Summary
Este trabalho descreve a clonagem de uma estirpe de cavalo de Troia de Ustilago maydis para a entrega no local das proteínas secretadas de milho em três tipos diferentes de tecidos de milho.
Abstract
Inspirado pelo mito de cavalo de Troia Homer´s, nós produzimos o patógeno milho, Ustilago maydis entregar proteínas secretadas para o apoplasto milho permitindo análise fenotípica em vivo. Este método não se baseia na transformação de milho mas explora recursos secretoras de patógenos e genética microbiana. Neste documento, permite a inspeção de in vivo entregue proteínas secretadas com alta resolução spatiotemporal em diferentes tipos de tecidos e infecção sites. A estratégia do cavalo de Troia pode ser utilizada para complementar transitoriamente milho fenótipos de perda-de-função, caracterizar funcionalmente os domínios da proteína, para analisar os efeitos da proteína alvo, ou estudar a sobredosagem de proteína em jogo, tornando-o uma ferramenta poderosa para estudos de proteína no sistema de colheita de milho. Este trabalho contém um protocolo preciso sobre como gerar uma cepa de cavalo de Troia, seguida de protocolos padronizados de infecção para aplicar esse método para três tipos de tecido diferentes de milho.
Introduction
O patógeno biotrófica Ustilago maydis é o agente causador da doença obscenidade milho1. Ele infecta todas as partes aéreas de milho, resultando em tumores grandes que contêm esporos melanized, preto. A nível global, U. maydis é estimado para causar uma perda anual de cerca de 2% do rendimento do milho, enquanto tumores são apreciados como uma iguaria gastronômica no México. Infecção da planta é iniciada por um apressório que secreta enzimas de lise de parede celular para penetrar a primeira camada de células epidérmicas de milho. De um local de infecção primária, U. maydis cresce intracelular e intercellularly, invadindo a célula de uma a duas camadas cada dia1,2. Resultados de infecção bem sucedida na hipertrofia da planta que se transforma em tumores visíveis após cinco dias pós infecção1,3,4. Durante todas as fases da infecção, hifas fúngicas invaginate da membrana do citoplasma de planta sem qualquer contacto directo para o anfitrião citoplasma1,2. O espaço de apoplasmic apertado entre as hifas infectante e a membrana plasmática de planta é considerado a hospedeiro/agente patogénico interativas do site, chamada de zona de interação biotrófica. A fim de superar o sistema imune inato de planta, U. maydis segrega uma matriz de proteínas efetoras para a interação biotrófica zona1. Alguns efetores são ocupados por células vegetais, enquanto os outros permanecem no biotrófica interação zona5,6,7,8. Um efetor apoplástica é UmPit2, que interage com proteases apoplástica milho para impedir a libertação da sinalização do peptide ZmZIP1 de ZmPROZIP por apoplástica protease atividade9,10.
Nas últimas décadas, U. maydis tornou-se não apenas um modelo para a genética de fungosas na interação planta-patógeno, mas também uma ferramenta valiosa na biotecnologia devido a um ciclo de vida bem compreendida, fácil acessibilidade genética e expressão heteróloga de secretado proteínas11,12,13. Foram determinados sinais para ambos secreção de proteína convencional e não convencional que permite o controle de modificações do posttranslational14. Recentemente, U. maydis foi empregado como uma ferramenta de cavalo de Troia para estudar pequeno, secretada milho proteínas em situ15. A abordagem de cavalo de Troia foi usada com sucesso para analisar a função da proteína secretada, pequena ZmMAC1 que está envolvido no desenvolvimento da antera. ZmMAC1 induz a divisão periclinal de células pluripotentes e especificação de destino célula do recém-formado células15. Pelo mesmo método, a função biológica do milho associada a danos peptide ZmZIP1 foi revelada. U. maydis segregar o milho que zmzip1 resultou na deficiente formação de tumor10. Assim, o cavalo de Troia abordagem representa uma valiosa rota alternativa à proteína em situ estudos com alta resolução spatiotemporal que faz nem exigem geração de linhas de transformação de milho estável nem infiltração de tecido com heterologously proteínas expressas e purificadas. Em particular, a estratégia do cavalo de Troia permite a secreção de qualquer proteína heteróloga para o apoplasto milho e comparação direta de infectados contra células não infectadas planta dentro do mesmo tecido.
Este protocolo ilustra as principais etapas para a geração de uma estirpe de cavalo de Troia U. maydis para estudar uma proteína de interesse. Além disso inclui informações precisas sobre os procedimentos de infecção de três tipos de tecido diferentes de milho (folhas adultas, borlas e orelhas) com U. maydis, que é um pré-requisito para estudar a função de progressão e proteína de infecção spatiotemporal nestes tecidos alvo. Sem mais especificações são determinado na amplificação de gene milho e microscópicas de imagens técnicas, uma vez que estas etapas são alvo específico e dependente do instrumento. Assim, o presente protocolo é dirigido aos usuários experientes de técnicas padrão de biologia molecular.
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Protocol
1. construção de um cavalo de Troia maydis U.
Nota: Veja a Figura 1.
- Amplifica um gene de interesse do milho do cDNA usando as primeiras demão gene-específico e uma correcção DNA polimerase. Clonar o principal produto do PCR e transformar a construção em Escherichia coli , seguindo as instruções do fornecedor do plasmídeo. Verifique se o gene correto da sequência de interesse pelo prior de sequenciamento Sanger usar para as próximas etapas da clonagem.
Nota: Especificações de PCR precisam ser otimizado devido às especificidades de sequência da primeira demão e condições de reação ideal DNA polimerase. - Desenho de primers para amplificar o milho gene de interesse sem a sequência de codificação um peptídeo sinal (SP).
- Estender o 5´ final do primer reverso com o motivo RSIATA e um Ncoeu corte local (tabela 1).
- Amplifica o milho gene de interesse com uma correcção DNA polimerase usando a construção PCR gerada em 1.1, como o modelo PCR.
- Duplo-digerir o produto do PCR e do plasmídeo de transformação U. maydis , p123-PUmpit2-SpUmpit2Zm -mac1-mCherry-Ha15, com Xbaeu e Nco I. purificar o produto do PCR digerido e plasmídeo.
- Ligar o produto do PCR digerido no p123-Ppit2-SpUmpit2Zm -mac1-mCherry-Ha modeloUmusando T4 DNA ligase, seguindo as instruções do manufacturer´s. Transformar o produto de ligadura em Escherichia coli e verifique se o gene correto da sequência de interesse por Sanger sequenciamento.
- Linearizar a p123-PUmpit2-SpUmpit2Zm -gene de interesse-mCherry-Ha com a enzima de restrição Sspeu e transformação de DNA para o solopathogenic U. maydis Coe SG20016. Isolar o U. maydis transformants pela seleção carboxin e confirmar transformants isolados por Southern blot análise16.
Nota: Para cada proteína de interesse, pelo menos três independentes U. maydis transformants deve ser isolado e analisado para estimar os efeitos de fenótipo de mutações aleatórias de fundo.
2. meios de cultura
- Preparar YEPSlight líquido médio16: extracto de levedura de 1,0% (p/v), 0,4% (p/v)-Bacto peptona e 0,4% (p/v) de sacarose. Dissolver todos os componentes em ddH2O e autoclave a 121 ° C por 15 min; autoclave a uma temperatura mais elevada, por um longo período de tempo ou repetidamente, reduziria a qualidade do meio.
- Preparar batata-dextrose-ágar (ágar-PD)20: 3,9% (p/v) de batata dextrose agar e 1,0% (p/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (f.c. 0,01 M). Misturar todos os componentes diretamente na garrafa para autoclave e adicione O ddH2mais uma barra de agitação magnética. Autoclave a 121 ° C por 15 min; autoclave a uma temperatura mais elevada, por um longo período de tempo ou repetidamente, reduziria a qualidade do meio.
- Preparar o PD-carvão ágar20: 3,9% (p/v) batata dextrose ágar-ágar, carvão de 1% (p/v) e 1,0% (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (f.c. 0,01 M). Misturar todos os componentes diretamente na garrafa para autoclave e adicione O ddH2mais uma barra de agitação magnética. Autoclave a 121 ° C por 15 min; autoclave a uma temperatura mais elevada, por um longo período de tempo ou repetidamente, reduziria a qualidade do meio.
3. planta de infecção
- Executar análise de milho divisão celular em resposta ao cavalo de Troia, entregado a proteína (por exemplo, à base de microscopia célula contando) previamente. U. maydisinduzida proliferação celular milho e formação de tumor subsequentes começa em torno de 4-5 dias pós infecção. As avaliações quantitativas doença dependem do tecido e devem ser realizadas de 6 a 14 dias pós infecção.
Nota: Diferentes cultivares de milho mostram diferentes níveis de suscetibilidade à infecção U. maydis . Milho cvs W23, A188, sílex de Gaspe, cedo Golden Bantam ou Va35 mostrar sensibilidade para este patógeno e são, portanto, as cultivares adequadas para estudos de cavalo de Troia. - Preparação do inóculo maydis U.
- Inclua a estirpe do progenitor SG200 como controlo negativo em todos os experimentos de cavalo de Troia para estimar os efeitos colaterais sobre a infecção pela cepa transgênica. Aqui, use uma tensão U. maydis , expressando uma versão não-segregada da proteína de interesse, como controlo negativo. No entanto, por razões de exequibilidade (por exemplo, maiores seleções), a cepa progenitora pode ser a escolha mais fácil de controlar.
- Antes de iniciar o experimento, estime o que equivale de cultura de infecção é necessários. Tenha em mente que a infecção de cada planta requer 1-1,5 mL de suspensão de U. maydis depende do tipo de tecido de milho.
Nota: Aproximadamente 1 mL de uma cultura da noite é suficiente para a diluição de uma OD600 de 0,2 em 20 mL de meio deluz YEPS, e 25 mL de uma cultura de U. maydis com uma OD600 de 0.8-1.0 são suficientes para a infecção de plantas de 13-16. - Zero U. maydis de agar um PD da placa usando uma pipeta Pasteur estéril, inocular em 5 mL de meio deluz YEPS e deixar a cultura crescer a 28 ° C, com agitação constante a 200 rpm por 16 h.
- Antes da infecção, examine a cultura de inoculação de U. maydis por microscopia de luz padrão para crescimento adequado e contaminação bacteriana na ampliação de X 400.
Nota: Em uma cultura adequada, apenas o fungo em forma de charuto é visível (Figura 2). - Misture 900 µ l de fresco YEPSluz com 100 µ l da cultura durante a noite e medir o OD600 usando meio deluz YEPS como um espaço em branco na análise Espectrofotômetro.
- Diluir a cultura durante a noite com meio deluz YEPS fresco para uma OD600 de 0.2 e deixar a cultura crescer a 28 ° C, com agitação constante a 200 rpm até atingir a fase de crescimento de log mid indicada por overdose600 nm de 0.8-1.0.
Nota: U. maydis células duplicar a cada 2 h sob essas condições, assim, o desejado de OD600 é alcançado após 4-5 h de cultivo. - Recolher as células em OD600 de 0.8-1.0 por fiação a 3.000 x g por 10 min e descartar o sobrenadante.
- Lave o centrifugado uma vez com o ddH2O. Para este efeito, adicionar um volume de cultura de DDQ2O, rotação com 3000 x g por 10 min e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as células cuidadosamente em ddH2O usando uma pipeta de vidro de 20 mL, ajustando assim o OD final600 3.0 (para um ensaio de cavalo de Troia) ou 1.0 (para classificação da doença).
- Verificação do cavalo de Troia: em planta de secreção da proteína do milho fusão
- Infectar plântulas de milho com um cavalo de Troia cepa17.
- Realize imagens microscópicas de mudas infectadas em 2-3 dias pós infecção usando um microscópio confocal de varredura a laser. Para este fim, excisar um pedaço retangular da folha 1 cm abaixo do ponto de injeção, colocar a amostra numa lâmina de microscópio e adicionar uma gota de DDQ2O. Para visualizar a proteína de fusão de mCherry, excitar o espécime em λ = 561 nm e emissão recorde em λ = 580-630 nm.
- Infecção de folhas de milho adultas
- Cultivar plantas de milho para a fase de folhas adultas (pelo menos quando da folha 7 cresce dentro do caule).
Nota: Este estágio é alcançado após quatro semanas após a sementeira sob condições de estufa de 14 h, h do dia/10 de 28 ° C, ritmo de noite de 22 ° C usando CV W23. Duração pode variar com as condições de cultivar e estufa de milho. - Transferir a cultura U. maydis (ver 3.2.9) uma seringa de 3 mL com agulha hipodérmica 20 x 1.
- Pressione o talo cuidadosamente para localizar o tecido meristema do caule. A base do meristema pode ser distinguida por uma transição de talo mais duro de tecido mais suave.
- Marca a meristema no talo usando uma caneta.
- Injecte 1,5 mL de cultura U. maydis 1 cm acima do tiro meristema ou meristema de inflorescência.
- Taxa de sintomas da doença em 6 e 12 dias pós infecção.
- Cultivar plantas de milho para a fase de folhas adultas (pelo menos quando da folha 7 cresce dentro do caule).
- Infecção de borlas
- Cultivar plantas de milho até atingir o estágio de borla.
Nota: Um cronograma detalhado sobre o desenvolvimento da antera e pendão em milho CV. W23 foi descrito anteriormente,1819. Borlas, contendo pre-meióticas anteras são altamente suscetíveis à infecção U. maydis ; no milho CV. W23 borlas são do tamanho de 4 a 7 cm. - Pressione o talo cuidadosamente para localizar a borla no tronco.
- Marca a ponta e a base da borla na haste usando uma caneta.
- Transferir a cultura U. maydis (ver 3.2.9) uma seringa de 3 mL com agulha hipodérmica 20 x 1.
- Injete 1,5 mL do inóculo em torno o pendão. Para assegurar a distribuição igual do inóculo, lentamente coloque 0,5 mL cada na ponta, a parte do meio e a base da borla marcada com a caneta.
- Taxa de sintomas da doença em 10 dias pós infecção.
- Cultivar plantas de milho até atingir o estágio de borla.
- Infecção dos ouvidos
Nota: o desenvolvimento de tecido de orelha difere em diferentes cultivares de milho e as condições da estufa e devem ser cuidadosamente observado antes da inoculação. Orelhas, começando a superar sedas são altamente suscetíveis à infecção U. maydis .- Transferir a cultura U. maydis (ver 3.2.9) uma seringa de 3 mL com agulha hipodérmica 20 x 1.
- Injete a agulha de inoculação para o espaço entre as folhas de casca tão profundamente quanto possível, sem ferir o ouvido.
- Lançamento 1,5 mL do inóculo em torno da orelha.
- Remova a seringa e agulha e massagear cuidadosamente o cob para distribuir a solução U. maydis igualmente.
- Taxa de sintomas da doença em 14 dias pós infecção.
- Confirmar a viabilidade do inóculo maydis U.
- Queda de 10 µ l de inóculo numa placa de ágar carvão PD e incubar a temperatura ambiente por 2 dias.
Nota: Se a respectiva cultura U. maydis é capaz de filamentos forma, micélio branco, macio torna-se visível (Figura 5)
- Queda de 10 µ l de inóculo numa placa de ágar carvão PD e incubar a temperatura ambiente por 2 dias.
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Representative Results
Construções para experimentos de cavalo de Troia U. maydis são clonadas em plasmídeo p123-PUmpit2-SpUmpit2-gene de interesse-mCherry-Ha. O milho gene de interesse é fundido a uma repórter de fluorescência de mCherry e um epítopo HA-marca. A expressão da proteína de fusão está sob controle dopit2 U. maydis Um promotor que é especificamente ativado durante a infecção21. A secreção direta da proteína de peptídeo de interesse para a zona de interação biotrófica, região codificante é fundida a sequência de peptídeo sinal de Um U. maydis pit221 (Figura 1). A transformação de U. maydis , o transgene é inserido o SG200 ip-locus por recombinação homóloga e inserção de genoma alvo pode ser verificada pela análise de Southern blot. Secreção da proteína de fusão é confirmada pelo laser confocal de varredura imagens microscópicas em plântulas deixa infectadas com uma cepa de cavalo de Troia (Figura 3). Como exemplo, mudas infectado com cavalo de Troia ou U. maydis estirpe SG200Zmmac1 secretando um ZmMAC1-mCHERRY ou um controle de não-cavalo de Troia Coe expressando Zm-noSPmac1-mCHERRY que carece de Umpit2- SP e posteriormente faz não da proteína segredo do ZmMAC1-mCHERRY-HA, são mostrados na Figura 315. Hifas secretando ZmMAC1 estão rodeadas por sinal fluorescente mCherry (Figura 3A). Em contraste, as hifas não-secretores só mostram sinal de fluorescência no citoplasma fúngico (Figura 3B).
Em particular, pendão infecção com U. maydis baseia-se na inoculação de tecido apropriado, conforme descrito na etapa 3.5. Localização de pendão impróprio ou distribuição desigual do inóculo pode resultar em não infectados pendão (Figura 4A) ou apenas parcial infecção da borla (Figura 4B). Para garantir a distribuição uniforme, o inóculo precisa ser soltos lentamente a agulha de inoculação de adquirir a infecção do tecido inteiro (Figura 4). Viabilidade do inóculo pode ser verificada colocando uma gota em ágar PD-carvão. Estirpes infecciosas formam filamentos aparecendo como escrever buço na placa como mostrado para a estirpe de progenitor de cavalo de Troia SG200 solopathogenic (Figura 5A) enquanto a tensão U. maydis que FB1 requer acasalamento antes da formação do filamento infecciosa ( Figura 5B).
| Nome | Adição de cartilha | Sequência (5´→3´) |
| Para a frente | Gene XbaI-milho | GCTCTAGA... |
| Inverter | Gene NcoI-RSIATA-milho | CATGCCATGGAGGCGGTGGCGATCGAGCG... |
Tabela 1: Sequências de adições de cartilha para adicionar restrição lados e motivo de RSIATA sequência ao gene de interesse, de milho de código.
Figura 1 : Visão esquemática do U. maydis cavalo de Troia plasmídeo clonagem estratégia. ZMmac1 (cinza claro) é lançado pela dupla digest de p123-PUmpit2-SpUmpit2Zm -mac1-mCherry-Ha. Em paralelo, o gene de interesse (amarelo) é amplificado por PCR. Para fins de clonagem, primers para diante e reversos são projetados incluem Xbaeu e Ncoeu clonagem de sites e um vinculador RSIATA (roxo). O produto do PCR é digerido com Xbaeu e Ncoeu. Após a ligadura, o plasmídeo de cavalo de Troia contém os seguintes elementos: conduzido pelo promotor Umpit2 , um de Umpit2-SP (azul) é fundido N-terminal para um milho gene de interesse ORF (amarelo). No C-terminal, um vinculador RSIATA, um gene repórter de mCHERRY (vermelho) e uma marca de epítopo HA (verde) são fundidos seguidos por um códon de parada. Antes da transformação de U. maydis , o plasmídeo de cavalo de Troia é digerido com Sspque para permitir a integração homóloga para o U. maydisip-locus (cinza). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Exame microscópico de luz de U. maydis cultura de inoculação. Vários charutos em forma de U. maydis sporidia são visíveis, algumas das quais passam por brotamento (indicado por asteriscos). Não há mais células estiverem presentes que indicaria uma contaminação da cultura. Barra de escala = 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Em planta confocal laser de varredura de imagem microscópica de um Ustilago Tensão de cavalo de Troia. Imagem latente da proteína mCherry-fundido milho ZmMAC1 após infecção de plântulas de milho utilizando a cepa de cavalo de Troia SG200Zmmac1 (A) ou uma cepa não-cavalo de Troia SG200Zmmac1- noSP falta o Umpit2-SP (B). Secretada ZmMAC1-mCHERRY-HA proteína de fusão situa-se na superfície do U. maydis hifas (A)15, indicado pelas cabeças de seta. Em SG200Zmmac1- noSP apenas uma localização citoplasmática de ZmMAC1 é visível (B), indicado pelo asterisco 15. Escala de barras = 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Tassel infecção com Maydis U.. Infecção malsucedida do pendão com pendão completa infecção (C) 12 dias após a infecção, infecção pendão parcial (B) e U. maydis (A) são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Ensaio de viabilidade do inóculo no ágar PD-carvão. A tensão solopathogenic SG2001 foi usada para a geração de cavalo de Troia. SG200 Self estimulante e forma filamentos infecciosos em uma placa de ágar de PD-carvão (A). A haploid tensão U. maydis FB1 requer acasalamento com uma cepa compatível antes de crescimento filamentoso (B)22. Escala de barras = 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Pesquisa de cultura moderna exige protocolos de análise molecular, a genética e os níveis de proteína. Genética de acessibilidade através de transformação não é disponível ou ineficiente e demorado para a maioria das espécies de culturas como o milho. Além disso, ferramentas genéticas confiáveis tais como sistemas de repórter do promotor são escassas, o que torna difícil para o estudo da função das proteínas in situ com alta resolução spatiotemporal nos sítios de tecidos distintos. Apoplástica proteínas podem ser estudadas por infiltração de heterologously expressadas e purificadas de proteínas nos tecidos. No entanto, apesar dos avanços na expressão da proteína heteróloga, alvo infiltração nos tecidos de cultura continua a ser difícil e muitas vezes ineficaz para análise de proteínas funcionais. A estratégia do cavalo de Troia é uma abordagem alternativa que não requer transformação ou infiltração de proteína. Empregando-se o aparelho de secreção do patógeno milho U. maydis, entrega de teoricamente qualquer proteína de interesse para o apoplasto planta de tecido infectado pode ser alcançada. Sobre o tamanho de uma proteína de interesse, os limites desta técnica tem ainda a ser explorado. Em ensaios anteriores, o efetor de U. maydis 290 aminoácidos que cmu1 fundido a mCherry foi com êxito secretada7. No entanto, a aplicabilidade do método cavalo de Troia para maiores proteínas permanece para ser testado. Se adições de modificações posttranslational à proteína de interesse são indesejáveis, secreção não convencional pode ser usada como uma rota alternativa para secreção clássica via SP14.
U. maydis é empregada como uma ferramenta padrão em biotecnologia de proteína por causa do enrolamento de proteínas confiável, modificação pós-traducional e secreção eficiências11,12,13. Não obstante, secreção de proteína para cada novo tipo de cavalo de Troia precisa ser cuidadosamente analisado, conforme descrito no passo 3. Recomenda-se realizar um teste inicial de cada estirpe de cavalo de Troia recém-gerado infectando mudas que são fáceis para infectar e inspecionar por imagens microscópicas.
SG200 é uma variedade de solopathogenic que não requer de acasalamento antes das experiências de cavalo de Troia e, portanto, é mais fácil de lidar. Embora a eficiência da infecção das estirpes compatíveis como FB1 e FB2 é superior a23, a eficiência de SG200 é suficiente para experimentos de cavalo de Troia. Algumas proteínas efetoras do U. maydis são ocupadas por células hospedeiras, enquanto outros permanecem no apoplasto. A diferenciação entre os dois grupos parece ser um processo controlado e específico; no entanto, os mecanismos subjacentes permanecem indescritível8 e não podem ser tidas em conta ao projetar um experimento. Portanto, as proteínas do interesse que têm para serem integrados a parede celular ou que têm de agir intracelular são não há candidatos adequados para a abordagem de cavalo de Troia.
Desde U. maydis é onipotente em infectando diversos tecidos aéreos de milho, o método de cavalo de Troia pode ser aplicado para várias proteínas, nos tecidos distintos e em estádios de desenvolvimento diferentes da planta, como folhas de plântulas, folhas adultas, borlas, e orelhas. Para citar apenas alguns aplicativos úteis, o cavalo de Troia permite teste local sobredosagem, efeitos de proteína impedimento ou caracterização funcional de domínios distintos da proteína.
Mantendo um incontaminados U. maydis cultura é crucial para todos os experimentos descritos desde que co-infecção com uma grande quantidade de bactérias desencadeia a resposta imune da planta e altera sua reação para com a proteína de interesse, tornando assim qualquer resultados inconclusivos. Estudos de cavalo de Troia no adulto deixa, borlas e orelhas tem que ser realizada com cultura de infecção màxima 1,5 mL como volumes mais elevados podem resultar em danos nos tecidos. Pendão e infecções de ouvido pode ser treinada usando água de cor manchada de comida ao invés de Ustilago inóculo.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer a Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella e Armin Hildebrand para fornecer material de espaço e a planta do laboratório. O trabalho original sobre o método de cavalo de Troia foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado de Leopoldina e projeto NSF IOS13-39229. O trabalho apresentado neste artigo foi apoiado por SFB924 (projetos A14 e B14) da DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
| 23 G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
| Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
| Cuvette (10 mm x 4 mm x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
| Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
| Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | use locally available equipment | ||
| Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Yeast extract | BD | 212750 |
References
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