Summary
इस काम का वर्णन एक Ustilago मेडिस ट्रोजन हॉर्स तनाव के लिए में सीटू प्रसव के लिए स्रावित मक्का प्रोटीन की क्लोनिंग मक्का के ऊतकों के तीन विभिन्न प्रकार में.
Abstract
होमर ´ एस ट्रोजन हॉर्स मिथक से प्रेरित होकर, हम मक्का रोगज़नक़ Ustilago मेडिस vivo phenotypic विश्लेषण में अनुमति apoplast मक्का में स्रावित प्रोटीन देने के लिए इंजीनियर । इस विधि मक्का परिवर्तन पर निर्भर नहीं करता है, लेकिन माइक्रोबियल आनुवंशिकी और रोगजनकों के स्रावी क्षमताओं का दोहन । इस के साथ साथ, यह के निरीक्षण की अनुमति देता है vivo में संक्रमण साइटों और ऊतकों के विभिंन प्रकार पर उच्च spatiotemporal संकल्प के साथ स्रावित प्रोटीन दिया । ट्रोजन हॉर्स रणनीति क्षणिक मक्का नुकसान का उपयोग किया जा सकता है-समारोह phenotypes, कार्यात्मक प्रोटीन डोमेन विशेषताएं करने के लिए, ऑफ लक्ष्य प्रोटीन प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए, या onside प्रोटीन खुराक का अध्ययन करने के लिए, यह एक शक्तिशाली उपकरण बनाने के लिए खाद्यान फसल प्रणाली में प्रोटीन की पढ़ाई । यह काम कैसे एक ट्रोजन हॉर्स मानकीकृत संक्रमण प्रोटोकॉल के बाद तनाव उत्पंन करने के लिए तीन अलग मक्का ऊतक प्रकार के लिए इस पद्धति को लागू करने पर एक सटीक प्रोटोकॉल शामिल हैं ।
Introduction
biotrophic रोगज़नक़ Ustilago मेडिस मकई मैल रोग की प्रेरणा का एजेंट है1। यह बड़े ट्यूमर में जिसके परिणामस्वरूप मक्का के सभी हवाई भागों को संक्रमित करता है जिसमें melanized, काले बीजाणु होते हैं । वैश्विक स्तर पर, मेडिस को मकई की उपज के लगभग 2% की वार्षिक हानि का कारण अनुमान है, जबकि ट्यूमर मेक्सिको में एक लजीज विनंरता के रूप में सराहना की जाती है । संयंत्र संक्रमण एक appressorium है कि सेल दीवार lysing एंजाइमों को मक्का एपिडर्मल कोशिकाओं की पहली परत घुसना स्रावित द्वारा शुरू की है । एक प्राथमिक संक्रमण साइट से, मेडिस intracellularly और सेलुलर बढ़ता है, एक दो सेल परतों हर दिन1,2पर हमला । संयंत्र अतिवृद्धि में सफल संक्रमण के परिणाम है कि पांच दिनों के बाद संक्रमण1,3,4पर दिखाई ट्यूमर में बदल जाता है । सभी संक्रमण चरणों के दौरान, कवक hyphae invaginate के बिना किसी भी सीधे संपर्क के संयंत्र कोशिका द्रव्य झिल्ली कोशिका द्रव्य1,2। संक्रमित hyphae और संयंत्र प्लाज्मा झिल्ली के बीच तंग apoplasmic अंतरिक्ष मेजबान/रोगज़नक़ इंटरएक्टिव साइट माना जाता है, biotrophic संपर्क क्षेत्र कहा जाता है । आदेश में संयंत्र जंमजात प्रतिरक्षा प्रणाली को दूर करने के लिए, मेडिस biotrophic संपर्क क्षेत्र1में प्रभावक प्रोटीन की एक सरणी स्रावित । कुछ प्रभाव संयंत्र कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है, जबकि अंय biotrophic संपर्क क्षेत्र5,6,7,8में रहते हैं । एक apoplastic प्रभाव UmPit2 है, जो apoplastic मक्का के साथ सूचना का आदान प्रदान करने के लिए ZmPROZIP से संकेतन पेप्टाइड ZmZIP1 की रिहाई को रोकने के साथ इंटरैक्ट करता गतिविधि9,10।
