Summary
Questo lavoro descrive la clonazione di un ceppo di Trojan horse Ustilago maydis per la consegna in loco delle proteine secrete mais in tre diversi tipi di tessuti mais.
Abstract
Ispirato a Homer´s Trojan horse mito, abbiamo progettato il patogeno mais Ustilago maydis per trasportare proteine secrete nel mais apoplasto permettendo l'analisi fenotipica in vivo. Questo metodo non si basa sulla trasformazione mais ma sfrutta genetica microbica e capacità secretiva di agenti patogeni. Nel presente documento, esso permette di ispezione di in vivo consegnato proteine secrete con alta risoluzione spazio-temporale a diversi tipi di siti d'infezione e tessuti. La strategia di Trojan horse possa essere utilizzata per integrare transitoriamente mais fenotipi di perdita-de-funzione, per caratterizzare funzionalmente domini proteici, per analizzare gli effetti della proteina fuori bersaglio, o per studiare l'iperdosaggio proteina-gioco, che lo rende un potente strumento per studi della proteina nel sistema raccolto del mais. Quest'opera contiene un protocollo preciso su come generare un ceppo di Trojan horse seguito da protocolli standardizzati infezione per applicare questo metodo a tre tipi di mais differenti del tessuto.
Introduction
L'agente patogeno biotrophic Ustilago maydis è l'agente causativo del mais smut malattia1. Essa colpisce tutte le parti aeree di mais con conseguente grandi tumori che contengono spore melanized, nero. A livello globale, U. maydis è stimata per causare una perdita annua di circa il 2% di rendimento di mais, mentre i tumori sono apprezzati come una prelibatezza gastronomica in Messico. Infezione di pianta è iniziata da un appressorium che secerne enzimi lisante parete cellulare per penetrare il primo strato di cellule epidermiche mais. Da un sito di infezione primaria, U. maydis cresce intracellulare e intercellularmente, invadendo la cella di uno o due strati ogni giorno1,2. Risultati di successo infezione nell'ipertrofia di pianta che si trasforma in tumori visibili su cinque giorni post infezione1,3,4. Durante tutte le fasi di infezione, i hyphae fungosi invaginano la membrana di citoplasma pianta senza alcun contatto diretto con l'host citoplasma1,2. Lo spazio di apoplasmic stretto tra le ife d'infezione e la membrana del plasma di pianta è considerato il sito interattivo di ospite/patogeno, chiamato la zona di interazione biotrophic. Al fine di superare il sistema immunitario innato di pianta, U. maydis secerne una matrice di proteine effettrici nel biotrophic interazione zona1. Alcuni effettori sono presi dalle cellule vegetali, mentre altri rimangono nel biotrophic interazione fuso5,6,7,8. Uno apoplastico effector è UmPit2, che interagisce con le proteasi apoplastico mais per impedire il rilascio del peptide ZmZIP1 da ZmPROZIP da apoplastico proteasi attività9,segnalazione10.
Negli ultimi decenni, U. maydis è diventato non solo un modello per la genetica fungina nell'interazione pianta-patogeno, ma anche uno strumento prezioso in biotecnologie a causa di un ciclo di vita ben compresa, facile accessibilità genetica e l'espressione eterologa di secreto proteine11,12,13. Segnali per entrambi secrezione di proteine convenzionali e non convenzionali sono stati determinati che consente il controllo delle modifiche di posttranslational14. Recentemente, U. maydis è stato usato come uno strumento di Trojan horse per studiare piccole, secreto mais proteine in situ15. L'approccio di Trojan horse è stato usato con successo per analizzare la funzione della proteina secreta, piccola ZmMAC1 che si occupa dello sviluppo dell'antera. ZmMAC1 induce la divisione periclinal di cellule pluripotenti e specifica di destino delle cellule delle cellule neonata15. Con lo stesso metodo, la funzione biologica del mais danni-associated peptide ZmZIP1 è stata rivelata. U. maydis che secerne il mais che zmzip1 ha provocato alterato tumore formazione10. Così, il Trojan horse approccio rappresenta un prezioso itinerario alternativo alla proteina in situ studi ad alta risoluzione spazio-temporale che non richiedono la generazione di linee di trasformazione mais stabile né infiltrazione del tessuto con heterologously proteine espresse e purificate. In particolare, la strategia di Trojan horse permette la secrezione di tutta la proteina eterologa in mais apoplasto e confronto diretto di infetti contro cellule vegetali non infetti all'interno del tessuto stesso.
