Summary
この作品は、3 つの異なったタイプのトウモロコシのティッシュに分泌されたトウモロコシ蛋白質の原配信経路トロイの木馬ひずみのクローニングについて説明します。
Abstract
Homer´s トロイの木馬神話に触発され、我々 はトウモロコシの病原体に体内の表現型解析を許可するトウモロコシのアポプラストから分泌されるタンパク質を提供する経路を設計されています。このメソッドは、トウモロコシの変換に依存しないが、微生物遺伝学、病原体の分泌機能を悪用します。ここで、体内の検査感染サイトや組織の異なる種類の高時空間解像度の分泌された蛋白質を配信できます。トロイの木馬戦略は一過性機能的タンパク質ドメイン、オフのターゲット蛋白質の効果を分析したり、オンサイド タンパク質過量投与、それにのための強力なツールを研究を特徴づけるためのトウモロコシの機能喪失の表現型を補完するために利用できます。トウモロコシの収穫システムにおけるタンパク質研究。この作業には、3 種類の異なるトウモロコシ組織にこのメソッドを適用するプロトコルを標準化された感染症に続いてトロイの木馬ひずみが発生する方法の正確なプロトコルが含まれています。
Introduction
赤病原体経路トウモロコシ黒穂病病1の原因となるエージェントです。Melanized、黒い胞子を含む大きな腫瘍でトウモロコシのすべての空中部分に感染します。グローバル レベルで米国アルテリシジンはメキシコで美食珍味として腫瘍を感謝しながらトウモロコシ収量の約 2% の年次損失を引き起こすと推定されます。植物の感染症は、トウモロコシの表皮細胞の最初の層を貫通する細胞壁溶解酵素を分泌する付着器によって開始されます。一次感染サイトから米国アルテリシジン成長細胞内と intercellularly、毎日1,2層 1 ~ 2 セルに侵入します。5 日に目に見える腫瘍に変わる植物の肥大で成功の感染結果感染1,3,4を投稿します。段階すべて感染菌糸はホスト細胞質1,2に任意の直接接触しなくても植物細胞質膜を鞘に収めた。感染菌糸と植物細胞膜間のタイトな apoplasmic スペースは、赤の相互作用ゾーンと呼ばれる宿主・病原体のインタラクティブなサイトと見なされます。植物自然免疫系を克服するためには、米国アルテリシジンは赤相互作用ゾーン1にエフェクター蛋白質の配列を分泌します。他の赤の相互作用ゾーン5,6,7,8のままいくつかのエフェクタの植物細胞にとられます。1 つ細胞壁のエフェクターは、シグナル伝達ペプチド ZmZIP1 ZmPROZIP から細胞壁プロテアーゼ活性9,10のリリースを防ぐためにトウモロコシの細胞壁酵素と相互作用する UmPit2 です。
最後の十年にわたって米国アルテリシジンなった植物-病原菌の相互作用、菌類の遺伝学もバイオ テクノロジー遺伝子手軽周知のライフ サイクルのために貴重なツールのためのモデルだけとの異種発現分泌タンパク質11,12,13。両方の従来型およびタンパク質の分泌のための信号は、翻訳後修飾14の制御を可能に決定されています。最近、米国アルテリシジンは小さい、勉強するトロイの木馬ツール分泌されるその場15トウモロコシ蛋白質として採用されました。トロイの木馬のアプローチは、小さな、分泌された蛋白質は葯の発達に関与する ZmMAC1 の機能を分析する正常に使用されました。ZmMAC1 は、多能性細胞と新しく生まれてくる細胞15の細胞運命仕様の周縁部を誘導します。同じ方法では、トウモロコシの被害関連ペプチド ZmZIP1 の生物学的機能が明らかになった。米国アルテリシジンZmZIP1 は、トウモロコシを分泌障害、腫瘍形成10です。したがって、トロイの木馬のアプローチを表す貴重な代替ルートはどちらも高時空間解像度でその場研究でタンパク質に必要な安定したトウモロコシ変換行もの組織浸潤の世代クローン発現と精製したタンパク質。特に、トロイの木馬戦略は、トウモロコシのアポプラストに任意の異種タンパク質の分泌と同じ組織内にある感染対非感染植物細胞の直接比較をできます。
このプロトコルは興味の蛋白質を調査する米国アルテリシジントロイの木馬歪みを生成するための主な手順を示しています。それさらを含む 3 つの異なるトウモロコシ組織型 (成人の葉、タッセルと耳) の感染対策に関する正確な情報米菌と時空間感染の進行そして蛋白質の機能を研究するための前提条件であります。これらのターゲットのティッシュ。それ以上の仕様は、トウモロコシの遺伝子増幅し顕微鏡イメージング技術、手順、ターゲット特定機器に依存したので。したがって、このプロトコルは、標準的な分子生物学の技術の経験豊富なユーザーに解決されます。
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Protocol
1.米国アルテリシジン木馬の建設
注:図 1を参照してください。
- 遺伝子特定のプライマーおよび校正のポリメラーゼは DNA を使用してトウモロコシの cDNA からの興味の遺伝子を増幅します。プライマリの PCR の製品をクローンし、大腸菌プラスミドのベンダーの指示に従って.構造体に変換サンガーのクローン作成、次の手順を使用する前にシーケンスによって興味のシーケンスの正しい遺伝子を確認します。
注:PCR 仕様はプライマー シーケンスの特異性と最適な DNA ポリメラーゼ反応条件のために最適化する必要があります。 - 信号のペプチッド (SP) のエンコード順序なし興味のトウモロコシの遺伝子を増幅するプライマーを設計します。
- RSIATA モチーフと下士官逆プライマーの 5´ 端を拡張サイト (表 1) を切る私。
- PCR のテンプレートとして 1.1 で生成された PCR コンストラクトを使用して校正の DNA ポリメラーゼと興味のトウモロコシの遺伝子を増幅します。
- ダブル ダイジェスト PCR の製品、米国アルテリシジン変換プラスミド p123 PUmpit2-SpUmpit2- ザンビアmac1 mCherry-ハ15、 Xbaと私は、下士官I. 消化の PCR 産物とプラスミドを浄化します。
- P123 PUmpit2-SpUmpit2- ザンビアmac1 mCherry-ハテンプレートに manufacturer´s の指示に従って T4 DNA リガーゼを使って消化液の PCR の製品を縛る。エシェリヒア属大腸菌に結紮製品を変換し、サンガーによる興味のシーケンスの正しい遺伝子を確認シーケンス。
- P123 PUmpit2-SpUmpit2- ザンビアの関心 mCherry の遺伝子- 制限の酵素SspとHaをリニア化」私と変換 solopathogenic米国に DNAアルテリシジンSG20016のひずみ。Carboxin 選択による米菌の形質転換細胞を分離し、南部で孤立した形質転換体のしみの分析16を確認します。
注:興味、少なくとも 3 つの独立した米国アルテリシジンの各蛋白質の形質転換体を分離し、背景のランダムな突然変異の表現型効果を推定する分析する必要があります。
2. 培地
- YEPSlight 液体中16の準備: 1.0% (w/v) 酵母エキス、0.4% (w/v)、バクト ペプトンおよび 0.4% (w/v) ショ糖。DdH2O および 15 分; 121 ° c のオートクレーブのすべてのコンポーネントを解散します。オートクレーブ高温で長期間または繰り返しの培地の品質が低下するでしょう。
- 準備ジャガイモ デキスト ロース寒天培地 (PD 寒天培地)20: 3.9% (w/v) ジャガイモ デキスト ロース寒天培地、および 1.0% (w/v) 1 M トリス-HCl pH 8.0 (0.01 M ・ fc)。オートクレーブのボトルに直接すべてのコンポーネントをミックスし、ddH2O プラス磁気攪拌棒を追加します。オートクレーブで 121 ° C、15 分;オートクレーブ高温で長期間または繰り返しの培地の品質が低下するでしょう。
- PD 炭寒天培地20の準備: 3.9% (w/v) ポテト ・ デキスト ロース寒天培地、1% (w/v) 木炭、1.0% (v/v) 1 M トリス-HCl pH 8.0 (0.01 M ・ fc)。オートクレーブのボトルに直接すべてのコンポーネントをミックスし、ddH2O プラス磁気攪拌棒を追加します。オートクレーブで 121 ° C、15 分;オートクレーブ高温で長期間または繰り返しの培地の品質が低下するでしょう。
3. 植物感染
- トロイの木馬 (例えば顕微鏡を用いた細胞カウント) タンパク質を配信する応答のトウモロコシの細胞分裂の分析を行う事前。米国アルテリシジン -トウモロコシの細胞増殖を誘発して 4-5 日ポスト感染周りその後腫瘍の形成開始。疾患の定量的評価は組織に依存しており、6 から 14 日までに行わなければなりません。
注:明確なトウモロコシの品種は、米国菌感染に感受性の異なるレベルを表示します。トウモロコシ c対W23、ガスペ フリント A188 初期黄金のバンタムや Va35 のこの病原体に対する感受性を示すトロイの木馬研究に適した品種で、このように。 - 米菌接種の準備
- 形質転換株による感染に対する副作用を推定するためにすべてのトロイの木馬の実験で否定的な制御として前駆ひずみ SG200 が含まれます。ここで、ネガティブ コントロールとして興味の蛋白質の非分泌のバージョンを表す米国アルテリシジンひずみを使用します。ただし、実用性 (例えばより大きい上映) の理由から、前駆ひずみ制御の簡単選択であるかもしれない。
- 実験を開始する前に推定感染文化の相当するものが必要があります。トウモロコシの組織型によって異なります各植物の感染が米国菌懸濁液の 1 〜 1.5 mL を必要があること注意してください。
注:外径600 YEPS光中の 0.2 で 20 mL の希釈のための十分な一晩文化約 1 mL を 13-16 植物の感染症のための十分な 0.8 1.0 の OD600 米アルテリシジン文化の 25 mL。 - PD 寒天培地からスクラッチ米国アルテリシジンの滅菌パスツール ピペットを使用してプレート、YEPS光媒体の 5 mL に接種させ 28 ° C で 16 時間 200 rpm で一定振動成長文化。
- 感染する前に適切な成長と 400 倍の倍率で細菌汚染の標準の光顕微鏡による米菌接種文化を調べます。
注:適切なカルチャ葉巻状菌だけは表示されている (図 2) です。 - 新鮮な YEPSライトの 900 μ L を混ぜて一晩文化を 100 μ l 添加し、分光光度計分析のブランクとして YEPS光媒体を用いた外径600を測定します。
- 0.2 の OD600に新鮮な YEPS光の中で一晩文化を希薄させ OD によって示される中間ログ成長段階に達するまで、200 rpm で一定振動 28 ° C で成長文化600 nm 0.8 1.0。
注:米国アルテリシジン細胞はこれらの条件の下ですべての 2 h を複製する、従って目的 OD600は栽培の 4-5 時間後に達されます。 - 3,000 x gで 10 分間で回して 0.8 1.0 の OD600細胞を収穫し、上澄みを廃棄します。
- 洗浄細胞ペレット ddH2o. と 1 時間この目的のためには、ddH2O、スピン 3000 × gで 10 分間の 1 つの文化ボリュームを追加し、上澄みを廃棄します。
- 慎重に ddH2O 20 mL ガラス ピペットを使用してそれにより最終的な OD600 (トロイの木馬の試金) の 3.0 または 1.0 (病気の評価) のための調整の細胞ペレットを再懸濁します。
- トロイの木馬の検証: planta トウモロコシ融合タンパク質の分泌
- トロイの木馬ひずみ17トウモロコシ幼植物に感染します。
- 共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して 2-3 日ポスト感染感染苗の顕微鏡イメージングを実行します。このため、葉の挿入ポイントの下 1 cm の長方形の部分を切除、顕微鏡スライド上にサンプルを置く、ddH2o. のドロップを追加MCherry 融合タンパク質を視覚化する λ で供試体をエキサイト = 561 nm、λ レコード放出 = 580 630 nm。
- 大人のトウモロコシの葉の感染
- 成人の葉の段階にトウモロコシを栽培する (とき少なくとも葉茎の中で成長する 7)。
注:この段階に達する 14 h、28 ° C の日/10 h、品種 W23 を使用して 22 の ° C 夜リズムの温室条件下で播種時に 4 週間後。トウモロコシの品種と温室効果の条件によって期間が異なります。 - 米国アルテリシジン文化を転送 (3.2.9 参照) 20 × 1 皮下注射針付き 3 mL 注射器に。
- 茎頂組織をローカライズする慎重に茎を押します。分裂組織の拠点は、柔らかい組織を困難茎からの移行によって区別できます。
- ペンを使用して茎の生長点をマークします。
- 米菌培養シュートの分裂組織または花序メリステムの上 1 cm の 1.5 mL を注入します。
- 6 と 12 日ポスト感染病の症状を評価します。
- 成人の葉の段階にトウモロコシを栽培する (とき少なくとも葉茎の中で成長する 7)。
- タッセルの感染
- タッセルの段階に達するまでには、トウモロコシの植物を育てます。
注:トウモロコシ品種 W23 で葯とタッセルの開発に関する詳細なタイムラインは、前述の18、19だった。減数分裂前の葯を含むタッセルが米菌感染に非常に敏感トウモロコシ品種 W23 のタッセル、4-7 cm のサイズです。 - 慎重に幹にタッセルをローカライズする茎を押します。
- マークの先端とペンを使用して茎のタッセルの基本。
- 米国アルテリシジン文化を転送 (3.2.9 参照) 20 × 1 皮下注射針付き 3 mL 注射器に。
- 房周り接種の 1.5 mL を注入します。接種の等しい配分を確保するため、ゆっくりと先端、中央部とペンでマークされているタッセルのベースに 0.5 mL を配置します。
- 10 日間ポスト感染病の症状を評価します。
- タッセルの段階に達するまでには、トウモロコシの植物を育てます。
- 耳の感染症
注:耳組織開発明確なトウモロコシの品種と温室効果の条件が異なり、接種前に注意深く観察する必要があります。シルクを脱却し始めて耳は非常米菌感染に受けます。- 米国アルテリシジン文化を転送 (3.2.9 参照) 20 × 1 皮下注射針付き 3 mL の注射器に。
- 殻葉間のスペースにできるだけ深く耳を傷つけることがなく接種針を挿入します。
- 耳の周りの接種材料の 1.5 mL のリリースです。
- 注射器と針を取り外して米国アルテリシジンソリューションを均等に配布するコブを慎重にマッサージします。
- 14 日記事感染病の症状を評価します。
- 米菌接種の有効性を確認します。
- PD 木炭寒天プレートに接種の 10 μ L を削除し、2 日間室温でインキュベートします。
注:場合は、それぞれ米国アルテリシジン文化はフォームのフィラメントが、ふわふわ、白い菌糸が表示されます (図 5)
- PD 木炭寒天プレートに接種の 10 μ L を削除し、2 日間室温でインキュベートします。
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Representative Results
米国アルテリシジンのトロイの木馬の実験のための構造は、プラスミド p123 PUmpit2-Umpit2Sp-関心 mCherry の遺伝子-Haに複製されます。MCherry蛍光レポーターとエピトープHAに興味のトウモロコシの遺伝子を融合-タグ。融合タンパク質の発現は、特に感染21中に活性化されている米アルテリシジンUmpit2プロモーターの制御下でです。赤相互作用ゾーンに関心ペプチド タンパク質の直接分泌するコーディングの地域は米国アルテリシジンUmpit221 (図 1) の信号のペプチッド シーケンスに融合されます。SG200 ipに米国アルテリシジン変換時に遺伝子が挿入されます- と対象となるゲノム挿入を相同組換えによって遺伝子座はサザンブロット解析で確認できます。融合タンパク質の分泌は、トロイの木馬ひずみ (図 3) 感染葉の苗で顕微鏡イメージング共焦点レーザー走査によって確認されます。例として、苗どちらか米国アルテリシジントロイの木馬株感染 SG200Zmmac1分泌 ZmMAC1 mCHERRY またはトロイの木馬馬制御ひずみ Umpit2- に欠けている表現する noSP Zmmac1 mCHERRYSP と続いてない秘密、ZmMAC1-mCHERRY-HA 蛋白質、図 3の15に示します。菌糸分泌 ZmMAC1 蛍光 mCherry 信号 (図 3 a) で囲まれています。対照的に、非分泌の菌糸は、真菌の細胞質 (図 3 b) の蛍光信号を表示するのみです。
特に、3.5 の手順で説明するよう、米国アルテリシジンのタッセル感染は適切な組織接種に依存します。不適切なタッセルのローカリゼーションまたは接種の不平等な配分は非感染タッセル (図 4 a) やタッセル (図 4 b) の部分的な感染症のみになります。均一な配分を確保するため、接種は接種針全体組織感染症 (図 4) を取得するからゆっくり解放される必要があります。PD 炭寒天に液滴を置くことによって、菌の生存率を確認できます。感染株 FB1 感染フィラメント形成 (の前に交配を必要と米国アルテリシジンひずみながら、solopathogenic トロイの木馬前駆ひずみ SG200 ようプレート (図 5 a) に綿毛を書いて表示されるフィラメントを形成します。5 b を図)。
| 名 | プライマー添加 | シーケンス (5´→3´) |
| フォワード | XbaI トウモロコシ遺伝子 | GCTCTAGA. |
| 逆 | NcoI RSIATA トウモロコシの遺伝子 | CATGCCATGGAGGCGGTGGCGATCGAGCG. |
表 1: シーケンス プライマー追加制限側面および興味のトウモロコシの遺伝子シーケンスを符号化 RSIATA モチーフを追加します。
図 1: の概要、米国アルテリシジントロイの木馬プラスミッドのクローニング戦略。Zmmac1 (ライトグレー) は、p123 PUmpit2-SpUmpit2- ザンビアmac1 mCherry-Haからダブル ダイジェストによって解放されます。並行して、興味 (黄色) の遺伝子は PCR によって増幅されます。目的のクローニングは、前方および逆のプライマー設計Xbaを含む私は、下士官クローニング サイトと RSIATA リンカー (パープル) 私。PCR の製品はXbaと消化される私と下士官私。血管を結紮後トロイの木馬プラスミドに次の要素が含まれています: Umpit2Umpit2プロモーターによって駆動される -SP (青) を N 末端興味 ORF (黄色) のトウモロコシの遺伝子を融合。ハエピトープ タグ (緑) (赤) mCHERRYレポーターの遺伝子、RSIATA リンカー C 末端が融合停止コドンが続く。米国アルテリシジン変換前にトロイの木馬プラスミドはSspと消化される米国 maydisipに相同の統合を許可する-軌跡 (灰色)。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: の光顕微鏡検査米菌接種文化。いくつか葉巻形の米国アルテリシジンsporidia が表示されます、いくつかの受ける新進 (アスタリスクによって示されます)。さらにセルが存在しない文化の汚染を示すでしょう。スケール バー = 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:(40)共焦点レーザー走査顕微鏡イメージング、黒穂病トロイの木馬ひずみ。MCherry 融合のトウモロコシ蛋白質 ZmMAC1 のトロイの木馬ひずみ SG200Zmmac1 (A) またはトロイの木馬馬ひずみ SG200Zmmac1noSP Umpit2SP (B) に欠けているを使用してトウモロコシ幼植物感染後の画像。米菌菌糸 (A)15、矢印によって示される表面に分泌 ZmMAC1 mCHERRY HA 融合タンパク質があります。SG200Zmmac1noSP ZmMAC1 の細胞質局在だけは目に見える (B)、 15のアスタリスクで示されます。スケール バー = 5 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 感染のタッセル米国アルテリシジン.米国アルテリシジン(A)、部分的なタッセル感染症 (B) 完全なタッセル感染 (C) 感染後 12 日とタッセルの不成功の感染が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: PD 炭寒天の菌の生存率アッセイ。Solopathogenic ひずみ SG2001は、トロイの木馬の生成で使用されました。SG200、自己刺激的な PD 炭寒天プレート (A) の伝染性のフィラメントを形成します。半数体米国アルテリシジンひずみ FB1 糸状 (B)22前に互換性のあるひずみと交配が必要です。スケール バー = 2 mm。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
現代の作物研究は、遺伝子の分子生物学的解析とタンパク質レベルのプロトコルを要求します。遺伝的アクセシビリティを介して変換はありません利用可能なまたは非効率的でトウモロコシなどほとんどの作物種のため時間がかかるです。また、プロモーター レポーター システムなど信頼性の高い遺伝的ツールが不足している、異なる組織サイトで高時空間解像度でその場でタンパク質の機能を研究することは困難になります。細胞壁タンパク質は、クローン表現および浄化された蛋白質の組織浸潤によって学ぶことができます。ただし、異種蛋白質の表現の進歩にもかかわらず、困難で、多くの場合非効率的なタンパク質機能解析のために対象となる作物組織浸潤が残ります。トロイの木馬戦略は、変換または蛋白質浸透を必要としない別のアプローチです。トウモロコシの病原体米国アルテリシジンの分泌装置を採用し、感染組織の植物アポプラストへの興味の蛋白質は理論的には任意の配信が実現できます。興味の蛋白質のサイズに関してこの手法の限界を探検するためにあります。旧試金 Cmu1 融合 mCherry 290 アミノ酸米アルテリシジンエフェクターは正常に分泌7だったただし、大きい蛋白質にトロイの木馬法の適用性がテストする残ります。興味の蛋白質翻訳後修飾の追加が望ましい、型破りな分泌部分は古典的な分泌を介してSP14への代替ルートとして使えます。
ために信頼性の高いタンパク質の折り畳み、翻訳後修飾、および分泌効率11,12,13タンパク質バイオ テクノロジーに標準的なツールとして米国アルテリシジンを採用します。それにもかかわらず、各トロイの木馬の新種のタンパク質の分泌は、ステップ 3 で説明するよう慎重に分析する必要があります。顕微イメージングによる感染検査簡単苗を感染させることによってすべてのトロイの木馬を新しく生成されたひずみの初期テストを実行する勧めします。
SG200 は、solopathogenic 株トロイの木馬実験前に交配を必要としない、扱いやすいためであります。FB1 と FB2 のように互換性のある菌株の感染効率は高い23、です SG200 の効率はトロイの木馬の実験のために十分。他のアポプラストのままいくつか米国アルテリシジンエフェクタータンパク質の宿主細胞によってとられます。両方のグループ間の差別化と思われる制御および特定のプロセス;ただし、基になるメカニズムはとらえどころのない8のまま、実験を設計するとき考慮に入れすることはできません。したがって、細胞壁に統合されるがあるや、細胞内で行動する、興味の蛋白質は、トロイの木馬のアプローチに適した候補ではありません。
苗葉、成人の葉、タッセルなど、別の植物の発達段階、区別された組織で、複数のタンパク質のトロイの木馬方法を適用ことができます米アルテリシジンは多様な空中トウモロコシ組織への感染に万能なので、耳。いくつかの有用なアプリケーションの名前、トロイの木馬は、ローカルの過量投与、オフサイド タンパク質効果、または異なる蛋白質の領域の機能特性をテストことができます。
汚染米菌を維持する文化はすべて記述されている実験のため重要な感染細菌の大量の感染植物の免疫応答をトリガーし、いずれかのレンダリング、興味の蛋白質への反応を変更するので結果は決定的でないです。トロイの木馬大人の葉、タッセルと耳高いボリュームは組織の損傷として最大限に 1.5 mL 感染文化と実行します。タッセルや耳の感染症は、黒穂病菌の代わりに食品色で汚れた水を使用して学習することができます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、ラボ スペースおよび植物材料を提供するためトーマス ドレッセルハウス場、マーティン Parniske、ヌールディン Djella とアーミン ヒルデブラントを感謝したいです。トロイの木馬方式のオリジナル作品は、レオポルジナ ポスドク親睦と NSF プロジェクト IOS13 39229 によって支えられました。この記事で紹介した作品は、DFG の SFB924 (A14 と B14 のプロジェクト) によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
| 23 G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
| Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
| Cuvette (10 mm x 4 mm x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
| Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
| Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | use locally available equipment | ||
| Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Yeast extract | BD | 212750 |
References
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