjoner av neurons, som numeriske synaptic tetthet, lengdene av aktive sonen i tverrsnitt og postsynaptic tetthet, bredden på den synaptiske kløften og antall synaptic blemmer, for å vurdere endringer i neuronal tilkobling og aktivisering mellom forskjellige eksperimentelle forhold. I tillegg var vi interessert i numerisk tettheten av tett kjerner blemmer (DCV) i neurons å bestemme mengden av lagrede neuropeptides i et bestemt område i hjernen.
Basert på suksessen til vår tilnærming for studiene beskrevet ovenfor, i vår neste trinnet har vi tilpasset vår arbeidsflyt for å merke områder for upartiske elementær analyser i menneskelige hjerne prøver. Dette ble gjort til bildet jern, som er lagret i ferritin molekyler i både neurons og gliacellene. For dette samlet vi et skript som tillot oss å automatisere det meste av driften for en tilfeldig screening-prosess av hjernen inndelinger i et definert område.
Protocol
Alle eksperimentene ble godkjent av en etisk komité på føderale departementet for vitenskap og forskning av Republikken Østerrike (BMWF-80.104/2-BrGT/2007 og BMWF-66.010/0037-II/3b/2013), eller etikk provisjon av det medisinske universitet av Graz nummer 28-549 ex 15/16 og gjennomført i henhold til direktivet for europeiske fellesskap råd 24 November 1986 (86/609/EEC) og direktivet av Europaparlamentet og rådet av 22 September2010 (2010/63/EU). Dyreforsøkene ble utformet og utført slik at antall dyr som brukes ble minimert.
1. disseksjon og fiksering av vev
- Euthanize mus (21 ukens gamle, kvinnelige C57BL/6J mus og C57BL/6N mus; mannlige WT og NPY KO mus på en blandet C57BL / 6:129 / SvJ (1:1) bakgrunn henholdsvis) ved å injisere 150 mg/kg pentobarbital intraperitoneally.
- Fjern hjernen fra skallen og umiddelbart halvert dem (skille venstre fra høyre halvkule) - ved hjelp av en skalpell.
- Umiddelbart plassere halvdelene i Glassbeholdere med 2% formaldehyd og 2,5% glutaraldehyde i 0.1 M cacodylate buffer (CH3)2AsO2Na·3H2O, pH justert 7,4 med 1 M NaCl), pH 7.4 på 4 ° C.
Advarsel: Fiksativene er giftige og bør håndteres med stor forsiktighet. Bruk bare med vernehansker og under avtrekksvifte. - Fikse hjernen halvdelene i 2 dager på 4 ° C og skyll i samme bufferen for minst 24 h, også på 4 ° C. Volumet av bufferen bør være om tidoblet prøven volumet.
2. Identifiser regionen rundt i hjernen ved å sammenligne Vibratome seksjoner med referanse inndelinger fra musen hjernen Atlas10
- Plass prøven hjernen på en vibratome. Sikre at retningen av hjernen er riktig (i dette tilfellet en koronale orientering ble valgt for hippocampus).
- Trim til regionen rundt (ROI) i hjernen. Kutte delene på en stor tykkelse (f.eks., 100 µm) til delen av hjernen med regionen rundt nås og kaste bort hver seksjon.
- Begynn å kutte delene vibratome med 20 µm tykkelse fra begynnelsen av hjernen med Avkastningen og plasserer delene vibratome på et glass lysbilde. Stain dem (Nissl flekk) ved å plassere inndelingene i 0,05% thionine acetate i natrium acetate buffer, pH 4.2 for 1 min (figur 1Ai).
- Sammenligne delene beiset med musen hjernen atlas bruker lys mikroskop og fortsette å kutte og flekker til ønsket hjernen koordinatene er nådd.
3. få en eksempelområdet for innebygging
- Så snart rett område er identifisert, starte kutte en del på 150 µm tykkelse med vibratome.
- Microdissect denne vibratome delen med et barberblad under stereo mikroskop. Klippe bort til deler rundt Avkastningen. Delen må ha en størrelse følgende forberedelsene for overføring elektronmikroskop (TEM) (ikke større enn 1 x 1 mm2).
4. TEM forberedelse - Embedding, ultratynne snitting og flekker
- Innebygging
- Etter-posisjonsavlesning 2 h i 2% osmium tetroxide ved romtemperatur (RT). Bruk et dekke prøven med minst 10 ganger prøven volumet, men unngå å bruke overflødig bindemiddel for å forhindre unødvendig giftig avfall.
FORSIKTIG: Osmium tetroxide er svært giftig og bør håndteres med stor forsiktighet. Bruk bare med vernehansker og under avtrekksvifte. - Tørke med EM Grade alkoholer i trinn på 20 min. Bruk et større volum enn i forrige trinn (50%, 70%, 80%, 96% og 100% etanol).
