Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Effect van fluorescente proteïnen op Fusion Partners Polyglutamine Toxicity Tests met gist

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58748
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Western Ontario, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Western Ontario

Summary

Dit artikel beschrijft protocollen voor de beoordeling van het effect van fluorescente proteïnen op de aggregatie en toxiciteit van de expansie van de misfolded polyglutamine voor de snelle evaluatie van een nieuw genfunctieonderzoek TL proteïne in het kader van fluorescerende verslaggevers.

Abstract

Voor het onderzoek van eiwitten lokalisatie en handel met behulp van levende cellen imaging, afhankelijk onderzoekers vaak van hun proteïne van belang aan een fluorescerende verslaggever smelten. De voortdurend evoluerende lijst van genetisch gecodeerde fluorescente proteïnen (FPs) presenteert gebruikers met verschillende alternatieven als het gaat om TL fusion ontwerp. Elke FP heeft specifieke eigenschappen voor optische en biofysische die de biochemische, cellulaire en functionele eigenschappen van de resulterende fluorescentie fusies beïnvloeden kunnen. Bijvoorbeeld, de verschillende FOD neiging om vormen van niet-specifieke oligomeren die vatbaar zijn voor het belemmeren van de functie van de fusion-partner. Helaas, slechts een paar methoden bestaan om te testen van het effect van FPs op het gedrag van de fluorescerende verslaggever. Hier beschrijven we een eenvoudige methode waarmee de snelle beoordeling van de gevolgen van FPs met behulp van polyglutamine (polyQ) toxiciteit testen in de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-uitgebreid huntingtin eiwitten zijn gekoppeld aan het begin van de ziekte van Huntington (HD), waar de uitgebreide huntingtin aggregaten in giftige oligomeren en integratie-organen. De aggregatie en toxiciteit van polyQ uitbreidingen in gist zijn sterk afhankelijk van de opeenvolgingen flankerend de polyQ regio, waaronder de aanwezigheid van fluorescerende labels, waardoor het een ideale experimenteel platform om te bestuderen van de impact van FPs op het gedrag van hun fusie partner.

Introduction

Aangezien de eerste karakterisering van de groen fluorescente proteïne (GFP) van Aequorea victoria1, een breed palet van genetisch gecodeerde FPs zijn ontwikkeld, waardoor cel biologen tegelijkertijd lokaliseren en bijhouden meerdere cellulaire gebeurtenissen/eiwitten in levende cellen2,3. FPs zijn afgeleid van meerdere organismen, uit kwallen koraal, en derhalve specifieke biofysische beeldschermeigenschappen die uitgebreid buiten hun respectieve fluorescerende spectrum afleiden. Deze eigenschappen omvatten helderheid, fotostabiliteit en een neiging tot oligomerize onder andere2,4. Het selecteren van monomeer FPs is een belangrijk aspect bij de keuze van een geschikte label tijdens het ontwerpen van een fluorescerende verslaggever, om ongepaste interacties en wijzigingen van de functie van de partner van de fusie te minimaliseren en maximaliseren van de efficiëntie van de verslaggever voor een cellulaire compartiment4,5,6gegeven. Terwijl GFP, na verloop van tijd is geëvolueerd om te minimaliseren van het effect van de fluorescerende tag toe te voegen aan de fusie partner5,7,8, hoe nieuwe FP varianten ten opzichte van presteren GFP blijft moeilijk in te schatten.

Er bestaan enkele methoden karakteriseren van het gedrag van de FOD. De meeste van hen betrekken biofysische eigenschappen van FPs met behulp van biochemische benaderingen, zoals ultracentrifugatie testen en gel filtratie protocollen9,10,11,12. Dergelijke methoden hebben de valkuil van het gebruik van gezuiverde FPs in oplossing, het aanbieden van weinig inzicht in hun gedrag in onbeschadigde cellen. De ontwikkeling van de georganiseerde Glad endoplasmatisch reticulum (OSER) assay aanbiedingen een kwantificeerbare beoordelingvan FPs neiging tot oligomerize in levende cellen13 door het controleren van de mogelijkheid van overexpressie bps te reorganiseren endoplasmatisch reticulum tubuli in OSER slierten14. Deze techniek kan met succes detecteren veranderingen tussen het monomeer en oligomere varianten van GFP en andere FPs. Echter het berust meestal op overexpressie in Transient transfected cellen, en de kwantificatie en beeldanalyse tijdrovend kunnen zijn tenzij de techniek wordt aangenomen als een automatische gegevensverzameling en analyse workflow.

