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Biology

Effetto di proteine fluorescenti su Fusion partner utilizzando saggi di tossicità di Polyglutamine in lievito

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58748
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Western Ontario, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Western Ontario

Summary

Questo articolo descrive i protocolli per valutare l'effetto di proteine fluorescenti sull'aggregazione e la tossicità di polyglutamine misfolded espansione per la valutazione rapida di una proteina fluorescente appena atipico nel contesto del reporter fluorescenti.

Abstract

Per l'indagine di localizzazione della proteina e il traffico usando la formazione immagine di cellule vive, i ricercatori spesso si affidano loro proteina di interesse ad un reporter fluorescente di fusione. L'elenco in continua evoluzione delle proteine fluorescenti geneticamente codificate (FPs) presenta agli utenti con diverse alternative quando si tratta di design fusion fluorescente. Ogni FP ha specifiche proprietà ottiche e biofisiche che possono influenzare le proprietà biochimiche, cellulari e funzionali delle fusioni fluorescente risultante. Per esempio, parecchi FPs tendono a formare oligomeri non specifici che sono suscettibili di ostacolare la funzione del partner di fusione. Purtroppo, solo pochi metodi esistono per testare l'impatto di FPs sul comportamento del reporter fluorescente. Qui, descriviamo un metodo semplice che permette la rapida valutazione dell'impatto della FPs utilizzando poliglutammina (polyQ) saggi di tossicità nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Proteine di huntingtin PolyQ espanso sono associati con l'insorgenza della malattia di Huntington (HD), dove l'huntingtina espanso vengono aggregati in oligomeri tossici e corpi di inclusione. L'aggregazione e la tossicità di poliQ espansioni in lievito sono altamente dipendente sulle sequenze fiancheggianti la regione di poliQ, compresa la presenza di tag fluorescente, fornendo così una piattaforma sperimentale ideale per studiare l'impatto di FPs sul comportamento dei loro partner di fusione.

Introduction

Poiché la caratterizzazione iniziale della proteina fluorescente verde (GFP) da Aequorea victoria1, un'ampia tavolozza di FPs codificato geneticamente sono stati sviluppati, permettendo i biologi delle cellule localizzare e monitorare contemporaneamente più eventi/proteine cellulari in vita cellule2,3. FPs sono derivati da organismi multipli, da meduse di corallo e pertanto, visualizzazione specifiche proprietà biofisiche che deviare ampiamente di là di loro rispettivo spettro fluorescente. Queste proprietà includono luminosità, fotostabilità e una tendenza a oligomerizzazione tra gli altri2,4. Selezionando monomerico FPs è un aspetto importante nella selezione di un tag adatto quando si progetta un reporter fluorescente, per minimizzare interazioni inappropriati e alterazioni della funzione del partner di fusione e massimizzare l'efficienza di reporter per un dato il compartimento cellulare4,5,6. Mentre GFP è, nel tempo, stato evoluto per ridurre al minimo l'effetto di aggiungere il tag fluorescente per la fusion partner5,7,8, come nuove varianti di FP eseguire rispetto a GFP rimane difficile da valutare.

Esistono alcuni metodi per caratterizzare il comportamento di FPs. La maggior parte di essi coinvolgono test proprietà biofisiche di FPs utilizzando approcci biochimici, quali ultracentrifugazione e gel filtrazione protocolli9,10,11,12. Tali metodi hanno l'avvertenza di utilizzare purificata FPs in soluzione, offrendo una visione poco sul loro comportamento in cellule intatte. Lo sviluppo delle offerte saggio organizzato reticolo endoplasmatico liscio (OSER) una valutazione quantificabile di tendenza FPs' a oligomerizzazione in vita cellule13 testando la capacità di riorganizzare i tubuli di reticolo endoplasmatico in FPs iperespresso OSER verticilli14. Questa tecnica è in grado di rilevare correttamente le modifiche tra le varianti monomerici e oligomerici di GFP e altri FPs. Tuttavia, esso si basa principalmente sulla sovraespressione in cellule trasfettate transitoriamente e la quantificazione e l'analisi di immagine può richiedere molto tempo, a meno che la tecnica viene adottata come una raccolta automatizzata dei dati e del flusso di lavoro di analisi.

