Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Effekten av fluorescerande proteiner på Fusion Partners använder Polyglutamine toxicitet analyser i jäst

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58748
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Western Ontario, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Western Ontario

Summary

Denna artikel beskriver protokoll för att bedöma effekten av fluorescerande proteiner om sammanläggning och toxicitet av felveckning polyglutamine expansion för snabb utvärdering av en nyligen uncharacterized fluorescerande protein inom ramen av fluorescerande reportrar.

Abstract

För utredning av protein localization och handel med hjälp av levande cell imaging, forskare förlitar sig ofta på fusing deras protein av intresse för en fluorescerande reporter. Ständigt listan över genetiskt kodade fluorescerande proteiner (FPs) presenterar användare med flera alternativ när det gäller fluorescerande fusion design. Varje FP har särskilda optiska och biofysiska egenskaper som kan påverka de resulterande fluorescerande fusioner biokemiska, cellulära och funktionella egenskaper. Exempelvis flera FPs tenderar att bilda ospecifik oligomerer som är mottagliga för hindra på funktionen av fusion partner. Tyvärr finns bara några metoder för att testa effekterna av FPs på uppförandet av fluorescerande reportern. Här, beskriver vi en enkel metod som möjliggör en snabb bedömning av effekterna av FPs med polyglutamine (polyQ) toxicitet analyser i spirande jästen Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-utökade huntingtin protein är associerade med uppkomsten av Huntingtons sjukdom (HD), där den utökade huntingtin aggregerar till toxiska oligomerer och inkludering organ. Sammanläggning och toxicitet av polyQ expansioner i jäst är starkt beroende av de sekvenser som flankerar polyQ regionen, inklusive förekomsten av fluorescerande taggar, vilket ger en idealisk experimentell plattform för att studera inverkan av FPs på beteendet hos sina Fusion partner.

Introduction

Eftersom den ursprungliga karakteriseringen av grönt fluorescerande protein (GFP) från Aequorea victoria1, en bred palett av genetiskt kodade FPs har utvecklats, så att cellbiologer att lokalisera och spåra samtidigt flera cellulära händelser/proteiner i levande celler2,3. FPs härleds från flera organismer, från maneter till coral och därför kan specifika biofysiska egenskaper för bildskärm att avleda utförligt bortom deras respektive fluorescerande spektrum. Dessa egenskaper omfattar ljusstyrka, photostability och en tendens att oligomerize bland annat2,4. Att välja monomer FPs är en viktig aspekt i valet av en lämplig tagg när du utformar en fluorescerande reporter, för att minimera olämpliga interaktioner och förändringar av fusion partnerns funktion och maximera reporter effektivitet för en ges mobilfack4,5,6. Medan GFP, över tid, har utvecklats för att minimera effekten av att lägga till taggen fluorescerande till fusion partner5,7,8, hur nya FP varianter utföra jämfört med GFP är fortfarande svårt att bedöma.

Det finns några metoder för att karakterisera uppförandet av FPs. De flesta av dem omfattar försök biofysiska egenskaper för FPs med biokemiska metoder, såsom ultracentrifugering och gel filtrering protokoll9,10,11,12. Sådana metoder har förbehållet att använda renat FPs i lösning, som ger lite insikt i deras beteende i intakta celler. Utvecklingen av den organisera slät endoplasmatiska nätverket (OSER) test erbjudanden en kvantifierbar bedömning av FPs' tendensen till oligomerize i levande celler13 genom att testa överuttryckt FPs förmåga att omorganisera endoplasmatiska retiklet tubuli in OSER virvlar14. Denna teknik kan identifiera ändringar mellan monomer och Oligomera varianter av god Jordbrukarsed och andra FPs. Men det bygger mestadels på överuttryck i normalnivå transfekterade celler och den kvantifiering och bildanalys kan vara tidskrävande såvida inte tekniken antas som en automatisk datainsamling och analys arbetsflöde.