- Plasser i propylen oksid for 40 min på rett sted i en blanding av propylen oksid/innebygging harpiks (1:2) for 2t på RT og 1:3 overnatting på 4 ° C.
FORSIKTIG: Propylen oksid er svært giftig og bør håndteres med stor forsiktighet. Bruk bare med vernehansker og under avtrekksvifte. - Bygge inn prøvene i 100% harpiks ved å endre harpiks 2 ganger etter 60 minutter og en gang etter 90 min (alle på 45 ° C).
- Endelig sett prøvene i riktig formene og la harpiksen danner ved 90 ° C for 3 dager (figur 1Aii).
- Etter-posisjonsavlesning 2 h i 2% osmium tetroxide ved romtemperatur (RT). Bruk et dekke prøven med minst 10 ganger prøven volumet, men unngå å bruke overflødig bindemiddel for å forhindre unødvendig giftig avfall.
- Trimming og Sectioning på en ultramicrotome.
- Trim blokken, at sidene er så glatt som mulig i deler å følge hverandre (figur 1Aiii).
- Produsere 55 nm ultratynne føljetong deler (skal være sølv grå) bruker en ultramicrotome. Bruke et spor rutenett (sporbredde 1 x 2 mm) belagt med pioloform (figur 1Aiv).
- Counterstain ultra tynne snitt på sporet rutenett med 2% uranyl acetate for 30 min og bly citrate for 30 s på RT (dette er standard elektronmikroskop metode11).
FORSIKTIG: Uranyl acetate er svært giftig og direkte kontakt bør unngås. Håndtere bare med vernehansker. Bly nitrat er giftig hvis svelging eller inhalert og bør håndteres med stor forsiktighet.
5. imaging tilsvarende ROIs på referansen og Look-Up deler på TEM med programvarepakker
- Undersøke delene på nettet med TEM bruker en lav forstørrelse (avhengig av størrelsen på delene) for retning, og å vurdere kvaliteten på delene.
- Start programvaren (en pakke med TEM analyseprogramvare, eller TIA, følger med mikroskopet) til å generere virtuelle bilder av deler ved å lagre hjørnepunkt delene. Som tillater programvaren å finne tilsvarende plasseringene til avkastning på hver del.
- Gå til delen og velger Sett inn til hjørnet poeng for delen referanse og look-up. Følg instruksjonene i popup-vinduet. Start med referansedelen og deretter fortsetter du med delen look-up. Kontroller at kantene i inndelingen som er parallell til neste punkt 1 og 2 (figur 1Bi) angis.
- Visualisere referansedelen under lav forstørrelse å identifisere områder av interesse og flytte mikroskop scenen bruker TIA på referansedelen til flere hjørnepunkt av Avkastningen for å lage en disposisjon av Avkastningen.
- Registrere koordinatene for resulterende polygon med RPS programvare. For dette, trykk Legg til koordinater i dialogboksen RPS programvaren på hvert punkt av polygon som trengs for å skissere Avkastningen i delen (figur 1Bii).
- Definere og angi en passende størrelse for prøvetaking områder og avstander mellom områder i RPS programvare (i presentert studien, prøvetaking områdene er 7 µm og avstanden mellom dem er 20 µm, resulterer i minst 20 prøvetaking områder innenfor det ROI). Trykk Beregne Raster, deretter programvaren genererer prøvetaking området koordinater i en systematisk uniform tilfeldig måte for den mikroskop-bilde stillinger innen polygon (figur 1Biii).
Merk: For en bedre orientering polygonen og prøvetaking områdene i polygonet kan vises av RPS (figur 1Biv).
- Lagre prøvepunkter på delen referanse og look-up bruke RPS programvare og TEM føljetong delen programvare. Dette er koordinatene til montasjer som er registrert etter11.
- RPS programvaren, trykk gå til neste posisjon til å flytte mikroskop scenen til x / y koordinatene til hver prøvetaking området i referanse seksjonen. Gå til plasseringen og sette inn importere disse koordinatene i programvaren i referanse seksjonen. Gjenta dette for alle koordinater.
- For å gjenspeile koordinatene i referansedelen til delen look-up, gå til delen og trykker gå til delen. Angi antall delen look-up (vanligvis 2) i dialogboksen.
- Bytte mellom delen referanse og look-up som beskrevet før for opptak av montasjer (se neste trinn), og endre plasseringen på referansedelen med beliggenhet og gå til nummer. Velg neste koordinat i dialogboksen.
- SerialEM-montasjer på hver prøvetaking koordinere, gå til fil og velger Ny Montage fra det miste-ned menyen. Velg riktig antall fliser og prosenten overlapping i dialogboksen. Til stede studere, en forstørrelse på 5000 X er tilstrekkelig til å gjenkjenne synaptic funksjonene under studie, men begrenset synsfelt av CCD kameraet nødvendig å lage montasjer av 2 x 2 bilder. Montasjer er laget med SerialEM.