Al fine di integrare questi approcci, abbiamo stabilito un'analisi che sfrutta l'effetto fluorescente tag sulla tossicità e aggregazione di poliQ espansioni in lievito15,16. L'espansione del tratto poliQ con più di 36 ripetizioni all'interno il primo essone del gene codificante che la proteina huntingtina (Htt) è associata con la malattia di Huntington17,18. L'espressione di espanso Httex1 nei risultati di lievito in una forte aggregazione delle proteine misfolded Htt accoppiata ad un difetto di sviluppo severo. Interessante, questi fenotipi sono fortemente influenzati dalle sequenze fiancheggianti il tratto poliQ, tra cui FPs15,16. Esso è stato razionalizzato che le diverse proprietà di FPs differenzialmente possono influenzare la tossicità polyQ in lievito. Infatti, rispetto alla GFP-come FPs, proteine fluorescenti rosse e le loro forme evolute hanno mostrato una ridotta tossicità e aggregazione16. Questo manoscritto fornisce un protocollo dettagliato per valutare l'effetto della prossima generazione di FPs sulla tossicità di poliQ e aggregazione in lievito. Questo test consente un'analisi rapida e potenzialmente ad alto contenuto di varianti FP che può essere utilizzato in parallelo con precedentemente caratterizzato tecniche per la caratterizzazione ottima del nuovo FPs e può valutare come se la cavano rispetto a GFP.

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Protocol

1. generazione di nuovo fluorescente Tagged Httex1 reporter per un'espressione in lievito

Nota: Questa sezione è stata modificata dal protocollo di Jiang et al. 16 e Albakri et al. 19.

  1. Disegnare primers per amplificare la sequenza che codifica la proteina fluorescente o interesse mediante PCR. Il primer forward dovrebbe includere una sequenza leader per assistere l'enzima di restrizione durante la digestione (GATC), seguita da un sito di restrizione SpeI (ACTAGT) e 20 basi a valle dell'ATG (escluse ATG) del gene della proteina fluorescente di interesse. Il primer reverse dovrebbe includere la sequenza leader (GATC), seguita da un sito di restrizione di SalI (GTCGAC) e il complemento inverso di 20 basi a Monte del codone di stop della sequenza FP (tra cui fermata).
  2. Utilizzando il primer disegnati nel passaggio 1.1, eseguire la reazione di PCR utilizzando un termociclatore con le seguenti impostazioni: calore a 95 ° C per 1 min e ciclo a 95 ° C per 30 s, 60 ° C per 30 s e 72 ° C per 2 min a kB del prodotto di PCR. L'esecuzione di 18 cicli è ampio.
  3. Eseguire la reazione di PCR su un gel di agarosio (0,5%, Tris-acetato-EDTA). Ci deve una singola banda corrispondente alla dimensione di prodotto previsto. Isolare il frammento utilizzando un kit di purificazione del gel.
  4. Il protocollo utilizza un vettore diex1 Htt che trasportano 25 (non tossico) e 72 (HD-associato, visualizzazione di una forte aggregazione) polyQ ripete. Digerire i frammenti PCR sia il vettore con enzimi di restrizione SpeI e SalI per 3 h a 37 ° C.
  5. Purificare il vettore digerito facendolo funzionare su un gel di agarosio come descritto al punto 1.3.
  6. Purificare il frammento della PCR digerito utilizzando un kit di purificazione di PCR.
  7. Legare il frammento della PCR digerito risultante e p415 -GAL1-bandiera-25/72QpolyQ plasmidi1 utilizzando ligasi T4 (1 h a temperatura ambiente). Utilizzare una reazione di 10 µ l (1 µ l di enzima T4, 1 µ l di tampone X 10, 6 µ l del frammento PCR e 2 µ l di vettore).
  8. Trasformare 2 µ l di reazione di legatura in 50 µ l di Escherichia coli-cellule competenti e li Incubare in ghiaccio per 30 min. Quindi, shock termico le cellule a 42 ° C per 30 s. aggiungere 1 mL di media escrescenza SOC e incubare a 37 ° C per 1 h in uno shaker. Piastra di 200 µ l di reazione su un piatto di LB-agar contenente ampicillina di 100 µ g/mL. Incubare la piastra a 37 ° C durante la notte.
  9. Selezionare tre diverse colonie batteriche, farle crescere durante la notte in 3 mL di LB-brodo contenente 100 ampicillina µ g/mL a 37 ° C in un agitatore ed estrarre il plasmide DNA utilizzando un kit di purificazione del plasmide.
  10. Verifica il plasmide digerendo 500 ng di DNA usando gli enzimi di restrizione SpeI e SalI per 1h a 37 ° C ed eseguire la reazione su un gel di agarosio (0,5%, Tris-acetato-EDTA). Dovrebbero esserci due bande alle giuste dimensioni del vettore (~ 7 kb) e l'inserto (dimensione varia secondo il gene di interesse). Verificare quindi il plasmide mediante sequenziamento.
  11. Trasformare il p415 -GAL1- plasmidi - polyQ-FPbandieranel ceppo di lievito W303 seguendo un protocollo di trasformazione lievito standard2.

