Summary
この資料では、蛍光タンパク質凝集の効果と蛍光レポーターのコンテキストで新しく, 蛍光タンパク質の迅速な評価のための誤って折りたたまれたポリグルタミン拡張の毒性を評価するためにプロトコルについて説明します。
Abstract
蛋白質のローカリゼーションと生細胞イメージングを用いた人身売買の調査、研究者は、しばしば蛍光レポーターに興味の彼らの蛋白質の融合に依存します。遺伝的に符号化された蛍光蛋白質 (FPs) の常に進化するリストは、それは蛍光融合設計に来るときいくつかの選択肢を持つユーザーを示します。各 FP は、結果として得られる蛍光融合の生化学的な携帯電話、および機能のプロパティに影響を与えることができます特定の光学的・生物物理プロパティを持ちます。たとえば、いくつかの FPs はフュージョン パートナーの機能を阻害する影響を受けやすい無指定のオリゴマーを形成する傾向があります。残念ながら、少数の方法だけは、FPs の蛍光レポーターの動作への影響をテストする存在します。ここでは、出芽酵母出芽酵母におけるポリグルタミン (polyQ) 毒性の試金を使用して FPs の影響を迅速に評価できるようにする簡単な方法をについて説明します。PolyQ 拡大 huntingtin 蛋白質は、拡張の huntingtin が有毒なオリゴマーと封入体に集約 (HD)、ハンチントン病の発症に関連付けられます。集約と酵母 polyQ 展開の毒性、蛍光タグ、FPs の動作への影響を研究する理想的な実験プラットフォーム提供の存在を含め、polyQ 地域を並べる順序に大きく依存、フュージョン パートナー。
Introduction
オワンクラゲ1、遺伝子にエンコードされた FPs の広いパレットから緑色蛍光タンパク質 (GFP) の初期特性が開発されているので同時にローカライズし、追跡する細胞生物学者が複数にできます。生活イベント/タンパク質は細胞2,3です。FPs は、サンゴとしたがって、彼らのそれぞれの蛍光スペクトルを超えて広く流用表示特定生物物理プロパティにクラゲから複数の有機体から派生します。これらのプロパティには、明るさには、光安定性、2,4他の間で oligomerize する傾向が含まれます。適切なタグの選択の重要な側面は、単量体の FPs を選択する不適切な相互作用と融合パートナーの機能の変化を最小限に抑え、レポーターの効率を最大化するために、蛍光レポーターを設計するとき、細胞内コンパートメント4,5,6を与えられました。GFP、時間をかけて、進化されているフュージョン パートナー5,7、8、蛍光タグの影響を最小限に抑えるため、FP の新しい亜種を実行と比較してどのように GFP のまま評価することは困難です。
FPs の動作を特徴付けるいくつかの方法が存在します。それらのほとんどは、超遠心法などの生化学的アプローチを使用して FPs の生物物理特性のテストを含むし、ゲルろ過プロトコル9,10、11,12。このようなメソッドがあるのままなセルの動作に少し洞察力を提供するソリューションで精製された FPs を使用して警告。組織の円滑な小胞体 (オゼ) 試金提供の開発生活 oligomerize FPs' 傾向の定量的評価細胞13発現 FPs に小胞体尿細管を再編成する能力をテストすることによってオゼ渦巻き14。この手法は、GFP のモノマー ・ オリゴマーのバリエーション、および他の FPs の間の変更を正常に検出できます。主一時的に transfected セルで過剰発現に依存し、定量、画像解析を時間がかかること、自動データ収集および解析ワークフロー技術を採用しない限り、します。
これらのアプローチを補完するために酵母15,16毒性に関する蛍光タグの効果と polyQ 展開の集計の活用を試金を設立しました。以上 36 polyQ ストレッチの拡大は huntingtin 蛋白質 (Htt) がハンチントン病17,18と関連付けられている遺伝子の最初のエクソン内で繰り返されます。拡張 Httex1ミスフォールド Htt タンパク質が重度の成長障害に結合の強い凝集酵母で発現。興味深いことに、これらの表現型は強く FPs15,16を含む polyQ ストレッチを並べる順序によって影響されます。それは FPs のさまざまなプロパティも差動酵母 polyQ 毒性に影響を与えることができます合理化されました。確かに、GFP のような FPs と比べると、赤の蛍光タンパク質とその進化形態を示している減らされた毒性と集計16。この原稿は、次世代 FPs の polyQ 毒性と酵母の凝集の効果を評価するために詳細なプロトコルを提供します。この試金は以前の特徴と並行使用できる FP の亜種の迅速かつ潜在的高コンテンツ分析新しい FPs の最適な評価方法評価方法彼らは GFP と比較して実行できます。