Questo protocollo illustra i passaggi principali per la generazione di un ceppo di Trojan horse U. maydis per studiare una proteina di interesse. Comprende ulteriori informazioni precise sulle procedure di infezione di tre tipi differenti del tessuto mais (foglie adulte, nappe e orecchie) con U. maydis, che è un prerequisito per studiare la funzione della proteina e progressione di spatiotemporal infezione in questi tessuti bersaglio. Ulteriori specificazioni non sono determinato su mais l'amplificazione del gene e microscopiche imaging tecniche, dal momento che questi passaggi sono specifici per la destinazione e strumento-dipendente. Così, questo protocollo è rivolto a utenti esperti di tecniche di biologia molecolare standard.
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Protocol
1. costruzione di un U. maydis Trojan Horse
Nota: Vedere la Figura 1.
- Amplificare un gene di interesse da mais cDNA usando gli iniettori di gene-specific e una rilettura della polimerasi del DNA. Clonare il principale prodotto di PCR e trasformare il costrutto in e. coli seguendo le istruzioni del fornitore del plasmide. Verificare il gene corretto della sequenza di interesse dal Priore di sequenziamento Sanger da utilizzare per i prossimi passi di clonazione.
Nota: PCR specifiche devono essere ottimizzati a causa delle specificità di sequenza primer e condizioni di reazione ottimale della polimerasi del DNA. - Disegnare primers per amplificare il gene mais di interesse senza la sequenza che codifica un peptide segnale (SP).
- Estendere l'estremità a 5 minuti del reverse primer con il motivo RSIATA e un Ncoio taglio sito (tabella 1).
- Amplificare il mais gene di interesse con una correzione di bozze polimerasi del DNA utilizzando il costrutto PCR generato in 1.1 come il modello PCR.
- Matrimoniale-digerire il prodotto PCR e il plasmide trasformazione U. maydis , p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha15, con XbaI e Nco I. purificare il digestato prodotto di PCR e plasmide.
- Legare il prodotto PCR digerito nel p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha modello utilizzando T4 DNA ligasi seguendo le istruzioni del produttore. Trasformare il prodotto di legatura in e. coli e verificare il gene corretto della sequenza di interesse di Sanger sequenziamento.
- Linearizzare il p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmgene di interesse-mCherry-Ha con l'enzima di restrizione Sspio e trasformazione del DNA in u solopathogenic . maydis ceppo SG20016. Isolare U. maydis trasformanti Carbossina selezione e confermare trasformanti isolati da Southern blot analisi16.
Nota: Per ogni proteina d'interesse, almeno tre indipendenti U. maydis trasformanti dovrebbero essere isolato e analizzati per valutare eventuali effetti di fenotipo di sfondo casuale mutazioni.
2. terreni di coltura
- Preparare YEPSlight liquido medio16: Estratto di lievito 1,0% (p/v), 0,4% (p/v) Bacto-Peptone e saccarosio 0,4% (p/v). Sciogliere tutti i componenti in ddH2O e sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 min; sterilizzazione in autoclave ad una temperatura superiore, per un lungo periodo di tempo o ripetutamente ridurrebbe la qualità del mezzo.
- Preparare le patate-destrosio-agar (PD-agar)20: 3,9% (p/v) patata destrosio agar e 1,0% (p/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (f.c. 0,01 M). Mescolare tutti i componenti direttamente in bottiglia per sterilizzazione in autoclave e aggiungere ddH2O più un ancoretta magnetica. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 min; sterilizzazione in autoclave ad una temperatura superiore, per un lungo periodo di tempo o ripetutamente ridurrebbe la qualità del mezzo.
- Preparare il PD-Charcoal agar20: 3,9% (p/v) patata destrosio agar, carbone 1% (p/v) e 1.0% (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (f.c. 0,01 M). Mescolare tutti i componenti direttamente in bottiglia per sterilizzazione in autoclave e aggiungere ddH2O più un ancoretta magnetica. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 min; sterilizzazione in autoclave ad una temperatura superiore, per un lungo periodo di tempo o ripetutamente ridurrebbe la qualità del mezzo.
3. pianta infezione
- Eseguire analisi di mais divisione cellulare in risposta a Trojan horse consegnato proteine (ad es., conta di base di microscopia cellulare) in anticipo. U. maydis-ha indotto la proliferazione delle cellule di mais e formazione successiva del tumore inizia intorno a 4-5 giorni post infezione. Valutazione quantitativa malattia dipendono dal tessuto e devono essere eseguite da 6 a 14 giorni post infezione.
