Summary
ويصف هذا العمل استنساخ عبئا مايديس Ustilago حصان طروادة لإيصال بروتينات الذرة يفرز في الموقع إلى ثلاثة أنواع مختلفة من الأنسجة الذرة.
Abstract
مستوحاة من أسطورة حصان طروادة Homer´s، نحن هندسيا الممرض مايديس Ustilago توصيل البروتينات يفرزها إلى أبوبلاست الذرة التي تسمح بتحليل المظهرية المجراة في الذرة. هذا الأسلوب لا يعتمد على تحويل الذرة ولكن يستغل قدرات الافرازية من مسببات الأمراض وعلم الوراثة الميكروبية. هذه الوثيقة، فإنه يسمح تفتيش المجراة في تسليم البروتينات يفرزها مع ارتفاع القرار الزمانية المكانية في أنواع مختلفة من مواقع الإصابة والأنسجة. يمكن استخدامها لعابر يكمل الذرة خسارة للدالة تعمل، لتوصيف وظيفيا نطاقات البروتين، لتحليل آثار البروتين خارج الهدف، أو لدراسة البروتين هدوئي الجرعة الزائدة، مما يجعله أداة قوية لاستراتيجية حصان طروادة دراسات البروتين في النظام محصول الذرة. ويتضمن هذا العمل بروتوكول دقيق بشأن كيفية توليد سلالة حصان طروادة تليها البروتوكولات العدوى موحدة لتطبيق هذا الأسلوب على ثلاثة أنواع مختلفة من الأنسجة الذرة.
Introduction
الممرض بيوتروفيك مايديس Ustilago هو المسبّب ل مرض التفحم الذرة1. أنه يصيب جميع أجزاء الجوي من الذرة الناتج في الأورام الكبيرة التي تحتوي على جراثيم ميلانيزيد، أسود. على الصعيد العالمي، يقدر مايديس U. يسبب خسارة سنوية من حوالي 2 في المائة محصول الذرة، بينما تقدر الأورام كطعام شهي تذوقي في المكسيك. مصنع العدوى هو بدأها أبريسوريوم التي تفرز الإنزيمات ليسينج جدار الخلية لاختراق الطبقة الأولى من خلايا البشرة الذرة. من موقع إصابة الأولية، ينمو مايديس U. إينتراسيلولارلي وإينتيرسيلولارلي، وغزو الخلية واحد إلى اثنين طبقات كل يوم1،2. نتائج الإصابة بنجاح في تضخم النباتات التي تتحول إلى أورام مرئية إلى خمسة أيام بعد الإصابة1،،من34. خلال جميع مراحل العدوى، إينفاجيناتي الفطرية خيوط فطرية الغشاء الهيولى المصنع دون أي اتصال مباشر إلى1،السيتوبلازم المضيف2. أبوبلاسميك ضيق المساحة بين خيوط فطرية إصابة وغشاء البلازما النبات يعتبر الموقع المضيف/الممرض التفاعلية، وتسمى منطقة التفاعل بيوتروفيك. وللتغلب على نظام المناعة الفطرية النباتية، تفرز U. مايديس صفيف بروتينات المستجيب في منطقة التفاعل بيوتروفيك1. وتتخذ بعض المستجيبة بالخلايا النباتية، بينما البعض الآخر لا يزال في بيوتروفيك تفاعل المنطقة5،6،،من78. واحد أبوبلاستيك المستجيب هو UmPit2، الذي يتفاعل مع البروتياز أبوبلاستيك الذرة لمنع الإفراج عن الببتيد ZmZIP1 من زمبروزيب،أبوبلاستيك البروتياز النشاط9مما يشير إلى10.