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Protocol
1. 新しい蛍光タグ Httex1酵母式の報道記者の世代
注: このセクションによって変更されているプロトコルから江ら16と Albakriら19。
- 蛍光タンパク質または PCR によって関心をコードする配列を増幅するプライマーを設計します。前方のプライマーは、制限酵素消化 (GATC) 中に続いて SpeI 制限サイト (ACTAGT) と興味の蛍光タンパク質遺伝子の ATG (ATG を除く) の下流 20 拠点を支援するリーダーのシーケンスを含める必要があります。逆のプライマーは、続いてサリ制限サイト (GTCGAC) と逆の補数 (stop を含む) FP シーケンスの停止コドン上流 20 拠点のリーダー シーケンス (GATC) を含める必要があります。
- 次の設定で、たちを使用して PCR の反作用を実行手順 1.1 で設計したプライマーを使用して: 95 ° C、1 分および 30 のサイクル 95 ° C で熱 s、60 ° C、30 秒と 2 分キロバイトごとに PCR の製品のための 72 ° C。18 サイクルを実行することは、十分です。
- Agarose のゲル (トリス酢酸 EDTA は 0.5%) の PCR の反作用を実行します。予想される製品サイズに対応するシングル バンドする必要があります。ゲル精製キットを使用してフラグメントを分離します。
- このプロトコルは、25 (無毒) を運ぶ Httex1ベクトルと 72 polyQ を繰り返す (HD 関連、強力な集計を表示する)。PCR のフラグメントと 37 ° C で 3 時間 SpeI とサリの制限の酵素とベクトルの両方をダイジェストします。
- 手順 1.3 のように agarose のゲルを実行することによって消化されたベクトルを浄化します。
- PCR 精製キットを使用して消化の PCR のフラグメントを浄化します。
- 結果として得られる消化液の PCR のフラグメントを縛る、p415-GAL1-フラグ-25/72QpolyQ プラスミド1 T4 リガーゼ (室温で 1 h) を使用して。10 μ L 反応 (T4 酵素の 1 μ L、10 X バッファーの 1 μ L、6 μ L の PCR のフラグメント、およびベクトルの 2 μ L) を使用します。
- 大腸菌の 50 μ L に ligation の反作用の 2 μ L を変換-有能なセルと 30 分間氷の上にそれらを孵化させなさい。その後、熱ショック 30 42 ° C で細胞 s の追加 SOC 伸長メディアの 1 mL とシェーカーで 1 h の 37 ° C で孵化させなさい。100 μ g/mL アンピシリンを含む LB 寒天培地プレート上の反応の 200 μ L をプレートします。37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。
- 3 つの個々 の細菌のコロニーを選択、一晩シェーカーで 37 ° C で 100 μ g/mL アンピシリンを含む流体培養基 LB の 3 mL でそれらを成長し、プラスミド プラスミド精製キットを使用して DNA を抽出します。
- 500 の消化によってプラスミッドをチェック 37 ° C および実行 agarose のゲル (トリス酢酸 EDTA は 0.5%) の反応で 1 h の SpeI とサリの制限酵素を用いた DNA の ng。ベクター (〜 7 kb) と挿入の右のサイズで 2 つのバンドをする必要があります (サイズは興味の遺伝子によって異なります)。その後、シーケンスによってプラスミッドを確認します。
- P415-GAL1-フラグ- polyQ FP プラスミド酵母 W303 標準酵母変換プロトコル2を次に変換します。
2. スポッティング アッセイ
- ストリーク酵母は、炭素源としてブドウ糖を酵母選択メディア (合成を完了-SC ロイシンなし) を含む寒天培地プレート上の任意の FP が付いたキャリング 25Q/72Q を複製します。同時にまた 25Q/72Q-ymsfGFP 肯定的な制御として使用するを連勝します。
注: 25Q/72Q 構造蛍光タグが含まれていない毒性はなく、ネガティブ コントロールとして使用できます。 - 2-3 d のための 30 の ° C でプレートを孵化させなさい。
- プレートから最大 3 つのシングル コロニーを選択します。
- 炭素源として 2% グルコースを添加した SC の 5 mL を接種します。
