Summary
Эта статья описывает протоколы оценить эффект от флуоресцентных белков на агрегации и токсичность смятых Хантингтона расширения для быстрой оценки недавно uncharacterized флуоресцентный белок в контексте флуоресцентные репортеров.
Abstract
Для расследования локализация протеина и торговли с использованием живых клеток исследователи часто полагаются на сплавляя их протеин интереса для флуоресцентных репортер. Постоянно развивающийся список генетически закодированный флуоресцентных белков (FPs) представляет пользователям с несколько альтернатив когда дело доходит до проектирования флуоресцентные фьюжн. Каждый FP имеет специфические оптических и биофизические свойства, которые могут повлиять на биохимические, сотовой и функциональных свойств результате флуоресцентные сплавливания. Например несколько кадров, как правило, образуют неспецифических олигомеров, которые подвержены препятствуют функции fusion партнером. К сожалению лишь несколько методов существуют для проверки воздействия на поведение флуоресцентные репортер FPs. Здесь мы опишем простой метод, который позволяет быстрой оценки влияния FPs с помощью анализов токсичности Хантингтона (polyQ) в многообещающий дрожжей Saccharomyces cerevisiae. PolyQ Расширенная гентингтина белки связаны с начала болезни Гентингтона (HD), где расширенной гентингтина объединяет в токсичных олигомеров и включение органов. Агрегирование и токсичность polyQ разложений в дрожжи сильно зависит от последовательности фланкируя polyQ региона, в том числе наличие флуоресцентные метки, обеспечивая тем самым идеальное экспериментальной платформы для изучения влияния FPs на поведение их Фьюжн-партнер.
Introduction
Поскольку были разработаны первоначальные характеристики зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) от Aequorea victoria1, широкая палитра генетически закодированный FPs, позволяя клеточных биологов одновременно локализации и отслеживания нескольких Сотовый события/белков в живых клетках2,3. FPs являются производными от нескольких организмов, от медуз кораллов, и таким образом, конкретные биофизические свойства отображения, которые отвлекают широко за пределами их соответствующих флуоресцентного спектра. Эти свойства включают яркость, светостойкость и тенденция к oligomerize среди других2,4. Выбор мономерных FPs является важным аспектом в выборе подходящего тега при проектировании флуоресцентный репортер, с тем чтобы свести к минимуму неуместные взаимодействий и изменения функции fusion партнером и максимизировать эффективность репортер для Учитывая сотовой отсек4,5,6. В то время как GFP со временем, была развивались, чтобы свести к минимуму эффект добавления флуоресцентные метки в fusion партнером5,7,8, как новые варианты FP выполняют по сравнению с GFP по-прежнему трудно оценить.
Существуют несколько методы характеризовать поведение FPs. Большинство из них включают проверку биофизические свойства FPs, с использованием биохимических подходов, таких как ultracentrifugation и гель фильтрации протоколов9,10,,1112. Такие методы имеют ограничение использования очищенной FPs в растворе, предлагая меньшюю проницательность в их поведение в нетронутым клеток. Развития предлагает пробирного организованной гладкой эндоплазменный ретикулум (Осер) количественной оценки FPs тенденция к oligomerize в живых клеток13 путем тестирования гиперэкспрессия FPs возможность реорганизовать эндоплазматического ретикулума трубочки в Осер мутовках14. Этот метод может успешно обнаружить изменения между мономерные и олигомерные варианты GFP и другие FPs. Однако она опирается главным образом на гиперэкспрессия временно transfected клеток, и количественный и анализа изображений может занять много времени, если техника принимается как автоматизированный сбор данных и анализ рабочего процесса.