على مدى العقود الماضية، U. مايديس أصبح ليس إلا نموذجا لعلم الوراثة الفطرية في تفاعل الكائنات الممرضة النباتية، ولكن أيضا أداة قيمة في مجال التكنولوجيا الأحيائية بسبب دورة الحياة مفهومة جيدا، سهولة الوراثية وتعبير مغايرة يفرز البروتينات11،،من1213. إشارات لإفراز البروتين التقليدية وغير التقليدية على حد سواء قد تم تحديد السماح بالتحكم في تعديلات بوستترانسلاشونال14. في الآونة الأخيرة، استخدمت U. مايديس كأداة حصان طروادة لدراسة صغيرة، ويفرز البروتينات الذرة في الموقع15. النهج حصان طروادة الذي استخدمت بنجاح لتحليل وظيفة البروتين الصغيرة، ويفرز ZmMAC1 التي تشارك في وضع العضو الذكرى. ZmMAC1 يدفع شعبة بيريكلينال pluripotent الخلايا ومواصفات مصير خلية من خلايا المنشأ حديثا15. بنفس الطريقة، كشف عن الوظيفة البيولوجية للذرة الببتيد المرتبط بالضرر ZmZIP1. مايديس U. إفراز الذرة ZmZIP1 أدت إلى إعاقة الورم تشكيل10. وهكذا، تمثل النهج حصان طروادة طريقا بديلة قيماً للبروتين في دراسات الموقع مع ارتفاع القرار الزمانية المكانية التي لا لا تتطلب توليد خطوط تحويل الذرة مستقرة ولا تسلل الأنسجة مع هيتيرولوجوسلي أعرب عنه وتنقية البروتينات. على وجه الخصوص، استراتيجية حصان طروادة يتيح إفراز أي البروتين مغايرة في أبوبلاست الذرة والمقارنة المباشرة للمصابين مقابل الخلايا النباتية غير المصابة داخل النسيج نفسه.
هذا البروتوكول يوضح الخطوات الرئيسية لتوليد عبئا حصان طروادة مايديس الولايات المتحدة لدراسة وتين فائدة. كذلك يتضمن معلومات دقيقة عن إجراءات العدوى من ثلاثة أنواع مختلفة من الأنسجة الذرة (أوراق الكبار، شرابات وآذان) مع مايديس شين، الذي شرط أساسي لدراسة وظيفة البروتين وتطور الإصابة الزمانية المكانية في هذه الأنسجة المستهدفة. أي مواصفات أخرى معين على الذرة الجينات التضخيم والمجهري تقنيات، التصوير منذ هذه الخطوات محددة الهدف وتعتمد على الصك. وهكذا، هذا البروتوكول هو موجهة إلى المستخدمين ذوي الخبرة من تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-بناء حصان طروادة مايديس u.
ملاحظة: انظر الشكل 1.
- تضخيم جين للفائدة من الذرة كدنا استخدام الإشعال الخاصة بالجينات وتصحيح التجارب المطبعية بوليميريز الحمض النووي. استنساخ المنتج بكر الأولية وتحويل بنية كولاي اتباع الإرشادات الخاصة بالمورد بلازميد. تحقق من الجين الصحيح لتسلسل الفائدة سانغر التسلسل قبل استخدامها لاستنساخ الخطوات المقبلة.
ملاحظة: مواصفات بكر تحتاج إلى أن يكون الأمثل نظراً لخصوصيات تسلسل التمهيدي وشروط الرد الأمثل دنا بوليميريز. - تصميم كبسولة تفجير لتضخيم الجين الذرة من الفائدة دون تسلسل الترميز إشارة هضميد (SP).
- تمديد نهاية 5´ التمهيدي عكسي مع فكرة رسياتا و ضابط صفأنا قطع الموقع (الجدول 1).
- تضخيم الجين الذرة للفائدة مع بوليميريز الحمض النووي تصحيح التجارب المطبعية استخدام بنية بكر ولدت في 1.1 كقالب PCR.
- مزدوج-خلاصة المنتج بكر وبلازميد التحول U. مايديس ، p123-سأمpit2-سأمpit2-Zmmac1-مشري-ها15، مع إكسباو ضابط صف أولاً تنقية المنتج بكر وبلازميد هضمها.
- اضطر المنتج بكر هضمها في p123-سأمpit2-سأمpit2-Zmmac1-مشري-ها القالب باستخدام الحمض النووي T4 ليجاسى اتباع التعليمات manufacturer´s. تحويل المنتج ربط كولاي والتحقق من الجين الصحيح لتسلسل الاهتمام سانغر التسلسل.