- Før innspillingen hver montasje, justere fokus (eller, hvis mulig, aktivere alternativet autofokus i innspillingen programvare). Velg mappen du vil lagre filen montasje og start innspillingen av montasjen ved å trykke Start i undermenyen montasje til venstre i SerialEM.
6. analysere TEM bildene med ImageJ til dokumentet Ultrastructural funksjoner.
Merk: For dette er det viktig å skape en justert bildestakk fra delen referanse og look-up.
- Konverter bildet-parene med ImageJ bilder til stakken til en stakkfilen og justere bildene med StackReg (må installeres fra BIG-EPFL http://sites.imagej.net/BIG-EPFL/; i den foreliggende sak, algoritmen Affine var brukes). For å få de numeriske tettheter på mobilnettet strukturfunksjonene, genererer skreddersydde ImageJ makroen Disector en opptelling-ramme med en størrelse på 5,5 x 5,5 µm plassert tilfeldig over bildet med en tilfeldig vinkel.
- Starte en makro Disector (plassering i ImageJ menyen avhenger av katalogen der det er lagret), og Definer parameterne (størrelse counting rammen antall segmenter) som nødvendig (figur 1Cii).
- Telle antall synapse/µm2 bruker Disector. Telle alle synapse i counting rammen som vises i referansedelen, men ikke synlig i delen oppslag. Utelat de synapser som snitter det to 'forbudt linjer"av disector; Men teller synapser på motsatt "aksept linjer". Til dette bruker du Multipoint verktøy i Toolsbar i ImageJ (figur 2A, figur 2B).
- For å måle synapse parametere, velger du bare synapser med synaptic leppe i tverrsnitt (på referansedelen, i samme delbildene brukes for disector).
- Starte plugin ObjectJ i ImageJ fra det miste-ned menyen (figur 2A) via Plugins | Analysere. Åpne et nytt prosjekt fra dialogboksen ObjectJ rullegardinmenyen. Dette åpner et vindu som lar brukeren disposisjon og merke strukturer med Markør verktøyet (figur 2B, rød sirkel). Synaptiske parameterne som brukes for eksperimenter som presenteres her er beskrevet i fremgangsmåten nedenfor.
- Måle lengden på presynaptic membranen og postsynaptic tetthet lengde ved å tegne en linje langs strukturen Markør verktøyet (figur 2B, rød sirkel).
- Få mener bredden på den synaptiske kløften ved å tegne en polygon dekker både før og postsynaptic membranen, med rett parallelle sider og en segmentert linje midway, equidistant for både membraner.
- For å bestemme antall forankret blemmer, telle alle blemmer som har en maksimal avstand fra presynaptic membranen av en vesicle diameter eller mindre.
- For å bestemme antall frakoblet blemmer, Tell de blemmer med maksimal avstand på en vesicle diameter fra forankret eller andre frakoblet blemmer på samme synapse.
7. produsere semi tynne snitt for lys mikroskopi til dokumentet makroskopisk funksjoner (i den foreliggende sak hvor celle) innenfor samme Avkastningen som valgt for TEM etterforskningen.
- Umiddelbart etter klipping delene ultratynne for TEM, cut to semi tynne snitt, 0,5 µm tykk og umiddelbart ved siden av hverandre. Plasser på et glass lysbilde og stain dem med 0,5% toluidine blå løsning. Plass en cover slip på delene (med DPX montering medium, som består av distyrene, plasticizer (tricresyl fosfat) og xylen). Disse to inndelinger brukes til å telle celle tall.
- Fotografere semi tynne snitt ved lav forstørrelse med lys mikroskop.
Merk: Strukturer under etterforskning må identifiseres i bildene. I studien, ble 20 X forstørrelse brukt til å identifisere cellen legemer. Eventuelt flere bilder vi sammen med en bildebehandling. - Justere parene av to påfølgende semi tynne snitt med en bildebehandling (f.eks., ImageJ).
Merk: Forskjeller rotasjon og størrelse (kan oppstå på grunn av komprimering gjenstander introdusert av snitteprosessen) skal justeres for en perfekt overlegg av de to delene. - Marker grensen til Avkastningen på * lys bildet. Avkastningen må tilsvare Avkastningen brukes for TEM bilder. For dette formålet, laste bildene i ImageJ og velger polygon valget Toolsbar (figur 2A).
- Generere et rutenett over hele bildet med ImageJ ved å åpne analyser | Verktøy | Rutenett og sette parametre etter behov.