Nota: Cultivar di mais distinte mostrano diversi livelli di suscettibilità all'infezione U. maydis . Mais cvs W23, A188, flint Gaspe, Early Golden Bantam o Va35 mostrano suscettibilità nei confronti di questo agente patogeno e così sono cultivar adatto per studi di Trojan horse. - Preparazione dell'inoculo U. maydis
- Includono il ceppo progenitore SG200 come controllo negativo in tutti gli esperimenti di Trojan horse al fine di stimare gli effetti collaterali sull'infezione dal ceppo transgenico. Qui, usare un ceppo di U. maydis esprimendo una versione non-secreto della proteina di interesse come controllo negativo. Tuttavia, per ragioni di praticabilità (ad es., grandi proiezioni), il ceppo progenitore può essere la scelta più facile del controllo.
- Prima di iniziare l'esperimento, stimare quali importi della cultura di infezione sono necessari. Tenete a mente che l'infezione di ogni pianta richiede 1-1.5 mL di sospensione U. maydis dipendono dal tipo di tessuto mais.
Nota: Circa 1 mL di una coltura durante la notte è sufficiente per la diluizione di un OD600 di 0,2 in 20 mL di mezzo YEPSluce e 25 mL di una cultura di U. maydis con un OD600 di 0.8-1.0 sono sufficienti per l'infezione di piante di 13-16. - Gratta e Vinci U. maydis da un agar PD piastra utilizzando una pipetta Pasteur sterile, inoculare in 5 mL di terreno YEPSluce e lasciare che la cultura crescere a 28 ° C con agitazione costante a 200 giri/min per 16 h.
- Prima dell'infezione, è necessario esaminare la cultura di inoculazione U. maydis da microscopia chiara standard per la corretta crescita e contaminazione batterica a 400 ingrandimenti.
Nota: In una cultura adatta, solo il fungo a forma di sigaro è visibile (Figura 2). - Mescolare 900 µ l di YEPS frescaluce con 100 µ l della coltura durante la notte e misurare il OD600 YEPSluce mezzo come un vuoto nell'analisi spettrofotometro.
- Diluire la cultura pernottamento con mezzo diluce YEPS fresco a un OD600 di 0.2 e lasciare che la cultura crescere a 28 ° C con agitazione costante a 200 giri/min fino a raggiungere la fase di crescita del Mid-log indicato da un OD600 nm di 0.8-1.0.
Nota: U. maydis cellule duplicare ogni 2 h in queste condizioni, così il desiderato OD600 è raggiunta dopo 4-5 h di coltivazione. - Raccogliere le cellule OD600 di 0.8-1.0 di filatura a 3.000 x g per 10 min e scartare il surnatante.
- Lavare il pellet cellulare una volta con ddH2O. A tale scopo, aggiungere un volume di cultura di ddH2O, spin con 3000 x g per 10 min e scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare attentamente in ddH2O utilizzando una pipetta di vetro da 20 mL, aggiustando in questo modo il finale OD600 a 3.0 (per l'analisi di un Trojan horse) o 1.0 (per voto di malattia).
- Verifica del Trojan horse: planta secrezione della proteina di fusione mais
- Infettare piantine di mais con un Trojan horse ceppo17.
- Eseguire formazione immagine microscopica delle piantine infette alle 2-3 giorni post infezione utilizzando un microscopio confocale a scansione laser. A tal fine, asportare un pezzo rettangolare di foglia 1 cm di sotto del punto di iniezione, posizionare il campione su un vetrino da microscopio e aggiungere una goccia di ddH2O. Per visualizzare la proteina di fusione mCherry, eccitare esemplare a λ = 561 nm ed emissione record a λ = 580-630 nm.
- Infezione di foglie di mais adulti
- Coltivare piante di mais alla fase di foglie adulte (quando almeno foglia 7 cresce all'interno del gambo).
Nota: Questa fase viene raggiunta dopo quattro settimane dopo la semina in serra di 14 h, 28 ° C giorno/10 h, ritmo di notte di 22 ° C utilizzando CV W23. Durata può variare con le condizioni di cultivar e serra di mais. - Diffondere la cultura di U. maydis (Vedi 3.2.9) in una siringa da 3 mL con ago ipodermico 20 x 1.