2. dosaggio di spotting

  1. Striscia il lievito cloni trasportante 25Q/72Q taggati con FP di interesse su una piastra di agar contenente lievito selezione supporto (sintetico completare-SC senza leucina) con glucosio come fonte di carbonio. Allo stesso tempo, anche striscia 25Q/72Q-ymsfGFP per servire come controllo positivo.
    Nota: 25Q/72Q costrutti che non contengono un tag fluorescente non sono tossici e possono servire come controllo negativo.
  2. Incubare le piastre a 30 ° C per 2-3 d.
  3. Selezionare fino a tre singole colonie dalla piastra.
  4. Inoculare 5 mL di SC completati con 2% di glucosio come fonte di carbonio.
  5. A pellet 200 µ l di ogni cultura durante la notte e lavare 3 volte con sterile di acqua distillata.
  6. Risospendere le cellule in media di SC che contengono 2% galattosio come fonte di carbonio per indurre l'espressione di poliQ fusioni. Incubare il galattosio media pernottamento a 30 ° C in un rotatore del tubo. Come controllo, ripetere questo passaggio utilizzando supporti contenenti glucosio.
  7. La mattina successiva, equalizzare la densità delle cellule di densità ottica a 600 nm (OD600) di 0,2 a 100 µ l di media di SC in una piastra a 96 pozzetti sterile.
  8. Preparare quattro diluizioni quintuplo di ciascun campione con acqua sterile di pipettaggio 20 µ l del campione dal precedente fino a 80 µ l di media nel pozzo successivo.
  9. Usa un lievito pinning strumento per individuare le cellule sui piatti selettive (che contengono glucosio o galattosio) e incubare a 30 ° C per 2 d.
  10. Immagine delle piastre con un dispositivo di documentazione di immagini.

3. quantificazione della crescita delle cellule in coltura liquida

  1. Preparare le colture cellulari, seguenti passaggi 2.1-2.5 del presente protocollo.
  2. Misurare il OD600 utilizzando uno spettrofotometro.
  3. Diluire le cellule a un OD600 di 0,1 a 300 µ l di media in una piastra a 96 pozzetti.
  4. Eseguire ogni esempio in triplice copia.
  5. Incubare la piastra in un lettore/incubatore di piastra con capacità di agitazione. Impostare il numero di campioni, la temperatura a 30 ° C, l'assorbanza a 600 nm, la lunghezza di esperimenti a 24 h e gli intervalli di misurazione a 15 min e selezionare la modalità di agitazione continua.
  6. Creare la curva di crescita e quantificare l'area sotto la curva utilizzando software di grafica scientifica. La GraphPad Prism 7 è consigliato. Incollare i dati in una tabella di x-y con tre valori di replicare. La curva di crescita verrà mostrata sotto la cartella grafici sul lato sinistro. Per quantificare l'area sotto la curva, selezionare Analyze in alto a sinistra e fare clic su Area sotto la curva nelle analisi di XY.