- 一晩カルチャごとの 200 μ L をペレットし、洗って 3 x 滅菌蒸留水します。
- 2% ガラクトース polyQ 融合発現を誘導するために炭素源として SC 培地で細胞を再懸濁します。メディアが 30 ° c 管回転で一晩ガラクトースを孵化させなさい。コントロールとしてグルコースを含むメディアを使用してこの手順を繰り返します。
- 次の朝、600 の光学濃度に細胞の密度を均等化滅菌 96 ウェル プレートで SC メディアの 0.2 に 100 μ L の nm (外径600)。
- 4 つの準備に次もメディアの 80 μ L にも前からサンプルの 20 μ L 分注による滅菌水で各サンプルの 5 倍希釈。
- 選択式ナンバー プレート (グルコースやガラクトースを含む) に細胞を発見し, 2 d の 30 ° C で酵母の固定ツールを使用します。
- 画像ドキュメント機器とプレートのイメージです。
3. 液体培養の細胞の成長の定量化
- このプロトコルの次の手順 2.1 2.5、細胞培養を準備します。
- 分光光度計を用いた OD600を測定します。
- 96 ウェル プレートでメディアの 0.1 で 300 μ L の OD600細胞を希釈します。
- 3 通では、各サンプルを実行します。
- 振動機能を持つプレート リーダー/インキュベーターでプレートを孵化させなさい。600 サンプル、30 ° C の温度、吸光度の数値を設定 nm、24 h 実験と連続振動モードを選択し、15 分の測定間隔の長さ。
- 成長曲線を作成して科学的グラフ作成ソフトウェアを使用して曲線の下の領域を定量化します。グラフパッド プリズム 7 をお勧めします。3 つのレプリケーション値を XY テーブルにデータを貼り付けます。成長曲線は、左側にある [グラフ] フォルダーの下に表示されます。曲線下面積を定量化するには、左上で分析を選択し、 XY 解析の曲線下の領域をクリックします。
4. 蛍光顕微鏡
- このプロトコルの次の手順 2.1 2.5、細胞培養を準備します。
- 10 セルを希釈 8 ウェル イメージング室に各サンプルの成長メディアと転送 200 μ で x。
- 室温で 63 X 計画 Aprochromoat 目的 (1.4 NA) を搭載した共焦点顕微鏡を用いた細胞をイメージします。
注: 共焦点の顕微鏡の使用はオプションです。標準的な広視野蛍光顕微鏡を使用もできます。 - 最適な画像の取得のピンホールとレーザー パワーを調整します。72Q 集計はディフューズ 25Q 信号よりはるかに明るいので、よく蛍光信号の飽和を避けるために異なるプラスミド間別の取得の設定を使用する必要があります。
- ImageJ20または別の画像処理ソフトウェアを使用して画像を処理します。この手順では、表示の集計を手動で計算できる細胞の割合が望まれます。
5. ドットのしみ
メモ: このプロトコルでドットのしみは蛋白質の表現のレベルを調べるため使用されます。このプロトコルの次の手順 2.1 2.5、細胞培養を準備します。
- 換散バッファー (100 mM トリス、pH 7.5; 200 mM の NaCl; 1 mM EDTA; 5% グリセロール、1 mM ジチオトレイトール [DTT]) でガラス製のビーズを使用して蛋白質の lysates を生成します。プロテアーゼ阻害剤、4 mM 特異フッ化物 (PSMF) とプロテアーゼ阻害剤のカクテルを直接使用する前に追加します。一晩の文化の 5 mL をペレットし、ガラスビーズの 200 μ L、200 μ L の換散バッファーのでそれを再懸濁します。12 ラウンドの渦 30 s。4 ° C 10 分で 12,000 × gで遠心し、上清を収集します。
- 総蛋白の濾過装置を用いた硝酸セルロースの膜に同量をスポットします。PBS で膜を prewet し、装置を組み立てます。真空源に接続し、ネジが締まっていることを確認します。真空をオンにし、重力によって膜サンプル フィルター。
- PBS-0.05 %tween/5% 無脂肪牛乳の膜をブロックします。
- 4 ° C で一晩一次反フラグ抗体と膜をインキュベートします。モノクローナル抗フラグ M1 をお勧めします。
- 膜 3 を洗って 10 分 PSB-0.05% トゥイーンの x。
- 膜蛍光に分類された二次抗体 (抗マウス IgG) PBS-0.05 %tween/5% 無脂肪牛乳に室温で 1 時間インキュベートします。
- 膜 3 x 10 分 PSB-0.05% トゥイーンを洗います。
- 画像 - イムノブロット ドキュメント システムを使用してしみ。