Ter aanvulling van deze benaderingen, opgericht wij een bepaling die van het effect van fluorescerende tags op de toxiciteit en aggregatie van polyQ uitbreidingen in gist15,16 profiteert. De uitbreiding van het polyQ traject met meer dan 36 herhaalt binnen de eerste exon de gene codering van dat het eiwit huntingtin (Htt) is geassocieerd met de ziekte van Huntington17,18. De expressie van uitgebreide Httex1 gist resulteert in een sterke aggregatie van het misfolded Htt-eiwit dat is gekoppeld aan een ernstige groei defect. Interessant is dat zijn deze fenotypen sterk beïnvloed door de het polyQ traject, met inbegrip van FPs15,16flankerende sequenties. Het werd gerationaliseerd dat de verschillende eigenschappen van FPs differentieel polyQ toxiciteit in gist kunnen beïnvloeden. Inderdaad, in vergelijking met GFP-achtige FPs, rode fluorescerende eiwitten en hun geëvolueerd vormen hebben aangetoond een verminderde toxiciteit en aggregatie16. Dit manuscript verstrekt een gedetailleerd protocol voor de beoordeling van het effect van de volgende generatie van FPs op polyQ toxiciteit en aggregatie in gist. Deze bepaling staat voor een snelle en potentieel hoge-content analyse van FP-varianten die kunnen worden gebruikt in parallel met eerder gekenmerkt technieken voor de optimale karakterisering van nieuwe FPs en kan beoordelen hoe ze presteren ten opzichte van GFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. generatie van nieuwe Fluorescently Tagged Httex1 verslaggevers voor een expressie in gist

Opmerking: Deze sectie is gewijzigd van het protocol door Jiang et al. 16 en Albakri et al. 19.

  1. Inleidingen te versterken van de codering van de fluorescente proteïne of belang door PCR reeks ontwerpen. De voorwaartse primer moet bevatten een reeks leider ter ondersteuning van het beperkingsenzym tijdens de spijsvertering (GATC), gevolgd door een beperkingsplaats SpeI (ACTAGT) en 20 basen stroomafwaarts van de ATG (met uitzondering van ATG) van het gen fluorescent proteïne van belang. De omgekeerde primer dient de leider volgorde (GATC), gevolgd door een SalI beperkingsplaats (GTCGAC) en het omgekeerde complement van 20 basen stroomopwaarts van de stop codon van de FP opeenvolging (met inbegrip van stop).
  2. Met de inleidingen ontworpen in stap 1.1, het uitvoeren van de PCR-reactie een thermocycler met de volgende instellingen opgegeven: warmte tot 95 ° C gedurende 1 minuut en cyclus bij 95 ° C gedurende 30 s, 60 ° C gedurende 30 s, en 72 ° C gedurende 2 minuten per kB van PCR product. Het uitvoeren van 18 cycli is voldoende.
  3. De PCR-reactie op een agarose gel (0,5% in Tris-acetaat-EDTA) worden uitgevoerd. Er moet een enkele band die overeenkomt met de grootte van de verwachte product. Isoleer de fragment met behulp van een gel zuivering kit.
  4. Het protocol maakt gebruik van een Httex1 vector uitvoering 25 (nontoxic) en 72 (HD-geassocieerde, tonen een sterke aggregatie) polyQ wordt herhaald. Verteren zowel de PCR fragmenten en de vector met SpeI en SalI beperkingsenzymen gedurende 3 uur bij 37 ° C.
  5. Zuiveren de verteerd vector door het runnen van het op een agarose gel zoals in stap 1.3.
  6. Zuiveren het verteerd PCR fragment met behulp van een PCR zuivering kit.
  7. Het resulterende verteerd PCR fragment afbinden en p415 -GAL1-vlag-25/72QpolyQ plasmiden1 met behulp van ligase T4 (1 uur bij kamertemperatuur). Gebruik een 10 µL reactie (1 µL van T4 enzym, 1 µL van 10 X buffer 6 µL van het PCR fragment en 2 µL van vector).
  8. Transformeren 2 µL van de reactie van de afbinding in 50 µL van Escherichia coli-bevoegde cellen en hen uit te broeden op het ijs gedurende 30 minuten. Vervolgens warmte-schok de cellen bij 42 ° C gedurende 30 s. toevoegen 1 mL SOC uitgroei media en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur in een shaker. Plaat 200 µL van de reactie op een plaat van de LB-agar met 100 µg/mL ampicilline. Incubeer de plaat bij 37 ° C's nachts.
  9. Selecteer drie afzonderlijke bacteriële kolonies, groeien ze 's nachts in 3 mL van de pond-Bouillon met 100 µg/mL ampicilline bij 37 ° C in een shaker en haal het plasmide DNA met behulp van een plasmide zuivering kit.
  10. Het plasmide controleren door het verteren van 500 ng van DNA met enzymen van de beperking van SpeI en SalI gedurende 1 uur bij 37 ° C en run de reactie op een agarose gel (0,5% in Tris-acetaat-EDTA). Moet er twee banden op de juiste grootte van de vector (~ 7 kb) en de bijsluiter (grootte varieert volgens het gen van belang). Controleer vervolgens of de plasmide door sequentiebepaling.
  11. Transformeren de p415 -GAL1-vlag- polyQ-FP plasmiden in de giststam W303 na een standaard gist transformatie protocol2.