4. fluorescente microscopia

  1. Preparare le colture cellulari, seguenti passaggi 2.1-2.5 del presente protocollo.
  2. Diluire le cellule 10 x in crescita media e trasferimento 200 µ l di ogni campione a 8 pozzetti imaging chambers.
  3. Immagine le celle utilizzando un microscopio confocale equipaggiato con un obiettivo X piano Aprochromoat 63 (1,4 NA) a temperatura ambiente.
    Nota: L'utilizzo di un microscopio confocale è facoltativo. Può essere impiegato anche un microscopio a fluorescenza grandangolari standard.
  4. Regolare la potenza laser e pinhole per acquisizione di immagine ottimale. Poiché gli aggregati 72Q sono molto più luminosi rispetto al segnale 25Q diffusa, spesso è necessario utilizzare un'impostazione di acquisizione diversi tra i diversi plasmidi per evitare la saturazione del segnale fluorescente.
  5. Elaborare le immagini usando ImageJ20 o un altro software di elaborazione delle immagini. A questo punto, la percentuale di cellule che display aggregato può essere calcolato manualmente è desiderata.

5. dot Blot

Nota: In questo protocollo, dot blot è usato per esaminare i livelli di espressione della proteina. Preparare le colture cellulari, seguenti passaggi 2.1-2.5 del presente protocollo.

  1. Generare la proteina lisati usando le perle di vetro in tampone di lisi (100 mM Tris, pH 7.5; 200 mM NaCl, 1 mM EDTA; 5% glicerolo, 1 mM dithiothreitol [DTT]). Aggiungere gli inibitori della proteasi, 4 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (ASL) e dell'inibitore di proteasi cocktail, direttamente prima dell'uso. A pellet 5ml della cultura durante la notte e risospendere esso in 200 µ l di perle di vetro e 200 µ l di tampone di lisi. Vortice 30 s per 12 giri. Centrifugare a 12.000 x g a 4 ° C per 10 minuti e raccogliere il surnatante.
  2. Individuare una pari quantità di proteine totali su una membrana di nitrocellulosa mediante un apparato di microfiltrazione. Prewet la membrana con PBS e montare l'apparecchiatura. Connettersi a una fonte di vuoto e assicurarsi che le viti siano serrate. Applicare il vuoto e lasciare che il filtro del campione attraverso la membrana dalla forza di gravità.
  3. Bloccare la membrana in PBS - 0.05% Tween/5% senza grassi del latte.
  4. Incubare la membrana con l'anticorpo primario anti-FLAG durante la notte a 4 ° C. Il monoclonale anti-FLAG che M1 è raccomandato.
  5. Lavare la membrana 3 x per 10 minuti ciascuno, con PSB - 0.05% Tween.
  6. Incubare la membrana con un anticorpo secondario fluorescente contrassegnato (anti-IgG di topo) per 1 h a temperatura ambiente in PBS - 0.05% Tween/5% senza grassi del latte.
  7. Lavare la membrana 3 x 10 min con PSB - 0.05% Tween.
  8. Immagine-macchia usando un sistema di documentazione di immunoblot.

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Representative Results

FPs hanno differenti proprietà biofisiche, compresa la loro tendenza a oligomerizzazione, che possono influenzare il comportamento dei loro partner di fusione nel contesto del reporter fluorescenti. Questo protocollo descrive un metodo semplice dove più FPs possono essere fusi per espansioni polyQ tossici. Poiché polyQ tossicità dipende fortemente le sequenze fiancheggianti il tratto poliQ15, questo dosaggio permette un confronto rapido e diretto dei reporter di fusione polyQ fluorescenti (Figura 1). Una lunghezza di poliQ non-HD-collegati (25Q) viene utilizzata come controllo negativo e non presenta tossicità significativa o aggregazione15,16,21,22. 72Q è impiegato per ottenere i fenotipi di HD-come, tra cui l'aggregazione di inibizione e polyQ di forte crescita. D'importanza, la Httex1 sequenza di codificazione impiegato mancanza il dominio ricco di prolina che segue il tratto poliQ. In presenza del dominio ricco di prolina, Httex1 non è tossico in lievito15. In questo test, un Httex1 fusa ad una variante monomerica ottimizzato lievito di superfolder GFP12 (ymsfGFP)16 viene utilizzato come controllo positivo come descritto in precedenza16. I costrutti di contengano anche un tag di epitopo FLAG al N-terminale di Httex1. Questo consente il rilevamento delle fusioni diverse con lo stesso anticorpo (anti-FLAG) per l'analisi biochimica. Come un prova-de-principio, 72Q Httex1 fusa a lievito-ottimizzato TagBFP2 (yomTagBFP2)23 non si traduca in lenta crescita misurata da uno spot saggi su piastre di agar o crescita in terreno liquido (Figura 2), che indica che la natura del tag fluorescente infatti può ostacolare il comportamento di espansione polyQ nelle cellule.

