Summary
Мы представляем Роман рабочего процесса для электронной микроскопии исследования мозговой ткани. Этот метод позволяет пользователю для изучения нейрональных функции в непредвзятой манере. Для элементного анализа мы также представляем сценарий, который автоматизирует большую часть рабочего процесса для рандомизированные выборки.
Abstract
Исследования ультраструктурные особенности нейронов и их синапсы возможны только с электронной микроскопии. Особенно для сравнительных исследований изменения в плотности и распределения таких функций протокол беспристрастной выборки жизненно важное значение для достижения надежных результатов. Здесь мы представляем рабочий процесс для захвата изображений образцов мозга. Рабочий процесс позволяет систематический единообразные случайной выборки в области определенных мозга, и изображения могут быть проанализированы с помощью disector. Этот метод гораздо быстрее, чем обширные изучения последовательных секций, но по-прежнему представляет целесообразный подход для оценки плотности и распределения Ультраструктура функций. До внедрения, окрашенных vibratome разделы были использованы как ссылку для определения области мозга под следствием, который помог ускорить подготовку общего образца процесса. Этот подход был использован для сравнительных исследований, влияние обогащенный жилищных условий на нескольких ультраструктурных параметров в мозг мыши. Опираясь на успешное использование рабочего процесса, мы адаптировали его для элементного анализа образцов мозга. Мы оптимизировали протокола с точки зрения времени взаимодействия с пользователем. Автоматизация всех времени шаги путем компиляции сценария для с открытым исходным кодом SerialEM помогает пользователю сосредоточиться на основной работе получения элементарного карты. Как и исходный рабочий процесс мы обратили внимание на беспристрастной выборки подход к гарантировать надежные результаты.
Introduction
В электронной микроскопии часто бывает сложно образец представитель регионов в рамках разделов. Мы, в качестве наблюдателя, часто смещены взглянуть на конкретные регионы, обращено наше внимание заметных особенностей образца, предотвращая хорошо распределенных, беспристрастной выборки. Смещения выборки можно избежать только если каждый частью региона интерес получает такой же шанс оказаться в электронная микрофотография1. Это позволяет избежать смещения выборки без программное решение, например, нажав trackball микроскопа вручную не глядя на изображение, чтобы выбрать выборки регионах где перестанет сцене. Но, строго говоря, это не случайная процедура, потому что, сознательно или подсознательно, пользователь может иметь влияние на движение сцены, и, Кроме того, это не сложный способ отбора проб регионов. Случайная выборка становится особенно важным, если пары разделов используются для оценки числа структур в определенном объеме, например, для stereology1, который требует пары разделов, известный расстоянии друг от друга. Также можно смотреть только в одну секцию и оценить количество конкретных структур2, но с этим подходом следователи склонны переоценивать численный плотность более крупные структуры, если структуры очень малы по Сравнение толщины среза. Альтернативные подходы, для восстановления томов ткани от последовательных секций и таким образом получить желаемых данных3. Но это очень много времени и не целесообразный подход (больше) сравнительных исследований.
Чтобы преодолеть эти проблемы, мы разработали рабочий процесс, который позволяет исследователю автоматически выбрать образцы для получения электронной микроскопии на регулярные интервалы в ультра-тонких секций. Положение электрона микроскопии случайных, позволяя беспристрастной выборки. Этот подход подходит как для определения числовых плотности структур (например, синапсы в течение определенного Нейропиль тома4,5) и размеры структурных особенностей (например, ширина синаптическую щель, или диаметр постсинаптических плотность4,5).
Рабочий процесс использует заказные случайную точку выборки (RPS) программное обеспечение (написана на языке Java script, используя сценарии программное обеспечение, поставляемое с нашими микроскопа), которая автоматически вычисляет сетки позиции в рамках предопределенных региона интерес в ультра-тонкий секции. Программное обеспечение RPS перемещает Этап микроскопа эти предопределенные точки, так что электронная микрофотография могут быть сделаны в каждой точке. Во-первых пользователь определяет область интереса в тонкие секции. Далее RPS программное обеспечение вычисляет сетки позиции в этом регионе. X / y координаты первой позиции создаются случайным образом, и оставшиеся должности размещены промежутки регулярной сетки в отношении в первую позицию. Потому что каждый частью региона интерес имеет такой же шанс рассматривается, это позволяет коллекции минимальный объем данных. Этот подход выборки также называется систематический единообразные случайной выборки (см. ссылки7 6,для получения более подробной информации).
Для определения числовых плотности структуры, мы работаем с пары разделов, которые являются известными расстоянии друг от друга. После получения электронная микрофотография из первого раздела в одной из заранее определенных позиций, ТЕА серийный раздел программного обеспечения (часть пакета программного обеспечения поставляется с нашими микроскопа) движется к соответствующей точке во втором разделе, для того чтобы получите электронная микрофотография соответствующего местоположения. Это повторяется для каждого местоположения в сетке заранее. В нашем подходе disector используется для подсчета числа частиц в каждой паре электронной микроскопии8,9. Disector состоит из пары учет кадров, один для каждого раздела8,9. Численное плотность объектов определяется только подсчет объекты видны на первый раздел (или справочный раздел), но не на второй раздел (или раздел поиска). Это позволяет оценить численные плотности объектов в быстрый и эффективный способ8,9. Кроме того на одной секции, двумерных структурные особенности могут быть измерены.