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Representative Results
FPs プロパティを持つ異なる生物物理 oligomerize、傾向を含む蛍光レポーターのコンテキストでその融合パートナーの行動に影響を与えることができます。このプロトコルでは、有毒な polyQ 展開に複数 FPs を融合することができます簡単な方法について説明します。PolyQ 毒性は並ぶ polyQ ストレッチ15シーケンスに依存、ので、この試金は蛍光 polyQ 融合記者 (図 1) の迅速かつ直接比較を可能します。HD-関連付けられている polyQ 長さ (25Q) ネガティブ コントロールとして使用され、有意な毒性または集計15,16,21,22が表示されません。強い成長阻害と polyQ 凝集を含む HD のような表現型を取得する 72Q を採用します。重要なは、シーケンスを符号化 Httex1は欠如 polyQ ストレッチに続くプロリン豊富なドメインを採用しました。プロリン豊富なドメインの存在下で Httex1は酵母15に有害ではないです。この分析では、酵母に最適化された単量体バリアント superfolder GFP12 (ymsfGFP)16の融合した Httex1は上記16として肯定的な制御として使用されます。構成要素には、Httex1の N 末端のフラグ エピトープ タグも含まれます。これにより、同じ抗体 (抗フラグ) 生化学分析のための別の融合の検出。酵母に最適化された TagBFP2 の証拠-の-原則として、融合した 72Q Httex1 (yomTagBFP2)23は発生しないことを示す寒天版でどちらかのスポットのアッセイまたは液体メディア (図 2) の成長によって測定される成長の遅い性質蛍光タグの細胞 polyQ 膨張挙動を妨げることができます確かに。
蛍光顕微鏡を用いた蛍光 polyQ 融合の集計を評価できます。72Q ymsfGFP 25Q と比較して大幅な集計が表示されます。ただし、72 yomTagBFP 蛍光シグナルは細胞質 (図 3) を通じて拡散。ほとんどの場合、同じイメージの取得の設定を使用する勧めはしません (電力、レーザー露光時間) 25Q と 72Q の両方の画像を取得します。72Q 発現細胞の凝集体が拡散 25Q 信号よりはるかに明るいです。したがって、72Q 画像を取得するために使用するイメージングの条件下では拡散 25Q 信号または表示されませんが非常に弱い可能性があります。適正な取得設定は、72Q 発現細胞のイメージング中に飽和状態を最小限に抑えるためにも適用する必要があります。
様々 な polyQ 融合の表現のレベルは、毒性影響が及ぶ。PolyQ 凝集体などの洗剤不溶性アミロイドは生化学的に研究し悪名高くにくいし、標準 SDS-PAGE による分析には適していません。したがって、ドット ・ ブロットは、蛋白質のレベルを評価するために実行できます。Httex1のアミノ末端終わりフラグ タグを含めることは FPs (図 4) の存在にもかかわらずすべての蛍光融合の検出を同時にことができます。また、半変化洗剤アガロース電気泳動 (SDD-年齢) は、polyQ オリゴマー16の形成を評価するために実行できます。詳しいプロトコルおよびビデオは、Halfmann、クイスト24にあります。
図 1: 酵母の polyQ 拡大蛋白質の毒性と集計に蛍光タンパク質タグの効果の分析のためのワークフロー ダイアグラム。最初に、FPs のイースト表現のベクトル フラグ タグ Httex1どちら 25Q をかくまっているのガラクトース誘導バージョンをエンコードにクローンを作成 (無毒) または 72Q (HD 関連付けられた集計、有毒) の繰り返し。クローン選択しシーケンスによって確認して、その後、酵母に変換します。ガラクトースを含むメディア、寒天のスポッティングのアッセイまたは液体の成長媒体のいずれかで次の polyQ 融合発現の誘導 polyQ 毒性を評価できます。PolyQ 凝集を蛍光顕微鏡で解析しました。異なる構造の相対式は、ドットのしみを使用して評価されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 代表的な増殖は、酵母で Httex1蛍光融合の表現に続く結果します。25Q または 72Q Httex1酵母融合 ymsfGFP、ブドウ糖 (コントロール) で培養した yomTagBFP またはガラクトース メディア (polyQ 誘起) 一晩や寒天または (B) に (A) を発見液体でさらに培養さまざまな条件下での成長を評価するメディア。