Summary
Este artigo descreve os protocolos para avaliar o efeito de proteínas fluorescentes na agregação e toxicidade de misfolded polyglutamine expansão para a avaliação rápida de uma proteína fluorescente recentemente descaracterizada no contexto dos repórteres fluorescentes.
Abstract
Para a investigação de localização da proteína e tráfico utilizando imagens de células vivas, pesquisadores muitas vezes dependem de sua proteína de interesse para um repórter fluorescente de fusão. A lista em constante evolução de proteínas fluorescentes geneticamente codificadas (FPs) apresenta aos usuários com várias alternativas quando se trata de projeto de fusão fluorescente. Cada FP tem propriedades específicas de ópticas e biofísicas que podem afetar as propriedades bioquímicas, celulares e funcionais das fusões fluorescentes resultantes. Por exemplo, vários FPs tendem a formar oligómeros inespecíficos que são susceptíveis de impedir a função do parceiro de fusão. Infelizmente, apenas alguns métodos existem para testar o impacto de FPs sobre o comportamento do repórter fluorescente. Aqui, descrevemos um método simples que permite a avaliação rápida do impacto da FPs usando polyglutamine (polyQ) ensaios de toxicidade em brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae. Huntingtina expandido PolyQ proteínas estão associadas com o aparecimento da doença de Huntington (HD), onde a huntingtina expandida agrega em oligômeros tóxicos e corpos de inclusão. A agregação e a toxicidade do polyQ expansões em levedura são altamente dependentes as sequências flanqueando a região polyQ, incluindo a presença de etiquetas fluorescentes, proporcionando uma plataforma experimental ideal para estudar o impacto do FPs sobre o comportamento de seus parceiro de fusão.
Introduction
Desde a caracterização inicial da proteína verde fluorescente (GFP) de Aequorea victoria1, uma variada gama de FPs geneticamente codificado foram desenvolvidos, permitindo que biólogos da célula localizar e rastrear simultaneamente múltiplos eventos/proteínas celulares na vida células2,3. FPs são derivadas de vários organismos, de água-viva de coral e, portanto, a exibição Propriedades biofísicas específicas que desviam-se extensivamente para além de seu respectivo espectro fluorescente. Essas propriedades incluem o brilho, fotoestabilidade e uma tendência para oligomerize, entre outros,2,4. Selecionar monomérico FPs é um aspecto importante na seleção de uma marca adequada ao projetar um repórter fluorescente, a fim de minimizar interações inadequadas e alterações da função do parceiro fusão e maximizar a eficiência de repórter para uma dado compartimento celular4,5,6. Enquanto as boas práticas agrícolas, ao longo do tempo, sido evoluiu para minimizar o efeito de adicionar a tag fluorescente para a fusão parceiro5,7,8, como novas variantes FP executam em relação ao GFP continua a ser difícil de avaliar.
Existem alguns métodos para caracterizar o comportamento de FPs. A maioria deles envolve testar propriedades biofísicas de FPs usando abordagens bioquímicas, tais como ultracentrifugação e gel filtração protocolos9,10,11,12. Tais métodos têm a limitação do uso de FPs purificada em solução, oferecendo pequeno insight sobre seu comportamento nas células intactas. O desenvolvimento do retículo endoplasmático liso organizado (OSER) ensaio oferece uma avaliação quantificável da tendência de FPs' a oligomerize em vida células13 , testando a capacidade de FPs Blumental de reorganizar os túbulos do retículo endoplasmático em Espirais OSER14. Esta técnica com êxito pode detectar alterações entre monoméricas e oligoméricas variantes de GFP e outros FPs. No entanto, baseia-se principalmente na superexpressão em células transfectadas transitoriamente, e a quantificação e análise de imagens podem ser demorados, a menos que a técnica é adotada como uma coleção de dados automatizada e fluxo de trabalho de análise.