Aggregazione delle fusioni polyQ fluorescente può essere valutata utilizzando la microscopia a fluorescenza. 72Q-ymsfGFP Visualizza aggregazione significativa rispetto ai 25Q. Tuttavia, il segnale fluorescente 72-yomTagBFP rimane diffuso in tutto il citoplasma (Figura 3). Nella maggior parte dei casi, non è consigliabile utilizzare le stesse impostazioni di acquisizione immagine (laser di potenza, tempo di esposizione) per acquisire immagini 25Q sia 72Q. Gli aggregati nelle cellule che esprimono 72Q sono molto più luminosi rispetto al segnale 25Q diffusa. Pertanto, in condizioni di imaging utilizzate per acquisire immagini 72Q, il segnale 25Q diffusa può apparire molto debole o non essere visibile a tutti. Impostazioni di acquisizione appropriati devono essere applicate anche per ridurre al minimo la saturazione durante l'imaging delle cellule che esprimono 72Q.

I livelli di espressione delle varie fusioni polyQ potrebbero influenzare la tossicità. Detersivo-insolubili amiloidi, come aggregati di poliQ, sono notoriamente difficili da studiare biochimicamente e non sono adatti per un'analisi di standerd SDS-PAGE. Di conseguenza, dot blot può essere eseguita per valutare i livelli di proteina. L'inserimento del tag bandiera all'estremità amminica di Httex1 permette la rilevazione di tutte le fusioni fluorescente simultaneamente, nonostante la presenza di FPs (Figura 4). In alternativa, elettroforesi su gel di agarosio detergente semi-denaturante (SDD-età) può essere eseguita per valutare la formazione di oligomeri di poliQ16. Un protocollo dettagliato e video sono disponibili in Elisa e Lindquist24.

Figure 1
Figura 1: diagramma di flusso di lavoro per l'analisi dell'effetto del tag proteina fluorescente sull'aggregazione e tossicità delle proteine di espansione polyQ in lievito. In primo luogo, FPs vengono clonate in vettori di espressione di lievito codifica una versione galattosio-inducibile di Bandierina-etichettate Httex1 che harboring entrambi 25Q (non tossico) o 72Q ripetizioni (HD-collegata, aggregante e tossiche). Cloni sono selezionati e verificati dall'ordinamento e, successivamente, trasformati in lievito. Dopo l'induzione dell'espressione di fusione di poliQ da incubazione in media contenenti galattosio, o spotting saggi su piastre di agar o liquido di coltura in grado di valutare la tossicità di poliQ. Aggregazione di PolyQ viene analizzato da microscopia fluorescente. Un'espressione relativa dei diversi costrutti è valutata usando la macchia del puntino. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Risultati di dosaggio rappresentante crescita seguendo l'espressione di Httex1 fluorescente fusioni in lievito. Lievito esprimendo 25Q o 72Q Httex1 fusa a ymsfGFP o yomTagBFP è stato coltivato in glucosio (controllo) o media di galattosio (indotta da polyQ) durante la notte e (A) macchiato su piastre di agar o (B) ulteriormente incubate in liquido supporti per valutare la crescita nelle diverse condizioni. Mentre 72Q-ymsfGFP induce un difetto di crescita significativa, 72Q-yomTagBFP Visualizza un fenotipo di crescita simile alla controparte non tossico 25Q. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Immagini fluorescenti rappresentative di Httex1 fluorescente fusioni in lievito. Lievito esprimendo 25Q o 72Q Httex1 fusa a ymsfGFP o yomTagBFP è stato coltivato in glucosio (controllo) o media di galattosio (indotta da polyQ) durante la notte e imaged con un microscopio confocale. Mentre l'espressione 72Q-ymsfGFP provoca una forte polyQ l'aggregazione di proteine, 72Q-yomTagBFP Visualizza un segnale citoplasmatico diffuso simile alla controparte non tossico 25Q. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Rappresentante dot blot analisi dell'espressione di fusione fluorescentiex1 Htt in lievito. Lievito esprimenti 25Q, 46Q, 72Q o 103Q Httex1 fusa alla PCP era coltivata in media di galattosio (indotta da polyQ) durante la notte e trattato per analisi di dot blot. Quintuplo diluizioni dei lisati cellulari vengono visualizzate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