पिछले दशकों में, मेडिस न केवल संयंत्र में कवक आनुवंशिकी के लिए एक मॉडल-रोगज़नक़ संपर्क बन गया है , लेकिन यह भी एक अच्छी तरह से समझ में आ जीवन चक्र, आसान आनुवंशिक पहुंच और heterologous अभिव्यक्ति की वजह से जैव प्रौद्योगिकी में एक महत्वपूर्ण उपकरण स्रावित प्रोटीन्स11,12,13. दोनों पारंपरिक और अपरंपरागत प्रोटीन स्राव के लिए संकेत posttranslational संशोधनों के नियंत्रण की अनुमति निर्धारित किया गया है14। हाल ही में, मेडिस 15सीटू में छोटे, गुप्त मक्का प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए एक ट्रोजन हॉर्स उपकरण के रूप में कार्यरत था । ट्रोजन हॉर्स दृष्टिकोण सफलतापूर्वक छोटे, गुप्त प्रोटीन ZmMAC1 है कि anther विकास में शामिल है के समारोह का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । ZmMAC1 नई गठित कोशिकाओं के pluripotent कोशिकाओं और सेल भाग्य विनिर्देश के periclinal विभाजन लाती है15. इसी विधि द्वारा खाद्यान क्षति से संबंधित पेप्टाइड ZmZIP1 के जैविक कार्य का पता चला । यू मेडिस स्रावित मक्का ZmZIP1 बिगड़ा ट्यूमर गठन10में हुई । इस प्रकार, ट्रोजन हॉर्स दृष्टिकोण उच्च spatiotemporal संकल्प है कि न तो स्थिर मक्का परिवर्तन लाइनों के उत्पादन की आवश्यकता होती है और न ही heterologously के साथ ऊतक घुसपैठ के साथ सीटू के अध्ययन में प्रोटीन के लिए एक मूल्यवान वैकल्पिक मार्ग का प्रतिनिधित्व करता है व्यक्त और शुद्ध प्रोटीन । विशेष रूप से, ट्रोजन हॉर्स रणनीति एक ही ऊतक के भीतर मक्का apoplast और संक्रमित बनाम गैर संक्रमित संयंत्र कोशिकाओं के प्रत्यक्ष तुलना में किसी भी heterologous प्रोटीन के स्राव को सक्षम बनाता है ।
इस प्रोटोकॉल एक यू मेडिस ट्रोजन हार्स तनाव पैदा करने के लिए ब्याज की एक प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए प्रमुख कदम दिखाता है । यह आगे spatiotemporal संक्रमण प्रगति और प्रोटीन समारोह का अध्ययन करने के लिए एक शर्त है जो मेडिसके साथ तीन अलग मक्का ऊतक प्रकार (वयस्क पत्तियों, लटकन और कान) के संक्रमण प्रक्रियाओं पर सटीक जानकारी शामिल इन लक्ष्य ऊतकों में । कोई आगे विनिर्देशों मक्का जीन प्रवर्धन और सूक्ष्म इमेजिंग तकनीक पर दिया जाता है, क्योंकि इन कदमों के लक्ष्य विशिष्ट और साधन-निर्भर कर रहे हैं । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल मानक आणविक जीवविज्ञान तकनीक के अनुभवी उपयोगकर्ताओं को संबोधित किया है ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. एक यू मेडिस ट्रोजन हॉर्स का निर्माण
नोट: चित्र 1देखें ।
- जीन विशिष्ट प्राइमरों और एक शु डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग कर मक्का सीडीएनए से ब्याज की एक जीन बढ़ाना. प्राथमिक पीसीआर उत्पाद क्लोन और प्लाज्मिड विक्रेता के निर्देशों का पालन ई. कोलाई में निर्माण को बदलने। अगले क्लोनिंग चरणों के लिए उपयोग करने से पहले सैंज अनुक्रमण द्वारा ब्याज अनुक्रम की सही जीन सत्यापित करें ।
नोट: पीसीआर निर्दिष्टीकरण प्राइमर अनुक्रम विशिष्टताओं और इष्टतम डीएनए पोलीमरेज़ प्रतिक्रिया शर्तों के कारण अनुकूलित करने की जरूरत है. - डिजाइन प्राइमरों के लिए एक संकेत पेप्टाइड (सपा) अनुक्रम एंकोडिंग के बिना ब्याज की मक्का जीन बढ़ाना ।