- Beregne areal og volum av polygonen fra antall punktene i området av interesse og delen tykkelse (volum = NCS * enGS * hST ; NCS = telles Cross seksjoner; EnGS = Rutenettstørrelse; hST = snittykkelsen).
- Telle antall kjerner fra neuronal cellen legemer i Avkastningen hvis de finnes bare på ett avsnitt. Velg Multipoint i ImageJ fra Toolsbar og merke cellene. Etter teller cellene i hver del, beregne antall celler per volum (
; Ctetthet = celle tetthet; Cantall = celletall). - Registrere alle målingene i vinduet ObjectJ resultater (figur 2C). Eksportere og lagre dem for videre bruk.
; Ctetthet = celle tetthet; Cantall = celletall).8. Bruk SerialEM skriften å optimalisere grunnleggende analyse i hjernen prøver i kombinasjon med DigitalMicrograph (DM, leveres med avbildningsfilter).
- Tuning Imaging Filter (GIF).
- Laste inn prøven i TEM og gå til et hull i utvalget for GIF tuning bruke styrekulen eller styrespaken av mikroskopet.
- Bytte til Energi filtrert TEM (EFTEM) i DM programvare/eller DM og velg CCD kamera i DM.
- Velg forstørrelsen for grunnleggende analyse (forstørrelsen avhengig struktur/området av interesse, i denne saken forstørrelsen satt fra 76 k opptil 125 kb). Angi eksponeringstid til 0,001 s og start visning.
- Fokusere strålen nøye til kantene kan bli sett og senter bjelken på bildet. Reduser C2/den objektive blenderåpning til kantene av blenderåpningen er synlig og senter strålen med styrekulen for strålen.
- Defokus strålen (rundt C2 46.2%, eksponeringstid for tuning bør være rundt 0,05 s) og finne null tap toppen (ZLP) ved å trykke knappen ZLP . Begynn tuning ved å trykke knappen Full melodi .
- Få tilfeldige punkter av oppkjøpet.
- Gå tilbake til TEM imaging modus og velg kamera og sjekke fokus ved forstørrelse 10 k (justere z og sett defokus til null).
- Velg LM 75 X forstørrelse og sjekk hvis kameraet ikke er satt inn (ellers det kan ikke styres av SerialEM programvare).
- Start SerialEM og åpne et nytt prosjekt.
- Åpne navigatøren. Kontroller innstillingene for kameraet i kamera og skript kontroller (for visning og post) og start visning (kameraet settes automatisk).
- Gjøre et hjørne kart i delen ultratynn, velge legge til punkter i Navigator vinduet.
- Angi hjørnet peker på kantene til en ultratynne delen. Flytte scenen til et hjørnepunkt ved å holde nede høyre-mus-tasten. Når et hjørne av delen er nådd, kan du legge til et hjørnepunkt med venstre-museklikk. Gjenta denne fremgangsmåten for å legge til 3 mer hjørnepunkt. Kontroller at i navigator vinduet boksen C for hjørnepunkt er billett for lagrede poeng.
- Starte hjørne montasjen (fortrinnsvis ved forstørrelse LM 75), gå til Navigator i SerialEM-menylinjen og velg Montaging & rutenett og Oppsett hjørne Montage fra det miste-ned menyen.
Merk: Best passende innstillinger for de valgte posten parameterne vises. Endre dem om nødvendig. I denne saken ble bare overlappingsprosenten endret til 20%.
- Skissere delen/Avkastningen på montasje bildet. Velg Legge til Polygon i navigator vinduet og kontur inndelingen med flere høyre-museklikk. Velg Legg til rutenettet poeng i rullegardinmenyen navigator og definere en avstanden mellom punktene (avstanden avhenger det eksperimentelle spørsmålet; f.eks., 10 µm, Figur 3).
- Følg skriptkommandoene. Angi punktene som vist i navigator og angi oppkjøpet poeng (f.eks., 20).
- Sett belysning terskel slik at skriptet kan unngå rutenettet barer. Følg skriptkommandoene og flytte scenen for manuelt å dekke synsfelt av en fjerdedel med rutenett-bar. Ifølge verdien som vises, angi en terskelverdi for belysning (skal være høyere enn verdien som vises).
- Vent til poengene for oppkjøp er valgt og matlaging rutinen er ferdig.
Merk: Dette lang tid og kan være over natten; skriptet sender mikroskopet til standby etter matlaging rutinen; matlaging rutinen er viktig å stabilisere avsnittene i elektronstråle.
- Energi filtrert TEM (EFTEM) grunnleggende analyse
- Velg EFTEM modus i TIA/DM og velg CCD kamera i DM.
- Midtstiller strålen og følge skriptkommandoene som vil flytte scenen til hver prøvetaking koordinat.
Merk: Brukeren blir spurt hvis scenen skal flyttes til neste koordinat. - Juster null tap toppen (ZLP) og angi C2 til ~ 46.2%.