In questo articolo, vari metodi per misurare l'aggregazione di Httex1 polyQ espansioni e loro effetto sulla crescita del lievito sono stati impiegati come un modello per studiare come i diversi fluorescente proteine alterano i loro soci di fusione nel contesto del reporter fluorescenti . Usando una variante GFP (ymsfGFP) come controllo positivo, abbiamo mostrato che questo rileva cambiamenti significativi nella tossicità di poliQ e aggregazione tra i diversi tag fluorescente e consente un confronto diretto e rapido tra le prestazioni di fusione di polyQ-FP contro GFP-etichettato costrutti16,19.

Mentre il presente protocollo si concentra su proteine fluorescenti, varie parti del protocollo potrebbero essere facilmente adattati per testare gli effetti di altri tag di proteina. Inoltre, il presente protocollo impiega vettori centromerica basso-copia lievito che possono variare in termini di numero di copie (in genere uno o due copie) presente in cellule25. Utilizzando vettori integranti per garantire un'espressione uniforme in condizioni sperimentali potrebbe ovviare a questo problema. Mentre questo protocollo è stato ottimizzato per l'utilizzo in background W303, possono essere impiegati altri ceppi di S. cerevisiae . Tuttavia, suscettibilità alla tossicità polyQ dovrebbe essere determinata utilizzando i vettori ymsfGFP-etichetta prima di progettare nuovi costrutti. In alcuni casi, può essere opportuno utilizzare vettori di alta-copia (2 µ) per generare un difetto di crescita significativa. Si consiglia inoltre di testare più isolati dopo la trasformazione del lievito con vettori di poliQ per evitare la selezione spontanee soppressori mostrando una tossicità ridotta polyQ. Della nota, il W303 lievito ceppo26 è solitamente utilizzato in quanto è più sensibile alla tossicità di poliQ di altri derivati S288C, come BY4741/BY474227, consentendo una più ampia gamma di fenotipi di crescita. D'importanza, ceppi impiegati per l'analisi di questa bisogno di portare la proteina prionica Rnq1 poiché le cellule Δ di rnq1non Mostra polyQ tossicità e aggregazione28. È anche importante utilizzare Httex1 costrutti che trasportano il tag di bandiera del amminico-terminale e manca il dominio ricco di prolina. Altre variazioni del disegno di fusione possono alterare tossici fenotipi15. Infine, l'induzione dell'espressione di fusione polyQ in contenenti galattosio media è un passo fondamentale del protocollo21. Durante il trasferimento di cellule da glucosio e galattosio contenente media, è importante lavare le cellule almeno tre volte con acqua sterile per eliminare tutte le tracce di glucosio che potrebbe contribuire a reprimere l'induzione del promotore Gal129. Quando eseguire dosaggi spotting, coltivando le cellule durante la notte in media di galattosio per indurre l'espressione della fusione può esacerbare il fenotipo tossico della fusione 72Q e aiutare a discriminare cambiamenti nella crescita attraverso diverse fusioni16.

Come una limitazione, gli studi precedenti non hanno rispettato gli effetti differenziali tra una versione nonmonomeric della PCP (un derivato GFP) e ymsfGFP16. Così, almeno per le varianti di GFP, questo test non può essere sufficientemente sensibile per discriminare tra varianti monomerici e oligomerici, evidenziando la necessità di integrare il polyQ tossicità dosaggi con altri metodi standard, come l'OSER dosaggio13 e analisi biochimica9,10,11,12 che può valutare direttamente l'oligomerizzazione. Inoltre, si deve osservare che FPs possono comportarsi in modo diverso in lievito rispetto ai saggi in vitro o la loro espressione in altri organismi23.