- Premere il gambo con attenzione per localizzare il tessuto di meristema nel gambo. La base del meristema può essere distinto da una transizione dal gambo più difficile al tessuto più morbido.
- Contrassegnare il meristema sul gambo con una penna.
- Iniettare 1,5 mL di U. maydis cultura 1 cm sopra il tiro meristem o di un meristema infiorescenza.
- Valuta i sintomi della malattia a 6 e 12 giorni post infezione.
- Coltivare piante di mais alla fase di foglie adulte (quando almeno foglia 7 cresce all'interno del gambo).
- Infezione di nappe
- Coltivare piante di mais fino a raggiungere la fase di nappa.
Nota: Una cronologia temporale dettagliata sullo sviluppo dell'antera e nappa in mais CV W23 era precedentemente descritti1819. Nappe contenenti pre-meiotic antere sono altamente suscettibili all'infezione U. maydis ; nel mais CV W23 nappe sono le dimensioni di 4-7 cm. - Premere il gambo con attenzione per localizzare la nappa nel gambo.
- Contrassegnare la punta e la base della nappa sul fusto mediante una penna.
- Diffondere la cultura di U. maydis (Vedi 3.2.9) in una siringa da 3 mL con ago ipodermico 20 x 1.
- Iniettare 1,5 mL di inoculo intorno la nappa. Per garantire un'equa distribuzione dell'inoculo, posizionare lentamente 0,5 mL ciascuno presso la punta, la parte centrale e la base della nappa segnata con la penna.
- Valuta i sintomi della malattia a 10 giorni post infezione.
- Coltivare piante di mais fino a raggiungere la fase di nappa.
- Infezione delle orecchie
Nota: lo sviluppo di tessuto orecchio differisce in distinte cultivar di mais e condizioni di serra e devono essere attentamente osservato prima dell'inoculazione. Orecchie a partire da superare sete sono altamente suscettibili all'infezione U. maydis .- Diffondere la cultura di U. maydis (Vedi 3.2.9) in una siringa da 3 mL con ago ipodermico 20 x 1.
- Iniettare l'ago di inoculazione nello spazio tra le foglie di buccia più profondamente possibile senza danneggiare l'orecchio.
- Versione 1,5 mL di inoculo intorno all'orecchio.
- Rimuovere la siringa plus ago e massaggiare accuratamente pannocchia per distribuire la soluzione U. maydis ugualmente.
- Valuta i sintomi della malattia alle 14 giorni post infezione.
- Confermare la vitalità dell'inoculo U. maydis
- Goccia di 10 µ l di inoculo su una piastra di agar carbone PD e incubare a temperatura ambiente per 2 giorni.
Nota: Se la rispettiva cultura U. maydis è in grado di filamenti di forma, micelio bianco, lanuginoso diventa visibile (Figura 5)
- Goccia di 10 µ l di inoculo su una piastra di agar carbone PD e incubare a temperatura ambiente per 2 giorni.
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Representative Results
Costrutti per U. maydis Trojan horse esperimenti sono clonati nel plasmide p123-PUmpit2-SpUmpit2-gene di interesse-mCherry-Ha. Il mais gene di interesse è fusa ad un reporter di fluorescenza mCherry e un epitopo HA-tag. L'espressione della proteina di fusione è sotto il controllo del promotorepit2 U. maydis Um che specificamente si attiva durante l'infezione21. A secrezione diretta della proteina del peptide di interesse nella zona di interazione biotrophic, la regione di codificazione è fuso per la sequenza del peptide segnale di messaggistica unificata U. maydis pit221 (Figura 1). Al momento di trasformazione U. maydis , il transgene è inserito nel SG200 ip-locus di ricombinazione omologa e inserimento mirato genoma può essere verificata mediante Southern blot. La secrezione della proteina di fusione è confermata da scansione laser confocale formazione immagine microscopica in semenzale foglie infette da un ceppo di Trojan horse (Figura 3). Ad esempio, piantine infettati con lo sforzo di Trojan horse di U. maydis SG200Zmmac1 che secernono un ZmMAC1-mCHERRY o un controllo non-Trojan horse ceppo esprimenti noSP-Zmmac1-mCHERRY che manca la messaggistica unificatapit2- SP e successivamente non della proteina segreto ZmMAC1-mCHERRY-HA, sono mostrati in Figura 315. IFE che secernono ZmMAC1 sono circondati da segnale fluorescente mCherry (Figura 3A). In contrasto, ife disecrezione mostrano solo segnale di fluorescenza nel citoplasma fungo (Figura 3B).