För att komplettera dessa närmar sig, etablerat vi en analysmetod som utnyttjar effekten av fluorescerande taggar på toxicitet och aggregering av polyQ expansioner i jäst15,16. Utbyggnaden av sträckan polyQ med mer än 36 upprepas inom den första exon gen kodning huntingtin proteinet (Htt) är associerad med Huntingtons sjukdom17,18. Uttrycket av utökade Httex1 i jäst resulterar i en stark aggregation av felveckning Htt protein kopplat till en kraftig tillväxt defekt. Intressant, är dessa fenotyper starkt influerad av de sekvenser som flankerar sträckan polyQ, inklusive FPs15,16. Det var rationaliseras att de olika egenskaperna hos FPs differentially kan påverka polyQ toxicitet i jäst. Faktiskt, det har visat en minskad toxicitet och aggregering16jämfört med GFP-liknande FPs, röd fluorescerande proteiner och deras utvecklade former. Detta manuskript ger ett detaljerat protokoll för att bedöma effekten av nästa generation av FPs på polyQ toxicitet och aggregering i jäst. Denna analys möjliggör en snabb och potentiellt hög-innehåll analys av FP varianter som kan användas parallellt med tidigare kännetecknas tekniker för optimal karakterisering av nya FPs och kan bedöma hur de utför jämfört med GFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. generering av ny Fluorescently taggade Httex1 reportrar för ett uttryck i jäst

Obs: Detta avsnitt har ändrats från protokollet av Jiang et al. 16 och Albakri o.a. 19.

  1. Design grundfärger att förstärka sekvensen kodning på fluorescerande protein eller ränta med PCR. Forward primer bör omfatta en ledare sekvens för att bistå den restriktionsenzym under matsmältningen (GATC), följt av en SpeI begränsning webbplats (ACTAGT) och 20 baser nedströms av de ATG (exklusive ATG) av fluorescerande protein genen av intresse. Reverse primer bör omfatta ledare sekvensen (GATC), följt av en SalI begränsning webbplats (GTCGAC) och det omvända komplementet av 20 baser uppströms av den stop kodon av FP sekvensen (inklusive stopp).
  2. Med hjälp av primers utformad i steg 1.1, utföra PCR-reaktionen med en termocykler med följande inställningar: värme till 95 ° C i 1 min och cykla i 95 ° C under 30 s, 60 ° C under 30 s och 72 ° C under 2 minuter per kB av PCR-produkten. Utför 18 cykler är riklig.
  3. Köra PCR-reaktionen på en agarosgel (0,5% i Tris-acetat-EDTA). Det bör ett enda band motsvarande förväntade Produktstorlek. Isolera fragmentet med en gel rening kit.
  4. Protokollet sysselsätter en Httex1 vektor bära 25 (giftfritt) och 72 (HD-associerad, visar en stark aggregation) polyQ upprepas. Smälta både PCR-fragmenten och vektorn med SpeI och SalI restriktionsenzym för 3 h vid 37 ° C.
  5. Rena smält vektorn genom att köra det på en agarosgel som i steg 1.3.
  6. Rena smält PCR-fragmentet med hjälp av en PCR-rening kit.
  7. Ligera resulterande smält PCR-fragmentet och p415 -GAL1-,flagg-25/72QpolyQ plasmider1 använda T4 ligase (1 h i rumstemperatur). Använd en 10 µL reaktion (1 µL T4 enzym, 1 µL 10 X buffert, 6 µL av PCR-fragmentet och 2 µL av vektor).
  8. Omvandla 2 µL av ligering reaktionen till 50 µL av Escherichia coli-behöriga celler och inkubera dem på is i 30 min. Sedan, heat-shock cellerna vid 42 ° C i 30 s. Lägg till 1 mL av SOC utväxt media och inkubera vid 37 ° C för 1 h i en shaker. Tallrik 200 µL av reaktionen på en LB-agarplatta innehållande 100 µg/mL ampicillin. Inkubera plattan vid 37 ° C över natten.
  9. Välj tre enskilda bakteriekolonier, växer dem över natten i 3 mL LB-buljong som innehåller 100 µg/mL ampicillin vid 37 ° C i en shaker och extrahera plasmiden DNA med hjälp av en plasmid rening kit.
  10. Kontrollera plasmiden genom att smälta 500 ng av DNA med restriktionsenzym SpeI och SalI för 1 h vid 37 ° C och kör reaktionen på en agarosgel (0,5% i Tris-acetat-EDTA). Det bör finnas två band på vektorn (~ 7 kb) och infoga rätt storlek (storlek varierar enligt gen av intresse). Kontrollera sedan plasmiden av sekvensering.
  11. Omvandla de p415 -GAL1-flagga- polyQ-FP plasmider in den jäst stam W303 efter en vanlig jäst omvandling protokoll2.