- Angi energien på 60 eV (i dette tilfellet verdien angis for påvisning av Fe M-kanten), splitt 10 eV og eksponering tid på 0,4 s. Sett inn slit og sette C2 til ~ 43.9%.
- Starte visningen og fokus bildet.
- Angi C2 til 46.2%, justere ZLP og sette C2 til 43.9%.
- Tilegne seg grunnleggende kart med grunnleggende innstillinger.
Merk: Standardinnstillingene kan brukes i dialogboksen oppkjøpet, men det anbefales å teste disse på forhånd, dersom det er mulig; eksempel filtrert bilder er vist i Figur 4. - Angi C2 til 46.2% og få tykkelse kart.
- Gjenta for alle bestemt oppkjøpet poeng (trinn 8.3.2-8.3.12).
- Følg instruksjonene i skriptet og få ett elektron micrographs eller montasjer av oppkjøpet poeng. Velg forstørrelsen slik at all (ultra-) strukturelle informasjon er synlig/identifiserbar.
- Lagre filen, navigator og resultatvinduet og fjerne slit.
- Lukke ventilen, fjerne prøven og stenge TEM.
Representative Results
Her beskriver vi en arbeidsflyt for å velge områdene for TEM i en automatisk og objektiv måte. Brukeren velger området av interesse i en ultratynn under TEM og bruker flere programvareløsninger for arbeidsflyten inkludert våre RPS programvare som automatisk beregner koordinatene til 20 prøvetaking områder innenfor området interesse. Deretter er TEM scenen flyttet til områdene prøvetaking for fotografering. Dette er mulig både for analysere enkelt deler og analysere par seksjoner, kjent avstand fra hverandre, som tillater å velge områder for imaging uten bias etterforsker.
Denne arbeidsflyten vist seg verdifulle når dokumentere ultrastructural funksjoner i musen hjernen deler4,5. I disse studiene, ble polymorph celle laget av dentate gyrus (DGpl) undersøkt som et område av interesse. Vår metode viste egnet for å undersøke DG, fordi en koronale del av det dorsal DG (Bregma −1.3) passer til en ultratynne delen og hans disposisjon blir lett gjenkjent på lav forstørrelse. Hvis andre områder av hjernen var undersøkes, ville det være viktig å sjekke deres størrelse og kjennetegn før du planlegger eksperimenter.
Bruke arbeidsflyten beskrevet her viste at EE bolig øker bredden på den synaptiske kløften betydelig i DGpl4, i forhold til standard boforhold. Videre ble antall tett kjernen blemmer betydelig redusert i holder til EE dyr4, som angir endringer i husholdningen til neuropeptides. Når WT og NPY knockout mus ble holdt under EE forhold, økt antall nevroner/µm³ i DGpl mens tettheten av DCV redusert i forhold til SE-bolig5. Derimot resulterte NPY knockout i en betydelig økning av synaptic blemmer i reservatet bassenget (frakoblet synaptic blemmer) uavhengig av boliger forhold5. Effekten av EE bredden på den synaptiske kløften ble reversert i gruppen NPY KO resulterer i en betydelig forskjell mellom EE plassert WT og NPY KO mus5. Tatt sammen med atferdsmessige studier av WT og NPY holdt knockout dyr under begge typer boforhold, angir en avgjørende rolle i NPY for nevrobiologiske virkningene av EE5.
For å visualisere jern lagret i hjernen, ble et skript kompilert for SerialEM programvare til tilfeldig poeng av oppkjøpet fra i en helt ultrathin del, med sikte på å skaffe en energi filtrert elektron mikroskop-bilde på hvert av disse punktene . Etter lasting delen i elektronmikroskop, skriptet utføres stabilisering av delen (dvs., 'prøven kjøkken' rutine) over natten. Skriptet deretter valgt tilfeldig et antall poeng forhåndsdefinerte av brukeren fra de merket med en rist i Figur 3. Ved å produsere en test mikroskop-bilde og sjekke sin gråtoner, sjekket skriptet hvis valgte punktene ble plassert på en synlig del av delen avvise punktene som landet på rutenettet barer. De fleste av arbeidsflyten ble utført av skriptet med minimal medvirkning av brukeren. Men var det ikke mulig å registrere automatisk energi filtrert micrographs (med dette oppsettet), som det var for lite lys for autofocus rutinemessige SerialEM. Derfor byttet vi til DM programvare så snart skriptet hadde flyttet scenen til hvert punkt justert fokus for hånd, og gjorde et EFTEM bilde av jern. Et eksempel for en EFTEM jern bilde fra post mortem menneskelige hjerne er vist i Figur 4.