- RSIATA आकृति और एक Ncoमैं काटने साइट (तालिका 1) के साथ रिवर्स प्राइमर के 5 ´ अंत विस्तार ।
- एक ठीक डीएनए पोलीमरेज़ के साथ ब्याज की मक्का जीन बढ़ाना पीसीआर टेंपलेट के रूप में १.१ में उत्पंन पीसीआर निर्माण का उपयोग कर ।
- पीसीआर प्रोडक् शन को डबल-डाइजेस्ट और उ मेडिस प्लाज्मिड, p123-पउमpit2-एसपीउमpit2-Zmmac1-mCherry-हा15, साथ XbaI और Nco I. पचता पीसीआर उत्पाद और प्लाज्मिड शुद्ध ।
- Ligate में पच पीसीआर प्रोडक्ट को p123-पीउमpit2-एसपीउमpit2-Zmmac1-mCherry-हा टेम्पलेट का उपयोग कर टी-4 डीएनए ligase निर्माता ´ एस निर्देशों का पालन. ई. कोलाई में बंधाव उत्पाद रूपांतरण और सैंज अनुक्रमण द्वारा ब्याज अनुक्रम की सही जीन सत्यापित करें ।
- Linearize द p123-पउमpit2-एसपीउमpit2-Zmजीन ऑफ प् याज-mCherry-हा प्रतिबंध एंजाइम Sspके साथ मैं और solopathogenic में डीएनए रूपांतरण यू । मेडिस तनाव SG20016. अलग U. मेडिस transformants चयन कार्बोक्सीन द्वारा और अलग transformants की पुष्टि दक्षिणी ब्लाट विश्लेषण16द्वारा ।
नोट: ब्याज के प्रत्येक प्रोटीन के लिए, कम से तीन स्वतंत्र U. मेडिस transformants अलग और यादृच्छिक पृष्ठभूमि उत्परिवर्तनों के किसी भी phenotype प्रभाव का अनुमान विश्लेषण किया जाना चाहिए ।
2. संस्कृति मीडिया
- तैयार YEPSlight तरल मध्यम16: १.०% (डब्ल्यू/वी) खमीर निकालने, ०.४% (डब्ल्यू/वी) Bacto-Peptone, और ०.४% (डब्ल्यू/वी) सुक्रोज । 15 मिनट के लिए १२१ ° c पर ddH2O और आटोक्लेव में सभी घटकों को भंग; एक उच्च तापमान पर autoclaving, समय की एक लंबी अवधि के लिए या बार के माध्यम की गुणवत्ता में कमी होगी ।
- आलू तैयार-डेक्सट्रोज-आगर (पीडी-आगर)20: ३.९% (डब्ल्यू/वी) आलू डेक्सट्रोज आगर, और १.०% (डब्ल्यू/वी) 1 एम Tris-एचसीएल पीएच ८.० (एफसीए ०.०१ मीटर) । autoclaving के लिए बोतल में सीधे सभी घटकों को मिलाएं और ddH2ओ प्लस एक चुंबकीय हलचल बार जोड़ें । 15 मिनट के लिए १२१ ° c पर आटोक्लेव; एक उच्च तापमान पर autoclaving, समय की एक लंबी अवधि के लिए या बार के माध्यम की गुणवत्ता में कमी होगी ।
- पीडी-चारकोल तैयार करें20: ३.९% (डब्ल्यू/वी) आलू डेक्सट्रोज आगर, 1% (डब्ल्यू/वी) चारकोल, और १.०% (वी/वी) 1 एम Tris-एचसीएल पीएच ८.० (एफसीए ०.०१ मीटर) । autoclaving के लिए बोतल में सीधे सभी घटकों को मिलाएं और ddH2ओ प्लस एक चुंबकीय हलचल बार जोड़ें । 15 मिनट के लिए १२१ ° c पर आटोक्लेव; एक उच्च तापमान पर autoclaving, समय की एक लंबी अवधि के लिए या बार के माध्यम की गुणवत्ता में कमी होगी ।
3. संयंत्र संक्रमण
- ट्रोजन हॉर्स वितरित प्रोटीन के जवाब में मक्का सेल विभाजन का विश्लेषण प्रदर्शन (जैसे, माइक्रोस्कोपी आधारित सेल गिनती) पहले से । U. मेडिस-प्रेरित मक्का कोशिका प्रसार और बाद में ट्यूमर गठन 4-5 दिनों के बाद संक्रमण के आसपास शुरू होता है । मात्रात्मक रोग आकलन ऊतक पर निर्भर होते हैं और 6 से 14 दिनों के बाद संक्रमण किया जाना चाहिए.