Для того, чтобы дополнять эти подходы, мы создали assay который использует эффект флуоресцентные метки на токсичность и агрегации polyQ разложений в дрожжи15,16. Расширение стрейч polyQ с более чем 36 повторяет в течение первого экзона гена кодирования белок гентингтин (НТТ) связан с болезни Гентингтона17,18. Выражение расширенной Httex1 в дрожжей приводит к сильным агрегации смятых Htt белка, в сочетании с дефектом серьезный рост. Интересно, что эти фенотипы сильно повлияли последовательностей фланкируя polyQ стрейч, включая FPs15,16. Было рационализировано, что различные свойства FPs дифференциально могут повлиять на токсичность polyQ дрожжей. Действительно по сравнению с GFP-подобных FPs, красных флуоресцентных белков и их развивались форм показали снижение токсичности и агрегации16. Эта рукопись содержит подробный протокол для оценки эффекта следующего поколения FPs на polyQ токсичности и агрегации в дрожжей. Этот assay позволяет для быстрого и потенциально высоким содержанием анализа FP вариантов, которые могут использоваться параллельно с ранее охарактеризовать методы для оптимального характеристика новых FPs и может оценить, как они выполняют по сравнению с GFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. поколение новых дневно меткой Httex1 репортеров для выражения в дрожжи
Примечание: Этот раздел был изменен из протокола Цзян и др. 16 и Albakri и др. 19.
- Дизайн праймеров для того чтобы усилить последовательности кодирования флуоресцентный белок или интерес методом ПЦР. Форвард грунт должен включать лидер последовательности для оказания помощи энзима ограничения во время пищеварения (GATC), затем ограничение сайта SpeI (ACTAGT) и 20 баз по течению ГПТ (исключая ГПТ) флуоресцентного белка гена интереса. Обратный грунт должен включать лидер последовательности (GATC), следуют Сали ограничения сайта (GTCGAC) и обратный дополнение 20 основ вверх по течению стоп кодон FP последовательности (включая стоп).
- С помощью грунты, предназначенные на этапе 1.1, выполнять реакции PCR с помощью Термоциклер со следующими параметрами: тепла до 95 ° C за 1 мин и цикла при 95 ° C за 30 сек, 60 ° C за 30 s и 72 ° C 2 мин ПЦР продукта в КБ. Выполнение 18 циклов является достаточным.
- Запуск реакции PCR на геле агарозы (0,5% в трис ацетат ЭДТА). Там должны однодиапазонный соответствующий размер ожидаемого продукта. Изолируйте фрагмента, используя комплект для очистки гель.
- Протокол использует векторex1 Htt, перевозящих 25 (нетоксичный) и 72 (HD-связанных, отображение сильный агрегации) polyQ повторяется. Дайджест ПЦР фрагментов и вектор с SpeI и Сали энзимами ограничения для 3 ч при 37 ° C.
- Очищайте переваривается вектор, запустив его на геле агарозы как в шаге 1.3.
- Очищайте фрагмента переваривается ПЦР, используя комплект для очистки ПЦР.
- Перевязать результирующий фрагмент переваривается ПЦР и p415 -GAL1-флаг-25/72QpolyQ плазмид1 с помощью T4 лигаза (1 ч при комнатной температуре). Используйте 10 мкл реакции (1 мкл T4 фермента, 1 мкл 10 X буфер, 6 мкл ПЦР фрагментов и 2 мкл вектора).
- Преобразовать 2 мкл реакции перешнуровки в 50 мкл кишечнойпалочки-компетентных клеток и инкубировать их на льду за 30 мин. Затем теплового шока клетки при 42 ° C за 30 s. Добавить 1 мл SOC нарост СМИ и инкубировать при 37 ° C в течение 1 ч в шейкере. Плита 200 мкл реакции на табличке LB-агар, содержащий ампициллина 100 мкг/мл. Инкубируйте пластины при 37 ° C на ночь.
- Выберите три индивидуальных бактериальных колоний, выращивать их на ночь в 3 мл LB-бульон, содержащий 100 ампициллин мкг/мл при 37 ° C в шейкере и извлечь плазмидной ДНК, используя комплект для очистки плазмиды.
- Проверьте плазмида, переваривание 500 нг ДНК с помощью SpeI и Сали энзимов ограничения для 1 ч при 37 ° C и запуск реакции на геле агарозы (0,5% в трис ацетат ЭДТА). Там должно быть две полосы на правом размеров вектор (~ 7 КБ) и вставить (размер зависит от гена интереса). Затем проверьте плазмида путем sequencing.
- Трансформировать p415 -GAL1-флаг- polyQ-FP плазмид в штамм дрожжей W303 после преобразования протокола Стандартный дрожжи2.
2. Анализируя Assay
- Полоска дрожжи клоны проведение 25Q/72Q, отмеченных FP интерес на табличке агар, содержащие дрожжи выбор СМИ (синтетический завершить SC без лейцина) с глюкозой как источника углерода. В то же время также испещрять 25Q/72Q-ymsfGFP в качестве позитивного элемента управления.