- لينيريزي p123-سأمpit2-سأمpit2-Zmالجينات للفائدة-مشري-ها مع إنزيم التقييد Sspالأول وتحويل الحمض النووي في الولايات المتحدة سولوباثوجينيك مايديس سلالة SG20016. عزل ترانسفورمانتس مايديس الولايات المتحدة بالتحديد كاربوكسين وتأكيد ترانسفورمانتس معزولة بالجنوب لطخة تحليل16.
ملاحظة: لكل البروتين من الفائدة، مستقلة على الأقل ثلاثة مايديس U. ترانسفورمانتس ينبغي أن تكون معزولة وتحليلها لتقدير آثار النمط الظاهري أي خلفية عشوائية الطفرات.
2-ثقافة وسائل الإعلام
- إعداد ييبسلايت السائلة متوسطة16: استخراج الخميرة 1.0% (w/v)، 0.4% (w/v) باكتو-ببتون، والسكروز 0.4% (w/v). تذوب جميع المكونات في ddH2س والاوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة؛ التعقيم في درجة حرارة أعلى، لفترة أطول من الوقت أو بصورة متكررة وسوف يقلل من جودة المتوسطة.
- إعداد البطاطا-سكر العنب-أجار (PD-أجار)20: أجار سكر العنب البطاطا 3.9% (w/v)، و 1.0% (w/v) 1 م تريس-HCl pH 8.0 (نادي 0.01 M). مزيج جميع المكونات في الزجاجة للتعقيم مباشرة وإضافة ddH2س بالإضافة إلى حانة إثارة مغناطيسية. اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة؛ التعقيم في درجة حرارة أعلى، لفترة أطول من الوقت أو بصورة متكررة وسوف يقلل من جودة المتوسطة.
- إعداد PD-الفحم أجار20: 3.9% (w/v) البطاطا الدكستروز أجار والفحم 1% (w/v) 1.0% (v/v) 1 م تريس-HCl pH 8.0 (نادي 0.01 M). مزيج جميع المكونات في الزجاجة للتعقيم مباشرة وإضافة ddH2س بالإضافة إلى حانة إثارة مغناطيسية. اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة؛ التعقيم في درجة حرارة أعلى، لفترة أطول من الوقت أو بصورة متكررة وسوف يقلل من جودة المتوسطة.
3-مصنع العدوى
- إجراء تحليل لانقسام الخلية الذرة ردا على حصان طروادة تسليم البروتين (مثلاً، على أساس الفحص المجهري خلية العد) مسبقاً. U. مايديسالناجمة عن انتشار الخلايا الذرة ويبدأ تشكيل الورم اللاحقة حول 4-5 أيام بعد الإصابة. التقييمات الكمية المرض تعتمد على الأنسجة، وينبغي أن يتم من 6 إلى 14 يوما بعد الإصابة.
ملاحظة: أصناف الذرة متميزة تظهر مستويات مختلفة من التعرض للإصابة مايديس U. . الذرة جمقابل W23، A188، جاسب فلينت، أوائل الذهبي البنطم أو Va35 تظهر حساسية تجاه هذا الممرض وبالتالي فهي أصناف مناسبة للدراسات حصان طروادة. - إعداد العدوى مايديس u.
- وتشمل سلالة السلف SG200 كعنصر سلبي في كل حصان طروادة التجارب بغية تقدير الآثار الجانبية على العدوى بسلالة محوره وراثيا. هنا، استخدم سلالة مايديس الولايات المتحدة الإعراب عن نسخة غير يفرز البروتين من الفائدة كعنصر سلبي. ومع ذلك، لأسباب تتعلق بالطابع العملي (مثلاً، أكبر عروض)، سلالة السلف قد يكون الاختيار أسهل من التحكم.
- قبل البدء التجربة، تقدير ما كميات من عدوى الثقافة مطلوبة. نضع في اعتبارنا أن العدوى لكل مصنع يتطلب 1-1.5 مل تعليق مايديس الولايات المتحدة تعتمد على نوع النسيج الذرة.