Мы применили этот процесс успешно для оценки различий в числа синапсов в гиппокампе мышей в жилищных условий по сравнению с обычной среде (SE) жилищных условий4,5, обогащенный окружающей среды (EE) а также для оценки ультраструктурных различия между дикого типа (WT) мышах и нейропептида Y (NPY) KO мышей держали под SE и EE5. Нашей целью было смотреть специально на структурных особенностей нейронов, как численные синаптических плотность, длины активной зоны в сечениях и постсинаптических плотности, ширина синаптическую щель и количество синаптических пузырьков, для того, чтобы оценить изменения в нейрональных подключения и активации между различных экспериментальных условиях. Кроме того мы были заинтересованы в численные плотность плотные ядра везикулы (DCV) в нейронах определить количество хранимых нейропептидов в определенной области мозга.
Основываясь на успехе нашего подхода для проведения исследований, описанных выше, в наш следующий шаг, мы адаптировали наш рабочий процесс для выбора областей для беспристрастной элементного анализа в рамках образцы человеческого мозга. Это было сделано для изображения железа, который хранится в молекулах ферритина в нейронов и глиальных клеток. Для этого мы составили скрипт, который позволил нам автоматизировать большинство операций для случайного отбора участков мозга в определенной области.
Protocol
Все эксперименты были утверждены Этический Комитет на Федеральное министерство науки и исследований Республики Австрии (BMWF-80.104/2-BrGT/2007 и BMWF-66.010/0037-II/3b/2013), или Комиссии по этике медицинского университета Граца, номер 28-549 ex 15/16 и проводится согласно Директивы Совета европейских сообществ от 24 ноября 1986 года (86/609/EEC) и директивой Европейского парламента и Совета 22 September2010 (2010/63/ЕС). Эксперименты на животных были разработаны и выполнены таким образом, чтобы свести к минимуму количество животных, используемых.
1. Вскрытие и фиксации ткани
- Усыпить мышей (21 недель старый, женские мышей C57BL/6J и C57BL/6Н мышей, мышей-самцов WT и NPY KO на смешанной C57BL / 6:129 / SvJ фон (1:1) соответственно) путем инъекций Пентобарбитал 150 мг/кг внутрибрюшинно.
- Удаление мозги из черепа и сразу порезать пополам (разделение слева от правого полушария) - с помощью скальпеля.
- Сразу же месте половинок в стеклянных контейнеров с 2% формальдегида и глутаровый 2,5% в 0,1 М cacodylate буфера (CH3)2Асо2Na·3H2O, рН, скорректированы до 7,4 с 1 M NaCl), рН 7,4 при 4 ° C.
Предупреждение: Фиксаторы являются токсичными и следует подходить с большой осторожностью. Используйте только защитные перчатки и под зонт. - Исправить половинки мозга для 2 дней при 4 ° C и промыть в тот же буфер для по крайней мере 24 часа, также при 4 ° C. Объем буфера должен быть на примерно десять объем образца.
2. определить области интереса в головном мозге, сравнивая Vibratome секции с ссылкой секции от мыши мозга Атлас10
- Поместите образцы мозга на vibratome. Проверьте правильность ориентации головного мозга (в этом случае, корональных ориентации был выбран для гиппокампа).
- Обрезка до региона интерес (ROI) в головном мозге. Вырезать в разделах при большой толщине (например., 100 мкм) до тех пор, пока часть мозга с регионом интерес достигается и выбросить каждый раздел.
- Начните сократить vibratome секции толщиной 20 мкм в начале части мозга с Руа и vibratome разделы на стеклянное скольжение. Линяют (Ниссль пятно), помещая в разделах в 0,05% тионина ацетат натрия ацетата буфера, рН 4,2 за 1 мин (Aiрис. 1).
- Сравнить окрашенных разделы с атласом мозга мыши, с помощью световой микроскоп и продолжить резки и пятнать пока не достиг желаемого мозг координат.
3. получение образца региона для встраивания
- Как только определены области справа, начала резки одной секции толщиной 150 мкм с vibratome.
- Microdissect этот раздел vibratome с лезвием бритвы под стерео Микроскоп. Отрежьте части вокруг ROI. Секция должна иметь подходящий размер для следующих этапов подготовки просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) (не больше, чем 1 x 1 мм2).
4. ТЕА подготовка - встраивание, ультра-тонкий, секционирование и окрашивания
- Встраивание
- После исправления 2 h в 2% осмия тетраоксид при комнатной температуре (RT). Использование тома для покрытия образца с по крайней мере 10 раз объема образца, но избегать использования избыточного фиксатором для предотвращения ненужных токсичных отходов.
Предупреждение: осмия тетраоксид высоко токсичен и следует подходить с большой осторожностью. Используйте только защитные перчатки и под зонт. - Обезвоживать, используя класс EM спиртов с шагом 20 минут использования больший объем, чем на предыдущем шаге (50%, 70%, 80%, 96% и 100% этанола).
- Место в окись пропилена для 40 мин на RT. место в смесь пропилена оксида/встраивание смолы (1:2) за 2 ч в RT и 1:3 на ночь при 4 ° C.
Предупреждение: Оксид пропилена высоко токсичен и следует подходить с большой осторожностью. Используйте только защитные перчатки и под зонт. - Внедрите образцы в 100% смолы, изменив смолы 2 раза после 60 минут и один раз после 90 мин (все на 45 ° C).