2. spotten Assay

  1. Streep de gist kloont uitvoering 25Q/72Q gelabeld met het KP van de rente over een agarplaat met gist selectie media (synthetische voltooien-SC zonder leucine) met glucose als de koolstofbron. Op hetzelfde moment, strijk ook 25Q/72Q-ymsfGFP om te dienen als positieve controle.
    Opmerking: 25Q/72Q constructies die geen een fluorescerend tag bevatten zijn niet giftig en kunnen dienen als negatieve controle.
  2. Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 2-3-d.
  3. Selecteer maximaal drie enkele kolonies van de plaat.
  4. Inoculeer 5 mL SC aangevuld met 2% glucose als de koolstofbron.
  5. Pellet 200 µL van iedere overnachting cultuur en wassen het 3 x met steriel gedistilleerd water.
  6. Resuspendeer de cellen in SC medium met 2% galactose als de koolstofbron voor het opwekken van de expressie van polyQ fusies. Incubeer de galactose media overnachting bij 30 ° C in een buis rotator. Als een besturingselement, herhaalt u deze stap met behulp van glucose-bevattende media.
  7. De volgende ochtend, gelijk de dichtheden van de cel aan optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van 0.2 in 100 µL van SC media in een steriele 96-wells-plaat.
  8. Bereiden vier vijfvoudige verdunningen voor elk monster met steriel water door pipetting 20 µL van het monster uit de vorige goed in 80 µL van media in de volgende goed.
  9. Gebruik een gist pinning hulpmiddel om ter plaatse de cellen op selectieve borden (met glucose of galactose) en Incubeer bij 30 ° C voor 2 d.
  10. Het imago van de platen met een beeldapparaat documentatie.

3. kwantificering van celgroei in vloeibare cultuur

  1. Bereiden de celculturen, volgende stappen 2.1-2.5 van dit protocol.
  2. De OD-600 met een spectrofotometer meten.
  3. Verdun de cellen tot een OD600 van 0.1 in 300 µL van media in een 96-wells-plaat.
  4. Elk monster in drievoud worden uitgevoerd.
  5. Incubeer de plaat in een plaat lezer/incubator met schudden mogelijkheden. Het aantal monsters, de temperatuur bij 30 ° C, de extinctie vastgesteldop 600 nm, de lengte van de experimenten tot 24 h, en de frequentie van de meting 15 min, en selecteer de continue schudden mode.
  6. Maak de groeikromme en kwantificeren van het gebied onder de curve met behulp van wetenschappelijke grafische software. De GraphPad prisma 7 wordt aanbevolen. Plak de gegevens in een XY-tabel met drie repliceren waarden. De groeikromme getoond onder de grafieken map aan de linkerkant. Kwantificeren van het oppervlak onder de kromme, analyseren links bovenaan selecteren en klik op gebied onder de curve in XY-analyses.