ملاحظة: حوالي 1 مل ثقافة بين عشية وضحاها كافية لتمييع ل التطوير التنظيمي600 مل 0.2 في 20 من ييبسخفيفة متوسطة، ومل 25 ثقافة مايديس الولايات المتحدة مع OD600 من 0.8-1.0 كافية لعدوى نباتات 13-16. - الصفر مايديس U. من أجار PD لوحة باستخدام ماصة باستور معقمة وتطعيم في 5 مل من ييبسخفيفة متوسطة واسمحوا ثقافة تنمو في 28 درجة مئوية مع الهز المستمر في 200 لفة في الدقيقة ح 16.
- قبل الإصابة، دراسة ثقافة التطعيم مايديس شين بالفحص المجهري الخفيفة القياسية للنمو السليم والتلوث البكتيري في 400 X التكبير.
ملاحظة: في ثقافة مناسبة، وهو فقط على شكل السيجار الفطر مرئية (الشكل 2). - مزيج ميليلتر 900 من جديد ييبسالضوء مع 100 ميليلتر للثقافة بين عشية وضحاها، وقياس OD600 استخدام ييبسخفيفة متوسطة كقرص فارغ في تحليل جهاز المطياف الضوئي.
- تمييع الثقافة بين عشية وضحاها مع ييبسخفيفة متوسطة جديدة ل التطوير التنظيمي600 من 0.2 وترك ثقافة تنمو في 28 درجة مئوية مع الهز المستمر 200 لفة في الدقيقة حتى تصل إلى مرحلة النمو سجل منتصف المؤشرة التطوير التنظيمي600 نانومتر 0.8-1.0.
ملاحظة: U. مايديس الخلايا تكرار كل ح 2 في ظل هذه الظروف، وبالتالي التوصل إلى التطوير التنظيمي المطلوب600 بعد ح 4-5 من زراعة. - حصاد الخلايا OD600 من 0.8-1.0 بالغزل في 3,000 س ز لمدة 10 دقائق، وتجاهل المادة طافية.
- أغسل بيليه الخلية مرة واحدة مع ddH2o. لهذا الغرض، إضافة إلى حجم ثقافة واحدة من ddH2س، تدور مع 3000 x ز لمدة 10 دقائق وتجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه الخلية بعناية في ddH2س باستخدام ماصة زجاجية 20 مل، وبالتالي ضبط التطوير التنظيمي النهائي600 إلى 3.0 (بالنسبة مقايسة حصان طروادة) أو 1.0 (لتصنيف الأمراض).
- تحقق حصان طروادة: في إفراز بﻻنتا من البروتين الانصهار الذرة
- إصابة بذور الذرة مع سلالة حصان طروادة17.
- القيام بتصوير مجهرية من الشتلات المصابة في 2-3 أيام بعد العدوى باستخدام مجهر مسح ليزر [كنفوكل]. وتحقيقا لهذه الغاية، المكوس قطعة مستطيلة من ورقة 1 سم أسفل نقطة الحقن ووضع العينة على شريحة مجهر وإضافة قطره من ddH2o. أن تصور البروتينات الانصهار مشري، تثير عينة في λ = 561 نيوتن متر وسجل الانبعاثات في λ = 580-630 نيوتن متر.
- يترك عدوى ذرة الكبار
- زراعة نباتات الذرة إلى مرحلة يترك الكبار (عندما يقل نبات ينمو 7 داخل الساق).
ملاحظة: يتم الوصول إلى هذه المرحلة بعد أربعة أسابيع عند البذر تحت ظروف الاحتباس الحراري ح 14، 28 درجة مئوية اليوم/10 ح، وإيقاع ليلة 22 درجة مئوية باستخدام عام W23. قد تختلف المدة مع شروط الذرة الصنف والاحتباس الحراري. - نقل ثقافة مايديس U. (انظر 3.2.9) في محقن 3 مل مع إبرة حقن 20 × 1.
- اضغط ساق بعناية لتعريب الأنسجة أرض في الساق. ويمكن تمييز قاعدة أرض بانتقال من ساق أكثر صعوبة للأنسجة ليونة.