- Наконец место образцы в правильной формы и пусть смолы полимеризации при 90 ° C в течение 3 дней (Aiiрис. 1).
- После исправления 2 h в 2% осмия тетраоксид при комнатной температуре (RT). Использование тома для покрытия образца с по крайней мере 10 раз объема образца, но избегать использования избыточного фиксатором для предотвращения ненужных токсичных отходов.
- Обрезки и Sectioning на ultramicrotome.
- Отделка блок, обеспечение того, чтобы стороны так гладко, как возможно в разделах присоединиться друг к другу (рис. 1Aiii).
- Производят 55 Нм ультратонкий серийный секции (должно быть серебряный серый) с помощью ultramicrotome. Используйте сетку слот (слот ширина 1 x 2 мм) с покрытием с pioloform (АИВрис. 1).
- Изображение ультратонкий разделы на сетках слот, используя 2% уранила ацетат 30 мин и свинца цитрат для 30 s на RT (это стандартная электронная микроскопия метод11).
Предупреждение: Уранила ацетат является высокотоксичным, и следует избегать любого прямого контакта. Обрабатывать только защитные перчатки. Свинца нитрат токсичен при проглатывании или вдыхании и следует подходить с большой осторожностью.
5. изображения соответствующего ROIs на ссылку и просмотровых секций на ТЕА с пакетами программного обеспечения
- Изучить разделы по сетке с помощью малое увеличение (в зависимости от размера разделов) ТЕА для ориентации и оценить качество секций.
- Начало (пакет программного обеспечения для анализа изображений ТЕА, или Тиа, поставляемое с микроскопом) программное обеспечение для создания виртуальных образов разделов, сохраняя угловых точек секций. Это позволяет программное обеспечение, чтобы найти соответствующие позиции ROI на каждой секции.
- Перейдите к разделу и выбрать Вставить для добавления угловых точек для секции ссылки и поиска. Следуйте инструкциям всплывающего окна. Начните с раздела ссылку и затем перейдите к разделу поиска. Убедитесь, что края секции, которые параллельно к следующему разделу пунктов 1 и 2 (рис. 1Bi) вводятся.
- Визуализируйте справочный раздел под низким увеличением для определения области интереса и перемещения микроскопа с помощью TIA на справочный раздел для несколько угловых точек ROI для создания наброски ROI.
- Запишите координаты результирующего полигона, с помощью RPS программного обеспечения. Для этого нажмите Добавить координаты в диалоговом окне RPS программного обеспечения в каждой точке полигона, который необходимо наметить ROI в разделе (рис. 1ВП).
- Определить и ввести подходящего размера для выборки районов и расстояния между районами в RPS программное обеспечение (в представленных исследовании, размер выборки районов составляет 7 мкм и расстояние между ними составляет 20 мкм, что приводит к по крайней мере 20 областях выборки в рамках ROI). Пресс Рассчитать растровый, затем программное обеспечение генерирует координаты области выборки систематический единообразные случайным образом для Микрофотография позиций в пределах полигона (Biiiрис. 1).
Примечание: Для лучшей ориентации, полигона и выборки районов внутри многоугольника может отображаться программное обеспечение RPS (Bivрис. 1).
- Хранения проб в разделе ссылки и поиска, с помощью RPS и ТЕА серийный раздел программного обеспечения. Вот координаты композиция которые записываются после11.
- В программном обеспечении RPS, нажмите Перейти к следующей позиции для перемещения микроскопа x / y координаты каждой выборки область в разделе ссылок. Перейти к Местоположение и вставки для импорта эти координаты в программном обеспечении в разделе ссылок. Повторите это для всех координат.
- Зеркало координаты из секции ссылку на раздел поиска, перейдите к разделу и нажмите Перейти к разделу. Введите номер секции просмотровые (обычно ' 2') в диалоговом окне.
- Для записи композиция (см. следующий шаг), переключение между в разделе ссылки и поиска, как описано ранее и изменить позицию на справочный раздел с расположением и Перейти на номер. Выберите следующий координат в диалоговом окне.
- Для SerialEM композиция на каждой выборки координировать, перейдите в меню файл и выбрать Новый фотомонтаж из раскрывающегося меню. В диалоговом окне выберите правильное количество плитки и процент перекрытия. Для настоящего исследования, увеличением 5000 X достаточно признать синаптических особенности при исследовании, но ограниченное поле зрения камеры на ПЗС, требуется сделать композиция 2 x 2 изображений. Композиция, сделаны с SerialEM.
- Перед записью каждого монтажа, корректировать фокус (или, если возможно, активировать опцию автофокусом в программное обеспечение для записи). Выберите папку для сохранения файла монтаж и начать запись монтаж, нажав запустить в подменю монтаж слева в SerialEM.
6. Анализ изображений ТЕА с ImageJ в документе ультраструктурные особенности.
Примечание: Для этого, это важно для создания стека выравнивания изображений из секции ссылки и поиска.
- Преобразовать изображение пары с ImageJ изображения стек в файл стека и выровнять изображения с StackReg (должен быть установлен от BIG-EPFL http://sites.imagej.net/BIG-EPFL/; в данном случае, алгоритм, который был Affine используется). Для получения численных плотности клеточных структурных особенностей, заказные ImageJ макрос Disector генерирует подсчет кадр с размером 5,5 х 5,5 мкм, помещены случайно на изображение с случайный угол.