नोट: अलग मक्का किस्मों मेडिस संक्रमण के लिए संवेदनशीलता के विभिन्न स्तरों दिखाते हैं । मक्का सीबनाम W23, A188, हांफना चकमक पत्थर, जल्दी सुनहरा Bantam या Va35 इस रोगज़नक़ के प्रति संवेदनशीलता दिखाने के लिए और इस प्रकार ट्रोजन हॉर्स अध्ययन के लिए उपयुक्त किस्मों हैं । - उ. मेडिस इनोक्युलम की तैयारी
- जनक तनाव SG200 सभी ट्रोजन हॉर्स प्रयोगों में एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल करने के लिए ट्रांसजेनिक तनाव से संक्रमण पर दुष्प्रभाव का अनुमान है । यहां, एक मेडिस एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में ब्याज की प्रोटीन के एक गैर स्रावित संस्करण व्यक्त तनाव का उपयोग करें । हालांकि, साध्यता के कारणों के लिए (जैसे, बड़ी स्क्रीनिंग), जनक तनाव नियंत्रण का आसान विकल्प हो सकता है ।
- प्रयोग शुरू करने से पहले, अनुमान है कि किस मात्रा में संक्रमण संस्कृति की जरूरत है । ध्यान रखें कि प्रत्येक पौधे के संक्रमण के लिए 1-१.५ एमएल की आवश्यकता है मेडिस का खाद्यान ऊतक के प्रकार पर निर्भर है ।
नोट: लगभग एक रात संस्कृति के 1 मिलीलीटर YEPSप्रकाश माध्यम के 20 मिलीलीटर में ०.२ के एक आयुध डिपो के लिए कमजोर पड़ने के लिए पर्याप्त है, और एक U. मेडिस संस्कृति के 25 मिलीलीटर के साथ एक६०० -1.0 का एक आयुध डिपो 13-16 पौधों के संक्रमण के लिए पर्याप्त हैं । - स्क्रैच मेडिस एक पीडी आगर प्लेट से एक बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग कर, YEPSप्रकाश माध्यम के 5 मिलीलीटर में inoculate और संस्कृति 16 ज के लिए २०० rpm पर लगातार मिलाने के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ने दो ।
- संक्रमण से पहले, 400X आवर्धन पर उचित विकास और बैक्टीरियल संदूषण के लिए मानक प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा यू मेडिस टीका संस्कृति की जांच ।
नोट: एक उपयुक्त संस्कृति में, केवल सिगार के आकार का कवक दिखाई देता है (चित्रा 2) । - रात भर संस्कृति के १०० µ एल के साथ ताजा YEPSप्रकाश के ९०० µ एल मिश्रण और spectrophotometer विश्लेषण में एक खाली के रूप में YEPSप्रकाश माध्यम का उपयोग कर आयुध डिपो६०० उपाय ।
- ०.२ के एक आयुध डिपो६०० के लिए ताजा YEPSप्रकाश माध्यम के साथ रात भर संस्कृति को पतला और संस्कृति 28 डिग्री सेल्सियस पर लगातार मिलाते हुए २०० rpm के साथ में बढ़ने जब तक मध्य लॉग विकास चरण 0.8-1.0 के एक आयुध डिपो६०० एनएम द्वारा संकेत तक पहुंचने तक ।
नोट: U. मेडिस कोशिकाओं इन शर्तों के तहत हर 2 घंटे डुप्लिकेट, इस प्रकार वांछित आयुध डिपो६०० खेती के 4-5 ज के बाद पहुंच गया है । - 10 मिनट के लिए ३,००० x g पर कताई और supernatant त्याग द्वारा 0.8-1.0 के आयुध डिपो६०० पर कोशिकाओं फसल ।
- ddH2ओ के साथ सेल गोली एक बार धो लें । इस प्रयोजन के लिए, ddH2हे, 10 मिनट के लिए ३००० x g के साथ स्पिन और supernatant त्याग की एक संस्कृति मात्रा जोड़ें ।
- एक 20-एमएल ग्लास पिपेट का उपयोग कर ddH2ओ में ध्यान से सेल गोली resuspend, जिससे ३.० (एक ट्रोजन हॉर्स परख के लिए) अंतिम आयुध डिपो६०० या १.० (रोग दर्ज़ा के लिए) को समायोजित ।
- ट्रोजन हॉर्स का सत्यापन: मक्का फ्यूजन प्रोटीन के planta स्राव में
- एक ट्रोजन हार्स तनाव17के साथ मक्का अंकुर संक्रमित ।
- 2-3 दिनों के बाद संक्रमण एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर संक्रमित अंकुरों की सूक्ष्म इमेजिंग प्रदर्शन । इस अंत करने के लिए, उत्पाद की पत्ती का एक आयताकार टुकड़ा 1 सेमी इंजेक्शन के बिंदु के नीचे, एक खुर्दबीन स्लाइड पर नमूना जगह और2ddH की एक बूंद जोड़ें हे । mCherry फ्यूजन प्रोटीन कल्पना करने के लिए, λ = ५६१ एनएम और λ पर रिकॉर्ड उत्सर्जन = ५८०-६३० एनएम पर नमूना उत्तेजित ।
- वयस्क मक्का के पत्तों का संक्रमण
- वयस्क पत्तियों की अवस्था में मक्का के पौधों की खेती करें (जब कम से पत्ती 7 डंठल के भीतर बढ़ता है) ।
नोट: इस चरण में 14 घंटे की ग्रीनहाउस शर्तों के तहत बुवाई पर चार सप्ताह के बाद पहुंच जाता है, 28 ° c दिन/10 एच, 22 ° c रात ताल cv. W23 का उपयोग कर । अवधि मक्का फसल और ग्रीनहाउस शर्तों के साथ भिंन हो सकते हैं । - मेडिस संस्कृति हस्तांतरण (3.2.9 देखें) में एक 3 एमएल एक 20G एक्स 1 hypodermic सुई के साथ सिरिंज ।
- डंठल में meristem ऊतक को स्थानीयकृत करने के लिए डंठल को ध्यानपूर्वक दबाएं । meristem का आधार नरम ऊतक के लिए कठिन डंठल से एक संक्रमण द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है ।
- एक पेन का उपयोग कर डंठल पर meristem चिह्नित करें ।
- गोली meristem या फूलना meristem ऊपर U. मेडिस संस्कृति 1 सेमी की १.५ मिलीलीटर सुई ।
- दर रोग लक्षण 6 और 12 दिनों के बाद संक्रमण ।
- वयस्क पत्तियों की अवस्था में मक्का के पौधों की खेती करें (जब कम से पत्ती 7 डंठल के भीतर बढ़ता है) ।
- लटकनों का संक्रमण
- लटकन चरण तक पहुँचने तक मक्का के पौधे उगाना.
नोट: मक्का cv. W23 में anther और लटकन विकास पर एक विस्तृत समयरेखा पहले18,19बताई गई थी । लटकन है पूर्व meiotic परागकोष युक्त उच्च मेडिस संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं; मक्का में cv. W23 लटकन है 4-7 सेमी के आकार के हैं । - डंठल में लटकन को स्थानीयकृत करने के लिए सावधानी से दबाएं ।
- टिप और एक पेन का उपयोग स्टेम पर लटकन के आधार चिह्नित करें ।
- मेडिस संस्कृति हस्तांतरण (3.2.9 देखें) में एक 3 एमएल एक 20G एक्स 1 hypodermic सुई के साथ सिरिंज ।
- लटकन के आसपास इनोक्युलम के १.५ मिलीलीटर सुई । इनोक्युलम के बराबर वितरण सुनिश्चित करने के लिए, धीरे से टिप पर ०.५ मिलीलीटर प्रत्येक जगह, मध्य भाग, और लटकन के आधार कलम के साथ चिह्नित ।
- 10 दिनों के बाद संक्रमण दर रोग लक्षण ।
- लटकन चरण तक पहुँचने तक मक्का के पौधे उगाना.
- कान का संक्रमण
नोट: कान ऊतक विकास अलग मक्का किस्मों और ग्रीनहाउस की स्थिति में अलग है और ध्यान से टीका से पहले मनाया जाना चाहिए । कान के लिए रेशम को तबदील करना शुरू करने के लिए उच्च मेडिस संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं ।- स्थानांतरण मेडिस संस्कृति (3.2.9 देखें) में एक 3 एमएल एक 20 जी एक्स 1 hypodermic सुई के साथ सिरिंज ।
- भूसी के बीच अंतरिक्ष में टीका सुई इंजेक्शन के रूप में गहराई से कान घायल बिना संभव के रूप में छोड़ देता है ।
- कान के आसपास इनोक्युलम के १.५ मिलीलीटर रिलीज ।
- सिरिंज प्लस सुई निकालें और ध्यान से सिल मालिश मेडिस भी समान रूप से समाधान वितरित करने के लिए ।
- दर रोग लक्षण 14 दिनों के बाद संक्रमण ।
- यू मेडिस इनोक्युलम की व्यवहार्यता की पुष्टि करें
- एक पीडी चारकोल आगर प्लेट पर इनोक्युलम के 10 µ एल ड्रॉप और 2 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
नोट: यदि संबंधित U. मेडिस संस्कृति रेशा फार्म करने में सक्षम है, शराबी, सफेद mycelium दिखाई बन जाता है (चित्रा 5)
- एक पीडी चारकोल आगर प्लेट पर इनोक्युलम के 10 µ एल ड्रॉप और 2 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
construction for U. मेडिस ट्रोजन हॉर्स प्रयोगों में क्लोन कर रहे हैं प्लाज्मिड p123-Pउमpit2-एसपीउमpit2-जीन ऑफ इंटरेस्ट-mCherry-हा. ब्याज की मक्का जीन एक mCherry प्रतिदीप्ति रिपोर्टर और एक epitope हाटैग से जुड़े हुए है । फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति यू मेडिस उमpit2 प्रमोटर के नियंत्रण में है जो विशेष रूप से21संक्रमण के दौरान सक्रिय है । biotrophic संपर्क क्षेत्र में ब्याज पेप्टाइड के प्रोटीन का स्राव प्रत्यक्ष करने के लिए, कोडिंग क्षेत्र यू मेडिस उमpit221 (चित्रा 1) के संकेत पेप्टाइड अनुक्रम से जुड़े हुए है । यू मेडिस परिवर्तन पर, transgene SG200 आईपीमें डाला जाता है-मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा लोकस, और लक्षित जीनोम प्रविष्टि दक्षिणी दाग विश्लेषण द्वारा सत्यापित किया जा सकता है । फ्यूजन प्रोटीन का स्राव एक ट्रोजन हॉर्स तनाव (चित्रा 3) के साथ संक्रमित पत्तियों अंकुर में सूक्ष्म इमेजिंग स्कैनिंग फोकल लेजर द्वारा पुष्टि की है । उदाहरण के रूप में, या तो U. मेडिस ट्रोजन हॉर्स तनाव SG200Zmmac1 स्रावित एक ZmMAC1-mCHERRY या एक गैर ट्रोजन हॉर्स नियंत्रण तनाव व्यक्त ंसप-Zmmac1-mCHERRY कि उमpit2कमी के साथ संक्रमित अंकुर- एसपी, और बाद में ZmMAC1-mCHERRY-हा प्रोटीन गुप्त नहीं है, चित्रा 315में दिखाया गया है । Hyphae स्रावित ZmMAC1 फ्लोरोसेंट mCherry सिग्नल (चित्रा 3ए) से घिरा हुआ है । इसके विपरीत, गैर-स्रावी hyphae केवल फफूंद कोशिका द्रव्य (चित्र बी) में प्रतिदीप्ति संकेत दिखाते हैं ।