4. fluorescent microscopie

  1. Bereiden de celculturen, volgende stappen 2.1-2.5 van dit protocol.
  2. Verdun de cellen 10 x in groei media en overdracht 200 µL van elk monster aan 8-well imaging kamers.
  3. Het imago van de cellen met behulp van een confocal microscoop uitgerust met een 63 X Plan Aprochromoat doelstelling (1.4 nvt) bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Het gebruik van een confocal microscoop is optioneel. Een standaard breed-gebied fluorescente microscoop kan ook worden gebruikt.
  4. De kracht van het gaatje en laser voor optimale Beeldacquisitie aanpassen. Aangezien de 72Q-aggregaten veel helderder dan de diffuse 25Q signaal zijn, is het vaak moet gebruiken een verschillende overname setting tussen de verschillende plasmiden teneinde verzadiging van het fluorescerende signaal.
  5. Het verwerken van de beelden met behulp van ImageJ20 of een andere beeldverwerking software. Bij deze stap, is het percentage cellen dat display aggregaat handmatig kan worden berekend gewenst.

5. dot Blot

Opmerking: In dit protocol, dot vlek wordt gebruikt voor het onderzoeken van de niveaus van eiwit expressie. Bereiden de celculturen, volgende stappen 2.1-2.5 van dit protocol.

  1. Genereren van eiwit lysates met glasparels in lysis-buffermengsel (1 mM EDTA, 100 mM Tris, pH 7.5; 200 mM NaCl; 5% glycerol, 1 mM dithiothreitol [DTT]). Voeg proteaseinhibitors, 4 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (ASL) en proteaseinhibitor cocktail, direct vóór gebruik. Pellet 5 mL van de overnachting cultuur en resuspendeer het in 200 µL van glasparels en 200 µL van lysis buffer. Vortex 30 s voor 12 ronden. Centrifugeer bij 12.000 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten en het verzamelen van de bovendrijvende substantie.
  2. Ter plaatse een gelijke hoeveelheid van totale eiwitten op een membraan van de nitrocellulose met behulp van een apparaat microfiltratie. Prewet van het membraan met PBS en monteren van het toestel. Verbinding maken met een vacuüm bron en zorg ervoor dat de schroeven zijn aangescherpt. Zet op het vacuüm en laat de voorbeeldfilter via het membraan door de zwaartekracht.
  3. Het blokkeren van het membraan in PBS - 0,05% Tween/5% vetvrije melk.
  4. Incubeer het membraan met primair antilichaam van Dizzee RASCAL 's nachts bij 4 ° C. De monoklonale Dizzee RASCAL-M1 wordt aanbevolen.
  5. Wassen van het membraan 3 x voor elke 10 min met PSB - 0,05% Tween.
  6. Incubeer het membraan met een fluorescently gelabeld secundair antilichaam (anti-muis IgG) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in PBS - 0,05% Tween/5% vetvrije melk.
  7. Wassen membraan 3 x 10 min met PSB - 0,05% Tween.
  8. Afbeelding-vlek met behulp van een documentatiesysteem immunoblot.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FPs hebben verschillende biofysische eigenschappen, met inbegrip van hun neiging om te oligomerize, die kunnen invloed hebben op het gedrag van hun fusie-partners in het kader van fluorescerende verslaggevers. Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode waar meerdere FPs aan giftige polyQ uitbreidingen kan worden gesmolten. Aangezien polyQ toxiciteit sterk afhankelijk van de opeenvolgingen flankerend de polyQ stretch15 is, toestaat deze bepaling dat een snelle en directe vergelijking van fluorescerende polyQ fusion verslaggevers (Figuur 1). De lengte van een niet-HD-geassocieerde polyQ (25Q) wordt gebruikt als een negatieve controle en toont geen significante toxiciteit of aggregatie15,16,21,22. 72Q wordt gebruikt om de HD-achtige fenotypen, met inbegrip van sterke groei inhibitie en polyQ aggregatie. Nog belangrijker is, het Htt-ex1 codering reeks werkzaam ontbreken de proline-rijk-domein die volgt op het stuk van de polyQ. In aanwezigheid van het domein van proline-rijk is Httex1 niet giftig in gist15. In deze test, wordt een Htt-ex1 gesmolten tot een gist-geoptimaliseerde monomeer variant van superfolder GFP12 (ymsfGFP)16 gebruikt als positieve controle als eerder beschreven16. De constructies bevatten ook een vlag epitoop tag op de N-terminus van Httex1. Dit maakt de ontdekking van de verschillende fusies met het dezelfde antilichaam (Anti-Flag) voor biochemische analyse. Als een bewijs-van-principe, 72Q Httex1 gesmolten tot gist-geoptimaliseerde TagBFP2 (yomTagBFP2)23 niet leidt tot een trage groei gemeten door ofwel ter plaatse testen op agar platen of groei in vloeibare media (Figuur 2), waaruit blijkt dat de aard van de TL-tag kan inderdaad belemmeren gedrag van de uitbreiding van de polyQ in cellen.