- وضع علامة أرض على ساق استخدام قلم.
- حقن 1.5 مل مايديس U. الثقافة 1 سم فوق أرض تبادل لإطلاق النار أو أرض نورات.
- معدل أعراض المرض في 6 و 12 يوما بعد الإصابة.
- زراعة نباتات الذرة إلى مرحلة يترك الكبار (عندما يقل نبات ينمو 7 داخل الساق).
- عدوى شرابات
- زراعة نباتات الذرة حتى وصلت إلى مرحلة شرابه.
ملاحظة: وكان وضع جدول زمني مفصل في التنمية العضو الذكرى وشرابه في عام الذرة W23 هو موضح سابقا18،19. شرابات المحتوية على أنثيرس هو ما قبل تكون عرضه للإصابة مايديس الولايات المتحدة ؛ في عام الذرة W23 شرابات بحجم 4-7 سم. - اضغط على ساق بعناية لتعريب الشرابة في الساق.
- وضع علامة على الحافة وقاعدة الشرابة على وقف استخدام قلم.
- نقل ثقافة مايديس U. (انظر 3.2.9) في محقن 3 مل مع إبرة حقن 20 × 1.
- حقن 1.5 مل العدوى حولها الشرابة. لضمان التوزيع المتساوي للعدوى، ببطء مكان كل 0.5 مل على الحافة والجزء الأوسط والقاعدة من شرابه تم وضع علامة بالقلم.
- معدل أعراض المرض في 10 أيام بعد الإصابة.
- زراعة نباتات الذرة حتى وصلت إلى مرحلة شرابه.
- عدوى آذان
ملاحظة: تطوير أنسجة الإذن تختلف في ظروف الاحتباس الحراري وأصناف الذرة متميزة ويجب أن يراعي بدقة قبل التطعيم. آذان بدأت تتفوق الحرير عرضه للعدوى U. مايديس .- نقل ثقافة مايديس U. (انظر 3.2.9) في محقن 3 مللي مع إبرة حقن 20 × 1.
- حقن إبرة التطعيم في المسافة بين أوراق قشر عميق قدر الإمكان دون إصابة الإذن.
- الإصدار 1.5 مل العدوى حول الإذن.
- إزالة حقنه بالإضافة إلى الإبر والتدليك بعناية الكوز لتوزيع حل مايديس الولايات المتحدة على قدم المساواة.
- معدل أعراض المرض في 14 يوما بعد الإصابة.
- التأكد من صلاحية العدوى مايديس u.
- إسقاط 10 ميليلتر من العدوى على طبق أجار فحم PD واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين.
ملاحظة: إذا كان كل ثقافة مايديس الولايات المتحدة غير قادرة على شكل خيوط، الميسليوم الأبيض رقيق، وتصبح مرئية (الشكل 5)
- إسقاط 10 ميليلتر من العدوى على طبق أجار فحم PD واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم استنساخ بنيات لإجراء التجارب على حصان طروادة U. مايديس إلى بلازميد ف p123أمpit2-سأمpit2-الجينات للاهتمام--متشيري--هكتار. الجين الذرة للفائدة هو تنصهر فيها مراسل مشري fluorescence وبيفرتون ها--الوسم. يتم التعبير عن البروتين الانصهار تحت سيطرة المروج مايديس الولايات المتحدة Umpit2 الذي يتم تنشيطه على وجه التحديد أثناء العدوى21. لإفراز مباشر من بروتين الببتيد الاهتمام إلى منطقة التفاعل بيوتروفيك، تنصهر فيها منطقة الترميز هو إشارة الببتيد تسلسل مايديس الولايات المتحدة Umpit221 (الشكل 1). عند تحويل مايديس شين ، يتم إدراج التحوير في SG200 الملكية الفكرية-موضع جزئ مثلى، والإدراج الجينوم المستهدفة يمكن التحقق من أن تحليل لطخة الجنوبي. ويؤكد [كنفوكل] ليزر المسح إفراز البروتين الانصهار يترك التصوير المجهري في الشتلات المصابة بسلالة حصان طروادة (الشكل 3). على سبيل مثال، شتلات مصابة أما سلالة حصان طروادة مايديس U. SG200Zmmac1 إفراز ZmMAC1-مشري أو عنصر تحكم غير حصان طروادة سلالة نسب Zm إذ تعرب عنmac1-مشري يفتقر إلى أمpit2- س، ومن ثم ليس سراً ZmMAC1 مشري-ها البروتين، مبينة في الشكل 315. خيوط فطرية إفراز ZmMAC1 محاطة مشري الفلورسنت إشارة (الشكل 3A). على النقيض من ذلك، إظهار عدم إفراز خيوط فطرية فقط إشارة fluorescence في السيتوبلازم الفطرية (الشكل 3B).