विशेष रूप से, मेडिस के साथ लटकन संक्रमण उचित ऊतक टीका पर निर्भर करता है, के रूप में ३.५ कदम में वर्णित है । अनुचित लटकन स्थानीयकरण या इनोक्युलम के असमान वितरण गैर संक्रमित लटकन (चित्रा 4a) या लटकन (चित्रा 4B) के केवल आंशिक संक्रमण में परिणाम कर सकते हैं । भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए, इनोक्युलम धीरे टीका सुई से जारी करने के लिए पूरे ऊतक संक्रमण (आंकड़ा 4c) प्राप्त करने की जरूरत है । इनोक्युलम की व्यवहार्यता पीडी-चारकोल आगर पर एक छोटी बूंद रखकर सत्यापित किया जा सकता है । संक्रामक उपभेदों फार्म solopathogenic ट्रोजन हॉर्स जनक तनाव SG200 (चित्रा 5) के लिए दिखाए गए के रूप में थाली पर फुलाना लिखने के रूप में प्रदर्शित रेशा, जबकि मेडिस तनाव FB1 संक्रामक रेशा गठन से पहले संभोग की आवश्यकता है ( चित्रा 5B).
| नाम | प्राइमरी इसके अलावा | अनुक्रम (5 ´ → 3 ´) |
| आगे | XbaI-मक्का जीन | GCTCTAGA... |
| उल्टा | NcoI-RSIATA-भुट्टा जीन | CATGCCATGGAGGCGGTGGCGATCGAGCG.... |
तालिका 1: प्राइमरी परिवर्धन का अनुक्रम प्रतिबंध पक्षों और RSIATA मूल भाव को जोड़ने के लिए क्रम कोडिंग के लिए मक्का ब्याज की जीन ।
चित्रा 1 : योजनाबद्ध सिंहावलोकन यू मेडिस ट्रोजन हॉर्स प्लाज्मिड क्लोनिंग स्ट्रैटेजी. Zmmac1 (light gray) p123-Pउमpit2-एसपीउमpit2-Zmmac1-mCherry-हासे डबल डाइजेस्ट द्वारा जारी है । समानांतर में, ब्याज की जीन (पीला) पीसीआर से परिलक्षित होता है । उद्देश्य क्लोनिंग के लिए, आगे और रिवर्स प्राइमर डिजाइन जो Xbaमैं और Ncoमैं साइटों क्लोनिंग और एक RSIATA linker (बैंगनी) शामिल हैं । पीसीआर प्रोडक् ट को Xbai और Ncoi के साथ पच रहा है । बंधाव के बाद, ट्रोजन हॉर्स प्लाज्मिड में निंनलिखित तत्व होते हैं: umpit2 प्रवर्तक द्वारा चालित, एक umpit2-SP (नीला), रुचि ओआरएफ (yellow) का खाद्यान जीन के लिए एन-टर्मिनल से जुड़े हुए है । पर सी-टर्मिनस, एक RSIATA लिंकर, एक mCHERRY रिपोर्टर जीन (लाल) और एक हा epitope टैग (हरा) एक बंद codon के बाद जुड़े हुए हैं । मेडिस परिवर्तन करने से पहले, ट्रोजन हॉर्स प्लाज्मिड Sspके साथ पचता है I maydisip-लोकस (धूसर) में मुताबिक़ एकीकरण की अनुमति देने के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : प्रकाश-सूक्ष्म परीक्षा यू मेडिस टीका कल्चर. कई सिगार के आकार का U. मेडिस sporidia दिखाई दे रहे हैं, जिनमें से कुछ नवोदित से गुजरना (तारक द्वारा संकेत) । आगे कोई कोशिकाएं मौजूद हैं जो संस्कृति के प्रदूषित होने का संकेत देती हैं । स्केल बार = 20 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3 : planta में एक के फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग Ustilago ट्रोजन हॉर्स तनाव । mCherry-से जुड़े मक्का प्रोटीन ZmMAC1 ट्रोजन हॉर्स तनाव SG200Zmmac1 (एक) या एक गैर ट्रोजन घोड़े तनाव SG200Zmmac1-ंसप कमी Umpit2-SP (ख) का उपयोग कर संक्रमण के बाद इमेजिंग । स्रावित ZmMAC1-mCHERRY-हा फ्यूजन प्रोटीन यू मेडिस hyphae की सतह पर स्थित है (A)15, तीर प्रमुखों द्वारा संकेत दिया । में SG200Zmmac1-ंसप केवल cytoplasmic स्थानीयकरण के ZmMAC1 दृश्यमान है (B), तारांकन चिह्न 15द्वारा दर्शाया गया है । स्केल बार्स = 5 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 4 : के साथ लटकन संक्रमण उ. मेडिस. मेडिस (ए), आंशिक लटकन संक्रमण (बी) और पूरा लटकन संक्रमण (सी) के साथ लटकन के असफल संक्रमण 12 दिनों के बाद संक्रमण दिखाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5 : पीडी-चारकोल आगार पर इनोक्युलम व्यवहार्यता परख । solopathogenic तनाव SG2001 ट्रोजन हॉर्स जनरेशन के लिए इस्तेमाल किया गया था । SG200 आत्म उत्तेजक है और एक पीडी-लकड़ी का कोयला आगार प्लेट (एक) पर संक्रामक तंतुओं रूपों । अगुणित मेडिस तनाव FB1 एक संगत तनाव के साथ संभोग की आवश्यकता है रेशा विकास से पहले (ख)22। स्केल बार्स = 2 मिमी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