2. spotting Assay

  1. Strimma jästen kloner redovisade 25Q/72Q med ränta på en agarplatta som innehåller jäst urval media (syntetiska slutföra-SC utan leucin) med glukos som kolkälla FP etiketten. På samma gång, också strimma 25Q/72Q-ymsfGFP att fungera som en positiv kontroll.
    Obs: 25Q/72Q konstruktioner som inte innehåller en fluorescerande tagg är inte giftiga och kan fungera som negativ kontroll.
  2. Inkubera plattorna vid 30 ° C i 2-3 d.
  3. Välj upp till tre enda kolonier från plattan.
  4. Inokulera 5 mL SC kompletteras med 2% glukos som kolkälla.
  5. Pellet 200 µL av varje övernattning kultur och tvätta det 3 x med sterilt destillerat vatten.
  6. Att resuspendera cellerna i SC media som innehåller 2% galaktos som kolkälla att inducera uttrycket av polyQ fusioner. Inkubera i galaktos media över natten vid 30 ° C i en tube rotator. Som en kontroll, upprepa detta steg med hjälp av glukos-innehållande media.
  7. Nästa morgon, utjämna cell tätheterna till optisk densitet på 600 nm (OD600) 0,2 i 100 µL av SC media i en steril plattan med 96 brunnar.
  8. Förbereda fyra fivefold utspädningar av varje prov med sterilt vatten genom pipettering 20 µL av provet från föregående långt in 80 µL av media i nästa väl.
  9. Använd en jäst fästa verktyg att upptäcka cellerna på selektiv plattor (innehåller glukos eller galaktos) och inkubera vid 30 ° C under 2 d.
  10. Bild plattorna med en bild dokumentation enhet.

3. kvantifiering av celltillväxt i flytande kultur

  1. Förbereda cellkulturer, följande steg 2.1-2.5 i detta protokoll.
  2. Mäta den OD600 med en spektrofotometer.
  3. Späd cellerna till en OD600 av 0,1 i 300 µL av media i en plattan med 96 brunnar.
  4. Kör varje prov i tre exemplar.
  5. Inkubera plattan i en tallrik läsare/inkubator med skakningar kapacitet. Ange antalet prover, temperaturen vid 30 ° C, absorbansen på 600 nm, längden på experimenten till 24 h och mätning intervallen till 15 min och väljer det kontinuerligt skakningar läget.
  6. Skapa tillväxtkurvan och kvantifiera arean under kurvan med vetenskapliga grafritande programvara. Den GraphPad Prism 7 rekommenderas. Klistra in data i ett XY-bord med tre replikerar värden. Tillväxtkurvan visas under mappen grafer på vänster sida. Att kvantifiera arean under kurvan, Välj analysera överst till vänster och klicka på området under kurvan i XY analyser.