- Запустите макрос Disector (расположение в ImageJ меню зависит от директории, где она сохраняется) и параметры (размер кадра подсчитывать количество сегментов) определяются как необходимые (Рисунок 1ИСИ).
- Подсчитать количество синапсов/мкм2 с помощью Disector. Граф каждый синапс рамке подсчета, который виден в разделе ссылок, но не виден в разделе поиска. Опустить эти синапсы, которые пересекаются с двумя «запретные полосы» disector; но количество синапсов на противоположной «признание линии». Для этого используйте Инструмент Multipoint расположен в Toolsbar в ImageJ (рис. 2A,B Рисунок 2).
- Для измерения параметров синапса, выберите только синапсов с синаптической расщелина, ориентированные в сечении (на справочный раздел; в рамках же изображения используется для disector).
- Запустите плагин ObjectJ в ImageJ из раскрывающегося меню (рисA) через плагины | Анализ. Откройте новый проект из раскрывающегося списка диалогового окна ObjectJ. Это откроет окно, которое позволяет пользователю наброски и Марк структур с Маркера инструмента (рис. 2B, красный круг). В следующих шагах описаны синаптических параметры, используемые для экспериментов, представленные здесь.
- Измерьте длину пресинаптической мембраны и длину постсинаптических плотности по прямой линии вдоль структуры, с помощью Маркера инструмента (рис. 2B, красный круг).
- Получите среднее ширина синаптическую щель, рисование многоугольника, охватывающих как предварительно и постсинаптической мембраны, с прямой параллельными сторонами и сегментированных линии Мидуэй, равноотстоящих для обоих мембраны.
- Для определения количества состыкованного везикулы, подсчитать все пузырьки, которые имеют максимальное расстояние от пресинаптической мембраны диаметром один пузырек или меньше.
- Для определения количества расстыковка везикулы, рассчитывать эти пузырьки с максимальное расстояние одной везикул диаметром от закреплена или другие расстыковка везикулы в же синапсе.
7. производство полутонкая разделы для микроскопии свет в документе макроскопические особенности (в данном случае номер ячейки) внутри же ROI как выбранный для ТЕА расследования.
- Сразу же после резки ультра-тонких секций для ТЕА, вырежьте две секции полутонкая, 0,5 мкм толщиной и непосредственно прилегающих друг к другу. Место на слайде стекла и пачкает их с помощью толуидиновый синий 0,5% раствора. Место крышку выскальзования на участках (с DPX монтаж среднего, состоящий из distyrene, пластификатор (трикрезилфосфат) и ксилол). Эти две секции используются для подсчета числа клеток.
- Фотография полутонкая секций при низком увеличении с использованием световой микроскоп.
Примечание: Структуры под следствием должен идентифицироваться в изображениях. В настоящем исследовании 20 X увеличение была использована для выявления клеток тела. При необходимости, несколько изображений можно сшиты вместе с программного обеспечения для обработки изображения. - Совместите пар двух последовательных полутонкая секций с программного обеспечения для обработки изображения (например., ImageJ).
Примечание: Различия в ротации и размер (может произойти из-за артефакты сжатия, представленный процесс резания) должна быть скорректирована для идеальной наложения двух секций. - Марк на границе ROI на изображении световой микроскопии. Рентабельность инвестиций должна соответствовать ROI, используемый для изображений ТЕА. Для этой цели загружать изображения в ImageJ и выберите выбор полигона из Toolsbar (рисA).
- Создание сетки над все изображение, используя ImageJ, открыв анализ | Инструменты | Сетка и задайте параметры, как требуется.
- Вычислить площадь и объем полигона из числа ГРИД точек в пределах области интереса и раздел толщина (объем = NCS * ОО * hST ; NCS = подсчет крест секций; ОО = размер сетки; hST = толщина среза).
- Подсчитать количество ядер из нейрональных клеток органов в рамках Руа, если они присутствуют только на одном разделе. Выберите Инструмент Multipoint в ImageJ из Toolsbar и Марк клетки. После подсчета клеток по каждому разделу, подсчитать количество ячеек на том (
; Cплотность = плотность клеток; Cколичество = клеток). - Запишите все измерения в окне Результаты ObjectJ (рис. 2C). Экспортируйте и сохраните их для дальнейшего использования.
; Cплотность = плотность клеток; Cколичество = клеток).8. Использование SerialEM сценарий для оптимизации элементного анализа в образцах мозга в сочетании с DigitalMicrograph (DM, поставляется с изображений фильтр).
- Настройка визуализации фильтр (GIF).
- Загрузить образец в ТЕА и перейти в отверстие в образце для настройки GIF с использованием trackball или джойстик микроскопа.
- Перейдите к Энергии фильтруют ТЕА (EFTEM) в программное обеспечение или DM DM и выберите Камера CCD в дм.
- Выберите масштаб для элементного анализа (масштаб зависит от структуры/область интересов; в данном случае, масштаб имеет значение от 76 k до 125 k). Установите время экспозиции 0,001 s и начать Просмотр.
- Фокус пучка тщательно до тех пор, пока края можно увидеть и центр луча в изображении. Уменьшите C2 / цель отверстие, пока края диафрагмы являются видимыми и центр пучка с trackball для пучка.