आधुनिक फसल अनुसंधान आनुवंशिक और प्रोटीन के स्तर पर आणविक विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल की मांग । परिवर्तन के माध्यम से आनुवंशिक पहुंच उपलब्ध है या अक्षम और मक्का के रूप में सबसे अधिक फसल प्रजातियों के लिए समय लेने वाली नहीं है । इसके अलावा, इस तरह के प्रमोटर रिपोर्टर सिस्टम के रूप में विश्वसनीय आनुवंशिक उपकरण दुर्लभ हैं, जो अलग ऊतक साइटों पर उच्च spatiotemporal संकल्प के साथ सीटू प्रोटीन समारोह में अध्ययन करने के लिए मुश्किल बना देता है । Apoplastic प्रोटीन के ऊतकों में heterologously व्यक्त की घुसपैठ और शुद्ध प्रोटीन द्वारा अध्ययन किया जा सकता है । हालांकि, heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति में अग्रिम के बावजूद, फसल के ऊतकों में लक्षित घुसपैठ मुश्किल और प्रोटीन कार्यात्मक विश्लेषण के लिए अक्सर अक्षम रहता है । ट्रोजन हॉर्स रणनीति रूपांतरण या प्रोटीन घुसपैठ की आवश्यकता नहीं है कि एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है । मक्का रोगज़नक़ मेडिसके स्राव तंत्र को रोजगार, सैद्धांतिक रूप से संक्रमित ऊतकों के पौधे apoplast में ब्याज की किसी भी प्रोटीन का वितरण प्राप्त किया जा सकता है । ब्याज का एक प्रोटीन के आकार के बारे में, इस तकनीक की सीमा अभी तक पता लगाया है । पूर्व परख में, २९० अमीनो एसिड मेडिस प्रभाव Cmu1 mCherry से जुड़े सफलतापूर्वक7स्रावित किया गया था । हालांकि, बड़े प्रोटीन के लिए ट्रोजन हॉर्स विधि की प्रयोज्यता परीक्षण किया जा करने के लिए रहता है । यदि ब्याज के प्रोटीन के लिए posttranslational संशोधनों के अतिरिक्त अवांछनीय हैं, अपरंपरागत रहस्य के माध्यम से शास्त्रीय स्राव के लिए एक वैकल्पिक मार्ग के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है सपा14।
U. मेडिस क्योंकि विश्वसनीय प्रोटीन तह, posttranslational संशोधन, और स्राव क्षमता11,12,13के प्रोटीन जैव प्रौद्योगिकी में एक मानक उपकरण के रूप में कार्यरत है । फिर भी, प्रत्येक नए ट्रोजन हॉर्स तनाव के लिए प्रोटीन स्राव के लिए सावधानी से विश्लेषण के रूप में चरण 3 में वर्णित की जरूरत है । यह हर नव उत्पंन ट्रोजन हार्स तनाव के एक प्रारंभिक परीक्षण करने के लिए की सिफारिश की है कि अंकुर संक्रमित करने के लिए आसान कर रहे है और सूक्ष्म इमेजिंग द्वारा निरीक्षण द्वारा ।
SG200 एक solopathogenic तनाव है कि ट्रोजन हॉर्स प्रयोगों से पहले संभोग की आवश्यकता नहीं है और इस तरह संभालना आसान है । हालांकि FB1 और FB2 की तरह संगत उपभेदों के संक्रमण दक्षता23उच्च है, SG200 की क्षमता ट्रोजन हॉर्स प्रयोगों के लिए पर्याप्त है । कुछ U. मेडिस प्रभाव प्रोटीन मेजबान कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है, जबकि अंय apoplast में रहते हैं । दोनों समूहों के बीच विभेद को नियंत्रित और विशिष्ट प्रक्रिया प्रतीत होती है; हालांकि, अंतर्निहित तंत्र8 मायावी बने रहते हैं और किसी प्रयोग को डिज़ाइन करते समय इसे ध्यान में नहीं रखा जा सकता । इसलिए, ब्याज कि सेल दीवार में एकीकृत किया जाना है या कि intracellularly अधिनियम के प्रोटीन है ट्रोजन हॉर्स दृष्टिकोण के लिए कोई उपयुक्त उंमीदवार हैं ।
चूंकि U. मेडिस विविध हवाई मक्का ऊतकों को संक्रमित करने में सर्वशक्तिमान है, ट्रोजन हॉर्स विधि कई प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है, विशिष्ट ऊतकों में और विभिन्न संयंत्र विकासात्मक चरणों में, जैसे कि अंकुरित पत्तियां, वयस्क पत्तियां, लटकन, और कान. बस कुछ उपयोगी अनुप्रयोगों का नाम करने के लिए, ट्रोजन हॉर्स स्थानीय खुराक, offside प्रोटीन प्रभाव, या विशिष्ट प्रोटीन डोमेन के कार्यात्मक लक्षण वर्णन का परीक्षण करने की अनुमति देता है ।
एक दूषित यू मेडिस संस्कृति को बनाए रखने के सभी प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है के बाद से सह बैक्टीरिया की एक बड़ी राशि के साथ संक्रमण संयंत्र की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से चलाता है और ब्याज की प्रोटीन के प्रति अपनी प्रतिक्रिया बदल, इस प्रकार प्रतिपादन किसी भी परिणाम अनिर्णायक । ट्रोजन हॉर्स अध्ययन वयस्क पत्तियों, लटकन और कान में अधिक से अधिक १.५ मिलीलीटर संक्रमण संस्कृति के साथ प्रदर्शन किया जाना है के रूप में उच्च मात्रा ऊतक नुकसान में परिणाम हो सकता है । लटकन और कान के संक्रमण Ustilago इनोक्युलम के बजाय खाद्य रंग-दाग पानी का उपयोग कर प्रशिक्षित किया जा सकता है ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक थॉमस Dresselhaus, मार्टिन Parniske, Noureddine Djella, और आर्मिन Hildebrand लैब अंतरिक्ष और संयंत्र सामग्री प्रदान करने के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । ट्रोजन हॉर्स विधि पर मूल काम एक Leopoldina postdoc फैलोशिप और NSF परियोजना IOS13-39229 द्वारा समर्थित किया गया था । इस लेख में प्रस्तुत कार्य को DFG के SFB924 (प्रोजेक्ट्स A14 एण्ड B14) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