72Q ymsfGFP は、重要な成長障害を誘発する、一方 72Q yomTagBFP は無毒 25Q 対応に似て成長表現型を表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 代表的な蛍光画像 Httex1蛍光融合酵母。酵母 25Q または 72Q Httex1融合 ymsfGFP または yomTagBFP はグルコース (コントロール) で培養したまたはガラクトース メディア (polyQ 誘起) 一晩し共焦点顕微鏡を用いたイメージングします。72Q ymsfGFP 式の結果強い polyQ 蛋白質の集合に、72Q yomTagBFP 拡散細胞質シグナル無毒 25Q 対応に似て表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 代表的なドットしみ Httex1蛍光融合発現酵母の解析です。酵母発現 25Q, 46Q, 72Q、または 103Q Httex1が CFP に融合された (polyQ 誘起) ガラクトース メディアで一晩培養し、ドットのしみの分析の処理します。セル lysates の 5 倍希釈液が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
この記事で Httex1 polyQ 展開と酵母の増殖への影響の集計を測定する様々 な試金がどのように異なる蛍光を勉強するはモデルとして採用されたタンパク質蛍光レポーターのコンテキストでその融合パートナーの変更.肯定的な制御として GFP バリアント (ymsfGFP) を使用して、示した polyQ 毒性と異なる蛍光タグ間集計の大幅な変化を検出とこに対して polyQ FP 融合パフォーマンスの直接かつ迅速な比較では、GFP 付けられた構造16,19。
この議定書は蛍光蛋白質に焦点を当てて、プロトコルのさまざまな部分が他の蛋白質のタグの効果をテストする容易に合わせることができます。さらに、この議定書は、コピー数 (一般に 1 ~ 2 コピー) セル25の存在の点で異なることができます低コピー酵母セントロメア ベクトルを採用しています。実験の条件統一式を確実に統合のベクトルを使用してこの問題を回避可能性があります。このプロトコルは、W303 バック グラウンドでの使用に最適化されています、一方他の酵母菌株を用いることができます。ただし、polyQ 毒性に対する感受性は、新しい構造を設計する前に ymsfGFP タグ ベクトルを使用して決定する必要があります。場合によっては、重要な成長の欠陥を生成する高コピー (2 μ) ベクトルを採用する適切なことがあります。また、polyQ 削減 polyQ 毒性を示す自発的な抑制を選択することを避けるためにベクトルを用いた酵母の形質転換に続く複数の菌株をテストすることをお勧めします。注、BY4741/BY474227, などの他の S288C 誘導体より polyQ 毒性に敏感である、酵母ひずみ26を用い W303 の成長表現型のより広い範囲のように。重要なは、このアッセイの系統はrnq1Δ セル polyQ 毒性と集計28に表示されませんので、Rnq1 プリオン蛋白質を運ぶ必要があります。また、アミノ末端のフラグの札を運ぶとプロリン豊富なドメインを欠けている Httex1の構成要素を使用することが重要です。フュージョン デザインの他のバリエーションは、有毒な表現型15を変更できます。最後に、ガラクトース含有 polyQ 融合発現の誘導メディアはプロトコル21の重要なステップです。グルコース-ガラクトース含むメディアからセルを転送する際、Gal1 プロモーター29の誘導を抑制に貢献できるブドウ糖のすべての痕跡を除去するために滅菌水で 3 回洗浄することが重要です。スポッティングの試金を実行すると、ガラクトース メディア融合の発現を誘導するために一晩で細胞を培養 72Q 融合の有毒な表現型が悪化して別融合16間で成長の変化を識別に役立ちます。
なお、以前の研究は CFP (GFP 誘導体) の nonmonomeric バージョンと ymsfGFP16の差動効果を観察しなかった。したがって、少なくとも GFP 系は、この試金ことができないモノマーとオリゴマーの亜種を区別するために十分に敏感な、polyQ を補完する必要性を強調毒性の試金の他の標準的な方法と、オゼ アッセイ13などと生化学的解析9,10、11,12重合を直接評価することができます。また、FPs が酵母の生体外の試金または他の有機体の23の発現と比較して異なる動作することができますに注意してください。