Примечание: 25Q/72Q конструкций, которые не содержат флуоресцентные метки не являются токсичными и может служить в качестве отрицательного контроля. - Инкубируйте пластины при 30 ° C для 2-3 d.
- Выберите до трех колоний одного из пластины.
- Прививать 5 мл SC с 2% глюкозы как источника углерода.
- Пелле 200 мкл каждую ночь культуры и мыть его 3 x с стерильной дистиллированной воды.
- Ресуспензируйте клетки в средствах массовой информации SC, содержащий 2% галактозы как источника углерода побудить выражение polyQ сплавливания. Инкубируйте галактозы, СМИ в одночасье при 30 ° C в ротатор трубки. Как элемент управления повторите этот шаг с помощью средств массовой информации, содержащие глюкозу.
- Следующим утром, выравнивания ячеек плотности оптической плотности на 600 Нм (600OD) 0,2 в 100 мкл SC СМИ в стерильных 96-луночных пластины.
- Подготовка четырех пятикратный разведений в 80 мкл СМИ в следующем хорошо каждого образца с стерильной водой путем дозирования 20 мкл пример из предыдущего.
- Использование дрожжей, закрепление инструмента месте клетки на выборочной пластин (содержащие глюкозы или галактозы) и Инкубируйте на 30 ° C для 2 d.
- Изображения пластины с устройством документации изображения.
3. Количественная оценка роста клеток в культуре жидких
- Подготовьте культур клеток, следующие шаги 2.1-2.5 настоящего Протокола.
- Измерьте ОД600 с помощью спектрофотометра.
- Разбавьте клетки к ОД600 0.1 в 300 мкл СМИ в 96-луночных пластины.
- Запуск каждого образца в трех экземплярах.
- Инкубируйте пластину в тарелку читателя/инкубаторе с трястия возможностями. Задать количество образцов, температура 30 ° c, поглощения в 600 Нм, длина измерения интервалов 15 мин, и выберите режим непрерывной тряски и экспериментов до 24 ч.
- Создание кривой роста и количественно определить площадь под кривой с использованием научного графического программного обеспечения. 7 Призма GraphPad рекомендуется. Вставка данных в таблицу XY с тремя реплицировать значения. Кривая роста будет показан в папке графики на левой стороне. Чтобы измерить площадь под кривой, выберите анализировать в левом верхнем углу и нажмите площадь под кривой в XY анализы.
4. Люминесцентная микроскопия
- Подготовьте культур клеток, следующие шаги 2.1-2.5 настоящего Протокола.
- Разбавить клетки 10 x на рост средств массовой информации и передачи 200 мкл каждого образца 8-Ну тепловизионных камер.
- Изображение клетки с помощью конфокального микроскопа с 63 X плана Aprochromoat цели (1.4 NA) при комнатной температуре.
Примечание: Использование конфокального микроскопа является необязательным. Стандартный-поля флуоресцентный Микроскоп также могут быть использованы. - Отрегулируйте обскуры и лазерной энергии для приобретения оптимального изображения. Так, как агрегатов 72Q гораздо ярче, чем диффузные 25Q сигнал, то часто требуется использовать разные приобретения между различными плазмиды для того, чтобы избежать насыщения флуоресцентного сигнала.
- Обработка изображения с помощью ImageJ20 или другой обработки изображений программное обеспечение. На этом шаге требуемый процент клеток, что агрегат дисплея можно рассчитать вручную.
5. точка помаркой
Примечание: В настоящем Протоколе, точка помарка использована для изучения уровнях выражения протеина. Подготовьте культур клеток, следующие шаги 2.1-2.5 настоящего Протокола.
- Генерировать лизатов белка с использованием стекляруса литического буфера (100 мм трис, рН 7,5; 200 мм NaCl; 1 мм ЭДТА; 5% глицерина, 1 мм Дитиотреитол [DTT]). Добавление ингибиторов протеазы, 4 мм phenylmethylsulfonyl фторид (PSMF) и ингибитор протеазы, коктейль, непосредственно перед использованием. Пелле 5 мл на ночь культуры и Ресуспензируйте в 200 мкл стеклянные бусы и 200 мкл буфера lysis. Вихрь 30 s 12 раундов. Центрифуга на 12000 x g при 4 ° C на 10 мин и собирать супернатант.
- Пятно равное количество суммарных белков на нитроцеллюлозную мембрану с использованием микрофильтрации аппарат. Prewet мембрана с PBS и собрать аппарат. Подключитесь к источнику вакуума и убедитесь, что винты затянуты. Включите пылесос и пусть пример фильтра через мембраны под действием силы тяжести.
- Блокировать мембрану в PBS - 0,05% Tween/5% обезжиренного молока.
- Проинкубируйте мембрану с основного антитела анти флаг на ночь при 4 ° C. Рекомендуется моноклонального анти флаг M1.
- Промойте мембрану 3 x 10 мин с ОВО - 0,05% анимации.
- Проинкубируйте мембрану с дневно обозначенные вторичное антитело (анти мыши IgG) за 1 ч при комнатной температуре в PBS - 0,05% Tween/5% обезжиренного молока.
- Промойте мембрану 3 x 10 мин с ОВО - 0,05% анимации.
- Изображение блот с помощью системы документации immunoblot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FPs имеют различные биофизические свойства, включая их тенденция к oligomerize, которые могут повлиять на поведение их слияние партнеров в контексте флуоресцентные репортеров. Этот протокол описывает простой метод, где несколько кадров может быть сливается с разложения токсичных polyQ. Поскольку polyQ токсичность сильно зависит от последовательности фланкируя polyQ стрейч15, этот assay позволяет быстрое и прямое сравнение флуоресцентный polyQ фьюжн Репортеры (рис. 1). HD-неассоциированные polyQ Длина (25Q) используется как отрицательный контроль и не отображать значительную токсичность или агрегирования15,16,21,22. 72Q используется для получения HD-как фенотипы, включая сильный рост торможение и polyQ агрегации. Важно отметить, что Httex1 кодирования последовательности занятых отсутствие proline богатые домен, который следует за polyQ стрейч. Присутствии proline богатых домена Httex1 не токсичен в дрожжи15. В этот assay Httex1 , сливается с дрожжей оптимизированный вариант мономерных superfolder GFP12 (ymsfGFP)16 используется как позитивный элемент управления как описано16. Конструкции также содержат тег epitope флаг на N-го Httex1. Это позволяет обнаруживать различные сплавливания с же антитела (анти флаг) для биохимического анализа. В качестве доказательства из принципа 72Q Httex1 сливается с оптимизирован дрожжей TagBFP2 (yomTagBFP2)23 не приводит к медленный рост измеряется либо пятно анализов на плитах агара или роста в жидких средах (рис. 2), указывая, что природа флуоресцентные метки могут действительно препятствуют polyQ расширения функциональности в клетках.
Агрегирование сплавливания флуоресцентный polyQ может быть оценена с помощью флуоресцентной микроскопии. 72Q-ymsfGFP отображает значительные агрегирования по сравнению с 25Q. Однако 72-yomTagBFP флуоресцентного сигнала остается рассеянный всей цитоплазме (рис. 3). В большинстве случаев, не рекомендуется использовать те же настройки получения изображения (лазерные власти, выдержка) приобрести изображений 25Q и 72Q. Агрегаты в клетках 72Q-выражая гораздо ярче, чем рассеянный 25Q сигнал. Таким образом изображений условиях для получения изображения 72Q, рассеянный 25Q сигнал может появляются очень слаб или не видны на всех. Соответствующие приобретения параметры должны применяться также к минимуму насыщение во время съемки 72Q-выражая клеток.
Уровни выражения различных polyQ расплавы могут повлиять на токсичность. Моющее нерастворимые Амилоиды, таких, как агрегатов polyQ, сложно изучить биохимически и не подходят для анализа standerd SDS-PAGE. Таким образом точка кляксы могут выполняться для оценки уровня белка. Включение флага тега в конце амино terminus Httex1 позволяет обнаружение всех флуоресцентные сплавливания одновременно, несмотря на присутствие FPs (рис. 4). Кроме того для оценки формирования polyQ олигомеров16может выполняться полу денатурируя стиральный порошок очки геля агарозы (SDD-возраст). Подробный протокол и видео доступны в Halfmann и Линдквист24.
Рис 1: Диаграмма рабочего процесса для анализа эффекта тега флуоресцентный белок на агрегации и токсичность polyQ расширения белков в дрожжи. Во-первых, FPs клонируются в векторы выражения дрожжи кодирования галактозо индуцибельной версия флага тегами Httex1 укрывательство или 25Q (нетоксичный) или 72Q (HD-связанных, статистической обработки и токсичных) повторяется. Клоны отбираются и проверяются последовательности и, впоследствии преобразована в дрожжей. После инкубации в галактозо содержащих СМИ, пятнистость анализов на плитах агара или жидкие средства роста индукции polyQ фьюжн выражения можно оценить polyQ токсичности. PolyQ агрегат анализируемой флуоресцентной микроскопии. Относительное выражение различных конструкций оценивается с использованием дот блот. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Представитель роста пробирного результаты после выражения Httex1 флуоресцентные сплавливания в дрожжей. Дрожжи, выражая 25Q или 72Q Httex1 сливается с ymsfGFP или yomTagBFP был культивировали в глюкозы (управления) или галактозы средства массовой информации (polyQ индуцированной) на ночь и либо (A) заметили на плиты агара или (B) далее инкубируют в жидкости средства массовой информации для оценки роста в различных условиях. В то время как 72Q-ymsfGFP вызывает значительный рост дефекта, 72Q-yomTagBFP отображает рост фенотип, аналогичный нетоксичен 25Q коллегами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Представитель флуоресцентного изображения Httex1 флуоресцентные сплавливания в дрожжи. Дрожжи, выражая 25Q или 72Q Httex1 сливается с ymsfGFP или yomTagBFP был культивировали в глюкозы (управления) или галактозы средства массовой информации (polyQ индуцированной) на ночь и образы с помощью конфокального микроскопа. В то время как 72Q-ymsfGFP выражение приводит к сильным polyQ агрегации белков, 72Q-yomTagBFP отображает рассеянный цитоплазматических сигнал похож на нетоксичен 25Q коллегами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Представитель точка блот анализ Httex1 флуоресцентные фьюжн выражения в дрожжей. Дрожжи, выражая 25Q, 46Q, 72Q или 103Q Httex1 сливается с КФП культивировали в СМИ галактозу (polyQ индуцированной) на ночь и обрабатываются для анализа помаркой точка. Показываются пятикратный разведений lysates клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье, различных анализов для измерения агрегации Httex1 polyQ разложения и их влияние на рост дрожжей были заняты как модель для изучения как различные флуоресцентные белки изменяют их слияние партнеров в контексте флуоресцентные репортеров . С помощью GFP вариант (ymsfGFP) как позитивный элемент, мы показали, что это обнаруживает существенные изменения в polyQ токсичности и агрегации между различными флуоресцентные метки и позволяет для прямого и быстрого сравнения производительности фьюжн polyQ-FP против GFP-тегами конструкции16,19.
Хотя настоящий протокол посвящен флуоресцентных белков, различные части протокола может быть легко адаптирована для тестирования эффекты других тегов белка. Кроме того настоящий протокол использует низкий копия дрожжи прицентромерного векторов, которые могут меняться с точки зрения числа копии (обычно одного-двух копий) присутствуют в клетках25. С помощью комплексных векторов для обеспечения единообразного выражение во всех экспериментальных условиях могут обойти эту проблему. Хотя этот протокол был оптимизирован для использования на фоне W303, могут использоваться другие штаммы S. cerevisiae . Однако подверженности токсичность polyQ должна определяться с помощью векторов, ymsfGFP меткой, до разработки новых конструкций. В некоторых случаях может быть целесообразным использовать высокий копии (2μ) вектора, чтобы генерировать значительный рост дефекта. Также предлагается для тестирования нескольких изолятов после преобразования дрожжей с polyQ вектора, чтобы избежать выбора спонтанное Подавители показаны снижение polyQ токсичности. Следует отметить, W303, штамм дрожжей26 обычно используется как он более чувствителен к polyQ токсичности, чем другие S288C производные, такие как BY4741/BY474227, таким образом позволяет для более широкого круга роста фенотипов. Важно отметить, что штаммов, используемых для этот assay должны нести прионных белков Rnq1 с rnq1Δ клетки не отображать polyQ токсичности и агрегации28. Важно также использовать Httex1 конструкции перевозящих тег флаг амино терминал и не хватает proline богатых домена. Другие варианты дизайна Фьюжн может изменить токсичных фенотипов15. Наконец, индукции polyQ фьюжн выражения в галактозо содержащих средств массовой информации является важным шагом в протокол21. При передаче клетки от глюкозы до галактозы содержащих СМИ, важно мыть ячейки по крайней мере три раза с стерильной водой, чтобы уничтожить все следы глюкозы, которые могли бы способствовать подавляющ индукции Gal1 промоутер29. При выполнении пятнистость анализов, культивирования клеток на ночь в средствах массовой информации галактозы побудить выражение fusion может усугубить токсичных фенотипа 72Q фьюжн и помочь дискриминации изменений в росте через различные сплавливания16.
Как ограничение предыдущие исследования не соблюдать дифференциального воздействия между nonmonomeric версия CFP (производная GFP) и ymsfGFP16. Таким образом, по крайней мере для GFP вариантов, этот assay не может быть достаточно чувствительным, чтобы различать варианты мономерные и олигомерных, подчеркнув необходимость дополнения polyQ токсичности assays другие стандартные методы, такие как Осер пробирного13 и Биохимический анализ9,10,11,12 , могут непосредственно оценить олигомеризация. Кроме того следует отметить, что FPs может вести себя по-разному в дрожжи, по сравнению с в vitro анализов или их выражения в других организмов23.
Вместе эти методы позволяют исследователям быстро характеризуют новые FPs и оценивать их влияние на их fusion партнером. В будущем этот протокол позволит быстро скрининга новых производных ранее характеризуется FPs для выявления мутантов, которые ведут себя аналогично GFP варианты, которые по-прежнему являются мерой золотой стандарт для FP репортеров. Хотя этот протокол посвящен флуоресцентных белков, она может быть легко адаптирована к экрану для эффектов других генетически закодированный теги, такие как SNAP-тегов30 и31SunTag.
В заключение этот протокол обеспечивает быстрый и легко масштабируемый пробирного для дальнейшей характеризации нового поколения FPs и другие генетически закодированный теги для исследований в области синтеза белка дизайн.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование поддерживается операционной грант от канадской институтов для медицинских исследований M.L.D. и п.л. Работы, представленные здесь поддерживается Джон р. Эванс руководитель фонда премии от Канадского фонда для инноваций и соответствующий фонд от Фонда исследований Онтарио п.л. Y.J. поддерживается MSc PhD стипендии передачи от декан Шулиха Школа M edicine и стоматологии в университете Западного Онтарио. S.D.G. поддерживается PhD стипендии от ALS Канады.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-alpha Competent E. coli (High efficiency) | New Englanfd Biolab | C2987 | |
| SpeI-HF | New Englanfd Biolab | R3133 | High fidelity enzymes are preferred |
| SalI-HF | New Englanfd Biolab | R0138 | High fidelity enzymes are preferred |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160 | |
| LB-Agar | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB-Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Ampicilin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600382 | |
| EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments inc | EPOCH2TC | |
| Yeast Pin Replicator | V&P Scientific inc. | VP407AH | |
| SPI imager | S&P Robotics inc. | spImager-M | |
| Zeiss LSM 800 confocal with AryScan | Carl Zeiss Microscopy | LSM 800 | |
| 8 well Lab-Tek imaging chambers | Fisher Scientific | 12565470 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Chemi Doc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| anti-FLAG M1 antibody | Sigma-Aldrich | F3040 | |
| Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody | Thermo | A32727 | |
| Plasmid MiniPrep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| Plasmid Gel extraction Kit | Fisher Scientific | K0831 | |
| PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Prizm | GraphPad | N/A | |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Fisher Scientific | BP13354 |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
- Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design. Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nature Communications. 6, 7670 (2015).
- Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).
- Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Pédelacq, J. -D., et al. Engineering soluble proteins for structural genomics. Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).
- Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).
- Pédelacq, J. -D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).
- Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions. Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).
- Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington's disease. Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).
- Gusella, J. F., MacDonald, M. E. Huntington's disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens. Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).
- Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations]. F1000Research. 7, 1242 (2018).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
- Duennwald, M. L. Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation. Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).
- Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae. Plos One. 8 (7), e67902 (2013).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
- Thomas, B. J., Rothstein, R. Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA. Cell. 56 (4), 619-630 (1989).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
- Meriin, A. B., et al. toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).
- Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156 (1), 119-122 (1995).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