- Расфокусировать пучка (около C2 46,2%, время экспозиции для настройки должно быть вокруг 0.05 s) и найти нулевой потерей пик (ZLP), нажав на кнопку ZLP . Начните процедуру настройки, нажав на кнопку настроить полный .
- Получите случайные точки приобретения.
- Вернуться к ТЕА изображений режим и выберите камеру и проверить фокус на увеличение 10 k (настроить оси z и defocus равным нулю).
- Выберите LM 75 X увеличение и проверить, если камера не установлена (в противном случае она не может контролироваться программным обеспечением SerialEM).
- Запустите SerialEM и откройте новый проект.
- Откройте навигатор. Проверьте настройки для камеры в камеру и сценарии элементов ( Просмотр и запись) и начать Просмотр (Камера автоматически вставляется).
- Чтобы сделать угол карта ультратонкий раздела, выберите добавить точки в окне Navigator.
- Установите угловые точки по краям ультратонкий секции. Переместите сцену в угловую точку, удерживая нажатой клавишу правой мыши. Когда достигается угол секции, добавьте в угловую точку с левой мыши. Повторите эту процедуру для добавления 3 больше угловых точек. Убедитесь, что в окне навигатора отмечена галочкой поле C для угловых точек для сохраненных точек.
- Чтобы начать монтаж угловой (желательно на увеличение LM 75), перейдите на Навигатор в строке меню SerialEM и выберите Montaging & сетки и Монтаж установки угла из раскрывающегося меню.
Примечание: Лучшим, установки параметров для выбранной записи параметров отображаются. При необходимости измените их. В данном случае только процент перекрытия было изменено на 20%.
- Изложить раздел/ROI на монтаж изображения. Выберите Добавить многоугольник в окне навигатора и наметить раздел с несколькими право мыш clicks. Выберите добавить сетку точек в раскрывающемся меню навигатора и определить расстояние между точками (расстояние зависит от экспериментальных вопрос; например., 10 мкм, рис. 3).
- Выполните команды сценария. Введите количество точек сетки, как показано в навигаторе и введите количество точек приобретения (например., 20).
- Установите порог освещения, так что сценарий можно избежать сетки баров. Выполните команды сценария и переместить стадии вручную, чтобы покрыть поле зрения на одну четверть с ГРИД баром. По словам отображаемое значение введите пороговое значение освещенности (должна быть выше, чем отображаемое значение).
- Подождите, пока выбранные точки для приобретения и закончена процедура приготовления.
Примечание: Это занимает много времени и может быть в одночасье; сценарий отправляет микроскопом в standby после окончания приготовления рутины; Процедура приготовления имеет важное значение для стабилизации в подразделах электронного луча.
- Энергии фильтруют элементный анализ ТЕА (EFTEM)
- Выберите режим EFTEM в TIA/DM и CCD камеры в ДМ.
- Центр луча и выполните команды сценария, которые будут двигаться сцену для каждой выборки координаты.
Примечание: Пользователь будет предложено если стадии следует переместить к следующему полю координат. - Совместите нулевой потерей пик (ZLP) и установить ~ 46,2% C2 .
- Набор энергии на 60 eV (в этом случае, значение для обнаружения М-краю Fe), щели во время 10 eV и воздействия на 0,4 с. Вставка щели и установить ~ 43,9% C2.
- Начать просмотр и резкость изображения.
- Установите C2 на 46,2%, выровняйте ZLP и установить 43,9% C2 .
- Приобрести элементарного карта с элементарного конкретных параметров.
Примечание: По умолчанию параметры могут использоваться в диалоге приобретение, но рекомендуется проверить эти заранее, если это возможно; Пример фильтрации изображения показаны на рисунке 4. - Установите C2 на 46,2% и приобрести карту толщины.
- Повторите для всех точек определяется приобретения (шаг 8.3.2-8.3.12).
- Следуйте инструкциям скрипта и получить один электрон микроскопии или композиция приобретение точек. Выберите масштаб так, что все (ultra-) структурная информация является видимым/идентифицировать.
- Сохранить файл журнала, навигатор и окно результаты и удалить щели.
- Закройте клапан, удалить образец и завершите ТЕА.
Representative Results
Здесь мы описываем рабочий процесс для выбора областей для ТЕА автоматическое и беспристрастной способом. Пользователь выбирает область интереса в ультра-тонкий разделе ТЕА и использует несколько программных решений для рабочего процесса, включая наши RPS программное обеспечение, которое автоматически вычисляет координаты 20 выборки районов в пределах области интерес. Затем на этапе ТЕА перемещается в каждой области выборки для фотографии. Это возможно как для анализа отдельных участков, так и для анализа пары разделов, известным расстоянием друг от друга, который позволяет выбрать области для изображений без предвзятости следователя.
Этот процесс оказался ценным при документировании ультраструктурные особенности в мыши мозга разделы4,5. В этих исследованиях превращение слоя клеток зубчатой извилины (DGpl) рассматривался как области, представляющей интерес. Наш метод оказался подходит для изучения ГД, потому что коронковой части спинной ГД (Bregma −1.3) вписывается в ультра-тонкий секции и ее контуры легко распознаются при низком увеличении. Если другие регионы мозга были рассмотрены, было бы важно, чтобы проверить их размер и отличительные черты до планирования экспериментов.
Применение рабочего процесса, описанного здесь показали, что EE жилья увеличивает ширину синаптическую щель значительно в DGpl4, в отношении стандартных жилищных условий. Кроме того количество густой ядро везикулы значительно уменьшилось в здании EE животных4, указанием изменений в семье нейропептидов. Когда WT и NPY нокаут мышей держали в условиях EE, количество нейронов/µm³ в DGpl увеличивается, в то время как плотность DCV снизился по отношению к SE-корпус5. В противоположность этому NPY нокаут привело значительное увеличение числа синаптических пузырьков в резерв (незакрепленных синаптических пузырьков) независимо от жилищных условий5. Влияние EE на ширину синаптическую щель была обращена вспять в группе NPY KO, что приводит к существенной разницы между EE-здание WT и NPY KO мышей5. Наряду с поведенческих исследований WT и NPY животные нокаут провел под обоих типов жилищных условий, это указывает на важную роль NPY нейробиологических эффекты EE5.
Для визуализации железа, хранящиеся в человеческом мозге, сценарий был составлен для программного обеспечения SerialEM случайным образом выбирать точки приобретения от в целом ультратонких секции, с целью получения энергии фильтруемый электронная микрофотография в каждой из этих точек . После загрузки раздел в электронный микроскоп, сценарий выполняется стабилизации секции (т.е., образец приготовление обычной) на ночь. Затем сценарий случайно выбранных количество точек, предопределенные пользователем от тех, которые отмечены с решетки на рисунке 3. Производя Микрофотография испытания и проверки ее уровней серого, сценарий проверки, если выбранные точки были расположены на видимой части раздела, отвергая точек, которые высадились на сетке баров. Большую часть рабочего процесса было обработано сценарий с минимальным вмешательством пользователя. Однако не удалось автоматически записывать энергии фильтруют микроскопии (с этой установки), как там было слишком мало света для автофокусировки обычной SerialEM. Таким образом мы перешли на DM программного обеспечения, как только сценарий переехал сцену в каждой точке, отрегулировать фокус вручную и сделал изображение EFTEM железа. На рисунке 4приведен пример для EFTEM железа изображения от post-mortem человеческий мозг.
Рисунок 1. Иллюстрации процесса. (A) основные этапы подготовки образца приведены (в направлении стрелки): vibratome разделы (i), embedding(ii), резка тонкий и ультра-тонких секций (iii) и ловить пар ультра-тонких секций на медь сетки (iv). (B) использование микроскопа поставщика программного обеспечения и RPS специализированного программного обеспечения для создания координаты области выборки, которые определяют сайты записи. Угловые точки секции хранятся в микроскопии программного обеспечения и ROI выделен (определенных с помощью полутонкая секции) (i); сетке выборки районов генерируется над ROI, случайный сдвиг (красная стрелка) вводится в x и y. Переход меньше, чем расстояние между районами выборки, (черные стрелки), так что вместо того, чтобы черные квадраты, которые имеют без сдвига, синие квадраты, которые случайно сдвинуты, используются для определения записи сайтов (ii); только отбор проб в границах ROI (рисуется как черные и голубые квадраты) используются для записи. Микроскопии производятся как в разделе ссылок (черные квадраты), так и в соответствующих местах в разделе поиска (синий квадрат) (iii). (C) Микрофотография производится на каждой области выборки с достаточным увеличением; Монтаж, состоящий из нескольких слияния изображений производится при необходимости (в данном случае, изображения были объединены вместе 2 x 2) (i); подсчитывать кадр генерируется и показано как наложение на изображении, будет учитываться структур в рамках и на «признание линии» (пунктирная рамка линии), но не те, на «запрещенные линии» (рамка твердой линии) (ii). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Измерения параметров ультраструктурных на пару ультра-тонких секций с беспристрастной подсчет кадра. (A) обзор ImageJ windows, используемый для подсчета и анализа клеточных структур. Левой стороне показывает электронная микрофотография с подсчитывать кадр как оверлей. На правой стороне: ImageJ пользовательский интерфейс (синий прямоугольник) с раскрывающегося меню (вверху) и панели инструментов (см. ниже); ObjectJ редактор объектов (зеленый прямоугольник); окна ObjectJ инструменты (оранжевый прямоугольник), где можно выбрать инструменты для измерения и окна результаты ObjectJ (черный прямоугольник), где описаны все измерения. (B) деталь от показаны заметно синапсов на электронная микрофотография (синапсы на обоих участках - стрелки; синапса только на подстановки раздела стрелок). Те помечены с помощью Multipoint-средство (красный кружок) на панели инструментов в ImageJ. (C) имена и измерения параметров синаптических функции определяются с помощью ObjectJ средств. Маркер-инструмент и функцию интерес выбираются и наброски, нарисованный на изображении слева мыш clicks вдоль структуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