على وجه الخصوص، والعدوى شرابه مع مايديس الولايات المتحدة تعتمد على تطعيم الأنسجة السليمة، كما هو موضح في الخطوة 3، 5. يمكن أن ينتج التعريب شرابه غير لائق أو التوزيع غير المتكافئ للعدوى شرابه غير مصابة (الشكل 4A) أو فقط جزئية العدوى من الشرابة (الشكل 4 باء). لضمان توزيع متساو، يلزم العدوى ببطء الإفراج عن إبرة التطعيم للحصول على أنسجة كامل الإصابة (الشكل 4). يمكن التحقق من صلاحية العدوى عن طريق وضع المعالجة تجميعية في أجار PD-الفحم. سلالات المعدية تشكل خيوط الظهور ككتابة زغب على اللوحة كما هو موضح سولوباثوجينيك حصان طروادة السلف سلالة SG200 (الشكل 5A) بينما سلالة مايديس U. FB1 يتطلب التزاوج قبل تشكيل خيوط المعدية ( الشكل 5B).
| الاسم | إضافة التمهيدي | تسلسل (5´→3´) |
| إلى الأمام | جين إكسباي-الذرة | جكتكتاجا... |
| عكس | الجينات نكوي-رسياتا-الذرة | كاتجككاتجاجكجتجكجاتكجاجكج... |
الجدول 1: تسلسل الإضافات التمهيدي لإضافة الجانبين التقييد والحافز رسياتا الترميز تسلسل الجين الذرة للفائدة.
الشكل 1 : نظرة عامة التخطيطي مايديس U. حصان طروادة بلازميد استنساخ استراتيجية- Zmmac1 (رمادي فاتح) ينطلق من خلاصة مزدوجة من p123-سأمpit2-سأمpit2-Zmmac1-مشري-هكتار. في موازاة ذلك، يتم تضخيمه الجينات للفائدة (أصفر) ببكر. لاستنساخ الغرض، صممت أجهزة الإشعال إلى الأمام وعكس التي تشمل Xbaأنا و ضابط صفأنا استنساخ مواقع ورابط رسياتا (الأرجواني). المنتج بكر يهضم مع Xbaأنا و ضابط صفوأنا. بعد ربط، بلازميد حصان طروادة ويتضمن العناصر التالية: مدفوعا بالمروجpit2 أم، أمpit2-س (أزرق) هو تنصهر ن لا شفاء منه لجينة ذرة لمصلحة ORF (أصفر). ج-المحطة ورابط رسياتا، أحد جينات مراسل مشري (أحمر) و ها حانمه علامة (الأخضر) هي تنصهر تليها كودون توقف. قبل تحويل مايديس شين ، يهضم بلازميد حصان طروادة مع موفر الخدمات المشتركةالأول للسماح بإدماج مثلى في مايديسيب الولايات المتحدة-محور (رمادي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الفحص المجهري الضوء مايديس U. ثقافة التطعيم. عدة السيجار على شكل U. مايديس سبوريديا مرئية، بعضها الخضوع للناشئين (المشار إليها بواسطة علامات نجمية). أية خلايا أخرى موجودة التي تشير إلى تلوث الثقافة. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : في بﻻنتا [كنفوكل] ليزر المسح التصوير المجهري أوستيلاجو سلالة حصان طروادة. التصوير من البروتين ZmMAC1 الذرة التي تنصهر فيها مشري بعد الإصابة الشتلات الذرة باستخدام سلالة حصان طروادة SG200Zmmac1 (A) أو سلالة غير حصان طروادة SG200Zmmac1-نسب تفتقر إلى Umpit2-ليرة سورية (ب). يفرز ZmMAC1 مشري ها الانصهار البروتين يقع على سطح مايديس U. خيوط فطرية (A)15، وأشارت إلى جانب الرؤساء السهم. هو فقط هيولى التعريب من ZmMAC1 في SG200Zmmac1-نسب مرئية (ب)، أشارت إلى جانب النجمة 15. تغيير حجم أشرطة = 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : شرابه العدوى مع مايديس U.. تظهر العدوى غير ناجحة من شرابه مع مايديس U. (A) والعدوى شرابه الجزئية (ب) والعدوى شرابه كاملة (ج) 12 يوما بعد الإصابة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : فحص صلاحية العدوى في أجار PD-الفحم- سلالة سولوباثوجينيك SG2001 استخدمت لتوليد حصان طروادة. SG200 هو تحفيز ذاتي وأشكال خيوط المعدية على طبق أجار PD-فحم (A). فرداني سلالة مايديس U. FB1 يتطلب التزاوج مع سلالة متوافقة قبل نمو الخيطية (ب)22. تغيير حجم أشرطة = 2 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بحوث المحاصيل الحديثة تتطلب البروتوكولات للتحليل الجزيئي في الجينية ومستويات البروتين. الوصول الوراثية عن طريق التحول غير متاح أو غير فعال وتستغرق وقتاً طويلاً لمعظم أنواع المحاصيل مثل الذرة. وعلاوة على ذلك، الأدوات الوراثية الموثوقة، مثل نظم مراسل المروج نادرة، مما يجعل من الصعب على دراسة وظيفة البروتين في الموقع مع ارتفاع القرار الزمانية المكانية في مواقع متميزة من الأنسجة. يمكن دراسة البروتينات أبوبلاستيك بتسلل هيتيرولوجوسلي المعلنة وتنقية البروتينات داخل الأنسجة. على الرغم من أوجه التقدم في تعبير مغايرة من البروتين، تسلل المستهدفة إلى أنسجة المحاصيل زال صعبة وغالباً غير فعالة لتحليل البروتينات الوظيفية. استراتيجية حصان طروادة هو نهج بديلة التي لا تتطلب التحول أو تسلل البروتين. يمكن أن يتحقق عن طريق استخدام جهاز إفراز الممرض الذرة مايديس شين، تسليم أي البروتين نظرياً لمصلحة أبوبلاست المصنع من الأنسجة المصابة. وفيما يتعلق بحجم بروتين فائدة، حدود هذا الأسلوب لم استكشاف. في الاختبارات السابقة، كان المستجيب مايديس U. 290 الأحماض الأمينية Cmu1 تنصهر فيها مشري بنجاح يفرز7. بيد أن إمكانية تطبيق أسلوب حصان طروادة للبروتينات أكبر لا تزال لفحصها. في حالة غير مرغوب فيها إضافات التعديلات بوستترانسلاشونال للبروتين للفائدة، يمكن استخدام إفراز غير تقليدية كمسار بديل لإفراز الكلاسيكية عن طريق س14.
مايديس U. يعملون كأداة قياسية في التكنولوجيا الأحيائية البروتين نظراً لطي البروتين موثوقة والتعديل بوستترانسلاشونال وإفراز كفاءات11،،من1213. ومع ذلك، يحتاج إفراز البروتين لكل سلالة جديدة من حصان طروادة يتم تحليلها بعناية كما هو موضح في الخطوة 3. من المستحسن القيام بالاختبار الأولى لكل سلالة حصان طروادة الذي تم إنشاؤه حديثا بإصابة الشتلات التي سهلة لتصيب وتفتيش بالتصوير المجهري.
SG200 هو سلالة سولوباثوجينيك التي لا تتطلب التزاوج قبل التجارب حصان طروادة وهو أسهل للتعامل مع ذلك. على الرغم من أن كفاءة عدوى سلالات متوافقة مثل FB1 FB2 هو أعلى23، كفاءة SG200 كافية لإجراء التجارب على حصان طروادة. يجري تناول بعض البروتينات المستجيب مايديس U. بالخلايا المضيفة، بينما آخرون البقاء في أبوبلاست. التفرقة بين كلا الفريقين ويبدو أن عملية مراقبة ومحددة؛ ومع ذلك، الآليات الكامنة تظل بعيدة المنال8 ولا يمكن أن تؤخذ في الاعتبار عند تصميم تجربة. ومن ثم، البروتينات ذات الأهمية التي يجب أن تدمج في جدار الخلية أو أن يكون التصرف إينتراسيلولارلي لا مرشحين مناسبين للنهج حصان طروادة.
منذ مايديس U. القاهر في إصابة الأنسجة الذرة الجوي المتنوعة، يمكن تطبيق أسلوب حصان طروادة للبروتينات متعددة، في أنسجة مختلفة وفي مراحل نمو النبات المختلفة، مثل أوراق الشتلات، ويترك الكبار، شرابات، و آذان. على سبيل المثال عدد قليل من التطبيقات المفيدة، يسمح حصان طروادة اختبار الجرعة المحلية أو آثار البروتين التسلل أو توصيف وظيفي من نطاقات البروتين متميزة.
الحفاظ على غير ملوثة مايديس U. الثقافة أمر بالغ الأهمية لجميع التجارب التي وصفت منذ الإصابة المشتركة مع كمية كبيرة من البكتيريا يطلق الاستجابة المناعية للنبات ويغير رد فعل تجاه البروتين الفائدة، مما يجعل أي نتائج غير حاسمة. يترك حصان طروادة دراسات في تعليم الكبار، شرابات وآذان المراد تنفيذها مع أقصى 1.5 مل عدوى الثقافة قد تؤدي زيادة حجم تلف الأنسجة. يمكن تدريب التهابات شرابه والإذن باستخدام الغذاء الملطخة بالألوان المائية بدلاً من العدوى أوستيلاجو .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب يود أن يشكر هيلدبراند أرمين ونور الدين ديلا، توماس دريسيلهاوس ومارتن بارنيسكي لتوفير مواد المختبر الفضائي ومحطة. كان يدعمها العمل الأصلي على طريقة حصان طروادة زمالة بوستدوك ليوبولدينا وجبهة الخلاص الوطني المشروع IOS13-39229. وأيد SFB924 (مشاريع A14 و B14) من DFG العمل المعروضة في هذه المقالة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
| 23 G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
| Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
| Cuvette (10 mm x 4 mm x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
| Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
| Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | use locally available equipment | ||
| Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Yeast extract | BD | 212750 |
References
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Doehlemann, G., et al. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).
- Matei, A., et al. How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves. New Phytologist. , (2018).
- Doehlemann, G., et al. Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis. The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).
- Doehlemann, G., et al. Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells. PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).
- Redkar, A., et al. A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors. The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).
- Djamei, A., et al. Metabolic priming by a secreted fungal effector. Nature. 478, 395-398 (2011).
- Tanaka, S., et al. A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize. eLife. 3, e01355 (2014).
- Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2. PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).
- Ziemann, S., et al. An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize. Nature Plants. 4, 172-180 (2018).
- Juárez-Montiel, M., et al. The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines. PLoS One. 10, e0133535 (2015).
- Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. Schmoll, M., Dattenböck, C. , Springer International Publishing. 183-200 (2016).
- Monreal-Escalante, E., et al. The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse. Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).
- Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
- van der Linde, K., et al. Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ. The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).
- Bösch, K., et al. Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).
- Chavan, S., Smith, S. M. A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines. Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).
- Kelliher, T., Walbot, V. Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule. Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).
- Egger, R. L., Walbot, V. Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies. Maydica. 60, M34 (2015).
- Holliday, R. Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. King, R. C. , Springer US. 575-595 (1974).
- Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation. Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).
- Banuett, F., Herskowitz, I. Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).
- Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1. The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).
