Summary
这项工作描述了克隆一个 ust原 maydis特洛伊木马菌株, 以便在原地传递分泌的玉米蛋白到三种不同类型的玉米组织。
Abstract
在荷马特洛伊木马神话的启发下, 我们设计了玉米病原体乌斯蒂拉戈·梅迪斯,将分泌的蛋白质传递到玉米注入中, 允许在体内进行表型分析。这种方法不依赖于玉米的转化, 而是利用了微生物遗传学和病原体的分泌能力。在这里, 它允许检查体内提供的分泌的蛋白质与高时空分辨率在不同种类的感染部位和组织。特洛伊木马策略可用于瞬时补充玉米功能损失表型, 功能表征蛋白质域, 分析非目标蛋白效应, 或研究单侧蛋白质过量, 使其成为一个强大的工具玉米作物系统中的蛋白质研究。这项工作包含了一个精确的协议, 如何生成特洛伊木马菌株, 然后是标准化的感染协议, 将这种方法应用于三种不同的玉米组织类型。
Introduction
生物养病原体乌斯蒂拉戈梅迪斯是玉米黑麦病1的病原体。它感染玉米的所有空中部位, 导致大肿瘤, 其中含有黑色素化的黑色孢子。在全球范围内,据估计, 美国梅迪斯每年会造成玉米产量损失 2% 左右, 而在墨西哥, 肿瘤被认为是一种美食。植物感染是由一种附着物引起的, 这种酶分泌细胞壁裂解酶, 以穿透玉米表皮细胞的第一层。从一个主要的感染部位,美国的梅迪斯生长在细胞内和细胞间, 每天侵入一到两个细胞层 1,2。成功的感染导致植物肥大, 在感染后5天变成可见的肿瘤 1,3,4。在所有感染阶段, 真菌菌丝侵入植物细胞质膜, 而不与宿主细胞质1,2有任何直接接触。感染菌丝与植物质膜之间紧密的表质空间被认为是宿主病原体的互动位点, 称为生物养能相互作用区。为了克服植物固有的免疫系统,美国将一系列效应蛋白分泌到生物养相互作用区 1。一些效应被植物细胞吸收, 而另一些效应则留在生物养细胞相互作用区 5、6、7、8。一个热塑性效应器是 umpit2, 它与热塑性玉米蛋白酶相互作用, 通过热塑性蛋白酶活性9,10防止 zmprozip 中的信号肽 zmzip1 的释放。
在过去的几十年里,由于人们对生命周期的了解、遗传的可及性和分泌物的异种表达, 美国梅迪斯不仅成为植物-病原体相互作用中真菌遗传学的典范, 而且成为生物技术中的一个宝贵工具。蛋白质11,12,13。常规和非常规蛋白质分泌的信号已被确定, 允许控制翻译后的修饰 14.最近,美国梅迪斯被用作特洛伊木马工具, 在原地研究小的、分泌的玉米蛋白.成功地应用特洛伊木马方法分析了参与花药发育的小的分泌蛋白 zmmac1 的功能。zmmac1 诱导新形成的细胞15的多能细胞的周周分裂和细胞命运指标.用同样的方法揭示了玉米损伤相关肽 zmzip1 的生物学功能。美国的梅迪斯分泌玉米 zmzip1 导致肿瘤形成受损10。因此, 特洛伊木马方法是一种有价值的替代途径, 可用于具有较高时空分辨率的原位蛋白质研究, 既不需要生成稳定的玉米转化线, 也不需要异源组织浸润表达和纯化的蛋白质。特别是, 特洛伊木马策略使任何异源蛋白分泌到玉米植物体内, 并直接比较同一组织内受感染的植物细胞与未感染的植物细胞。
该协议说明了产生一个美国梅迪斯特洛伊木马菌株来研究感兴趣的蛋白质的主要步骤。它还包括关于三种不同玉米组织类型 (成年叶子、花被和耳朵) 感染程序的准确信息, 这是研究时空感染进展和蛋白质功能的先决条件在这些目标组织中没有对玉米基因扩增和显微成像技术作出进一步的规定, 因为这些步骤是针对特定目标和与仪器有关的。因此, 该协议是针对有经验的标准分子生物学技术的用户。
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Protocol
1. 建造一个 u. maydis特洛伊木马
请注意:请参见图 1。
- 利用基因特异性引物和 dna 聚合酶校对, 放大玉米 cdna 中感兴趣的基因。克隆主要 pcr 产物, 并按照质粒供应商的指示将结构转化为大肠杆菌.在使用下一个克隆步骤之前, 通过 sanger 测序验证感兴趣序列的正确基因。