A fim de complementar essas abordagens, estabelecemos um ensaio que se beneficia do efeito de etiquetas fluorescentes sobre a toxicidade e a agregação de expansões polyQ no fermento15,16. A expansão do trecho com mais de 36 polyQ repete dentro o primeiro exon de codificação do gene que da proteína huntingtina (Htt) está associada com a doença de Huntington17,18. A expressão de expandido Httex1 em resultados de levedura em um forte agregação da proteína Htt misfolded acoplada a um defeito grave de crescimento. Curiosamente, estes fenótipos são fortemente influenciados pelas sequências flanqueando o trecho polyQ, incluindo FPs15,16. Isso foi racionalizado que as diferentes propriedades de FPs diferencialmente podem afetar polyQ toxicidade no fermento. De fato, comparado ao GFP-como FPs, proteínas fluorescentes vermelhas e suas formas evoluídas mostraram uma reduzida toxicidade e agregação16. Este manuscrito fornece um protocolo detalhado para avaliar o efeito da próxima geração de FPs na toxicidade polyQ e agregação em levedura. Este ensaio permite uma análise rápida e potencialmente alto teor de variantes FP que pode ser usado em paralelo com anteriormente caracterizada técnicas para caracterização ideal de novo FPs e pode avaliar qual o seu desempenho em comparação com as boas práticas agrícolas.
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Protocol
1. geração de novo fluorescente etiquetado Httex1 repórteres para uma expressão em levedura
Nota: Esta secção foi modificada o protocolo por Jiang et al . 16 e Albakri et al . 19.
- Desenho de primers para amplificar a sequência de codificação da proteína fluorescente ou interesse pelo PCR. O primer para a frente deve incluir uma sequência de líder para ajudar a enzima de restrição durante a digestão (GATC), seguida por um site de restrição SpeI (ACTAGT) e 20 bases a jusante do ATG (excluindo ATG) do gene da proteína fluorescente de interesse. O primer reverso deve incluir a sequência de líder (GATC), seguido de um sítio de restrição de SalI (GTCGAC) e o complemento de reverso de 20 bases montante do códon de parada da sequência FP (incluindo paragem).
- Utilizando os primers desenhados na etapa 1.1, realizar a reação de PCR usando um thermocycler com as seguintes configurações: calor para 95 ° C por 1 min e ciclo a 95 ° C por 30 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C por 2 min por kB de produto do PCR. Realização de 18 ciclos é amplo.
- Execute a reação de PCR em um gel de agarose (0,5% no Tris-Acetato-EDTA). Lá deve uma única banda correspondente ao tamanho do produto esperado. Isole o fragmento usando um kit de purificação de gel.
- O protocolo emprega um vetor deex1 Htt carregando 25 (não tóxico) e 72 (HD-associado, exibindo uma forte agregação) polyQ repete. Digerir ambos os fragmentos PCR e o vetor com enzimas de restrição SpeI e SalI por 3 h a 37 ° C.
- Purifica o vetor digerido, executando-o em um gel de agarose, como na etapa 1.3.
- Purifica o fragmento digerido do PCR usando um kit de purificação de PCR.
- Ligam o fragmento resultante de PCR digerido e p415 -GAL1-bandeira-25/72QpolyQ plasmídeos1 usando T4 ligase (1 h à temperatura ambiente). Use uma reação de 10 µ l (1 µ l da enzima T4, 1 µ l de tampão de X 10, 6 µ l de fragmento do PCR e 2 µ l de vetor).
- Transformar a 2 µ l de reação da ligadura em 50 µ l de Escherichia coli-células competentes e incube-os em gelo por 30 min. Então, calor-choque as células a 42 ° C por 30 s. adicionar 1 mL de mídia de consequência SOC e incubam a 37 ° C, durante 1 h em um shaker. Placa de 200 µ l da reação em um prato de LB-ágar contendo 100 ampicilina µ g/mL. Incube a placa a 37 ° C durante a noite.
- Selecione três colônias bacterianas individuais, cultivá-las durante a noite em 3 mL de LB-caldo contendo 100 ampicilina µ g/mL a 37 ° C em uma coqueteleira e extrair o plasmídeo de DNA usando um kit de purificação de plasmídeo.
- Verifique o plasmídeo por digestão de 500 ng de DNA usando enzimas de restrição SpeI e SalI durante 1 h a 37 ° C e a reação de executar em um gel de agarose (0,5% no Tris-Acetato-EDTA). Deve haver duas bandas com os tamanhos certos do vetor (~ 7 kb) e o insert (tamanho varia de acordo com o gene de interesse). Em seguida, verifique se o plasmídeo de sequenciação.
- Transforme ascende a p415 -GAL1-, plasmídeos - polyQ-FP debandeirapara a cepa de levedura W303 seguindo um protocolo de transformação de fermento padrão2.