Samenvoeging van de fluorescerende polyQ fusies kan worden beoordeeld met behulp van fluorescentie microscopie. 72Q-ymsfGFP toont aanzienlijke samenvoeging in vergelijking met 25Q. De 72-yomTagBFP fluorescent signaal blijft echter diffuus in het cytoplasma (Figuur 3). In de meeste gevallen, is het niet aanbevolen om gebruik dezelfde afbeelding overname-instellingen (laser macht, belichtingstijd) verwerven van zowel 25Q als 72Q beelden. De aggregaten in de uiting van de 72Q cellen zijn veel helderder dan het diffuus 25Q signaal. Daarom onder imaging voorwaarden gebruikt voor het verwerven van 72Q beelden, kan het signaal diffuus 25Q lijken zeer zwak of niet helemaal zichtbaar zijn. Passende overname-instellingen moeten ook worden toegepast om te minimaliseren van de verzadiging tijdens de beeldvorming van de uiting van de 72Q cellen.

Expressie niveaus van de diverse fusies van polyQ kunnen de toxiciteit beïnvloeden. Wasmiddel onoplosbare amyloids, zoals polyQ de aggregaten, zijn notoir moeilijk te bestuderen biochemically en zijn niet geschikt voor een analyse door tentoonstellingsstand SDS-pagina. Daarom kunnen dot blots worden uitgevoerd om te beoordelen eiwitniveaus. De opneming van de vlag-tag aan het einde van de amino terminus van Httex1 maakt de ontdekking van alle de fluorescerende samensmeltingen gelijktijdig, ondanks de aanwezigheid van FPs (Figuur 4). Als alternatief, semi-denatureren wasmiddel agarose gelelektroforese (SDD-leeftijd) kan worden uitgevoerd om te beoordelen van de vorming van polyQ oligomeren16. Een gedetailleerd protocol en video zijn beschikbaar in Halfmann en Lindquist24.

Figure 1
Figuur 1: werkstroomdiagram voor de analyse van het effect van fluorescente proteïne-tag op de aggregatie en toxiciteit van polyQ uitbreiding eiwitten in gist. Eerst, FPs zijn gekloond in gist expressievectoren codering een galactose-afleidbare versie van vlag-gelabeld Httex1 herbergen ofwel 25Q (nontoxic) of 72Q (HD-geassocieerde, aggregeren en toxische) herhaalt. Klonen worden geselecteerd en gecontroleerd door sequentiebepaling en, later, getransformeerd in gist. Na de inductie van polyQ fusion expressie door incubatie in galactose-bevattende media, spotten testen op agar platen of groei vloeibare media kan beoordelen van de toxiciteit van de polyQ. PolyQ aggregatie wordt geanalyseerd door fluorescent microscopie. Een relatieve uitdrukking van de verschillende constructies wordt beoordeeld met behulp van dot vlek. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Vertegenwoordiger groei assay resultaten na de expressie van Httex1 fluorescerende fusies in gist. Gist uiting van 25Q of 72Q Httex1 gesmolten naar ymsfGFP of yomTagBFP werd gekweekt in glucose (control) of galactose media (polyQ-geïnduceerde) 's nachts en ofwel (A) gespot op agar platen of (B) bebroede verder in vloeistof media te beoordelen van de groei onder de verschillende omstandigheden. Tijdens 72Q-ymsfGFP een aanzienlijke groei defect induceert, geeft 72Q-yomTagBFP een groei fenotype vergelijkbaar met de nontoxic 25Q tegenhangers. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Vertegenwoordiger fluorescerende beelden van Httex1 fluorescerende fusies in gist. Gist uiting van 25Q of 72Q Httex1 gesmolten naar ymsfGFP of yomTagBFP werd gekweekt in glucose (control) of galactose media (polyQ-geïnduceerde) 's nachts en beeld met een confocal microscoop. Tijdens de 72Q-ymsfGFP-expressie in een sterke polyQ eiwit aggregatie resulteert, geeft 72Q-yomTagBFP een diffuus cytoplasmatische signaal vergelijkbaar met de nontoxic 25Q tegenhangers. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Vertegenwoordiger dot analyse van de vlek van Httex1 fluorescerende fusion meningsuiting in gist. Gist waarin 25Q, 46Q, 72Q of 103Q Httex1 GVB gesmolten werd gekweekt in galactose media (polyQ-geïnduceerde) 's nachts en verwerkt voor dot vlekkenanalyse. Vijfvoudige verdunningen van de cel lysates worden weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit artikel verschillende testen om te meten de aggregatie van Httex1 polyQ uitbreidingen en hun effect op de groei van de gist werkten als een model om te bestuderen hoe de verschillende TL eiwitten veranderen hun fusie-partners in het kader van fluorescerende verslaggevers . Met behulp van een GFP-variant (ymsfGFP) als positieve controle, toonden we dat dit belangrijke veranderingen in polyQ toxiciteit en aggregatie tussen verschillende TL tags detecteert en zorgt voor een directe en snelle vergelijking van de polyQ-FP fusion prestaties tegen GFP-gelabeld constructies16,19.