На рисунке 3. Выбор, отбор областей для элементного сопоставления в рамках ROI для энергии фильтруют просвечивающей электронной микроскопии. SerialEM используется для выбора региона интерес и предложить большое количество выборки районов на регулярные интервалы (розовый кресты на рисунках A и B). Затем сценарий случайным образом выбирает выборки районов (из этих предопределенных координат) для приобретения. Выборки районов с плохой освещенности отклоняются избежать сетки баров и сценарий останавливается, как только 20 районах хорошо освещенной выборки были отобраны в рамках ROI. (A) обзор всей области интереса, изложенные многоугольник, с большим числом возможных выборки районов, отмеченные X. (B) подробно показаны области выборки до случайного отбора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Пример получения элементарного карта (EFTEM). (A) светлые области ТЕА Микрофотография вокруг приобретения точки. Случайно выбранной области был использован для получения элементарного карта и характеризуется черный прямоугольник. (B) EFTEM до края окна изображения, сделанные в произвольно выбранной области. (C) EFTEM после края окна изображения в той же области. (D) Элементаль карта железа из той же области (M-edge). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Исследователя для получения данных на ультраструктурные функции в непредвзятой манере позволяет рабочий процесс, представленные здесь. Это гораздо меньше времени, чем объем расследований из последовательных секций. Для достижения этой цели используются несколько различных приложений. Во-первых наше программное обеспечение на заказ RPS (для подробной информации о доступности, обращайтесь соответствующий автор) используется для ввести случайные этап shift, чтобы выбрать координаты области выборки. Это позволяет систематический единообразные случайной выборки ROI. Далее, для подсчета конкретных структур, мы адаптировали метод disector, где сравниваются 2 последовательных секций с известным расстоянием, Роман способом, по сравнению с предыдущих исследований13,14,15 , как мы использовали наш RPS специализированного программного обеспечения для систематический единообразные случайной выборки. Это экономит время по сравнению с 3D-реконструкции всего тома из последовательных секций. RPS программного обеспечения по индивидуальному заказу специально разработана для одного типа микроскопа, который является ограничивающим фактором для воспроизведения рабочего процесса. Альтернативой от этого конкретного программного обеспечения будет приложение, которое позволяет сценариев и совместимо с другими моделями микроскопа.
Мы успешно использовать этот подход для наших сравнительных исследований4,5. На ультра-тонких секций нейронной ткани изложенные области интересов и изображения были взяты систематический единообразные случайной выборки в этой области. Стоит отметить, что сфера интересов, превращение слое зубчатой извилины, является довольно небольшой площади для расследования, которые могут быть полезны для нашего подхода. В рамках случайно помещены disector мы оценивали количество DCV и несколько ультраструктурные особенности синапсов в DGpl взрослых мышей размещается в SE и EE, а также взрослых WT мышей против взрослых мышей NPY нокаут. Используя наш подход, собранные данные показали изменения в некоторых из исследуемых параметров. Эти выводы подтверждают те из других аналогичных исследований в отношении несовершеннолетних животных2.
Недостаток использования экспериментальной этого рабочего процесса может быть что это multi распыления подход не является идеальным с точки зрения удобства для пользователей, как пользователям нужно получить комфортно с различных интерфейсов (в нашем случае, Пользовательский интерфейс, ТЕА серийный секции RPS программного обеспечения и программного обеспечения SerialEM). Обучение для обработки всех приложений в эффективный способ много времени и должны быть приняты во внимание. Однако инвестировать время в научиться использовать этот рабочий процесс по-прежнему явно благоприятные во времени, которая необходима для анализа всего тома с последовательным секции ТЕА. Метод с использованием disector, размещенных систематический единообразные случайной выборки в области интересов достаточно представить достоверных данных1 без необходимости расследовать большое количество секций/тома.
Чтобы максимизировать результаты в наших исследованиях, жизненно важно принять хороший уход во время подготовки проб, как сохранение тканей и структур важно не только для оценки структурных особенностей, но и для определения области интересов однозначно. Решающим фактором и возможно еще один недостаток этого метода, является то, что высокое качество ультра-тонких секций пар требуется: там должно быть без отверстий или морщины, которые покрывают площадь под расследование в любой из разделов, и толщина среза должна быть поддерживал однородной. Исследователь должен быть хорошо подготовленных в ultramicrotomy. Уход за должно также приниматься при визуализации в подразделах ТЕА, как разделы чувствительны к электронно пучка повреждений и может легко разорвать. Кроме того важно выбрать правильный количество проб областей в ROI. В зависимости от экспериментальной целью увеличение микроскопии электрон должен быть установлен тщательно. Для наших экспериментов конкретно, считая синапсов в центральной нервной системе, 20 регионов интерес на одном участке площадью 30.25 мкм2 являются оптимальными. Рекомендуется для подготовки персонала в признавая особенности в вопросе (в нашем случае синапсы, синаптических особенности и DCV), чтобы получить надежные результаты. С целью выявления синапсы, синаптических пузырьков должны быть идентифицированы, и это требует резолюция по крайней мере 10 Нм. Для этого увеличение 5000 X была оптимальной, но он должен отметить, что масштаб зависит от аппаратных параметров, таких как тип и положение камеры и должны быть адаптированы для других типов микроскопа и/или камеры. Она также имеет следует отметить, что протокол использует приложений, специфичных для одного ТЕА и у пользователей с другими моделями рассмотреть различия в настройке.