総称して、これらのメソッドは急速に新しい FPs を特徴付けるし、融合相手にその効果を測定する研究者を許可します。将来は、このプロトコルは GFP 変種があるまだ FP レポーターのためのゴールド スタンダード メジャーと同様突然変異を識別するために特徴付けられる以前の FPs の新規誘導体の迅速なスクリーニングを可能になります。このプロトコルは、蛍光タンパク質に焦点を当てて、それは簡単に、スナップ タグ30 SunTag31など、他の遺伝子にエンコードされたタグの効果は、画面を適応できます。
結論としては、このプロトコルは、迅速かつ簡単に拡張可能なアッセイ FPs と他の遺伝子にエンコードされたタグ融合タンパク質の設計研究を導くための新世代の更なる特徴解析を有効にするを提供します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
M.L.D. とパの健康研究のためカナダの機関から営業許可を支えこの研究ここで示した作業は革新のためのカナダの財団からジョン ・ r ・ エバンス リーダー基金受賞によってサポートされパ能にオンタリオ州研究基金から一致する基金に支えられて修士博士課程転送奨学金にシューリックスクール M 学校の長のedicine ・歯学部西部オンタリオの大学で。S.D.G. は、ALS カナダから博士課程奨学金によってサポートされます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-alpha Competent E. coli (High efficiency) | New Englanfd Biolab | C2987 | |
| SpeI-HF | New Englanfd Biolab | R3133 | High fidelity enzymes are preferred |
| SalI-HF | New Englanfd Biolab | R0138 | High fidelity enzymes are preferred |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160 | |
| LB-Agar | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB-Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Ampicilin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600382 | |
| EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments inc | EPOCH2TC | |
| Yeast Pin Replicator | V&P Scientific inc. | VP407AH | |
| SPI imager | S&P Robotics inc. | spImager-M | |
| Zeiss LSM 800 confocal with AryScan | Carl Zeiss Microscopy | LSM 800 | |
| 8 well Lab-Tek imaging chambers | Fisher Scientific | 12565470 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Chemi Doc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| anti-FLAG M1 antibody | Sigma-Aldrich | F3040 | |
| Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody | Thermo | A32727 | |
| Plasmid MiniPrep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| Plasmid Gel extraction Kit | Fisher Scientific | K0831 | |
| PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Prizm | GraphPad | N/A | |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Fisher Scientific | BP13354 |
References
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