Collettivamente, questi metodi permettono ai ricercatori di caratterizzare il nuovo FPs rapidamente e misurare il loro effetto sul loro partner di fusione. In futuro, questo protocollo consentirà lo screening rapido di nuovi derivati di FPs precedentemente caratterizzati per identificare i mutanti che si comportano analogamente alle varianti GFP, che sono ancora la misura aurea per i reporter della FP. Mentre questo protocollo si concentra su proteine fluorescenti, può essere facilmente adattata allo schermo per gli effetti di altri tag codificato geneticamente, ad esempio SNAP-tag30 e SunTag31.

In conclusione, questo protocollo fornisce un'analisi rapida e facilmente scalabile per consentire ulteriore caratterizzazione della nuova generazione di FPs e altri tag codificato geneticamente per guidare la ricerca nella progettazione di proteine di fusione.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo studio è supportato da una sovvenzione di funzionamento da istituti canadesi per ricerca di salute M.L.D e P.L. Il lavoro qui presentato è supportato da un John R. Evans Leader Fund award della Fondazione canadese per l'innovazione e un corrispondente fondo del fondo di ricerca di Ontario per P.L. Y.J. è supportato da un master alla borsa di studio di dottorato trasferimento dal preside della scuola Schulich di M edicine e odontoiatria presso l'Università del Western Ontario. S è supportato da una borsa di studio di dottorato di ricerca in Canada ALS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-alpha Competent E. coli (High efficiency) New Englanfd Biolab C2987
SpeI-HF New Englanfd Biolab R3133 High fidelity enzymes are preferred
SalI-HF New Englanfd Biolab R0138 High fidelity enzymes are preferred
Agarose Fisher Scientific BP160
LB-Agar Fisher Scientific BP1425
LB-Broth Fisher Scientific BP1426
Ampicilin Fisher Scientific BP1760
PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase Agilent Technologies 600382
EPOCH2 microplate spectrophotometer BioTek Instruments inc EPOCH2TC
Yeast Pin Replicator V&P Scientific inc. VP407AH
SPI imager S&P Robotics inc. spImager-M
Zeiss LSM 800 confocal with AryScan Carl Zeiss Microscopy LSM 800
8 well Lab-Tek imaging chambers Fisher Scientific 12565470
Bio-Dot apparatus Bio-Rad 1706545
Chemi Doc XRS+ Bio-Rad 1708265
anti-FLAG M1 antibody Sigma-Aldrich F3040
Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody Thermo  A32727
Plasmid MiniPrep Kit Fisher Scientific K0503
Plasmid Gel extraction Kit Fisher Scientific K0831
PCR Purification Kit Fisher Scientific K0702
Prizm GraphPad N/A
TAE (Tris-Acetate-EDTA) Fisher Scientific BP13354

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
  3. Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design. Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).
  4. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
  5. Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nature Communications. 6, 7670 (2015).
  6. Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).
  7. Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
  8. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  9. Pédelacq, J. -D., et al. Engineering soluble proteins for structural genomics. Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).
  10. Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).
  11. Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).
  12. Pédelacq, J. -D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).
  13. Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
  14. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).
  15. Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).
  16. Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions. Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).
  17. Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington's disease. Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).
  18. Gusella, J. F., MacDonald, M. E. Huntington's disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens. Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).
  19. Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations]. F1000Research. 7, 1242 (2018).
  20. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  21. Duennwald, M. L. Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation. Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).
  22. Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).
  23. Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae. Plos One. 8 (7), e67902 (2013).
  24. Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).
  25. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
  26. Thomas, B. J., Rothstein, R. Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA. Cell. 56 (4), 619-630 (1989).
  27. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
  28. Meriin, A. B., et al. toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).
  29. Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156 (1), 119-122 (1995).
  30. Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
  31. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).

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Jiang, Y., Di Gregorio, S., Albakri, M. B., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast. J. Vis. Exp. (141), e58748, doi:10.3791/58748 (2018).

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