请注意:由于引物序列特性和最佳的 dna 聚合酶反应条件, pcr 规范需要优化。 - 设计引物来扩增感兴趣的玉米基因, 而不使用编码信号肽 (sp) 的序列。
- 使用 rsiata 主题和ncoi 切割站点扩展反向底漆的5端 (表 1)。
- 利用1.1 中生成的 pcr 结构作为 pcr 模板, 用 dna 聚合酶进行校对, 扩增感兴趣的玉米基因。
- 双消化 pcr 产物和u. maydis 转化质粒, p123-pumpit2-spum pit2-zmmac1-marriri-ha 15,与xbai 和 nco纯化消化后的 pcr 产物和质粒。
- 将消化后的 pcr 产品加入到p123-pumpit2-spum pit2-zmmac1-mcherri-ha模板中使用 t4 dna 连接酶跟随制造商的说明。将结扎产物转化为大肠杆菌,并通过桑格测序验证感兴趣序列的正确基因。
- 利用限制性酶 sspi对 p123-p um pit2-spum pit2-zm 基因进行线性化, 并将 dna 转化为太阳致病性 u。梅迪斯菌株 sg20016。通过卡卡新的选择分离u.可能的转化物, 并通过南方印迹分析确认分离的变压器16。
请注意:对于每个感兴趣的蛋白质, 至少应分离和分析三个独立的u. maydis转化物, 以估计随机背景突变的表型效应。
2. 文化传媒
- 制备 yepsl特液体培养基16:1.0% (w/v) 酵母提取物, 0.4% (w/v) bacto-peppone, 0.4% (w/v) 蔗糖。在121°c 下溶解 ddh2o 中的所有组件和高压灭菌器 15分钟;在较高的温度下高压灭菌, 时间较长或反复, 会降低介质的质量。
- 准备 poto-dextrose-agar (pd-agar) 20:3.9% (w/v) 马铃薯葡萄糖琼脂, 1.0% (w/v) 1 m Tris-HCl ph 值 8.0 (fc. 0.01 m)。将瓶子中的所有成分直接混合, 以便高压灭菌, 并添加 ddh2o和磁性搅拌杆。121°c 高压灭菌器 15分钟;在较高的温度下高压灭菌, 时间较长或反复, 会降低介质的质量。
- 准备 pd-charcoaragar20:3.9%(w/v) 马铃薯葡萄糖琼脂, 1% (w/v) 木炭, 1.0% (v/v) 1 m Tris-HCl ph 值 8.0 (fic. 0.01 m)。将瓶子中的所有成分直接混合, 以便高压灭菌, 并添加 ddh2o和磁性搅拌杆。121°c 高压灭菌器 15分钟;在较高的温度下高压灭菌, 时间较长或反复, 会降低介质的质量。
3. 植物感染
- 事先对特洛伊木马提供的蛋白质 (例如,基于显微镜的细胞计数) 进行玉米细胞分裂分析。美国可能引起的玉米细胞增殖和随后的肿瘤形成开始约4-5 后感染。定量疾病评估取决于组织, 应在感染后6至14天进行。
请注意:不同的玉米品种对美国可能感染的易感性程度不同。玉米c vs. w23、a188、gaspe 火石、早期金班塔姆或 va35 对这种病原体表现出易感性, 因此是适合特洛伊木马研究的品种。 - 接种的制剂
- 在所有特洛伊木马实验中都包括了祖株 sg200 作为负对照, 以估计转基因菌株感染的副作用。在这里, 使用美国的梅迪斯菌株来表达一个非分泌版本的蛋白质感兴趣的作为一个负对照。然而, 由于实用性的原因 (例如,较大的筛选), 祖株菌株可能是更容易选择的控制。
- 在开始实验之前, 估计需要多少感染培养。请记住, 每株植物的感染需要 1-1.5 ml 的u. maydis悬浮液取决于玉米组织类型。
请注意:大约1毫升的隔夜培养物足以稀释到 ods 600 的 0.2,在20毫升的yeps 轻介质, 25 毫升的美国梅迪斯培养与od600 0.8-1.0 是足够的感染13-16 植物。 - 从 pd 琼脂板上划伤, 使用无菌的巴斯德移液器, 在 yeps 轻介质的5毫升中接种, 让培养物在 28°c时生长, 在200转/分的温度下不断晃动, 每小时200转.