2. ensaio da mancha
- Raia o fermento clona escriturada 25Q/72Q com o FP de interesse em uma placa de ágar contendo meios de seleção de levedura (sintética completa-SC sem leucina) com glicose como fonte de carbono. Ao mesmo tempo, também marcam a 25Q/72Q-ymsfGFP para servir como controle positivo.
Nota: 25Q/72Q construções que não contêm uma etiqueta fluorescente não são tóxicas e podem servir como controle negativo. - Incube as placas a 30 ° C, durante 2-3 d.
- Selecione até três colônias única da placa.
- Inocule 5ml de SC suplementado com 2% de glicose como fonte de carbono.
- Pelota 200 µ l de cada cultura durante a noite e lavar 3x com estéril de água destilada.
- Ressuspender as células em mídia de SC contendo 2% de galactose como fonte de carbono para induzir a expressão de polyQ fusões. Incube a galactose mídia durante a noite a 30 ° C em um rotador de tubo. Como um controle, repita este passo usando meios que contenham glicose.
- Na manhã seguinte, equalizar as densidades de célula a densidade óptica em 600 nm (OD600) de 0,2 em 100 µ l de mídia SC em uma placa de 96 poços estéril.
- Prepare quatro diluições quíntuplo de cada amostra com água esterilizada por pipetagem 20 µ l da amostra anterior até 80 µ l de mídia no poço próximo.
- Use um fermento fixando a ferramenta para manchar as células em placas seletivas (contendo glicose ou galactose) e incube a 30 ° C para d 2.
- As placas da imagem com um dispositivo de documentação de imagem.
3. quantificação do crescimento celular em cultura líquida
- Prepare as culturas de células, seguir passos 2.1-2.5 do presente protocolo.
- Medir o OD600 usando um espectrofotômetro.
- Dilua as células de uma OD600 de 0,1 em 300 µ l de mídia em uma placa de 96 poços.
- Execute cada amostra em triplicado.
- Incube a placa em uma placa leitor/incubadora com agitação capacidades. Definir o número de amostras, a temperatura de 30 ° C, a absorvância em 600 nm, comprimento dos experimentos de 24 h e os intervalos de medição, a 15 min e selecione o modo de agitação contínuo.
- Criar a curva de crescimento e quantificar a área sob a curva usando software de gráfico científico. O GraphPad Prism 7 é recomendado. Cole os dados em uma mesa XY com três valores de replicar. A curva de crescimento será mostrada na pasta gráficos no lado esquerdo. Para quantificar a área sob a curva, selecione analisar no canto superior esquerdo e clique em área sob a curva em análises XY.
4. fluorescente microscopia
- Prepare as culturas de células, seguir passos 2.1-2.5 do presente protocolo.
- Diluir as células 10 x em crescimento media e transferência 200 µ l de cada amostra a câmaras de imagem de 8 poços.
- Imagem das células usando um microscópio confocal, equipado com um objetivo X plano Aprochromoat 63 (1.4 at) à temperatura ambiente.
Nota: O uso de um microscópio confocal é opcional. Também pode ser empregado um microscópio fluorescente padrão de campo amplo. - Ajuste a potência de pinhole e laser para aquisição de imagem ideal. Uma vez que os agregados de 72Q são muito mais brilhantes do que o sinal 25Q difusa, muitas vezes é necessário usar uma configuração diferente de aquisição entre os plasmídeos diferentes para evitar a saturação do sinal fluorescente.
- Processe as imagens usando o ImageJ20 ou outro software de processamento de imagem. Neste passo, a percentagem de células que exibição agregado pode ser calculado manualmente é desejada.
5. dot Blot
Nota: No presente protocolo, borrão do ponto é usado para examinar os níveis de expressão de proteínas. Prepare as culturas de células, seguir passos 2.1-2.5 do presente protocolo.
- Gere o lisado de proteína usando contas de vidro em tampão de lise (EDTA 1 mM, 100 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl; 5% glicerol, 1mm ditiotreitol [TDT]). Adicione inibidores da protease, fluoreto de phenylmethylsulfonyl de 4 mM (PSMF) e cocktail, diretamente antes da utilização do inibidor da protease. 5 mL de cultura durante a noite de pelotas e Resuspenda-lo em 200 µ l de grânulos de vidro e 200 µ l de tampão de Lise. Vórtice de 30 s por 12 rodadas. Centrifugar a 12.000 x g a 4 ° C por 10 min e recolher o sobrenadante.
