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Biology

Effet des protéines fluorescentes sur des partenaires de Fusion utilisant les épreuves de toxicité Polyglutamine chez la levure

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58748
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Western Ontario, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Western Ontario

Summary

Cet article décrit les protocoles afin d’évaluer l’effet des protéines fluorescentes sur l’agrégation et la toxicité de l’expansion de polyglutamine mal repliées pour l’évaluation rapide d’une protéine fluorescente nouvellement indéterminée dans le contexte de reporters fluorescents.

Abstract

Pour l’enquête de localisation des protéines et du trafic à l’aide de l’imagerie de cellules vivantes, chercheurs comptent souvent sur leur protéine d’intérêt à un journaliste fluorescent de fusion. La liste en constante évolution des protéines fluorescentes génétiquement encodés (FPs) présente aux utilisateurs plusieurs solutions de rechange en matière de conception de fusion fluorescent. Chaque FP possède des propriétés optiques et biophysiques spécifiques qui peuvent affecter les propriétés biochimiques, cellulaires et fonctionnelles les fusions fluorescent qui en résulte. Par exemple, plusieurs FPs tendent à former des oligomères non spécifiques qui sont susceptibles d’entraver la fonction de la partenaire de fusion. Malheureusement, seulement quelques méthodes existent pour tester l’impact des FPs sur le comportement du reporter fluorescent. Nous décrivons ici une méthode simple qui permet une évaluation rapide de l’impact d’images par seconde en utilisant les épreuves de toxicité polyglutamine (polyQ) dans la levure Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-élargi la huntingtine protéines sont associées à l’apparition de la maladie de Huntington (MH), où la huntingtine élargie regroupe en oligomères toxiques et des corps d’inclusion. L’agrégation et la toxicité des expansions de polyQ chez les levures sont fortement tributaires des séquences flanquant la région polyQ, y compris la présence d’étiquettes fluorescentes, fournissant ainsi une plate-forme expérimentale idéale pour étudier l’impact des FPs sur le comportement de leurs partenaire de fusion.

Introduction

Étant donné que la caractérisation initiale de la protéine fluorescente verte (GFP) de Aequorea victoria1, une large palette de génétiquement encodé IPS ont été développés, permettant aux biologistes cellulaires de localiser et de suivre simultanément plusieurs événements/protéines cellulaires dans la vie des cellules de2,3. FPs proviennent de plusieurs organismes, de méduses, coraux, et par conséquent, Visualisez les propriétés biophysiques spécifiques qui détourner largement au-delà de leur spectre de fluorescence respectif. Ces propriétés incluent luminosité photostabilité et une tendance à oligomerize, entre autres,2,4. Sélection de monomère FPs est un aspect important dans la sélection d’une balise appropriée lorsque vous concevez un journaliste fluorescent, afin de minimiser les interactions inappropriées et altérations de la fonction de la partenaire de fusion et de maximiser l’efficacité de journaliste pour une étant donné le compartiment cellulaire4,5,6. Tandis que GFP a, au fil du temps, a été élaborée pour minimiser l’effet de l’ajout de la balise fluorescente à la fusion partenaire5,7,8, comment les nouvelles variantes FP effectuent par rapport à la GFP reste difficile à évaluer.

Peu de méthodes existe pour caractériser le comportement des FPs. La plupart d'entre eux comportent des essais des propriétés biophysiques des FPs en utilisant des approches biochimiques, tels que l’ultracentrifugation et gel filtration protocoles9,10,11,12. Ces méthodes ont la mise en garde de l’utilisation de FPs purifiée en solution, offrant une vision un peu dans leur comportement dans les cellules intactes. Le développement de l’offre de dosage du réticulum endoplasmique lisse (OSER) organisé une évaluation quantifiable de tendance FPs' à oligomerize la vie des cellules13 en testant la capacité du FPs surexprimée à réorganiser les tubules de réticulum endoplasmique dans OSER verticilles14. Cette technique peut détecter avec succès des changements entre monomères et oligomères variants de la GFP et autres FPs. Toutefois, il s’appuie principalement sur la surexpression dans les cellules transfectées transitoirement, et la quantification et l’analyse de l’image peuvent prendre beaucoup de temps à moins que la technique est adoptée comme une collecte automatisée des données et les flux de travail de l’analyse.

Afin de compléter ces approches, nous avons établi une analyse qui profite de l’effet des étiquettes fluorescentes sur la toxicité et l’agrégation des expansions polyQ dans levure15,16. L’expansion de l’étirement de polyQ avec plus de 36 se répète dans le premier exon du gène codage de que la protéine huntingtine (Htt) est associée à la maladie de Huntington17,18. L’expression d’étendue Httex1 dans les résultats de la levure dans une forte agrégation de la protéine Htt mal repliée, couplée à un défaut de croissance sévère. Fait intéressant, ces phénotypes sont fortement influencées par les séquences flanquant le tronçon de polyQ, y compris les FPs15,16. Il a été rationalisé que les différentes propriétés de FPs peuvent affecter différemment polyQ toxicité chez la levure. En effet, par rapport à GFP-like FPs, protéines fluorescentes rouges et leurs formes évoluées ont montré une toxicité et agrégation réduit16. Ce manuscrit fournit un protocole détaillé afin d’évaluer l’effet de la prochaine génération de FPs sur la toxicité de polyQ et agrégation dans la levure. Ce dosage permet une analyse rapide et potentiellement forte teneur des variantes FP qui peut être utilisé en parallèle avec caractérisait auparavant techniques pour la caractérisation optimale de nouveau FPs et peut évaluer comment ils effectuent par rapport à la GFP.

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Protocol

1. génération de nouveau fluorescent tag Httex1 Reporters pour une Expression dans la levure

Remarque : Cette section a été modifiée par le protocole de Jiang et al. 16 et Albakri et al. 19.

  1. Concevoir des amorces pour amplifier la séquence codant pour la protéine fluorescente ou intérêt par PCR. L’apprêt avant devrait inclure une séquence de chef de file pour aider l’enzyme de restriction pendant la digestion (GATC), suivie d’un site de restriction SpeI (ACTAGT) et 20 bases en aval de l’ATG (à l’exclusion des ATG) du gène protéine fluorescente d’intérêt. L’apprêt inverse devrait inclure la séquence de tête (GATC), suivie d’un site de restriction de SalI (GTCGAC) et le complément inverse de 20 bases en amont du codon stop de la séquence FP (y compris l’arrêt).
  2. En utilisant les amorces conçues à l’étape 1.1, effectuer la réaction de PCR utilisant un thermocycleur avec les paramètres suivants : chaleur à 95 ° C pendant 1 min et cycle à 95 ° C pendant 30 s, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 2 min par Ko du produit PCR. Effectuer 18 cycles est ample.
  3. Exécutez la réaction PCR sur gel d’agarose (0,5 % en Tris-acétate-EDTA). Il faut une seule bande correspondant au diamètre du produit attendu. Isoler le fragment à l’aide d’un kit de purification de gel.
  4. Le protocole utilise un vecteur deex1 Htt transportant 25 (non toxique) et 72 (HD-associés, affichant une forte agrégation) polyQ se répète. Digérer les fragments PCR tant le vecteur avec des enzymes de restriction SpeI et SalI pendant 3 h à 37 ° C.
  5. Purifier le vecteur digéré en l’exécutant sur gel d’agarose comme dans l’étape 1.3.
  6. Purifier le fragment PCR digéré à l’aide d’un kit de purification de PCR.
  7. Ligaturer le fragment résultant de PCR digéré et p415 -GAL1-drapeau-25/T4 ligase (1 h à température ambiante) à l’aide de plasmides de 72QpolyQ1 . Utiliser une réaction de 10 µL (1 µL d’enzyme T4 1 µL de tampon de X 10, 6 µL du fragment PCR et 2 µL de vecteur).
  8. Transformer 2 µL de la réaction de ligature dans 50 µL d’Escherichia coli-cellules compétentes et les incuber sur glace pendant 30 min. Puis, choc thermique les cellules à 42 ° C pendant 30 s. Ajouter 1 mL de médias excroissance SOC et incuber à 37 ° C pendant 1 h dans un shaker. Plaque de 200 µL de la réaction sur une plaque de LB-agar contenant 100 ampicilline µg/mL. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit.
  9. Sélectionnez les trois colonies bactériennes individuelles, cultivez-les du jour au lendemain dans 3 mL de bouillon LB contenant 100 ampicilline µg/mL à 37 ° C dans un shaker et extraire l’ADN à l’aide d’un kit de purification de plasmide de plasmide.
  10. Vérifiez le plasmide en digérant 500 ng d’ADN à l’aide des enzymes de restriction SpeI et SalI pendant 1 h à 37 ° C et exécuter la réaction sur un gel d’agarose (0,5 % en Tris-acétate-EDTA). Il devrait y avoir deux bandes à la bonne taille du vecteur (~ 7 Ko) et l’insert (la taille varie selon le gène d’intérêt). Ensuite, vérifiez le plasmide par séquençage.
  11. Transformer le p415 -GAL1- plasmides - polyQ-FPdrapeaudans la souche de levure W303 suite à un protocole de transformation levure standard2.

2. repérer le dosage

  1. Ensemencer la levure clones comptable 25Q/72Q le tag avec le PC d’intérêt sur une gélose contenant des medias de sélection de levures (synthétique complet-SC sans leucine) avec le glucose comme source de carbone. Dans le même temps, aussi ensemencer 25Q/72Q-ymsfGFP pour servir de témoin positif.
    Remarque : 25Q/72Q des constructions qui ne contiennent pas une balise fluorescente ne sont pas toxiques et peuvent servir de témoin négatif.
  2. Incuber les plaques à 30 ° C pendant 2-3 jours.
  3. Sélectionnez jusqu'à trois colonies individuelles de la plaque.
  4. Inoculer 5 mL du SC additionné de 2 % de glucose comme source de carbone.
  5. Granule 200 µL de chaque culture au jour le jour et le laver 3 x avec stérile de l’eau distillée.
  6. Remettre en suspension les cellules dans un milieu SC contenant 2 % galactose comme source de carbone pour induire l’expression de fusions de polyQ. Incuber le galactose médias nuit à 30 ° C dans un agitateur de tube. Comme contrôle, répétez cette étape en utilisant les médias contenant du glucose.
  7. Le lendemain matin, égaliser la densité des cellules à une densité optique à 600 nm (OD600) de 0,2 à 100 µL de médias SC dans une plaque à 96 puits stérile.
  8. Préparer quatre dilutions quintuplé, passant de chaque échantillon avec de l’eau stérile par pipetage 20 µL de l’échantillon de l’ancien bien dans 80 µL des médias dans le prochain puits.
  9. Utiliser une levure épinglage outil pour repérer les cellules sur des géloses sélectives (contenant du glucose ou du galactose) et incuber à 30 ° C pendant 2 jours.
  10. Les plaques d’images avec un dispositif de documentation d’images.

3. quantification de la croissance des cellules dans un milieu liquide

  1. Préparer les cultures de cellules suivant étapes 2.1-2.5 du présent protocole.
  2. Mesurer l' OD600 à l’aide d’un spectrophotomètre.
  3. Diluer les cellules à une OD600 de 0,1 à 300 µL des médias dans une plaque à 96 puits.
  4. Exécuter chaque échantillon en triple exemplaire.
  5. Incuber la plaque dans un lecteur de plaque/incubateur avec agitation capacités. Définir le nombre d’échantillons, la température à 30 ° C, l’absorbance à 600 nm, la longueur des expériences à 24h et les intervalles de mesure 15 min, puis sélectionnez le mode d’agitation continu.
  6. Créer la courbe de croissance et de quantifier l’aire sous la courbe à l’aide de logiciels graphiques scientifiques. Le GraphPad Prism 7 est recommandé. Collez les données dans une table XY avec trois valeurs répétées. La courbe de croissance apparaît sous le dossier de graphiques sur le côté gauche. Afin de quantifier l’aire sous la courbe, sélectionnez analyser en haut à gauche, puis cliquez sur la surface sous la courbe dans les analyses XY.

4. fluorescence Microscopy

  1. Préparer les cultures de cellules suivant étapes 2.1-2.5 du présent protocole.
  2. Diluer les cellules 10 x en croissance médias et transfert 200 µL de chaque échantillon à 8 puits chambres d’imagerie.
  3. Image des cellules à l’aide d’un microscope confocal, équipé d’un objectif de Aprochromoat de Plan X 63 (1,4 NA) à température ambiante.
    Remarque : L’utilisation d’un microscope confocal est facultative. Un microscope à fluorescence grand-angulaire standard peut également être employé.
  4. Régler la puissance de trou d’épingle et laser pour l’acquisition d’image optimale. Étant donné que les agrégats de 72Q sont beaucoup plus lumineux que le signal de 25Q diffuse, il faut souvent utiliser un réglage différent d’acquisition entre les plasmides différents afin d’éviter la saturation du signal fluorescent.
  5. Traiter les images à l’aide de ImageJ20 ou un autre logiciel de traitement d’image. À cette étape, le pourcentage de cellules que l’agrégat d’affichage peut être calculé manuellement est souhaité.

5. dot Blot

Remarque : Dans ce protocole, tache de point est utilisée pour examiner les niveaux d’expression de protéine. Préparer les cultures de cellules suivant étapes 2.1-2.5 du présent protocole.

  1. Générer des lysats de protéines à l’aide de perles de verre dans le tampon de lyse (EDTA 1 mM, 100 mM Tris, pH 7,5 ; 200 mM NaCl ; 5 % de glycérol, dithiothréitol 1 mM [TNT]). Ajouter des inhibiteurs de protéase, le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PSMF) de 4 mM et inhibiteur de la protéase cocktail, directement avant utilisation. 5 mL de la culture au jour le jour à pellets et il resuspendre dans 200 µL de perles de verre et 200 µL de tampon de lyse. Vortex 30 s pour 12 tours. Centrifuger à 12 000 g à 4 ° C pendant 10 minutes et recueillir le surnageant.
  2. Repérer une quantité égale de protéines totales sur une membrane de nitrocellulose, à l’aide d’un appareil de microfiltration. Prewet de la membrane avec du PBS et assembler l’appareil. Se connecter à une source de vide et vérifiez que les vis sont serrées. Allumer l’aspirateur et laisser le filtre de l’échantillon à travers la membrane par gravité.
  3. Bloquer la membrane dans le lait sans gras de PBS - 0.05 % Tween/5%.
  4. Incuber la membrane avec des anticorps anti-drapeau primaire durant la nuit à 4 ° C. L’anticorps monoclonal anti-Flag que M1 est recommandé.
  5. Laver la membrane 3 x pour 10 min chacun avec PSB - 0,05 % de Tween.
  6. Incuber la membrane avec un anticorps secondaire fluorescent étiqueté (anti-souris IgG) pendant 1 h à température ambiante dans le lait sans gras de PBS - 0.05 % Tween/5%.
  7. Laver la membrane 3 x 10 min avec PSB - 0,05 % de Tween.
  8. Image-tache à l’aide d’un système de documentation immunoblot.

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Representative Results

FPs ont différentes propriétés biophysiques, notamment leur tendance à oligomerize, qui peuvent affecter le comportement de leurs partenaires de fusion dans le cadre de reporters fluorescents. Ce protocole décrit une méthode simple, où plusieurs FPs peuvent être fusionnés à l’expansion de la polyQ toxique. PolyQ toxicité étant fortement dépendante des séquences flanquant l' étirement polyQ15, ce test permet de comparer rapidement et directement de reporters de fusion polyQ fluorescent (Figure 1). Une longueur de polyQ non HD-associés (25Q) est utilisée comme contrôle négatif et n’affiche pas une toxicité importante ou agrégation15,16,21,22. 72Q est employé pour obtenir les HD-comme les phénotypes, y compris l’inhibition et polyQ agrégation de forte croissance. Ce qui est important, Httex1 séquence codante employée manque le domaine riche en proline qui suit l’étirement polyQ. En présence du domaine riche en proline, Httex1 n’est pas toxique chez la levure15. Dans ce test, un Httex1 fusionnée à une variante monomère optimisé levure de superfolder GFP12 (ymsfGFP)16 est utilisé comme témoin positif comme précédemment décrit16. Les constructions contiennent également une balise d’épitope de drapeau à l’extrémité N-terminale Httex1. Cela permet de détecter les différentes fusions avec le même anticorps (anti-drapeau) pour une analyse biochimique. Comme une preuve de principe, 72Q Httex1 fusionnée à levure optimisé TagBFP2 (yomTagBFP2)23 n’entraîne pas de ralentissement de la croissance mesurée par deux dosages spots sur milieu gélosé ou croissance en milieu liquide (Figure 2), ce qui indique que la nature de la balise fluorescente peut en effet entraver polyQ comportement de développement dans les cellules.

Agrégation des fusions polyQ fluorescent peut être évaluée à l’aide de la microscopie de fluorescence. 72Q-ymsfGFP affiche agrégation significative par rapport à 25Q. Cependant, le signal fluorescent 72-yomTagBFP reste diffus dans tout le cytoplasme (Figure 3). Dans la plupart des cas, il n’est pas recommandé d’utiliser les mêmes paramètres d’acquisition image (laser de puissance, durée d’exposition) pour acquérir des images aussi bien 25Q et 72Q. Les agrégats dans les cellules exprimant le 72Q sont beaucoup plus lumineux que le signal de 25Q diffuse. Par conséquent, dans des conditions d’imagerie utilisées pour acquérir des images de 72Q, le signal de 25Q diffus apparaissent très faible ou ne pas apparaître du tout. Paramètres d’acquisition appropriée doivent également s’appliquer pour réduire au minimum la saturation au cours de l’imagerie des cellules exprimant le 72Q.

Niveaux d’expression des différentes fusions polyQ pourraient affecter la toxicité. Insoluble dans le détergent amyloïdes, tels que les agrégats de polyQ, sont notoirement difficiles à étudier biochimiquement et ne conviennent pas à une analyse par standerd SDS-PAGE. Par conséquent, dot blots peuvent être effectuées pour évaluer les niveaux de la protéine. L’inclusion de l’étiquette d’indicateur à l’extrémité aminée de Httex1 permet de détecter toutes les fusions fluorescentes en même temps, malgré la présence d’images par seconde (Figure 4). Par ailleurs, semi-dénaturation détergent gel d’agarose (SDD-AGE) peut être effectuée afin d’évaluer la formation d' oligomères de polyQ16. Un protocole détaillé et la vidéo sont disponibles dans hamid et Lindquist24.

Figure 1
Figure 1 : diagramme de flux de travail pour l’analyse de l’effet de la balise de la protéine fluorescente sur l’agrégation et la toxicité des protéines expansion polyQ chez la levure. Tout d’abord, les FPs sont clonés dans des vecteurs d’expression levure codant une version galactose-induisible de drapeau-le tag Httex1 hébergeant soit 25Q (non toxique) ou 72Q (HD-associés, agrégation et toxiques) répétitions. Clones sont sélectionnés et vérifiés par séquençage et, transformés par la suite, dans la levure. Après l’induction de l’expression de fusion polyQ par incubation dans des milieux contenant du galactose, détachage dosages sur milieu gélosé ou milieux liquides peuvent évaluer la toxicité de polyQ. Agrégation de PolyQ est analysée par microscopie à fluorescence. Une expression relative des différentes constructions est évaluée au moyen de la tache de dot. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Résultats d’analyse représentatifs de croissance suivant l’expression de Httex1 fluorescentes fusions dans la levure. Levures exprimant soit 25Q soit 72Q Httex1 fusionné au ymsfGFP ou yomTagBFP a été cultivée en glucose (contrôle) ou médias de galactose (origine polyQ) durant la nuit et soit (A) repéré sur plaques de gélose ou (B) autres incubés dans un liquide médias pour évaluer la croissance dans les différentes conditions. Alors que 72Q-ymsfGFP induit un défaut de croissance significative, 72Q-yomTagBFP affiche un phénotype de croissance comme les homologues non toxique 25Q. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Images fluorescentes représentatives de Httex1 fluorescentes fusions dans la levure. Levures exprimant soit 25Q soit 72Q Httex1 fusionné au ymsfGFP ou yomTagBFP a été cultivée en glucose (contrôle) ou médias de galactose (origine polyQ) durant la nuit et photographié avec un microscope confocal. Alors que l’expression de 72Q-ymsfGFP aboutit à une agrégation des protéines polyQ forte, 72Q-yomTagBFP affiche un signal cytoplasmique diffus comme les homologues non toxique 25Q. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Représentant dot blot analyse de Httex1 fusion fluorescent expression chez la levure. Levures exprimant 25Q, 46, 72Q ou 103 q Httex1 fusionnée à la PCP a été cultivées dans des milieux de galactose (origine polyQ) du jour au lendemain et traitée pour buvardage de dot. Cinq fois les dilutions des lysats cellulaires sont indiquées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Dans cet article, divers essais pour mesurer l’agrégation des expansions de polyQ Httex1 et leur effet sur la croissance de levure étaient employés comme modèle pour étudier comment les différents fluorescentes protéines modifient leurs partenaires en matière de fusion dans le cadre de reporters fluorescents . En utilisant une variante de la GFP (ymsfGFP) comme témoin positif, nous avons montré qu’il détecte des changements significatifs dans les polyQ toxicité et agrégation entre différentes étiquettes fluorescentes et permet une comparaison directe et rapide de la performance de fusion polyQ-FP contre Constructions de GFP-étiquetée16,19.

Alors que le présent Protocole se concentre sur les protéines fluorescentes, diverses parties du protocole pourraient être facilement adaptés pour tester les effets d’autres étiquettes de la protéine. En outre, le présent protocole emploie les vecteurs centromérique levure de faibles copies, qui peuvent varier en termes de nombre de copies (généralement une ou deux copies) présent dans les cellules25. À l’aide de vecteurs intégratives d’assurer une expression uniforme entre les conditions expérimentales peut contourner ce problème. Alors que ce protocole a été optimisé pour une utilisation en arrière-plan W303, autres souches de S. cerevisiae peuvent être employées. Cependant, la sensibilité à la toxicité des polyQ doit être déterminée en utilisant les vecteurs ymsfGFP-tag avant la conception de nouvelles constructions. Dans certains cas, il peut être approprié d’employer des vecteurs de la haute-copie (2µ) pour générer un défaut de croissance importante. Il est également suggéré de tester plusieurs isolats suite à la transformation de levure avec des vecteurs de polyQ pour éviter de sélectionner des suppresseurs spontanés montrant une toxicité réduite polyQ. À noter, le W303 de souche de levure26 est habituellement utilisé comme il est plus sensible à la toxicité des polyQ qu’autres dérivés S288C, tels que BY4741/BY474227, permettant ainsi un plus large éventail des phénotypes de la croissance. Important, souches employées pour cet essai doivent porter le prion Rnq1 puisque les cellules Δ de rnq1ne s’affichent pas polyQ toxicité et agrégation28. Il est également important d’utiliser des constructions deex1 Htt portant l’étiquette d’indicateur amino-terminale et manquant le domaine riche en proline. D’autres variantes de la conception de fusion peuvent modifier des phénotypes toxiques15. Enfin, l’induction de l’expression de fusion de polyQ dans le contenant du galactose media est une étape cruciale du protocole21. Lors du transfert de cellules de médias de galactose-contenant du glucose, il est important de laver les cellules au moins trois fois avec de l’eau stérile pour éliminer toutes les traces de glucose qui pourraient contribuer à réprimer l’induction du promoteur Gal129. Lorsque vous effectuez des tests de détachage, cultivant les cellules pendant la nuit dans les médias de galactose pour induire l’expression de la fusion peut exacerber le phénotype toxique de la fusion de 72Q et aider à discriminer des changements dans la croissance à travers différentes fusions16.

Comme une limitation, les études précédentes n’a pas observé les effets différentiels entre une version nonmonomeric de PCP (un dérivé de la GFP) et ymsfGFP16. Ainsi, au moins pour les variants de la GFP, ce test ne peut être suffisamment sensible pour distinguer les variantes monomères et oligomères, en soulignant la nécessité de compléter la polyQ toxicité essais avec d’autres méthodes standards, tels que l’OSER dosage13 et analyse biochimique9,10,11,12 qui peut évaluer directement l’oligomérisation. En outre, il convient de noter que les FPs peuvent se comporter différemment dans la levure par rapport à des essais in vitro ou leur expression dans les autres organismes23.

Collectivement, ces méthodes permettent aux chercheurs de rapidement caractériser de nouveaux FPs et mesurer leurs effets sur leur partenaire de fusion. À l’avenir, ce protocole permettra le dépistage rapide de nouveaux dérivés du FPs déjà caractérisés pour identifier les mutants qui ont un comportement semblable aux variantes de GFP, qui sont encore à la mesure de l’étalon-or pour les reporters de la FP. Ce protocole se concentre sur les protéines fluorescentes, il peut facilement être adapté pour dépister les effets d’autres balises génétiquement encodés, telles que SNAP-tag30 et SunTag31.

En conclusion, ce protocole prévoit un essai rapid et facilement évolutif afin de permettre une caractérisation plus poussée de la nouvelle génération de FPs et d’autres étiquettes génétiquement encodées à orienter les recherches dans la conception de protéine de fusion.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette étude est soutenue par une subvention de fonctionnement des instituts de recherche en santé à M.L.D. et P.L. Le travail présenté ici est pris en charge par une attribution de fonds Leader John R. Evans de la Fondation canadienne pour l’Innovation et un fonds correspondant provenant du Fonds de recherche de l’Ontario à P.L. Y.J. est supporté par une maîtrise à la bourse de doctorat transfert du doyen de l’École Schulich de M dernière édition et en médecine dentaire à l’Université de Western Ontario. S.D.G. est soutenu par une bourse de doctorat du Canada de l’ALS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-alpha Competent E. coli (High efficiency) New Englanfd Biolab C2987
SpeI-HF New Englanfd Biolab R3133 High fidelity enzymes are preferred
SalI-HF New Englanfd Biolab R0138 High fidelity enzymes are preferred
Agarose Fisher Scientific BP160
LB-Agar Fisher Scientific BP1425
LB-Broth Fisher Scientific BP1426
Ampicilin Fisher Scientific BP1760
PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase Agilent Technologies 600382
EPOCH2 microplate spectrophotometer BioTek Instruments inc EPOCH2TC
Yeast Pin Replicator V&P Scientific inc. VP407AH
SPI imager S&P Robotics inc. spImager-M
Zeiss LSM 800 confocal with AryScan Carl Zeiss Microscopy LSM 800
8 well Lab-Tek imaging chambers Fisher Scientific 12565470
Bio-Dot apparatus Bio-Rad 1706545
Chemi Doc XRS+ Bio-Rad 1708265
anti-FLAG M1 antibody Sigma-Aldrich F3040
Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody Thermo  A32727
Plasmid MiniPrep Kit Fisher Scientific K0503
Plasmid Gel extraction Kit Fisher Scientific K0831
PCR Purification Kit Fisher Scientific K0702
Prizm GraphPad N/A
TAE (Tris-Acetate-EDTA) Fisher Scientific BP13354

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Effet des protéines fluorescentes sur des partenaires de Fusion utilisant les épreuves de toxicité Polyglutamine chez la levure
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Jiang, Y., Di Gregorio, S., Albakri, M. B., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast. J. Vis. Exp. (141), e58748, doi:10.3791/58748 (2018).

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