Terwijl het huidige protocol is gericht op fluorescente proteïnen, zou verschillende gedeelten van het protocol gemakkelijk aangepast aan het testen van de effecten van andere eiwit-tags. Bovendien, dit protocol maakt gebruik van lage-kopie gist centromeric vectoren die in termen van moleculen (meestal één of twee exemplaren) aanwezig in cellen25 variëren kunnen. Met behulp van integratieve vectoren te zorgen voor een uniforme expressie in experimentele omstandigheden kon het omzeilen van dit probleem. Terwijl dit protocol is geoptimaliseerd voor gebruik op de achtergrond van de W303, kunnen andere S. cerevisiae stammen worden. Echter, gevoeligheid voor polyQ toxiciteit moet worden bepaald met behulp van de ymsfGFP-gelabeld vectoren voorafgaand aan ontwerpen van de nieuwe constructies. In bepaalde gevallen kan het dienstig zijn om hoge-kopie (2µ) vectoren voor het genereren van een aanzienlijke groei defect in dienst. Het wordt ook voorgesteld om het testen van meerdere isolaten na de transformatie van de gist met polyQ vectoren te vermijden selecteren van spontane suppressors tonen de toxiciteit van een verminderde polyQ. Van de nota, de W303 gist stam26 meestal gebruikt wordt als het is gevoeliger voor polyQ toxiciteit dan andere S288C-derivaten, zoals BY4741/BY474227, waardoor voor een breder scala van groei fenotypen. Nog belangrijker is, moeten stammen werkzaam voor deze test het prion-eiwit Rnq1 omdat rnq1Δ cellen polyQ toxiciteit en aggregatie28niet weergeven. Het is ook belangrijk om te gebruiken Httex1 constructies dragen de amino-terminal vlag tag en ontbreekt het proline-rijk-domein. Andere variaties van het ontwerp van fusie kunnen giftige fenotypen15wijzigen. Tot slot, de inductie van de polyQ fusion expressie in galactose-bevattende media is een cruciale stap voor de protocol-21. Bij het overbrengen van cellen uit glucose naar galactose-bevattende media, is het belangrijk om te wassen van de cellen ten minste driemaal met steriel water te elimineren alle sporen van glucose die bijdragen kunnen aan het onderdrukken van de inductie van de promotor Gal129. Bij het uitvoeren van spotten testen, kan kweken de cellen overnachting in galactose media voor het opwekken van de expressie van de fusie verergeren het giftige fenotype van de fusie van 72Q en helpen discrimineren van veranderingen in de groei over verschillende samensmeltingen16.

Als een beperking, deed eerdere studies niet observeren Differentiele effecten tussen een nonmonomeric versie van GVB (een derivaat van GFP) en ymsfGFP16. Dus, ten minste voor GFP varianten, deze bepaling kan niet gevoelig genoeg is om te discrimineren tussen monomeer en oligomere varianten, benadrukken de behoefte aan een aanvulling van de polyQ toxiciteit te testen met andere standaard methoden, zoals de OSER assay13 en biochemische analyse9,10,11,12 oligomerisatie rechtstreeks kunt beoordelen. Ook moet opgemerkt worden dat FPs anders in gist in vergelijking met in vitro testen of hun uitdrukking in andere organismen23 gedragen kan.