4. fluorescerande mikroskopi

  1. Förbereda cellkulturer, följande steg 2.1-2.5 i detta protokoll.
  2. Späd cellerna 10 x i tillväxt medier och överföring 200 µL av varje prov till 8-väl tänkbar kamrarna.
  3. Bild cellerna med confocal Mikroskop utrustat med en 63 X planerar Aprochromoat mål (1,4 NA) vid rumstemperatur.
    Obs: Användningen av confocal Mikroskop är valfritt. Ett standard wide-fältet fluorescerande Mikroskop kan också vara anställd.
  4. Justera pinhole och laser kraften för optimal bild förvärv. Eftersom 72Q aggregaten är mycket ljusare än den diffusa 25Q signalen, krävs det ofta att använda en annan förvärv inställning mellan de olika plasmidsna för att undvika mättnad av fluorescerande signalen.
  5. Bearbeta bilderna med ImageJ20 eller en annan bildbehandling programvara. I detta steg önskas procentandelen celler att displayen aggregat kan beräknas manuellt.

5. dot Blot

Obs: I detta protokoll används dot blot att undersöka protein uttrycksnivåerna. Förbereda cellkulturer, följande steg 2.1-2.5 i detta protokoll.

  1. Generera protein lysates med glaspärlor i lyseringsbuffert (100 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% glycerol, 1 mM Ditiotreitol [DTT]). Lägg till proteashämmare, 4 mM phenylmethylsulfonyl fluor (PSMF) och proteashämmare cocktail, direkt före användning. Pellets 5 mL av övernattning kultur och återsuspendera det i 200 µL glaspärlor och 200 μl lyseringsbuffert. Vortex 30 s för 12 omgångar. Centrifugera vid 12 000 x g vid 4 ° C i 10 min och samla supernatanten.
  2. Spot en lika stor mängd totala proteiner på en nitrocellulosa membran med en mikrofiltrering apparatur. Prewet membranet med PBS och Montera apparaten. Anslut till ett vakuum källa och kontrollera att skruvarna är åtdragna. Slå på vakuum och låt provet filtret genom membranet av gravitationen.
  3. Blockera membranet i PBS - 0,05% Tween/5% fettfri mjölk.
  4. Inkubera membranet med primär anti-Flag antikropp över natten vid 4 ° C. Den monoklonala anti flaggan M1 rekommenderas.
  5. Tvätta membranet 3 x 10 min varje med PSB - 0,05% Tween.
  6. Inkubera membranet med en fluorescently märkt sekundär antikropp (antimus IgG) för 1 h vid rumstemperatur i PBS - 0,05% Tween/5% fettfri mjölk.
  7. Tvätta membran 3 x 10 min med PSB - 0,05% Tween.
  8. Bild-blot använder ett system för dokumentation av immunoblot.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FPs har olika biofysiska egenskaper, inklusive deras tendens att oligomerize, som kan påverka beteendet hos sina fusion partners i samband med fluorescerande reportrar. Det här protokollet beskriver en enkel metod där flera FPs kan vara smält till giftiga polyQ expansioner. Eftersom polyQ toxicitet är starkt beroende av de sekvenser som flankerar polyQ stretch15, tillåter denna analys en snabb och direkt jämförelse av fluorescerande polyQ fusion reportrar (figur 1). En icke-HD-associerade polyQ längd (25Q) används som en negativ kontroll och visar inte signifikant toxicitet eller sammanläggning15,16,21,22. 72Q är anställd för att erhålla de HD-liknande fenotyper, inklusive stark tillväxt hämning och polyQ aggregation. Ännu viktigare, den Httex1 kodande sekvens anställd brist på prolin-rika domänen som följer polyQ sträckan. I närvaro av domänen proline-rika är Httex1 inte giftigt i jäst15. I denna analys används en Httex1 smält till en jäst-optimerade monomer variant av superfolder GFP12 (ymsfGFP)16 som en positiv kontroll som tidigare beskrivits16. Konstruktioner innehåller också en flagga epitop tagg vid N-terminalen av Httex1. Detta tillåter identifiering av de olika fusioner med samma antikropp (anti-Flag) för biokemisk analys. Som ett proof-of-principle, 72Q Httex1 smält till jäst-optimerade TagBFP2 (yomTagBFP2)23 inte resulterar i långsam tillväxt mätt antingen plats analyser på agarplattor eller tillväxt i flytande media (figur 2), vilket indikerar att arten den fluorescerande tagg kan faktiskt hindra polyQ expansion beteende i celler.

Sammanläggning av de fluorescerande polyQ fusioner kan bedömas med hjälp av fluorescerande mikroskopi. 72Q-ymsfGFP visar betydande aggregering jämfört med 25Q. 72-yomTagBFP fluorescerande signalen förblir emellertid diffust i hela cytoplasman (figur 3). I de flesta fall, det rekommenderas inte att använda samma bild förvärv inställningar (laser power, exponeringstid) att förvärva både 25Q och 72Q bilder. Aggregaten i 72Q-uttryckande celler är mycket ljusare än den diffusa 25Q signalen. Därför imaging villkor används för att förvärva 72Q bilder, kanske mycket svag diffust 25Q signalen visas eller inte syns alls. Lämpliga förvärv inställningar bör också tillämpas för att minimera mättnad under bildtagning 72Q-uttryckande cellerna.

Uttrycksnivåerna för de olika polyQ fusioner kan påverka toxiciteten. Tvättmedel-olöslig amyloid, såsom polyQ aggregat, är notoriskt svåra att studera biokemiskt och lämpar sig inte för en analys av standerd SDS-PAGE. Dot blotting kan därför utföras för att bedöma proteinnivåer. Införandet av taggen flagga i slutet av Httex1 amino terminus tillåter upptäckt av alla de fluorescerande fusioner samtidigt, trots närvaron av FPs (figur 4). Alternativt, semi denatureringen tvättmedel agaros gel-elektrofores (SDD-ålder) kan göras för att bedöma bildandet av polyQ oligomerer16. En detaljerad protokoll och video finns i Halfmann och Lindquist24.

Figure 1
Figur 1: arbetsflödesdiagram för analys av effekten av fluorescerande protein tag om sammanläggning och toxicitet av polyQ expansion proteiner i jäst. Först, FPs är klonade in jäst uttryck vektorer kodning en galaktos-inducerbara version av flagg-märkta Httex1 härbärgerat antingen 25Q (giftfritt) eller 72Q (HD-associerad, aggregering och toxiska) repetitioner. Kloner är utvalda och verifierade av sekvensering och därefter omvandlas i jäst. Efter induktion av polyQ fusion uttryck genom inkubation i galaktos-innehållande media, antingen tubkikare analyser på agarplattor eller tillväxt flytande media kan bedöma polyQ toxicitet. PolyQ aggregering analyseras av fluorescerande mikroskopi. En relativ uttryck för olika konstruktioner bedöms med hjälp av dot blot. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Representativa tillväxt analysens resultat efter uttryck för Httex1 fluorescerande fusioner i jäst. Jäst uttrycker antingen 25Q eller 72Q Httex1 smält till ymsfGFP eller yomTagBFP var odlade i glukos (kontroll) eller galaktos media (polyQ-inducerad) över natten och antingen (A) fläckig på agarplattor eller (B) inkuberas vidare i vätska Media att bedöma tillväxt på olika villkor. Medan 72Q-ymsfGFP inducerar en betydande tillväxt defekt, visar 72Q-yomTagBFP en tillväxt fenotyp liknar de giftfritt 25Q motsvarigheterna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Representativa fluorescerande bilder av Httex1 fluorescerande fusioner i jäst. Jäst uttrycker antingen 25Q eller 72Q Httex1 smält till ymsfGFP eller yomTagBFP var odlade i glukos (kontroll) eller galaktos media (polyQ-inducerad) över natten och avbildas med en confocal Mikroskop. Medan 72Q-ymsfGFP uttrycket resulterar i en stark polyQ protein aggregering, visar 72Q-yomTagBFP en diffust cytoplasmiska signal liknar de giftfritt 25Q motsvarigheterna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Representativa dot blot analys av Httex1 fluorescerande fusion uttryck i jäst. Jäst uttrycker 25Q, 46Q, 72Q eller 103Q Httex1 smält till GFP var odlade i galaktos media (polyQ-inducerad) över natten och bearbetas för dot blot analys. Fivefold utspädningar av det cell-lysates visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna artikel, olika analyser att mäta sammanläggning av Httex1 polyQ expansioner och deras inverkan på jäst tillväxt var anställda som en modell att studera hur olika fluorescerande proteiner förändrar deras fusion partners i samband med fluorescerande reportrar . Med en god Jordbrukarsed variant (ymsfGFP) som en positiv kontroll, visade vi att detta upptäcker betydande förändringar i polyQ toxicitet och aggregering mellan olika fluorescerande Taggar och möjliggör en direkt och snabb jämförelse av polyQ-FP fusion prestanda mot GFP-märkta konstruktioner16,19.

Medan detta protokoll fokuserar på fluorescerande proteiner, kunde olika delar av protokollet anpassas lätt till testa effekterna av andra protein taggar. Dessutom sysselsätter protokolls låg-kopia jäst centromeric vektorer som kan variera i form av kopia antalet (vanligtvis en till två kopior) närvarande i cellerna25. Med integrativ vektorer för att säkerställa ett enhetligt uttryck över experimentella förhållanden kunde kringgå detta problem. Medan detta protokoll har optimerats för användning i W303 bakgrunden, kan andra S. cerevisiae stammar vara anställd. Känslighet för polyQ toxicitet bör dock bestämmas med hjälp av ymsfGFP-taggade vektorerna före utforma nya konstruktioner. I vissa fall kan det vara lämpligt att anställa hög-kopia (2µ) vektorer till generera en betydande tillväxt defekt. Det föreslås också för att testa flera isolat efter jäst omvandlingen med polyQ vektorer att undvika att välja spontana dämpning visar en minskad polyQ toxicitet. Att notera, den W303 jäst stam26 används vanligen som det är mer känsliga för polyQ toxicitet än andra S288C derivat, såsom BY4741/BY474227, vilket möjliggör ett bredare utbud av tillväxt fenotyper. Ännu viktigare, behöver stammar som anställd för denna analys bära Rnq1 prionproteinet eftersom rnq1Δ celler inte visar polyQ toxicitet och aggregering28. Det är också viktigt att använda Httex1 konstruktioner bära taggen amino-terminal flagga och saknar proline-rika domänen. Andra varianter av fusion design kan förändra giftiga fenotyper15. Slutligen, induktion av polyQ fusion uttrycket i galaktos-innehållande media är ett kritiskt steg av protokoll21. När du överför celler från glukos till galaktos-som innehåller media, är det viktigt att tvätta cellerna minst tre gånger med sterilt vatten för att avlägsna alla spår av glukos som kan bidra till att undertrycka induktion av Gal1 arrangören29. När du utför tubkikare analyser, kan odla cellerna övernattning i galaktos media att inducera uttrycket av fusionen förvärra toxiska fenotypen av 72Q fusion och hjälpa diskriminera förändringar i tillväxt över olika fusioner16.

Som en begränsning iakttog tidigare studier inte differentiella effekter mellan en nonmonomeric version av GFP (en god Jordbrukarsed derivat) och ymsfGFP16. Således, åtminstone för god Jordbrukarsed varianter, denna analys kanske inte tillräckligt känslig för att diskriminera mellan monomer och Oligomera varianter, belyser behovet av att komplettera polyQ toxicitet analyser med andra vanliga metoder, såsom OSER assay13 och bioanalys9,10,11,12 som direkt kan bedöma oligomerisering. Det bör dessutom noteras att FPs kan bete sig annorlunda i jäst jämfört med in vitro- analyser eller deras uttryck i andra organismer23.