In particolare, infezione di nappa con U. maydis si basa sull'inoculazione del tessuto corretto, come descritto al punto 3.5. Localizzazione di nappa improprio o distribuzione disuguale dell'inoculo può provocare non infetta Nappa (Figura 4A) o solo parziale infezione di nappa (Figura 4B). Per garantire la distribuzione uniforme, l'inoculo deve essere lentamente rilasciato dall'ago inoculazione di acquisire l'infezione del tessuto intero (Figura 4). Vitalità dell'inoculo può essere verificato posizionando una goccia sull'agar di PD-carbone. Ceppi infettivi formano filamenti che appaiono come scrivere lanugine sulla piastra come mostrato per il solopathogenic Trojan Horse ceppo progenitore SG200 (Figura 5A) mentre il ceppo di U. maydis che FB1 richiede accoppiarsi prima formazione dei filamenti infettive ( Figura 5B).
| Nome | Aggiunta di primer | Sequenza (5´→3´) |
| Avanti | Gene XbaI-mais | GCTCTAGA... |
| Invertire | Gene NcoI-RSIATA-mais | CATGCCATGGAGGCGGTGGCGATCGAGCG... |
Tabella 1: Sequenze di aggiunte di primer per aggiungere i lati restrizione e il motivo RSIATA codifica sequenza al mais gene di interesse.
Figura 1 : Panoramica schematica della U. maydis Trojan horse plasmide clonazione strategia. ZMmac1 (grigio chiaro) è pubblicato dalla doppia digest da p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha. In parallelo, il gene di interesse (giallo) è amplificato dalla PCR. Per la clonazione a scopo, forward e reverse primer sono progettati che includono Xbaio e Ncoho clonazione di siti e un linker RSIATA (viola). Il prodotto PCR viene digerito con Xbaio e Ncoio. Dopo la legatura, il Trojan horse plasmide contiene i seguenti elementi: guidato dal promotorepit2 Um, un Umpit2-SP (blu) è fusa N-terminalmente ad un mais gene di interesse ORF (giallo). Al C-terminale, un linker RSIATA, un gene del reporter mCHERRY (rosso) e un tag HA epitopo (verde) sono fusi seguita da un codone di arresto. Prima trasformazione U. maydis , il plasmide di Trojan horse è digerito con Sspho per consentire l'integrazione omologa in U. maydisip-locus (grigio). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : L'esame al microscopio luce di U. maydis cultura di inoculazione. Diversi-a forma di sigaro U. maydis sporidia sono visibili, alcuni dei quali subiscono in erba (indicato da un asterisco). Nessun ulteriori cellule sono presenti, il che indicherebbe una contaminazione della cultura. Barra della scala = 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : In planta laser confocale scansione formazione immagine microscopica di un Ustilago Trojan horse ceppo. Imaging della proteina mais mCherry-fuse ZmMAC1 dopo l'infezione di mais semenzale usando il ceppo di Trojan horse SG200Zmmac1 (A) o di un ceppo non-Trojan horse SG200Zmmac1- noSP manca il Umpit2-SP (B). Secreta ZmMAC1-mCHERRY-HA proteina di fusione si trova sulla superficie del U. maydis IFE (A)15, indicato dalle teste di freccia. In SG200Zmmac1- noSP solo localizzazione citoplasmatica di ZmMAC1 è visibile (B), indicato asterisco 15. Scala bar = 5 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Nappa infezione con U. maydis. Sono mostrati infruttuoso infezione di nappa con U. maydis (A), infezione nappa parziale (B) e completa nappa infezione (C) 12 giorni dopo l'infezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Analisi di attuabilità di inoculo su agar PD-carboncino. Il ceppo di solopathogenic SG2001 è stato utilizzato per la generazione di Trojan horse. SG200 è auto-stimolante e forme infettive filamenti su una piastra di agar di PD-carbone (A). L'aploide U. maydis ceppo FB1 richiede l'accoppiamento con un ceppo compatibile prima crescita filamentosa (B)22. Scala bar = 2 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Ricerca di coltura moderna richiede protocolli per l'analisi molecolare sulla genetica e i livelli della proteina. Accessibilità genetica tramite trasformazione non è disponibile o inefficiente e richiede molto tempo per la maggior parte delle specie coltivate come il mais. Inoltre, affidabili strumenti genetici quali sistemi reporter promotore sono scarse, che rende difficile studiare la funzione della proteina in situ con alta risoluzione spazio-temporale a siti di tessuto distinti. Apoplastico proteine possono essere studiati da infiltrazione delle proteine heterologously espresse e purificate nei tessuti. Tuttavia, malgrado gli avanzamenti nell'espressione di proteine eterologhe, mirata infiltrazione nei tessuti di coltura rimane difficile e spesso inefficiente per l'analisi funzionale della proteina. La strategia di Trojan horse è un approccio alternativo che non richiede la trasformazione o l'infiltrazione della proteina. Impiegando l'apparato di secrezione dell'agente patogeno mais U. maydis, consegna di teoricamente qualsiasi proteina di interesse nell'apoplasto pianta del tessuto infetto può essere raggiunto. Per quanto riguarda le dimensioni di una proteina di interesse, i limiti di questa tecnica hanno ancora da esplorare. Nelle analisi precedenti, l'effettore di U. maydis 290 aminoacidi che CMU1 fusa a mCherry era con successo secrete7. Tuttavia, l'applicabilità del metodo Trojan horse di proteine più grande rimane per essere testato. Se aggiunte di modifiche di posttranslational alla proteina di interesse sono indesiderabili, secrezione non convenzionale può essere utilizzata come un percorso alternativo alla classica secrezione via SP14.
U. maydis è impiegato come uno strumento standard in biotecnologia della proteina a causa della piegatura della proteina affidabile, modifiche post-traduzionali e secrezione efficienze11,12,13. Tuttavia, la secrezione di proteine per ogni nuovo ceppo di Trojan horse deve essere attentamente analizzati come descritto nel passaggio 3. Si consiglia di eseguire un test iniziale di ogni ceppo appena generato Trojan horse infettando i semenzali che sono facili da infettare e di ispezionare da formazione immagine microscopica.
SG200 è un ceppo di solopathogenic che non necessita di accoppiamento prima gli esperimenti di Trojan horse e così è più facile da gestire. Anche se l'efficienza di infezione dei ceppi compatibile come FB1 e FB2 è superiore23, l'efficienza di SG200 è sufficiente per esperimenti di Trojan horse. Alcune proteine effettrici U. maydis sono presi da cellule dell'ospite, mentre altri rimangono nell'apoplasto. La differenziazione tra i due gruppi sembra essere un processo controllato e specifico; Tuttavia, i meccanismi di fondo rimangono sfuggenti8 e non possono tenere in considerazione quando si progetta un esperimento. Di conseguenza, le proteine di interesse che devono essere integrati in parete delle cellule o che devono agire intracellulare non sono nessun candidati idonei per l'approccio di Trojan horse.
U. maydis , essendo Onnipotente a infettare diversi tessuti mais aeree, il metodo di Trojan horse può essere applicato per più proteine, in tessuti distinti e alle fasi di sviluppo differenti della pianta, come semenzale foglie, foglie adulte, nappine, e orecchie. Per citarne solo alcune applicazioni utili, il Trojan horse consente di testare l'iperdosaggio locale, gli effetti della proteina di fuorigioco o caratterizzazione funzionale dei domini proteici distinti.
Mantenere un incontaminato U. maydis cultura è cruciale per tutti gli esperimenti descritti poiché co-infezione con una grande quantità di batteri innesca la risposta immunitaria della pianta e altera la sua reazione verso la proteina di interesse, rendendo qualsiasi risultati inconcludenti. Lascia gli studi di Trojan horse in adulto, nappe e le orecchie devono essere eseguite con al massimo 1,5 mL infezione coltura come volumi superiori possono provocare danni ai tessuti. Nappa e infezioni alle orecchie può essere addestrati utilizzando cibo tinto colore acqua invece di Ustilago inoculo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella e Armin Hildebrand per la fornitura di materiale di laboratorio spazio e pianta. L'opera originale sul metodo Trojan horse era sostenuto da una borsa postdoc Leopoldina e progetto NSF IOS13-39229. Il lavoro presentato in questo articolo è stato supportato da SFB924 (progetti A14 e B14) del DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
| 23 G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
| Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
| Cuvette (10 mm x 4 mm x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
| Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
| Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | use locally available equipment | ||
| Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Yeast extract | BD | 212750 |
References
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