Figur 1. Illustrasjon av arbeidsflyten. (A) de viktigste trinnene for eksempel utarbeidelsen vises (i pilens retning): vibratome inndelinger (i), embedding(ii), kutte semi tynn og ultra-tynne deler (iii), og fange par ultra tynne snitt på kobber rutenett (iv). (B) bruk av både mikroskop leverandørens programvare og skreddersydde RPS programvare å lage prøvetaking området koordinater som bestemmer webområdene opptak. Hjørnepunkt delene lagres i mikroskopi programvaren og Avkastningen er skissert (identifisert ved hjelp av delene semi tynn) (i); et rutenett av prøvetakingen områder er generert over Avkastningen, en tilfeldig forskyvning (rød pil) er innført i x og y. Skiftet er mindre enn avstanden mellom prøvetaking områdene, (svart piler), slik at i stedet for de svarte firkantene, som har ingen SKIFT, blå rutene som flyttes tilfeldig, brukes til å fastsette webområdene opptak (ii); bare prøvetaking områder innenfor grensene til Avkastningen (trukket som svart og blå firkanter) brukes for opptak. Micrographs gjøres både i referansedelen (svarte firkanter) og tilsvarende steder i delen oppslag (blå ruter) (iii). (C) et mikroskop-bilde gjøres i hvert utvalg område på en tilstrekkelig forstørrelse; en montasje som består av flere flettede bilder gjøres om nødvendig (i dette tilfellet, 2 x 2 bilder ble flettet sammen) (i); en opptelling ramme genereres og vises som et overlegg i bildet, strukturer i rammen og på "aksept linjer' (stiplede rammen linjer) vil telles, men ikke de på"forbudt linjer' (solid ramme linjer) (ii). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Måle ultrastructural parametere på et par ultra tynne snitt med en upartisk counting ramme. (A) oversikt over ImageJ windows brukes for maskintelling og analysere cellulære strukturer. Venstre siden viser den elektron mikroskop-bilde med opptelling ramme som et overlegg. Høyre side: ImageJ brukergrensesnittet (blå rektangel) med det miste-ned menyen (øverst) og verktøylinjen (nedenfor); redigeringsprogrammet for ObjectJ (grønn rektangel); ObjectJ verktøy -vinduet (oransje rektangel) der du kan velge verktøy for måling og ObjectJ resultatvinduet (svart rektangel) hvor alle målingene er dokumentert. (B) detaljer en vises de merkede synapser på elektron mikroskop-bilde (synapser på begge deler - piler, synapse på oppslag delen-pilspisser). De er merket med multipunkt-verktøyet (rød sirkel) på verktøylinjen i ImageJ. (C) navn og måle parametere synaptic funksjonene er definert ved hjelp av ObjectJ verktøy. Markør-verktøyet og funksjonen av interesse er valgt og disposisjonen trukket i bildet av venstre-museklikk langs strukturen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Velge prøvetaking områder for grunnleggende kartlegging i en avkastning for energi filtrert overføring elektronmikroskop. SerialEM brukes til å velge et område av interesse og foreslå et høyt antall prøvetaking områder på en regelmessig mellomrom (rosa krysser i bilder A og B). Et skript velger deretter tilfeldig prøvetaking områder (fra disse forhåndsdefinerte koordinater) for oppkjøpet. Prøvetaking områder med dårlig belysning forkastes for å unngå rutenettet barer og skriptet stopper 20 godt opplyst prøvetaking områder har blitt valgt i Avkastningen. (A) oversikt over hele området rundt, omgitt av en polygon, med et høyt antall mulige prøvetaking områder merket med X. (B) detaljer en viser prøvetaking områdene før tilfeldig utvalg. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Eksempel på grunnleggende kart (EFTEM) Kjøp. (A) lyse feltet TEM mikroskop-bilde av området rundt oppkjøpet punkt. En tilfeldig valgt området ble brukt til å få en grunnleggende kart og er merket med et svart rektangel. (B) EFTEM pre kanten vinduet bilde laget i tilfeldig valgte området. (C) EFTEM etter kanten vindu bildet på samme område. (D) grunnleggende kart over jern i samme området (M-edge). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Arbeidsflyten presenteres her gjør forskeren å få data om ultrastructural funksjoner på en objektiv måte. Dette er mye mindre tidkrevende enn volum undersøkelser fra føljetong deler. Flere forskjellige programmer brukes til å oppnå dette målet. Først brukes vår skreddersydde RPS -programvare (for detaljer om tilgjengelighet, vennligst kontakt tilsvarende forfatteren) til å introdusere en tilfeldig scenen-shift for å velge prøvetaking området koordinatene. Dette gir en systematisk uniform stikkprøvekontroll av Avkastningen. Deretter for telling av spesifikke strukturer, vi tilpasset metoden disector hvor 2 etterfølgende avsnittene med kjent distanse sammenlignes, i en ny måte i forhold til tidligere studier13,14,15 som vi brukte vår skreddersydd RPS programvare for systematisk uniform stikkprøvekontroll. Dette sparer tid i forhold til 3D-rekonstruere hele volumer fra føljetong deler. Skreddersydd RPS programvaren er spesielt utviklet for én type mikroskop som er en begrensende faktor for gjengivelse arbeidsflyten. Et alternativ fra denne bestemte programvare ville være et program som kan og er kompatibel med andre mikroskop modeller.
Vi benyttet ble denne tilnærmingen for våre komparative studier4,5. Ultra tynne snitt av neuronal vev, området av interesse ble skissert og bilder ble tatt av systematisk uniform stikkprøvekontroll innenfor dette området. Det må bemerkes at området av interesse, det polymorph laget av dentate gyrus, er et ganske lite område å undersøke som kan være gunstig for vår tilnærming. En tilfeldig plassert disector, vi vurdert antall DCV og flere ultrastructural funksjoner i synapser i DGpl av voksen mus ligger i SE og EE samt voksen WT mus versus voksen NPY knockout mus. De innsamlede dataene bruker vår tilnærming, og viste endringer i noen av parameterne undersøkt. Disse funnene bekreftet de fra andre lignende studier i juvenile dyr2.
En ulempe av eksperimentell bruk av arbeidsflyten kan være at denne multi-application-tilnærmingen ikke er ideell når det gjelder brukervennlighet, brukerne trenger å bli komfortabel med forskjellige brukergrensesnitt (i vårt tilfelle, brukergrensesnittet, TEM føljetong delen RPS programvaren og SerialEM programvare). Lære å håndtere alle programmer på en effektiv måte er tidkrevende og bør tas i betraktning. Investere tid i å lære å bruke denne arbeidsflyten er imidlertid fortsatt tydelig gunstige over tid som er nødvendig for å analysere hele volumer med føljetong delen TEM. Metoden med å bruke en disector plassert ved systematisk uniform stikkprøvekontroll i området rundt er tilstrekkelig å presentere pålitelige data1 uten behov for å undersøke en høy mengde deler/volum.
For å maksimere utfallet i våre studier, var det viktig å ta godt vare under eksempel forberedelse, som bevaring av vev og strukturer ikke er bare avgjørende for å vurdere strukturelle funksjoner, men også for å identifisere området av interesse entydig. En avgjørende faktor, og kanskje en annen ulempe med denne metoden er at det kreves høy kvalitet ultra tynne snitt parene: det må være noen hull eller rynker som dekker området under etterforskning i delene, og snittykkelsen må vedlikeholdt homogen. Forskeren må være godt trent på ultramicrotomy. Forsiktighet må også tas når imaging avsnittene i TEM, delene er følsomme for elektron strålen skade og kan lett rive fra hverandre. Videre er det viktig å velge riktig antall prøvetaking områder i Avkastningen. Avhengig av eksperimentelle målet har forstørrelsen av elektron micrographs angis nøye. For våre eksperimenter spesielt er teller synapser i sentralnervesystemet, 20 regioner av interesse på ett avsnitt med området 30.25 µm2 optimal. Det anbefales av personellet i erkjennelsen funksjonene i spørsmålet (i vårt tilfelle synapser, synaptic funksjoner og DCV) å få pålitelige resultater. Synaptiske blemmer må identifiseres for å identifisere synapser, og dette krever en oppløsning på minst 10 nm. For dette, en forstørrelse på 5000 X var optimal, men det må bemerkes at forstørrelsen avhengig av maskinvareparametere som typen og plasseringen av kameraer og måtte tilpasses for andre mikroskop og/eller kameraet. Det har også bemerkes at protokollen bruker programmer bestemt en TEM og at brukere med andre modeller må vurdere forskjellene i oppsettet.
Vi tror våre arbeidsflyt kan tilpasses for mange andre programmer ikke bare i nevrovitenskap, men i et bredt felt av biologiske vitenskap og materielle vitenskap (når den høye oppløsningen av en TEM er nødvendig) når problemstillingen krever en systematisk uniform tilfeldig prøvetaking og hvor å bli undersøkt ber om en tid effektiv måte analyse. For eksempel er vi for tiden interessert i å lokalisere jern-butikker i den menneskelige hjernen. For dette, har vi nylig tilpasset våre arbeidsflyten, slik at grunnleggende analyse på ultra tynne snitt i tilfeldig valgt områder. For å redusere antallet programmer som er nødvendig for arbeidsflyten, har vi som mål å bruke ved hjelp av SerialEM programvare, fordi det kan programmeres til å flytte scenen til forhåndsinnstilt som kan velges på en tilfeldig måte. Vi opprettet tilpassede skript for å kontrollere TEM, med sikte på automatizing arbeidsflyten helt. Dette viste seg mulig bortsett fra autofokusering i filtrert tenkelig modus, som ikke gir tilfredsstillende resultater. Vi brukte dermed DM programvare for fokusering og for å få energi-filtrert bilder.
I sammendraget presenterer vi programvareløsninger som hjelper i å skaffe elektron micrographs på en objektiv måte.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Finansiert av prosjektnummeret østerrikske Science fondet, FWF, P 29370 B27
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | SigmaAldrich | P3761 | |
| Formaldehyde | Merck | 1040051000 | 1kg |
| Glutardialdehyde | Science Services | E 16210 | 25%; 100ml; EM grade |
| cacodylate buffer | Merck | C4945 | 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate |
| Thionine acetate/Ceristain | Merck | 861340 | |
| acetic acid | Merck | 1000631000 | 1 L |
| Sodium hydroxide | Merck | 1064951000 | 1 kg, pellets |
| osmium tetraoxide | Science Services | E 19110 | 10x1g |
| TAAB embedding resin | Science Services | TAT001 | 500g |
| DMP-30 | Science Services | TAD024 | 100g |
| DDSA | Science Services | TAD025 | 500g |
| Uranyl acetate dihydrate | Plano GmbH | 19481 | depleted, 25g |
| Ultrastain 2 | Leica | 16707235 | Lead citrate |
| Toluidine blue solution | Agar Scientific | AGR1727 | 10g |
| Pioloform | Plano GmbH | R1275 | 10g Powder |
| Proylenoxide | SigmaAldrich | 82320-1L | 1L |
| DPX embedding medium | Plano GmbH | R1320 | embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml |
| Vibratome, Leica VT 1000 | Leica Microsystems, Vienna, Austria | ||
| Leica Ultracut UCT, ultramicrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
| Tecnai G2 20 | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| Megaview wide angle camera | Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany | ||
| US 1000 digital camera | Gatan, Pleasanton, USA | ||
| TEM Imaging Analysis Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| FEI Serial Section Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| Fiji, ImageJ 1.52e | National Institute of Health, USA | ||
| SPSS 20.0 | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | ||
| SerialEM | Regents of the University of Colorado | ||
| RPS (random point sampling) software 0.9a | custom-made | ||
| Disector v1.0.2 (ImageJ macro) | custom-made | ||
| EFTEMSerialEM (SerialEM script) | custom-made |
References
- Howard, V., Reed, M. Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. , BIOS Scientific Publishers. Oxford. (1998).
- Nakamura, H., Kobayashi, S., Ohashi, Y., Ando, S. Age-changes of brain synapses and synaptic plasticity in response to an enriched environment. Journal of Neuroscience Research. 56 (3), 307-315 (1999).
- Landers, M. S., Knott, G. W., Lipp, H. P., Poletaeva, I., Welker, E. Synapse formation in adult barrel cortex following naturalistic environmental enrichment. Neuroscience. 199, 143-152 (2011).
- Reichmann, F., et al. A novel unbiased counting method for the quantification of synapses in the mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 240, 13-21 (2015).
- Reichmann, F., et al. Environmental enrichment induces behavioural disturbances in neuropeptide Y knockout mice. Scientific Report. 6, 28182 (2016).
- Mayhew, T. M. Taking Tissue Samples from the Placenta: An Illustration of Principles and Strategies. Placenta. 29, 1-14 (2008).
- Ferguson, S., Steyer, A. M., Mayhew, T. M., Schwab, Y., Lucocq, J. M. Quantifying Golgi structure using EM: combing volume-SEM and stereology for higher throughput. Histochemistry and Cell Biology. 147, 653-669 (2017).
- Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. Journal of Microscopy. 134 (2), 127-136 (1984).
- Gundersen, H. J., et al. The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (10), 857-881 (1988).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier/Academic Press. (2008).
- Lewis, P. R., Knight, D. P. Staining Methods for Sectioned Material. , Elsevier/North-Holland Biomedical Press. (1988).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J Struct Biol. 152 (1), can be downloaded from http://bio3d.colorado.edu/SerialEM 36-51 (2005).
- Rampon, C., Tang, Y. P., Goodhouse, J., Shimizu, E., Kyin, M., Tsien, J. Z. Enrichment induces structural changes and recovery from nonspatial memory deficits in CA1 NMDAR1-knockout mice. Nature Neuroscience. 3 (3), 238-244 (2000).
- Xu, X., Ye, L., Ruan, Q. Environmental enrichment induces synaptic structural modification after transient focal cerebral ischemia in rats. Experimental Biology and Medicine. 234 (3), 296-305 (2009).
- Lonetti, G., et al. Early environmental enrichment moderates the behavioral and synaptic phenotype of MeCP2 null mice. Biological Psychiatry. 67 (7), 657-665 (2010).