- Mancha uma quantidade igual de proteínas totais em uma membrana de nitrocelulose, usando um aparelho de microfiltração. Prewet da membrana com PBS e montar o aparelho. Conectar a uma fonte de vácuo e verifique se que os parafusos estão apertados. Ligue o aspirador de pó e deixe o filtro de amostra através da membrana por gravidade.
- Bloquear a membrana em PBS - 0.05% Tween/5% gordura de leite.
- Incubar a membrana com anticorpo antibandeira primário durante a noite a 4 ° C. Recomenda-se o anticorpo monoclonal antibandeira M1.
- Lavar a membrana 3 x por 10 min cada com PSB - 0,05% Tween.
- Incube a membrana com um anticorpo secundário fluorescente etiquetada (anti-mouse IgG) por 1h à temperatura ambiente em PBS - 0.05% Tween/5% gordura de leite.
- Lave a membrana 3 x 10 min com PSB - 0,05% Tween.
- Imagem-blot utilizando um sistema de documentação de immunoblot.
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Representative Results
FPs têm diferentes propriedades biofísicas, incluindo sua tendência a oligomerize, que podem afetar o comportamento dos seus parceiros de fusão no contexto dos repórteres fluorescentes. Este protocolo descreve um método simples onde várias FPs pode ser fundido a expansões polyQ tóxicos. Desde polyQ toxicidade é altamente dependente as sequências flanqueando o estiramento polyQ15, este ensaio permite uma comparação rápida e direta de repórteres de fusão polyQ fluorescente (Figura 1). Um comprimento de polyQ HD não-associados (25Q) é usado como um controle negativo e não exibir toxicidade significativa ou agregação15,16,21,22. 72Q é empregada para obter os fenótipos de HD-like, incluindo agregação de inibição e polyQ de forte crescimento. Importante, o Httex1 sequência de código empregado falta o domínio rico em prolina que segue o trecho do polyQ. Na presença do domínio rico em prolina, Httex1 não é tóxico em fermento15. Neste ensaio, um Httex1 fundida a uma variante monomérica fermento otimizado de superfolder GFP12 (ymsfGFP)16 é usado como um controle positivo, como descrito anteriormente,16. As construções também contenham uma tag epítopo da bandeira no N-terminal de Httex1. Isto permite a detecção das fusões diferentes com o mesmo anticorpo (antibandeira) para análise bioquímica. Como um prova de princípio, 72Q Httex1 fundido a levedura otimizado TagBFP2 (yomTagBFP2)23 não resulta em crescimento lento, medido por qualquer lugar ensaios em placas de ágar ou crescimento em meio líquido (Figura 2), indicando que a natureza da marca fluorescente de fato pode impedir comportamento de expansão polyQ nas células.
Agregação de fusões do polyQ fluorescentes pode ser avaliada usando microscopia fluorescente. 72Q-ymsfGFP exibe agregação significativa em comparação com 25Q. No entanto, o sinal fluorescente 72-yomTagBFP continua a ser difundido em todo o citoplasma (Figura 3). Na maioria dos casos, é recomendável não usar as mesmas configurações de aquisição de imagem (laser poder, tempo de exposição) para adquirir imagens tanto 25Q e 72Q. Os agregados nas células 72Q-expressando são muito mais brilhantes do que o sinal 25Q difusa. Portanto, sob condições de imagem usadas para adquirir imagens de 72Q, o sinal de 25Q difusa pode parecer muito fraco ou não ser visível em tudo. Configurações de aquisição adequada também devem ser aplicadas para minimizar a saturação durante a imagem latente das células 72Q-expressando.
Níveis de expressão das várias fusões polyQ poderiam afetar a toxicidade. Insolúvel em detergente amiloides, tais como polyQ agregados, são notoriamente difíceis de estudar bioquimicamente e não são adequados para uma análise por standerd SDS-PAGE. Portanto, os borrões do ponto podem ser realizados para avaliar os níveis de proteína. A inclusão da tag bandeira na extremidade amino terminal de Httex1 permite a detecção de todas as fusões fluorescentes simultaneamente, apesar da presença de FPs (Figura 4). Alternativamente, eletroforese em gel de agarose detergente semi desnaturação (SDD-idade) pode ser realizada para avaliar a formação de oligômeros de polyQ16. Um protocolo detalhado e vídeo estão disponíveis em Jorge e Lindquist24.
Figura 1: diagrama de fluxo de trabalho para a análise do efeito da marca de proteína fluorescente na agregação e toxicidade das proteínas de expansão polyQ no fermento. Primeiro, FPs são clonados em vetores de expressão de levedura codificando uma versão galactose-inducible do bandeira-tag Httex1 abrigando qualquer 25Q (não tóxico) ou (72Q HD-associados, agregando e tóxico) repetições. Clones são selecionados e verificados por sequenciamento e, posteriormente, transformados em levedura. Após a indução da expressão de fusão polyQ pela incubação em mídia contendo galactose, ou spotting ensaios em placas de ágar ou meio de crescimento líquido podem avaliar a toxicidade do polyQ. PolyQ agregação é analisada por microscopia fluorescente. Uma expressão relativa das diferentes construções é avaliada usando borrão de ponto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Os resultados de ensaio de crescimento representativo seguindo a expressão de Httex1 fluorescentes fusões no fermento. Fermento expressando 25Q ou 72Q Httex1 fundidos para ymsfGFP ou yomTagBFP foi cultivado em glicose (controle) ou mídia de galactose (induzida por polyQ) durante a noite e também (A) visto em placas de ágar ou (B) mais incubadas em líquido meios para avaliar o crescimento sob diferentes condições. Enquanto 72Q-ymsfGFP induz um defeito significativo crescimento, 72Q-yomTagBFP exibe um fenótipo de crescimento semelhante às contrapartes não tóxico 25Q. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens fluorescentes representante de Httex1 fluorescentes fusões no fermento. Fermento expressando 25Q ou 72Q Httex1 fundidos para ymsfGFP ou yomTagBFP foi cultivado em glicose (controle) ou mídia de galactose (induzida por polyQ) durante a noite e fotografada com um microscópio confocal. Enquanto a expressão de 72Q-ymsfGFP resulta em uma agregação de proteínas polyQ forte, 72Q-yomTagBFP exibe um sinal citoplasmático difuso semelhante às contrapartes não tóxico 25Q. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Ponto representativo blot-análise da expressão de fusão fluorescente Httex1 em levedura. Fermento expressando 25Q, 46Q, 72Q ou 103Q Httex1 fundido ao PCP foi cultivado em meios de galactose (induzida por polyQ) durante a noite e processado para análise do ponto do borrão. Quíntuplo diluições dos lisados celulares são mostradas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste artigo, vários ensaios para medir a agregação de Httex1 polyQ expansões e seu efeito sobre o crescimento de levedura foram utilizados como modelo para estudar como diferente fluorescente proteínas alteram seus parceiros de fusão no contexto dos repórteres fluorescentes . Usando uma variante GFP (ymsfGFP) como um controle positivo, mostramos que isso detecta alterações significativas de toxicidade polyQ e agregação entre diferentes etiquetas fluorescentes e permite uma comparação direta e rápida do desempenho de fusão do polyQ-FP contra Construções de GFP-etiquetado16,19.
Enquanto o presente protocolo enfoca proteínas fluorescentes, várias partes do protocolo podem ser facilmente adaptadas para testar os efeitos de outras marcas de proteína. Além disso, o presente protocolo emprega vetores centromérica de baixo-cópia fermento que podem variar em termos de número de cópias (geralmente um ou dois exemplares) presente em células25. Usar vetores integrativa para garantir uma expressão uniforme em condições experimentais pode contornar este problema. Enquanto este protocolo foi otimizado para uso no fundo W303, outras estirpes de S. cerevisiae podem ser empregadas. No entanto, a susceptibilidade à toxicidade do polyQ deve ser determinada usando os vetores de ymsfGFP-tag antes de projetar novas construções. Em certos casos, pode ser apropriado empregar vetores de alta-cópia (2µ) para gerar um defeito significativo crescimento. Também é aconselhável para testar vários isolados após a transformação de leveduras com vetores polyQ para evitar selecionando supressores espontâneas, mostrando uma toxicidade reduzida polyQ. De nota, o W303 cepa de levedura26 é usado geralmente como é mais sensível à toxicidade polyQ que outros derivados de S288C, tais como BY4741/BY474227, permitindo assim uma maior gama de fenótipos de crescimento. Importante, cepas empregadas para este teste precisam carregar a proteína príon Rnq1, uma vez que as células Δ de rnq1não exibir polyQ de toxicidade e agregação28. Também é importante o uso de construções deex1 Htt carregando a marca de bandeira de amino-terminal e falta o domínio rico em prolina. Outras variações do projeto fusão podem alterar fenótipos tóxicos15. Finalmente, a indução da expressão polyQ fusão em que contenham galactose media é uma etapa crítica do protocolo21. Quando a transferência de células de glicose e galactose contendo mídia, é importante lavar as células pelo menos três vezes com água esterilizada para eliminar todos os vestígios de glicose que poderia contribuir para reprimir a indução de promotor Gal129. Ao realizar ensaios de spotting, cultivo as células durante a noite em mídia de galactose para induzir a expressão da fusão pode exacerbar o fenótipo tóxico da fusão 72Q e ajudar a discriminar as alterações no crescimento através de de diferentes fusões16.
Como uma limitação, estudos anteriores não observaram efeitos diferenciais entre uma versão nonmonomeric do PCP (um derivado GFP) e ymsfGFP16. Assim, pelo menos para as variantes GFP, este ensaio pode não ser suficientemente sensível para discriminar entre variantes monoméricas e oligoméricas, destacando a necessidade de complementar o polyQ toxicidade ensaios com outros métodos padrão, tais como o OSER ensaio13 e análise bioquímica9,10,11,12 que diretamente podem avaliar a oligomerização. Além disso, deve notar-se que FPs podem se comportar de forma diferente no fermento em comparação com ensaios em vitro ou sua expressão em outros organismos23.
Coletivamente, estes métodos permitem que pesquisadores rapidamente caracterizam novo FPs e medir o seu efeito sobre o seu parceiro de fusão. No futuro, este protocolo irá permitir o rastreio rápido de novos derivados de FPs anteriormente caracterizadas para identificar os mutantes que se comportam da mesma forma para as variantes GFP, que ainda são a medida padrão-ouro para repórteres FP. Enquanto este protocolo enfoca proteínas fluorescentes, pode facilmente ser adaptado para a tela, para os efeitos de outras marcas geneticamente codificados, como SNAP-marca30 e SunTag31.
Em conclusão, este protocolo fornece um ensaio rápido e facilmente escalável para habilitar mais caracterização da nova geração de FPs e outras tags geneticamente codificados para guiar a pesquisa em design da proteína de fusão.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo é suportado por uma subvenção de funcionamento de institutos canadenses para pesquisa em saúde para M.L.D. e paixao O trabalho aqui apresentado é suportado por um prêmio de John R. Evans líder fundo da Fundação Canadense para a inovação e um fundo correspondente do fundo de investigação do Ontário para paixao Y.J. é suportado por um MSc para bolsa de doutorado transferência do reitor da escola de Schulich M edicine e odontologia na Universidade de Ontário ocidental. S.D.G. é suportado por uma bolsa de doutorado do Canadá ALS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-alpha Competent E. coli (High efficiency) | New Englanfd Biolab | C2987 | |
| SpeI-HF | New Englanfd Biolab | R3133 | High fidelity enzymes are preferred |
| SalI-HF | New Englanfd Biolab | R0138 | High fidelity enzymes are preferred |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160 | |
| LB-Agar | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB-Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Ampicilin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600382 | |
| EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments inc | EPOCH2TC | |
| Yeast Pin Replicator | V&P Scientific inc. | VP407AH | |
| SPI imager | S&P Robotics inc. | spImager-M | |
| Zeiss LSM 800 confocal with AryScan | Carl Zeiss Microscopy | LSM 800 | |
| 8 well Lab-Tek imaging chambers | Fisher Scientific | 12565470 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Chemi Doc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| anti-FLAG M1 antibody | Sigma-Aldrich | F3040 | |
| Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody | Thermo | A32727 | |
| Plasmid MiniPrep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| Plasmid Gel extraction Kit | Fisher Scientific | K0831 | |
| PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Prizm | GraphPad | N/A | |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Fisher Scientific | BP13354 |
References
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