Мы считаем, что наш рабочий процесс можно адаптировать для многих других приложений, не только в неврологии, но и в широком поле биологической науки, а также материальная наука (когда требуется высокое разрешение ТЕА) всякий раз, когда вопрос исследования требует систематической форме случайная выборка и количество образцов быть расмотренным просит время эффективный способ анализа. Например мы в настоящее время заинтересованы в локализации запасы железа в человеческом мозге. Для этого недавно мы адаптировали наши рабочего процесса, для элементного анализа на ультра-тонких секций в произвольно выбранных районах. Для того, чтобы свести к минимуму количество приложений, которые необходимы для рабочего процесса, мы стремились применить с помощью программного обеспечения SerialEM только, потому что он может быть запрограммирован для перемещения на сцену, чтобы предустановленных точек, которые могут быть выбраны случайным образом. Мы создали пользовательские сценарии для управления ТЕА, с целью автоматизирующие процесс полностью. Это оказалось возможным за исключением автофокусировки в отфильтрованного изображения режиме, который не дают удовлетворительные результаты. Мы таким образом использовал DM программное обеспечение для фокусировки и для получения энергии фильтрация изображений.
Таким образом мы представляем программные решения, которые помогают в получении электронной микроскопии в объективной форме.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Финансируется номер проекта Австрийский фонд науки, FWF, P 29370 B27
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | SigmaAldrich | P3761 | |
| Formaldehyde | Merck | 1040051000 | 1kg |
| Glutardialdehyde | Science Services | E 16210 | 25%; 100ml; EM grade |
| cacodylate buffer | Merck | C4945 | 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate |
| Thionine acetate/Ceristain | Merck | 861340 | |
| acetic acid | Merck | 1000631000 | 1 L |
| Sodium hydroxide | Merck | 1064951000 | 1 kg, pellets |
| osmium tetraoxide | Science Services | E 19110 | 10x1g |
| TAAB embedding resin | Science Services | TAT001 | 500g |
| DMP-30 | Science Services | TAD024 | 100g |
| DDSA | Science Services | TAD025 | 500g |
| Uranyl acetate dihydrate | Plano GmbH | 19481 | depleted, 25g |
| Ultrastain 2 | Leica | 16707235 | Lead citrate |
| Toluidine blue solution | Agar Scientific | AGR1727 | 10g |
| Pioloform | Plano GmbH | R1275 | 10g Powder |
| Proylenoxide | SigmaAldrich | 82320-1L | 1L |
| DPX embedding medium | Plano GmbH | R1320 | embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml |
| Vibratome, Leica VT 1000 | Leica Microsystems, Vienna, Austria | ||
| Leica Ultracut UCT, ultramicrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
| Tecnai G2 20 | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| Megaview wide angle camera | Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany | ||
| US 1000 digital camera | Gatan, Pleasanton, USA | ||
| TEM Imaging Analysis Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| FEI Serial Section Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| Fiji, ImageJ 1.52e | National Institute of Health, USA | ||
| SPSS 20.0 | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | ||
| SerialEM | Regents of the University of Colorado | ||
| RPS (random point sampling) software 0.9a | custom-made | ||
| Disector v1.0.2 (ImageJ macro) | custom-made | ||
| EFTEMSerialEM (SerialEM script) | custom-made |
References
- Howard, V., Reed, M. Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. , BIOS Scientific Publishers. Oxford. (1998).
- Nakamura, H., Kobayashi, S., Ohashi, Y., Ando, S. Age-changes of brain synapses and synaptic plasticity in response to an enriched environment. Journal of Neuroscience Research. 56 (3), 307-315 (1999).
- Landers, M. S., Knott, G. W., Lipp, H. P., Poletaeva, I., Welker, E. Synapse formation in adult barrel cortex following naturalistic environmental enrichment. Neuroscience. 199, 143-152 (2011).
- Reichmann, F., et al. A novel unbiased counting method for the quantification of synapses in the mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 240, 13-21 (2015).
- Reichmann, F., et al. Environmental enrichment induces behavioural disturbances in neuropeptide Y knockout mice. Scientific Report. 6, 28182 (2016).
- Mayhew, T. M. Taking Tissue Samples from the Placenta: An Illustration of Principles and Strategies. Placenta. 29, 1-14 (2008).
- Ferguson, S., Steyer, A. M., Mayhew, T. M., Schwab, Y., Lucocq, J. M. Quantifying Golgi structure using EM: combing volume-SEM and stereology for higher throughput. Histochemistry and Cell Biology. 147, 653-669 (2017).
- Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. Journal of Microscopy. 134 (2), 127-136 (1984).
- Gundersen, H. J., et al. The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (10), 857-881 (1988).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier/Academic Press. (2008).
- Lewis, P. R., Knight, D. P. Staining Methods for Sectioned Material. , Elsevier/North-Holland Biomedical Press. (1988).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J Struct Biol. 152 (1), can be downloaded from http://bio3d.colorado.edu/SerialEM 36-51 (2005).
- Rampon, C., Tang, Y. P., Goodhouse, J., Shimizu, E., Kyin, M., Tsien, J. Z. Enrichment induces structural changes and recovery from nonspatial memory deficits in CA1 NMDAR1-knockout mice. Nature Neuroscience. 3 (3), 238-244 (2000).
- Xu, X., Ye, L., Ruan, Q. Environmental enrichment induces synaptic structural modification after transient focal cerebral ischemia in rats. Experimental Biology and Medicine. 234 (3), 296-305 (2009).
- Lonetti, G., et al. Early environmental enrichment moderates the behavioral and synaptic phenotype of MeCP2 null mice. Biological Psychiatry. 67 (7), 657-665 (2010).