Sammantaget tillåter dessa metoder forskare att snabbt karakterisera nya FPs och mäta deras effekt på deras fusion partner. Detta protokoll kommer att i framtiden möjliggöra snabb screening av nya derivat av tidigare kännetecknas FPs att identifiera mutanter som beter sig på samma sätt till GFP varianter, som fortfarande är den gyllene standard åtgärden för FP reportrar. Medan detta protokoll fokuserar på fluorescerande proteiner, kan det lätt anpassas till skärmen för effekterna av andra genetiskt kodade taggar, t ex SNAPIN-tag30 och SunTag31.

Avslutningsvis ger detta protokoll en snabb och enkelt skalbar analysen för att aktivera ytterligare karakterisering av den nya generationen av FPs och andra genetiskt kodade taggar för att vägleda forskning i fusion protein design.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Denna studie stöds av ett driftsbidrag från den kanadensiska institut för hälsa forskning till M.L.D. och P.L. Arbetet presenteras här stöds av en John R. Evans ledare Fund award från den kanadensiska Institutet för Innovation och en matchande fond från Ontario forskningsfonden till P.L. yj stöds av civilingenjör till PhD överföring stipendium från dekanus för den Schulich School av M läkemedlet och tandvård vid The University of Western Ontario. S.D.G. stöds av ett PhD stipendium från ALS Kanada.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-alpha Competent E. coli (High efficiency) New Englanfd Biolab C2987
SpeI-HF New Englanfd Biolab R3133 High fidelity enzymes are preferred
SalI-HF New Englanfd Biolab R0138 High fidelity enzymes are preferred
Agarose Fisher Scientific BP160
LB-Agar Fisher Scientific BP1425
LB-Broth Fisher Scientific BP1426
Ampicilin Fisher Scientific BP1760
PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase Agilent Technologies 600382
EPOCH2 microplate spectrophotometer BioTek Instruments inc EPOCH2TC
Yeast Pin Replicator V&P Scientific inc. VP407AH
SPI imager S&P Robotics inc. spImager-M
Zeiss LSM 800 confocal with AryScan Carl Zeiss Microscopy LSM 800
8 well Lab-Tek imaging chambers Fisher Scientific 12565470
Bio-Dot apparatus Bio-Rad 1706545
Chemi Doc XRS+ Bio-Rad 1708265
anti-FLAG M1 antibody Sigma-Aldrich F3040
Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody Thermo  A32727
Plasmid MiniPrep Kit Fisher Scientific K0503
Plasmid Gel extraction Kit Fisher Scientific K0831
PCR Purification Kit Fisher Scientific K0702
Prizm GraphPad N/A
TAE (Tris-Acetate-EDTA) Fisher Scientific BP13354

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
  3. Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design. Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).
  4. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
  5. Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nature Communications. 6, 7670 (2015).
  6. Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).
  7. Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
  8. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  9. Pédelacq, J. -D., et al. Engineering soluble proteins for structural genomics. Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).
  10. Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).
  11. Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).
  12. Pédelacq, J. -D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).
  13. Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
  14. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).
  15. Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).
  16. Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions. Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).
  17. Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington's disease. Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).
  18. Gusella, J. F., MacDonald, M. E. Huntington's disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens. Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).
  19. Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations]. F1000Research. 7, 1242 (2018).
  20. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  21. Duennwald, M. L. Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation. Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).
  22. Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).
  23. Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae. Plos One. 8 (7), e67902 (2013).
  24. Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).
  25. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
  26. Thomas, B. J., Rothstein, R. Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA. Cell. 56 (4), 619-630 (1989).
  27. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
  28. Meriin, A. B., et al. toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).
  29. Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156 (1), 119-122 (1995).
  30. Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
  31. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).

Tags

Biologi fråga 141 fluorescerande proteiner polyglutamine toxicitet jäst tillväxt analyser aggregering grönt fluorescerande protein fluorescerande mikroskopi
Effekten av fluorescerande proteiner på Fusion Partners använder Polyglutamine toxicitet analyser i jäst
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiang, Y., Di Gregorio, S., Albakri, … More

Jiang, Y., Di Gregorio, S., Albakri, M. B., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast. J. Vis. Exp. (141), e58748, doi:10.3791/58748 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter