Summary
이 문서에서는 집계에 형광 단백질의 효과 형광 기자 들의 맥락에서 새로 새롭거나 형광 단백질의 급속 한 평가 misfolded polyglutamine 확장의 독성을 평가 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
단백질 지 방화 및 라이브 셀 이미징 사용 하 여 매매의 수사에 대 한 연구는 종종 형광 기자에 게 관심사의 그들의 단백질을 융합에 의존 합니다. 끊임없이 진화 목록이 유전자 인코딩된 형광 성 단백질 (FPs) 형광 퓨전 디자인에 관해서 여러 대안을 가진 사용자를 선물 한다. 각 FP는 특정 광학 및 생물 속성이 결과 형광 융해의 생화학, 세포, 및 기능 속성에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 여러 FPs 융합 파트너의 기능에 방해에 취약 일반 올리고를 형성 하는 경향이 있다. 불행히도, 몇 가지 방법만 형광 기자의 행동에 FPs의 영향을 테스트 위해 존재 합니다. 여기, polyglutamine (polyQ) 독성 분석 실험을 사용 하 여 신진 효 모 Saccharomyces cerevisiae에 FPs의 영향의 급속 한 평가 가능 하 게 간단한 방법을 설명 합니다. PolyQ 확장 huntingtin 단백질 확장된 huntingtin 독성 올리고 포함 시체로 집계 Huntington의 질병 (HD)의 증상과 연결 됩니다. 집계 및 효 모에 polyQ 확장의 독성은 높은 FPs의 행동에 미치는 영향을 공부 하는 이상적인 실험 플랫폼을 제공 하는 형광 태그의 존재를 포함 하 여 polyQ 지역 측면 시퀀스에 따라 그들의 퓨전 파트너입니다.
Introduction
이후 Aequorea 빅토리아1, 유전자 인코딩된 FPs의 넓은 팔레트에서에서 녹색 형광 단백질 (GFP)의 초기 특성을 개발 하 고, 허용 동시에 지역화 및 추적 세포 생물학 여러 생활에서 셀룰러 이벤트/단백질 세포2,3. FPs는 산호, 그리고 그러므로, 표시 특정 생물 속성을 광범위 하 게 그들의 각각 형광 스펙트럼 넘어 전환에 해파리에서 여러 유기 체에서 파생 됩니다. 이러한 속성에는 밝기, photostability, 및 다른 사람의 사이에서 oligomerize2,4경향이 포함 됩니다. 부적절 한 상호 작용 및 융합 파트너의 기능 변경 최소화 하 고 대 한 기자 효율 극대화 형광 기자를 설계할 때 적합 한 태그의 선택에 중요 한 측면 이다 단위체 FPs를 선택 하는 주어진 세포 구획4,,56. GFP는, 시간이 지남에 진화 되었습니다 융합 파트너5,,78형광 태그를 추가 하는 효과 최소화 하기 위해 하는 동안 GFP 남아 평가 하기 어려운 새로운 FP의 변종에 비해 수행 하는 방법.
FPs의 동작에 몇 가지 방법이 존재 한다. 그들의 대부분 ultracentrifugation 같은 생 화 확 적인 방법을 사용 하 여 프레임의 생물 속성 테스트를 포함 하 고 젤 여과 프로토콜9,10,,1112. 이러한 메서드는 그대로 셀에 그들의 행동에 약간의 통찰력을 제공 하는 솔루션에서 순화 된 프레임을 사용 하 여 경고. 조직된 부드러운 바인딩과 그물 (OSER) 분석 결과 제공의 개발 FPs' 경향이 생활에서 oligomerize의 정량 평가에 떠다니고 그물 tubules를 재구성 overexpressed FPs의 능력을 테스트 하 여13 세포 OSER whorls14. 이 기술을 성공적으로 GFP의 단위체 및 oligomeric 변형 및 다른 프레임 간의 변화를 감지할 수 있습니다. 그러나, overexpression 뚜렷이 transfected 세포에 주로 의존 하 고 정량 및 이미지 분석 시간이 걸릴 수 기술을 자동화 된 데이터 수집 및 분석 워크플로우로 채택 하지 않는 한.
이러한 접근을 보완 하기 위해 효 모15,16에서 독성에 형광 태그의 효과 및 polyQ 확장의 집계의 이용 하는 분석 결과 설립 했습니다. 이상 36와 polyQ 스트레치의 확장 huntingtin 단백질 (Htt)이 헌팅턴 병17,18연관 유전자 인코딩 첫 번째 엑손에서 반복 됩니다. 가혹한 성장 결함을 결합 misfolded Htt 단백질의 강한 집계에 효 모 결과에 확장된 Htte x 1 의 식입니다. 흥미롭게도,이 고기 FPs15,16를 포함 하 여 polyQ 스트레치 측면 시퀀스에 의해 강하게 좌우 된다. 그것은 프레임의 다른 속성 polyQ 독성 누 룩에 영향을 미칠 차동 수 합리화 했다. 실제로, GFP 같은 FPs에 비해 붉은 형광 단백질 및 그들의 진화 형태 나타났습니다 감소 독성 및 집계16. 이 원고는 polyQ 독성과 효 모에 집계에 FPs의 다음 세대의 효과 평가 하기 위해 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 이 분석 결과 이전 특징을 동시에 사용할 수 있는 FP의 변종의 신속 하 고 잠재적으로 하이 콘텐츠 분석에 대 한 새로운 FPs 고 수의 최적의 특성에 대 한 기술 평가 어떻게 그들이 수행 GFP에 비해 수 있습니다.
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Protocol
1. 새로운 붙일 태그가 Httex1 효 모에는 식에 대 한 기자 들의 세대
참고:이 섹션은 프로토콜에서에 의해 수정 된 장 외. 16 및 Albakri 외. 19.
- 형광 단백질 또는 PCR에 의해 관심을 인코딩 순서를 증폭 하는 뇌관 디자인. 앞으로 뇌관 리더 시퀀스 소화 (GATC) 동안 제한 효소 SpeI 제한 사이트 (ACTAGT) 및 관심사의 형광 단백질 유전자의 ATG (ATG 제외)의 하류 20 기초를 지원 하기 위해 포함 되어야 합니다. 반전 뇌관 사리 제한 사이트 (GTCGAC)와 (를 포함 하 여 중지) FP 시퀀스의 정지 codon의 상류 20 기지의 반전 보수 지도자 시퀀스 (GATC)를 포함 해야 합니다.
- Thermocycler는 다음 설정을 사용 하 여 PCR 반응을 수행 단계 1.1에서에서 설계 하는 뇌관을 사용 하 여: 1 분 및 30 주기 95 ° C에서 95 ° C에 열 s, 60 ° C 30에 대 한 s, 그리고 PCR 제품의 kB 당 2 분 동안 72 ° C. 18 주기를 수행 하는 것입니다 충분 한.
- (트리 스-아세테이트-EDTA에 0.5%)는 agarose 젤에 PCR 반응을 실행 합니다. 단일 밴드가 예상된 제품 크기에 해당 한다. 분리 젤 정화 키트를 사용 하 여 조각.
- 프로토콜 사용 하 여 25 (저온)를 들고 Httex1 벡터 및 72 polyQ 반복 (HD-관련 된, 강한 집계를 표시). PCR 파편 및 벡터 3 h 37 ° c.에 대 한 SpeI 및 사리 금지 효소로 소화
- 1.3 단계 에서처럼 agarose 젤에 그것을 실행 하 여 소화 벡터를 정화.
- PCR 정화 키트를 사용 하 여 소화 PCR 파편을 정화.
- 선 결과 소화 PCR 파편 및 p415-GAL1-플래그-25/72QpolyQ 플라스 미드1 T4 리가 (실 온에서 1 h)을 사용 하 여. 10 µ L 반응 (T4 효소의 1 µ L, 10 X 버퍼의 1 µ L, PCR 파편의 6 µ L 및 벡터의 2 µ L)을 사용 합니다.
- 대장균의 50 µ L로 결 찰 반응의 2 µ L 변환-유능한 세포와 30 분 동안 얼음에 그들을 품 어. 다음, 열-충격 30 42 ° C에서 셀 s. 추가 SOC 파생물 미디어의 1 mL 및 통에 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어. 100 µ g/mL 암 피 실린을 포함 하는 파운드-한 천 격판덮개에 반응의 200 µ L 플레이트. 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어.
- 3 개인적인 세균성 식민지를 선택 하 고 파운드-국물 통에 37 ° C에서 100 µ g/mL 암 피 실린 포함의 3 mL에서 하룻밤 성장 플라스 미드 플라스 미드 정화 키트를 사용 하 여 DNA를 추출.
- 500을 소화 하 여 플라스 미드를 확인 실행 반응 agarose 젤 (트리 스-아세테이트-EDTA에 0.5%)에 37 ° C에서 1 시간에 대 한 SpeI 및 사리 제한 효소를 사용 하 여 DNA의 ng. 벡터 (~ 7 kb) 및 삽입의 오른쪽 크기에 두 밴드 해야 (크기는 관심사의 유전자에 따라 다름). 다음, 연속으로 플라스 미드를 확인 합니다.
- p415-GAL1-누 룩 스트레인 W303 표준 효 모 전이 프로토콜2다음으로플래그-polyQ FP 플라스 미드를 변환.
2. 분석 결과 보 이나
- 줄무늬 누 룩 운반 25Q/72Q 태그의 탄소 원으로 포도 당을 효 모 선택 미디어 (합성 완료-SC 신 없이)을 포함 한 천 배지에서 FP와 함께 복제 합니다. 동시에 또한 25Q/72Q-ymsfGFP 긍정적인 통제 역할을 행진.
참고: 형광 태그를 포함 하지 않는 25Q/72Q 구문 독성 되지 않습니다 하 고 부정적인 제어 될 수 있습니다. - 2-3 d 30 ° C에서 번호판을 품 어.
- 접시에서 최대 3 개의 단일 식민지를 선택 합니다.
- 탄소 소스로 2% 포도 당으로 보충 하는 SC의 5 mL 접종
- 각 숙박 문화의 200 µ L 작은 및 그것을 씻어 3 x 살 균 증류수.
- 사우스 캐롤라이나 미디어 polyQ 융해의 표현을 유도를 탄소 원으로 2% 갈 락 토스를 포함 하는 셀 resuspend 미디어 튜브 회전에서 30 ° C에서 하룻밤 갈 락 토스를 품 어. 컨트롤, 포도 당 포함 된 미디어를 사용 하 여이 단계를 반복 합니다.
- 다음날 아침, 맞춰야 600에서 광학 밀도를 셀 밀도 살 균 96 잘 접시에 SC 미디어의 0.2에서 100 µ L의 nm (OD600).
- 4 준비 다음 우물에 있는 미디어의 80 µ L로 잘 이전에서 샘플의 pipetting 20 µ L에 의해 살 균 물으로 각 샘플의 오부 희석.
- 효 모 고정 도구를 사용 하 여 선택적 접시 (포도 당 또는 갈 락 토스를 포함 하는)에 셀 고 2 d 30 ° C에서 품 어.
- 이미지 문서 장치 판 이미지.
3. 액체 문화에서 세포 성장의 정량화
- 세포 배양,이 프로토콜의 다음 단계 2.1-2.5를 준비 합니다.
- OD600 는 분 광 광도 계를 사용 하 여 측정 합니다.
- 96 잘 접시에 미디어의 300에서 0.1 µ L의 OD600 셀을 희석.
- 3 중에서 각 샘플을 실행 합니다.
- 떨고 기능 플레이트 리더/인큐베이터에 접시를 품 어. 600에서 샘플, 30 ° C에서 온도, 흡수도의 수를 설정 nm, 24 h, 실험 및 15 분을 선택 연속 진동 모드 측정 간격의 길이.
- 성장 곡선을 만들고 과학적인 그래프 소프트웨어를 사용 하 여 곡선 아래의 영역을 계량 합니다. GraphPad Prism 7 것이 좋습니다. 3 복제 값으로 XY 테이블에 데이터를 붙여 넣습니다. 성장 곡선 그래프 폴더 왼쪽에 표시 됩니다. 곡선 아래의 영역을 계량, 왼쪽 상단에 분석 을 선택 하 고 곡선 아래의 영역 XY 분석을 클릭 합니다.
4. 형광 현미경 검사 법
- 세포 배양,이 프로토콜의 다음 단계 2.1-2.5를 준비 합니다.
- 셀 10 희석 성장 미디어와 전송 200 µ L 8 잘 이미징 챔버에 각 샘플의 x.
- 실 온에서 63 X 계획 Aprochromoat 목표 (1.4 없음)을 갖춘 공초점 현미경을 사용 하 여 셀을 이미지.
참고: 공초점 현미경의 사용은 선택 사항. 표준 넓은 분야 형광 현미경도 사용할 수 있습니다. - 최적의 이미지 수집을 위한 작은 구멍 및 레이저 파워를 조정 합니다. 72Q 집계 확산 25Q 신호 보다 훨씬 밝은 때문에, 형광 신호 포화를 방지 하기 위해 다른 플라스 미드 사이 다른 수집 설정을 사용 하려면 종종 필요 합니다.
- ImageJ20 또는 다른 이미지 처리 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 처리 합니다. 이 단계에서 디스플레이 집계 수동으로 계산할 수 있습니다 셀의 비율은 원한다.
5. 점 오 점
참고:이 프로토콜에 점 오 점 단백질 표정 수준 검사에 사용 됩니다. 세포 배양,이 프로토콜의 다음 단계 2.1-2.5를 준비 합니다.
- 단백질 lysates 유리 구슬 (100 mM Tris, pH 7.5; 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% 글리세롤, 1 m m dithiothreitol [DTT]) 세포의 용 해 버퍼에서 사용 하 여 생성 합니다. 프로 테아 제 억제제, 4 mM phenylmethylsulfonyl 불 (PSMF)와 프로 테아 제 억제 물 칵테일, 직접 사용 하기 전에 추가 합니다. 야간 문화의 5 mL을 작은 고 유리 구슬의 200 µ L에 세포의 용 해 버퍼의 200 µ L resuspend. 12 라운드에 대 한 소용돌이 30 s. 10 분 동안 4 ° C에서 12000 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한을 수집 합니다.
- 장을 기구를 사용 하 여 니트로 멤브레인에 총 단백질의 동일한 금액을 자리. PBS 가진 막 prewet 하 고 기구를 조립. 진공 소스에 연결 하 고 나사 강화 있는지 확인 하십시오. 켜고 진공 중력에 의해 멤브레인을 통해 샘플 필터를 하자.
- PBS-0.05 %Tween/5% 지방 없는 우유에 막을 차단 합니다.
- 4 ° c.에 하룻밤 기본 안티 플래그 항 체로 막 품 어 단일 클로 널 반대로 플래그 m 1이 좋습니다.
- 3 막 씻고 PSB-0.05% 트윈으로 각 10 분 x.
- 붙일 레이블된 이차 항 체 (반대로 마우스 IgG) PBS-0.05 %Tween/5% 지방 없는 우유에 실 온에서 1 h와 막 품 어.
- 막 PSB-0.05% 트윈와 3 x 10 분 워시.
- 이미지-오 점 immunoblot 문서 시스템을 사용 하 여.
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Representative Results
FPs는 다른 생물 속성, oligomerize에 그들의 추세를 포함 하 여 형광 기자 들의 맥락에서 그들의 융합 파트너의 동작에 영향을 미칠 수 있다. 이 프로토콜에는 여러 FPs 독성 polyQ 확장을 융합 하는 수 있는 간단한 방법을 설명 합니다. PolyQ 독성 측면 polyQ 스트레치15시퀀스에 상당히 의존 때문에,이 분석 결과 형광 polyQ 퓨전 기자 (그림 1)의 신속 하 고 직접적인 비교를 허용 한다. HD 관련 된 polyQ 길이 (25Q) 부정적인 제어로 사용 되 고 중요 한 독성 또는 집계15,16,,2122표시 하지 않습니다. 72Q는 강력한 성장 억제 및 polyQ 집계를 포함 하 여 HD 처럼 고기를 얻기 위해 채택 된다. 중요 한 것은, 코딩 시퀀스 Httex1 부족 polyQ 스트레치는 프롤린 부유한 도메인 고용. 프롤린 부유한 도메인 존재 Httex1 효 모15에 독성이 있다. 이 분석 결과에서 Httex1 superfolder GFP12 (ymsfGFP)16 의 효 모에 최적화 된 단위체 변형 융합 앞에서 설명한16긍정적인 컨트롤로 사용 됩니다. 구문 또한 Htte x 1의 N-말단에서 플래그 피토 프 태그를 포함합니다. 생 화 확 적인 분석에 대 한 동일한 항 체 (항 기)와 다른 융해의 검색 수 있습니다. 원칙으로 서 증거-의-, 72Q Httex1 융합 효 모에 최적화 된 TagBFP2 (yomTagBFP2)23 귀착되 지 않는다 느린 성장 한 천 판에 어느 자리 분석 실험 또는 액체 매체 (그림 2)에 있는 성장에 의해 측정을 나타내는 성격 형광 태그의 셀에 polyQ 확장 동작을 방해 실제로 수 있습니다.
형광 polyQ 융해의 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 평가 될 수 있다. 72Q-ymsfGFP 25Q에 비해 상당한 집계를 표시 합니다. 그러나, 72-yomTagBFP 형광 신호 유지 세포질 (그림 3)에 걸쳐 확산 됩니다. 대부분의 경우, 동일한 이미지 수집 설정을 사용 하도록 권장 되지 않습니다 (레이저 출력, 노출 시간) 25Q 및 72Q 이미지. 72Q 표현 셀에서 집계는 확산된 25Q 신호 보다 훨씬 밝은. 따라서, 72Q 이미지를 수집 하는 데 사용 되는 이미징 조건에서 확산된 25Q 신호 수 있습니다 매우 약한 나타나거나 하지 전혀 볼 수 있습니다. 적절 한 인수 설정은 표현 하는 72Q 세포의는 이미징 동안 채도 최소화 하기 위해 적용 되어야 한다.
식 수준을 다양 한 polyQ 융해의 독성 영향을 미칠 수 있습니다. PolyQ 집계 등 세제 불용 성 amyloids 악명 화학적 공부 하기 어려운 고 표준 SDS-PAGE로 분석에 적합 하지 않습니다. 따라서, 점 오 점은 단백질 수준을 평가를 수행할 수 있습니다. Htte x 1 의 아미노 말단 끝 플래그 태그의 포함 FPs (그림 4)의 존재에도 불구 하 고 동시에, 모든 형광 성 융해의 탐지를 허용 한다. 또는, 반 변성 세제 agarose 젤 전기 이동 법 (SDD-나이) polyQ 올리고16의 형성 평가를 수행할 수 있습니다. 자세한 프로토콜 및 비디오 Halfmann 및 Lindquist24사용할 수 있습니다.
그림 1: 집계에 형광 단백질 태그의 효과 및 효 모에 polyQ 확장 단백질의 독성의 분석에 대 한 워크플로 다이어그램. 첫째, FPs 효 모 식 벡터 인코딩 Htt 플래그 태그ex1 어느 25Q 은닉의 갈 락 토스를 유도할 수 있는 버전으로 복제 됩니다 (저온) 또는 72Q (HD 관련, 집계 및 독성) 반복. 클론 선택 및 시퀀싱에 의해 확인 그리고, 연속적으로, 효 모에 변형. 갈 락 토스를 포함 하는 미디어, 한 천 배지에서 탐지 분석 실험 또는 성장 액체 매체에서 부 화에 의해 polyQ 퓨전 식의 유도 따라 polyQ 독성을 평가할 수 있습니다. PolyQ 집계 형광 현미경에 의해 분석 된다. 상대 표현의 다른 구문 점 오를 사용 하 여 평가 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Httex1 형광 성 융해 효 모에의 식을 따라 하는 대표적인 성장 분석 결과 결과. 25Q 또는 72Q Htte x 1 을 표현 하는 효 모 ymsfGFP 융합 또는 yomTagBFP 포도 (제어)에 경작 되었다 또는 갈 락 토스 미디어 (polyQ 유도) 밤새 고 중 (A) 발견 한 천 배지 또는 (B)에 액체에서 더 incubated 평가 다른 조건 하에서 성장 하는 미디어. 동안 상당한 성장 결함을 유도 하는 72Q ymsfGFP, 72Q-yomTagBFP 성장 형을 저온 25Q 대조 물에 유사한 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 누 룩에 Httex1 형광 성 융해의 대표적인 형광 이미지. 25Q 또는 72Q Htte x 1 을 표현 하는 효 모 ymsfGFP 융합 또는 yomTagBFP 포도 (제어)에 경작 되었다 또는 갈 락 토스 (polyQ 유도) 하룻밤 언론과 confocal 현미경으로 몇 군데. 72Q ymsfGFP 식에 강한 polyQ 단백질 집계 결과, 하는 동안 72Q yomTagBFP 저온 25Q 대조 물에 유사한 확산된 세포질 신호를 표시 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 대표 점 가릴 Httex1 형광 퓨전 식 효 모에의 분석. 표현 25Q, 46Q, 72Q, 또는 103Q Httex1 CFP를 융합 하는 효 모 갈 락 토스 미디어 (polyQ 유도)에서 하룻밤 배양 되었고 점 오 점 분석에 대 한 처리. 세포 lysates의 오부 희석 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 문서에서는, Httex1 polyQ 확장 및 효 모 성장에 미치는 영향의 집계를 측정 하기 위해 다양 한 분석 공부 어떻게 다른 형광 모델로 채택 되었다 단백질 형광 기자 들의 맥락에서 그들의 퓨전 파트너 변경 . 우리이 polyQ 독성 및 집계 다른 형광 태그 사이 상당한 변화를 감지 하 고 polyQ FP 퓨전 성능에 대 한 직접적이 고 빠른 비교에 대 한 수 보여 긍정적인 컨트롤로 GFP 변형 (ymsfGFP)를 사용 하 여, GFP 태그 구문을16,19.
현재 프로토콜은 형광 단백질에 초점을 맞추고, 하는 동안 프로토콜의 다양 한 부분 다른 단백질 태그의 결과 테스트 하는 쉽게 적응 수 있습니다. 또한, 현재 프로토콜 복사 번호 (일반적으로 1 ~ 2 부) 셀25에 측면에서 다를 수 있는 낮은 복사 효 모 centromeric 벡터를 사용 합니다. 실험 조건에서 균일 한 식 되도록 통합 벡터를 사용 하 여이 문제를 우회할 수 있습니다. 이 프로토콜은 W303 배경에서 사용 하기 위해 최적화 되었습니다, 그러나 다른 S. cerevisiae 긴장을 사용할 수 있습니다. 그러나, 민감성 polyQ 독성에 새로운 구조를 디자인 하기 전에 ymsfGFP 태그 벡터를 사용 하 여 결정 되어야 합니다. 경우에 따라 중요 한 성장 결함을 생성 하 고 복사 (2µ) 벡터를 사용 하는 적절 한 수 있습니다. 그것은 또한 감소 polyQ 독성을 보여주는 자발적인 진압을 선택 하지 않으려면 polyQ 벡터와 누 룩 변환에 따라 여러 개의 격리 된 테스트를 제안 했다. 노트, 효 모 스트레인26 는 일반적으로 그것은 BY4741/BY474227, 같은 다른 S288C 파생 상품 보다 polyQ 독성에 더 민감한 사용 W303 따라서 성장 고기의 넓은 범위에 대 한 허용. 중요 한 것은,이 분석 결과 대 한 고용 하는 긴장은 rnq1Δ 세포 polyQ 독성 및 집계28컨트롤이 표시 되지 않습니다 Rnq1 프리온 단백질을 휴대 해야 합니다. 그것은 또한 Httex1 구문 아미노 터미널 플래그 태그를 운반 하 고 부족 프롤린 부유한 도메인을 사용 하는 것이 중요. 퓨전 디자인의 다른 변이 유독 고기15를 변경할 수 있습니다. 마지막으로, 갈 락 토스를 포함 하는 polyQ 퓨전 식의 유도 미디어 프로토콜21의 중요 한 단계입니다. 포도 당-에 갈 락 토스-포함 된 미디어에서 세포를 전송, 그것은 세 번 이상 억압 Gal1 발기인29의 유도에 기여할 수 있는 포도의 모든 흔적을 제거 하기 위해 살 균 물으로 세포 세척 하는 것이 중요. 탐지 분석을 수행할 때 72Q 퓨전의 독성 표현 형을 악화 수 있습니다 갈 락 토스 미디어 융합의 표현을 유도를 하룻밤 사이에 세포 배양 그리고 다른 융해16에서 성장에 변화를 차별 하는 데 도움이.
제한, 이전의 연구는 CFP (GFP 파생)의 nonmonomeric 버전 ymsfGFP16사이의 차동 효과 관찰 하지 않았다. 따라서, 적어도 GFP 변종에 대 한이 분석 결과 되지 않을 수 있습니다 충분히 민감한 단위체와 oligomeric 변종 사이의 차별을, 강조는 polyQ를 보완 하기 위해 필요 독성 분석 실험 다른 표준 방법으로는 OSER 시험13 같은 고 생 화 확 적인 분석9,10,,1112 직접 oligomerization을 평가할 수 있는. 또한, 프레임 분석 생체 외에서 또는 다른 유기 체23에 그들의 식에 비해 효 모에 다르게 동작할 수 있습니다 주목 해야한다.
이 메서드는 빠르게 새로운 FPs를 특성화 하 고 그들의 퓨전 파트너에 그들의 효과 측정 하는 연구를 수 있습니다. 미래에,이 프로토콜에는 FP 기자에 대 한 표준 측정 지금도 GFP 이체를 유사 하 게 동작 하는 돌연변이 식별 하기 위해 이전 특징이 FPs의 새로운 파생 상품의 빠른 심사 수 있게 된다. 이 프로토콜은 형광 단백질에 초점을 맞추고, 그러나 그것은 쉽게 스냅인 태그30 등 노31다른 유전자 인코딩된 태그의 효과 대 한 화면을 적용할 수 있습니다.
결론적으로,이 프로토콜에는 융해 단백질 디자인 연구를 안내 하는 FPs와 다른 유전자 인코딩된 태그의 새로운 세대의 더 특성 수 있도록 신속 하 고 쉽게 확장 가능한 분석 결과를 제공 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구 M.L.D.와 P.L. 건강 연구를 위한 캐나다 학회에서 운영 보조금에 의해 지원 됩니다. 여기에 제시 된 작품은 존 R. 에반스 지도자 기금 수상 혁신을 위한 캐나다 재단에서 지원 하 고 P.L. Y.J.에 온타리오 연구 기금에서 매칭 펀드 Schulich M 학교 학장에서 박사 전송 하는 MSc에 의해 지원 됩니다. edicine 고 치과에 웨스턴 온타리오 대학. S.D.G.는 ALS 캐나다에서 박사 학위 장학금에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-alpha Competent E. coli (High efficiency) | New Englanfd Biolab | C2987 | |
| SpeI-HF | New Englanfd Biolab | R3133 | High fidelity enzymes are preferred |
| SalI-HF | New Englanfd Biolab | R0138 | High fidelity enzymes are preferred |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160 | |
| LB-Agar | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB-Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Ampicilin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600382 | |
| EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments inc | EPOCH2TC | |
| Yeast Pin Replicator | V&P Scientific inc. | VP407AH | |
| SPI imager | S&P Robotics inc. | spImager-M | |
| Zeiss LSM 800 confocal with AryScan | Carl Zeiss Microscopy | LSM 800 | |
| 8 well Lab-Tek imaging chambers | Fisher Scientific | 12565470 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Chemi Doc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| anti-FLAG M1 antibody | Sigma-Aldrich | F3040 | |
| Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody | Thermo | A32727 | |
| Plasmid MiniPrep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| Plasmid Gel extraction Kit | Fisher Scientific | K0831 | |
| PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Prizm | GraphPad | N/A | |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Fisher Scientific | BP13354 |
References
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- Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
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