| 23 G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
| Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
| Cuvette (10 mm x 4 mm x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
| Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
| Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | use locally available equipment | ||
| Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Yeast extract | BD | 212750 |
References
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Doehlemann, G., et al. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).
- Matei, A., et al. How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves. New Phytologist. , (2018).
- Doehlemann, G., et al. Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis. The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).
- Doehlemann, G., et al. Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells. PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).
- Redkar, A., et al. A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors. The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).
- Djamei, A., et al. Metabolic priming by a secreted fungal effector. Nature. 478, 395-398 (2011).
- Tanaka, S., et al. A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize. eLife. 3, e01355 (2014).
- Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2. PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).
- Ziemann, S., et al. An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize. Nature Plants. 4, 172-180 (2018).
- Juárez-Montiel, M., et al. The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines. PLoS One. 10, e0133535 (2015).
- Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. Schmoll, M., Dattenböck, C. , Springer International Publishing. 183-200 (2016).
- Monreal-Escalante, E., et al. The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse. Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).
- Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
- van der Linde, K., et al. Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ. The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).
- Bösch, K., et al. Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).
- Chavan, S., Smith, S. M. A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines. Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).
- Kelliher, T., Walbot, V. Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule. Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).
- Egger, R. L., Walbot, V. Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies. Maydica. 60, M34 (2015).
- Holliday, R. Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. King, R. C. , Springer US. 575-595 (1974).
- Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation. Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).
- Banuett, F., Herskowitz, I. Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).
- Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1. The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).