- 在感染之前, 用标准的光学显微镜检查美国的梅迪斯接种培养物, 以获得400x 放大倍率的适当生长和细菌污染。
请注意:在合适的培养中, 只有雪茄状的真菌是可见的 (图 2)。 - 在分光光度计分析中, 将900μl 的新鲜 yops光与 100μl的隔夜培养物混合, 并使用 yeps轻介质作为空白测量 od 600。
- 用新鲜的 yeps培养基将隔夜培养稀释至 od600的 0.2, 并让培养物在28°c 时生长, 在200点转速下不断晃动, 直到达到 od600 纳米为 0.8-1.0 的中对数生长阶段。
请注意:在这些条件下, u. maydis 细胞每2小时重复一次, 因此在4-5 的培养后达到所需的 od600 . - 以0.8-1.0 的 od收获细胞, 以 3, 000 x克的速度旋转 10分钟, 并丢弃上清液。
- 用 ddh2o清洗一次细胞颗粒。为此, 加入一个 ddh2o的培养体积, 用 3000 x g 旋转10分钟, 丢弃上清液。
- 使用20-ml 玻璃移液器在 ddh2o中小心地重新拔插细胞颗粒, 从而调整最终 od600至 3.0 (用于特洛伊木马检测) 或 1.0 (用于疾病等级)。
- 特洛伊木马的验证: 玉米融合蛋白在植物分泌中的含量
- 用特洛伊木马菌株17感染玉米幼苗.
- 使用共聚焦激光扫描显微镜对感染幼苗在感染后2-3天进行显微成像。为此, 切除一片长方形的叶子1厘米以下的注射点, 将样品放在显微镜幻灯片上, 并添加一滴 ddh2o.为了可视化 mcherry 融合蛋白, 激发样品在 = 561 nm 和记录发射在 = 580-630 nm。
- 成年玉米叶片感染
- 将玉米植株培育成成虫 (当至少在茎中生长7叶)。
请注意:在14小时、28°c 日、22°c 的夜间节奏下使用 cv. w23 播种后四周后, 达到了这一阶段。持续时间可能因玉米品种和温室条件而异。 - 将u. maydis培养物 (见 3.2.9) 转移到带有 20g x 1 皮下注射针的3毫升注射器中。
- 小心地按下茎, 将茎中的分生组织定位。分生组织的基部可以通过从较硬的茎过渡到较软的组织来区分。
- 用钢笔在茎上标记分生组织。
- 在拍摄分生组织或花序分生组织上方1厘米处注入 1.5 ml 的 u . maydis 培养物。
- 在感染后6天和12天的情况下评价疾病症状。
- 将玉米植株培育成成虫 (当至少在茎中生长7叶)。
- 贻贝感染
- 种植玉米植株, 直到达到花子阶段。
请注意:关于玉米 cv. w23 中花药和花被开发的详细时间表先前描述了18,19。含有减数分裂前花药的流苏极易受到美国的可能感染;在玉米 cv. w23 中, 轮穗的大小为4-7 厘米。 - 小心地按下茎, 将茎中的线丝定位。
- 用钢笔在茎上标记花丝的尖端和底部。
- 将u. maydis培养物 (见 3.2.9) 转移到带有 20g x 1 皮下注射针的3毫升注射器中。
- 在流苏周围注入1.5 毫升的接种器。为了确保接种器的均匀分布, 慢慢地将 0.5 ml 分别放置在尖端、中间部分和用笔标记的流苏底部。
- 在感染后10天的情况下得出疾病症状。
- 种植玉米植株, 直到达到花子阶段。
- 耳朵感染
注:不同的玉米品种和温室条件下的耳朵组织发育不同, 在接种前必须仔细观察。开始长出丝绸的耳朵极易受到美国的可能感染.- 将u. maydis培养物 (见 3.2.9) 转移到带有 20g x 1 皮下注射针的3毫升注射器中。
- 在不伤害耳朵的情况下, 将接种针注入外壳叶片之间的空间, 以尽可能深的程度。
- 释放在耳朵周围接种的1.5 毫升。
- 取出注射器加针头, 仔细按摩芯, 均匀地分发u. misis 溶液。
- 在感染后14天的情况下得出疾病症状。
- 确认美国接种疫苗的可行性
- 将接种剂的10μl 滴在 pd 木炭琼脂板上, 在室温下孵育2天。
请注意:如果各自的美国梅迪斯培养能够形成细丝, 蓬松的白色菌丝体就会显现 (图 5)
- 将接种剂的10μl 滴在 pd 木炭琼脂板上, 在室温下孵育2天。
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Representative Results
构建 u. maydis特洛伊木马实验被克隆到质粒 p123-p umpit2-spum pit2-基因的兴趣 mmcherrie-ha.感兴趣的玉米基因与mcherry荧光记者和表位 ha标记融合在一起。融合蛋白的表达在美国的 fydis umpit2启动子的控制下, 该启动子在感染 21期间被特别激活。为了将感兴趣的肽蛋白直接分泌到生物养相互作用区, 编码区域融合到 u. maydis umpit221的信号肽序列中。在u. maydis转化后, 转基因通过同源重组插入 sg200 ip位点, 并通过南方印迹分析验证有针对性的基因组插入。融合蛋白的分泌通过共聚焦激光扫描显微镜成像证实了幼苗叶片感染特洛伊木马菌株 (图 3)。例如, 感染u. maydis特洛伊木马菌株 sg200zmmac1的幼苗分泌 zmmac1-mcherry 或表示 nosp-zm mac1-mcherry 的非特洛伊木马控制菌株, 而这种菌株缺乏 um pit2-sp, 随后不保密 zmac1-mcherry-ha 蛋白, 如图 315所示。分泌 zmmac1 的希帕被荧光 mcherry 信号包围 (图 3 a)。相反, 非分泌菌丝只在真菌细胞质中显示荧光信号 (图 3b)。
特别是, 流苏感染与美国梅迪斯依赖于适当的组织接种, 如步骤3.5 中所述。接种器的不适当的流苏定位或分布不均可能导致未感染的流苏 (图 4a) 或仅部分感染流苏 (图 4A)。为了确保均匀分布, 接种疫苗需要慢慢地从接种针中释放, 以获得整个组织感染 (图 4c)。通过在 pd-char烟ar 上放置液滴, 可以验证接种剂的可行性。感染菌株形成细丝, 在盘上出现写绒毛, 如孤头特洛伊木马祖株 sg200 (图 5a) 所示, 而u. maydis菌株 fb1 需要在感染性长丝形成前交配 (图 5b)。
| 名字 | 底漆加法 | 序列 (5 ' → 3 ') |
| 向前 | xbai-玉米基因 | gctctaga..。 |
| 反向 | 恩戈伊-rsiat-玉米基因 | catgcagggggggggggggggaggcg..。 |
表 1: 在感兴趣的玉米基因中添加限制侧和 rsiata 母题编码序列的引物添加序列。
图 1: 原理图概述美国梅迪斯特洛伊木马质粒克隆策略.zmmac1 (浅灰色) 是由双消化从p123-pumpit2-spum pit2-zmmac1-mcherriri-ha 的双消化释放。同时, 感兴趣的基因 (黄色) 被 pcr 扩增。为了克隆目的, 正向和反向引物的设计包括xbai 和ncoi 克隆站点和 rsiata 链接器 (紫色)。用xbai 和ncoi 对 pcr 产物进行消化。结扎后, 特洛伊木马质粒包含以下元素: 由 umpit2启动子驱动, umpit2-sp(蓝色) 与感兴趣的 orf (黄色) 的玉米基因融合 n-末端。在 c-dina, 一个 rsiata 链接器,一个 mcherry记者基因 (红色) 和一个 ha表位标签 (绿色) 融合在一起, 然后是一个停止密码子。在u. maydis转化之前, 特洛伊木马质粒被sspi 消化, 以允许同源的集成到美国的梅迪普-轨迹 (灰色)。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 光镜检查美国的疫苗接种文化。几个雪茄状的斑潜蝇是可见的, 其中一些正在萌发 (用星号表示)。没有进一步的细胞表明培养物受到污染。刻度栏 = 20μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:在普兰塔共聚焦激光扫描显微成像.乌斯蒂拉戈特洛伊木马应变.利用特洛伊木马菌株 sg200zm mac1 (a) 或非特洛伊木马菌株 sg200 zm mac1-nosp 对玉米幼苗感染后 mcherry融合玉米蛋白 zmmac1 的成像. 分泌的 zmac1-mcherry-ha 融合蛋白位于u. maydis hyphae (a)15的表面, 用箭头头表示。在 sg200zmmax1-nosp 中, 只有 zmmac1 的细胞质定位是可见的 (b), 用星号15表示。刻度条 = 5μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 塔塞尔感染你的梅迪斯在感染12天后, 发现未能成功的卡塞尔感染与u. maydis (a)、部分卡塞尔感染 (b) 和完全的卡塞尔感染 (c)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: pd-炭琼脂的气素活性测定.将太阳致病菌株 sg2001用于特洛伊木马的生成。sg200 是自我刺激的, 在 pd-char富有琼脂板 (a) 上形成传染性细丝。单倍体u. maydis 菌株 fb1 要求在丝状生长 (b)22之前与兼容菌株交配。刻度条 = 2 毫米。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
现代作物研究需要关于基因和蛋白质水平的分子分析的协议。对于玉米等大多数作物品种来说,通过转化实现遗传可及性是不可用的, 也是效率低下和耗时的。此外, 可靠的遗传工具, 如启动子报告系统, 这使得很难研究在不同的组织部位具有高时空分辨率的原位蛋白功能。光蛋白可以通过异源表达和纯化的蛋白质渗入组织来研究。然而, 尽管异源蛋白表达取得了进展, 但有针对性地渗入作物组织仍然很困难, 而且在蛋白质功能分析方面往往效率低下。特洛伊木马策略是一种不需要转化或蛋白质渗透的替代方法。通过使用玉米病原体 u . maydis的分泌物, 理论上可以将任何感兴趣的蛋白质输送到受感染组织的植物植物体中。关于感兴趣的蛋白质的大小, 这种技术的局限性还有待探讨。在以前的检测中, 290个氨基酸u. maydis效应器 cmu1 与 mcherry 融合成功分泌了 7。然而, 特洛伊木马方法对更大蛋白质的适用性仍有待检验。如果添加翻译后修饰的蛋白质感兴趣的是不可取的, 非常规分泌物可以作为一个替代途径,通过sp14 经典分泌物。
由于可靠的蛋白质折叠、翻译后修饰和分泌效率11、12、13, 美国梅迪斯被用作蛋白质生物技术的标准工具.然而, 蛋白质分泌的每一个新的特洛伊木马菌株需要仔细分析, 如步骤3中所述。建议通过感染易于感染和通过显微成像检查的幼苗, 对每一个新产生的特洛伊木马菌株进行初步测试。
sg200 是一种太阳致病菌株, 在特洛伊木马实验之前不需要交配, 因此更容易处理。尽管 fb1 和 fb2 等兼容菌株的感染效率较高, 但sg200 的感染效率足以进行特洛伊木马实验。一些u. maydis效应蛋白被宿主细胞吸收, 而另一些则留在中风中。这两个群体之间的区别似乎是一个有控制和具体的过程;然而, 潜在的机制仍然难以捉摸 8, 在设计实验时不能考虑到这一点。因此, 感兴趣的蛋白质, 必须集成到细胞壁或必须在细胞内行动, 是不适合的候选人特洛伊木马的方法。
由于u. maydis在感染各种空中玉米组织方面是万能的, 特洛伊木马方法可应用于多种蛋白质, 在不同的组织和不同的植物发育阶段, 如幼苗叶片, 成虫, 外带, 和耳朵。仅举几个有用的应用, 特洛伊木马允许测试局部过量, 越位蛋白效应, 或功能表征的不同蛋白质领域。
维持未被污染的美国梅迪斯培养对所有上述实验都至关重要, 因为与大量细菌的联合感染会触发植物的免疫反应, 并改变其对感兴趣的蛋白质的反应, 从而使任何结果没有定论。特洛伊木马研究成人叶子, 外翻和耳朵必须进行最大1.5 毫升感染培养, 因为更高的体积可能会导致组织损伤。流苏和耳部感染可以训练使用食物颜色染色的水, 而不是乌斯蒂拉戈接种。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢托马斯·德雷塞尔豪斯、马丁·帕尼斯克、努雷丁·杰拉和阿明·希尔德布兰德提供的实验室空间和植物材料。关于特洛伊木马方法的最初工作得到了 leopoldina 博士后研究金和 nsf 项目 ios13-9229 的支持。本文介绍的工作得到了 dfg sfb924 (项目 a14 和 b14) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
| 23 G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
| Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
| Cuvette (10 mm x 4 mm x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
| Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
| Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | use locally available equipment | ||
| Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Yeast extract | BD | 212750 |
References
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