Deze methoden toestaan collectief, onderzoekers om snel nieuwe FPs te karakteriseren en hun effect op hun fusie partner meten. Dit protocol kan in de toekomst, de snelle screening van nieuwe derivaten van eerder gekarakteriseerd bps te identificeren van mutanten die werken op dezelfde manier aan GFP varianten, die nog steeds de gouden standaard maatregel voor FP verslaggevers. Terwijl dit protocol is gericht op fluorescente proteïnen, kan het gemakkelijk worden aangepast aan het scherm voor de effecten van andere genetisch gecodeerde codes, zoals de module-tag30 en SunTag31.

Kortom, biedt dit protocol een snelle en gemakkelijk schaalbare assay zodat verdere karakterisering van de nieuwe generatie van FPs en andere genetisch gecodeerde codes bij onderzoek in fusie-eiwit ontwerp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Deze studie wordt ondersteund door een subsidie voor huishoudelijke uitgaven van de Canadese instituten voor gezondheidsonderzoek naar M.L.D. en P.L. Het werk hier gepresenteerd wordt ondersteund door een John R. Evans leider Fund award van de Canadese Stichting voor innovatie en een bijpassende Fonds van het onderzoeksfonds Ontario P.L. Y.J. wordt ondersteund door een MSc naar PhD scholarship van de overdracht van de decaan van de School van de Schulich van M edicine en tandheelkunde aan de University of Western Ontario. S.D.G. wordt ondersteund door een PhD Scholarship uit ALS Canada.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-alpha Competent E. coli (High efficiency) New Englanfd Biolab C2987
SpeI-HF New Englanfd Biolab R3133 High fidelity enzymes are preferred
SalI-HF New Englanfd Biolab R0138 High fidelity enzymes are preferred
Agarose Fisher Scientific BP160
LB-Agar Fisher Scientific BP1425
LB-Broth Fisher Scientific BP1426
Ampicilin Fisher Scientific BP1760
PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase Agilent Technologies 600382
EPOCH2 microplate spectrophotometer BioTek Instruments inc EPOCH2TC
Yeast Pin Replicator V&P Scientific inc. VP407AH
SPI imager S&P Robotics inc. spImager-M
Zeiss LSM 800 confocal with AryScan Carl Zeiss Microscopy LSM 800
8 well Lab-Tek imaging chambers Fisher Scientific 12565470
Bio-Dot apparatus Bio-Rad 1706545
Chemi Doc XRS+ Bio-Rad 1708265
anti-FLAG M1 antibody Sigma-Aldrich F3040
Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody Thermo  A32727
Plasmid MiniPrep Kit Fisher Scientific K0503
Plasmid Gel extraction Kit Fisher Scientific K0831
PCR Purification Kit Fisher Scientific K0702
Prizm GraphPad N/A
TAE (Tris-Acetate-EDTA) Fisher Scientific BP13354

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
  3. Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design. Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).
  4. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
  5. Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nature Communications. 6, 7670 (2015).
  6. Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).
  7. Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
  8. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  9. Pédelacq, J. -D., et al. Engineering soluble proteins for structural genomics. Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).
  10. Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).
  11. Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).
  12. Pédelacq, J. -D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).
  13. Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
  14. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).
  15. Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).
  16. Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions. Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).
  17. Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington's disease. Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).
  18. Gusella, J. F., MacDonald, M. E. Huntington's disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens. Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).
  19. Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations]. F1000Research. 7, 1242 (2018).
  20. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  21. Duennwald, M. L. Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation. Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).
  22. Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).
  23. Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae. Plos One. 8 (7), e67902 (2013).
  24. Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).
  25. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
  26. Thomas, B. J., Rothstein, R. Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA. Cell. 56 (4), 619-630 (1989).
  27. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
  28. Meriin, A. B., et al. toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).
  29. Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156 (1), 119-122 (1995).
  30. Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
  31. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).

Tags

Biologie kwestie 141 fluorescente proteïnen polyglutamine toxiciteit gist groei testen aggregatie groen fluorescent proteïne fluorescent microscopie
Effect van fluorescente proteïnen op Fusion Partners Polyglutamine Toxicity Tests met gist
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiang, Y., Di Gregorio, S., Albakri, … More

Jiang, Y., Di Gregorio, S., Albakri, M. B., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast. J. Vis. Exp. (141), e58748, doi:10.3791/58748 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter