Summary
在这里, 我们提出了一个评估小鼠腹腔巨噬细胞吞噬使用增强绿色荧光蛋白表达大肠杆菌的方案.
Abstract
这份手稿描述了一种简单和可重复的方法来进行吞噬试验。该方法的第一部分涉及建立一个 pet-sumo-egfp 矢量 (sumo = 小泛素样改性剂), 并在大肠杆菌(bl21de) 中表达增强的绿色荧光蛋白 (egfp)。在37°c 条件下, 与巨噬细胞共培养 1小时;负对照组在冰上孵育相同时间。然后, 巨噬细胞就可以进行评估了。该技术的优点包括步骤简单、简单, 流式细胞仪和荧光显微镜均可测量吞噬能力。即使巨噬细胞与甲醛固定, egfp 表达大肠杆菌也是稳定的, 即使在巨噬细胞固定后也能显示出强烈的荧光信号。该方法不仅适用于巨噬细胞系或原代巨噬细胞的体外评估, 而且适用于外周血单个核细胞粒细胞和单核细胞吞噬的评价。结果表明, 小 (8周) 小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力高于老年 (16个月大) 小鼠的巨噬细胞。总之, 该方法能测定巨噬细胞吞噬, 适用于先天免疫系统功能的研究。
Introduction
巨噬细胞吞噬检测常用于研究先天免疫功能。先天免疫反应可能表明易受感染。巨噬细胞系在免疫学研究中得到了广泛的应用。然而, 延长的通道可能会导致基因丢失和这些细胞系的免疫功能受损。因此, 原代腹腔巨噬细胞是研究细胞功能1的理想对象。
虽然先天免疫反应被认为是完整的在老年身体,吞噬能力可能会下降相比, 在年轻的身体2, 3。在这里, 我们将演示一种方法来评估腹腔巨噬细胞的吞噬细胞的年轻 (8周大) 和老年 (16个月大) 使用 egfp 表达大肠杆菌, 这是方便, 快速, 经济上可行的。
使用表达 egfp 的大肠杆菌菌株是本方法的优点之一, 因为这些细菌是稳定的, 并显示强烈的荧光信号, 即使在巨噬细胞固定 4% (w/v) 甲醛。此外, 通过使用表达 egfp 的大肠杆菌, 研究人员不需要进一步染色后吞噬, 这节省了时间。此外, 巨噬细胞对大肠杆菌表面抗原具有免疫耐受性, 使大肠杆菌比使用表达 egfp 的真菌或荧光标记的珠子更适合进行吞噬试验。
使用表达 egfp 的大肠杆菌, 可以很容易地在2小时内完成吞噬检测, 并根据研究人员的用途, 通过流式细胞仪和荧光显微镜进行测量。由于该方法直接测量吞噬能力, 其结果比其他间接方法更具有重现性。
该方法也已在 raw264.7 细胞系和人外周血单个核细胞4中得到验证。下面的文本提供了执行此检测的详细分步说明, 并强调了研究人员可能修改以满足其实验需求的关键步骤。
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Protocol
所有程序均根据《国家卫生研究院实验动物护理和使用指南》进行, 这些程序得到了大连医科大学动物护理和使用委员会的批准。6个月大 (体重30-35 克) 和8周大 (20-25 克) spf (无特定病原体) 雄性 c57bl6 小鼠从大连医科大学 spf 动物中心获得。所有的老鼠都被关押在动物住所里, 可以获得食物和水.温度保持在 20-24°c, 湿度为 40%-70%, 照明为 12小时/12小时暗。在实验前, 动物被允许在环境中适应至少7天。
1. pet-sumo-egfp 质粒的构建和 egfp 表达的诱导
- 合成 egfp 基因片段 (由自定义基因合成服务合成的 717 bp 序列, 请参见材料表和补充文件 1的序列), 并用正向引物放大片段 (5 '-atggggggggggaggagg-3 ') 和反向底漆 (5 '-ctggctcccatccgcgcg-3 '), 使用高保真 taq dna 聚合酶。
- 为确保聚合酶链反应 (pcr) 产物在下一步中具有单 3 ' 腺嘌呤悬垂的 ta 克隆, 请在最后一个周期后在72°c 下使用30分钟的扩展 (pcr 条件见补充文件 1 )。用琼脂糖凝胶电泳检测 pcr 产物。
- 使用 t4 dna 连接酶的 ta 克隆方法5将 pcr 产物克隆到 pet-sumo 载体中 (见材料表)。在室温 (20-25) 下对反应进行培养30分钟。该向量在核苷酸653和653之间线性化, 每根链上有 1 bp 5 ' t-悬垂。
- 将结扎产物转化为化学上有能力的大肠杆菌菌株 , 如下所示: 通过在42°c 下的热冲击, 在90度的情况下, 将 pcr 产品的 5μl (100 纳克) 添加到 100μl BL21(DE);将混合物放在冰上 3分钟, 然后加入400μl 的溶酶体肉汤 (lb) 介质, 在37°c 预热, 在37°c 和120转/分晃动1小时。
- 用诱导乳糖 (0.5 mmol) 在 lb-kanamycin (100μg/ml) 板表面接种100μl 的细菌, 产生 egfp 表达株。在37°c 下隔夜生板。
注: 如果 egfp 被成功表达, 一些菌落可以观察到在黑暗中发光的绿灯。- (可选) 选择菌落, 通过 dna 测序验证插入的 egfp 片段。dna 测序的引物有: 前、5 '-agattttgtgggggtattagg-3 ';反转, 5 '-ttatttgcgggggggg-3 '。
- 用100μgml 卡那霉素将阳性菌落接种到 lb 培养基5毫升。在13°c 的晃动孵化器中孵育, 每分钟120转 2小时, 然后将诱导乳糖加入 0.5 mmol 的最终浓度, 并继续晃动 6小时, 诱导 egfp 表达。从经验上讲, 当晃动6小时时, 600 nm (od600) 的光学密度可能达到0.7 或更高。
- 将细菌培养基的10μl 添加到幻灯片上, 用盖板覆盖, 并在倒置荧光显微镜下检查 egfp 的表达。表达 egfp 的细菌可以在2-8°c 的培养基中储存数周。
2. 小鼠腹腔巨噬细胞分离与原代培养
- 在使用前, 将3.5 克硫代乙酸酯加入100毫升的蒸馏水中, 并将混合物高压灭菌至无菌。将硫代乙酸酯培养基泵入引擎盖中的1ml 无菌注射器中, 供小鼠腹膜注射使用。每个注射器使用一只鼠标, 以避免感染。使用硫代乙酸酯可以增加巨噬细胞的数量。可在没有硫代乙酸酯但巨噬细胞产量较低的情况下分离常驻腹腔腹腔巨噬细胞。
- 使用当地动物护理和使用委员会批准的方法对老鼠进行麻醉。使用 23 g 针, 用1毫升注射器将3.5% 的硫代乙酸介质注入小鼠腹腔。
注: 通过诱导麻醉, 腹膜注射可以很容易地进行, 并减少注射引起的内脏损伤的风险。 - 用水和食物保持鼠标和脂肪3天。每天监测动物的体重和食物摄入量。如果身体体重损失在3天内超过 10%, 则将动物排除在实验之外。
- 3天后, 用宫颈脱位对小鼠进行安乐死, 用七氟醚在密闭的盒子里迅速诱导麻醉。或者, 使用当地动物护理和使用委员会批准的方法对老鼠实施安乐死。
- 将鼠标放入一个有75% 乙醇的盘子 (直径为10厘米) 进行消毒, 然后迅速将其转移到引擎盖上。将鼠标放在盘子上, 将前爪固定在板上, 以固定鼠标的位置。
- 使用连接在 20 g 针上的5毫升注射器, 将针头倾斜在 30°-40°的角度, 将5毫升的冷 (4-10°c) 磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 注入小鼠的腹腔, 避免刺穿肠道。如果肠道 (或任何其他器官) 被刺破, 老鼠及其细胞不能再用于实验, 因为这可能会激活不适合原代细胞培养的细胞。
- 在老鼠腹部两侧进行温和的按摩。然后, 轻轻地缓慢地吸气液体。将腹腔液放入50毫升离心管中。重复这些步骤2x 或3倍。
- 在冷冻离心机 (4-8°c) 中, 以 400 x克离心分离悬浮细胞10分钟。在 rpmi 1640 培养基中, 用10% 的胎牛血清 (fbs) 去除上清液并重新悬浮细胞颗粒。数一数单元格。从经验上讲, 当细胞在培养基10毫升中重新悬浮时, 细胞密度大约等于 5 x 10 6 细胞。
- 在6孔板的每口井中加入 5 x10 6个细胞进行流式细胞仪检测, 将 5 x 10 5 细胞添加到一个24孔板中, 用于荧光显微镜。在37°c 的情况下, 在5% 的 co2孵化器中培养细胞。培养基可以在3小时后刷新, 以去除不粘的细胞, 因为这些细胞大多是淋巴细胞。粘附细胞主要为巨噬细胞, 能很好地粘附在组织培养处理的塑料中。
3. 用荧光显微镜检测巨噬细胞吞噬
- 观察明亮场显微镜下的细胞, 以评估细胞活力和细胞密度。
- 从24孔板中取出培养基。如表 1所示, 在每个细胞中加入100μl 的新鲜培养基和10μl 的细菌悬浮液 (约 2 x10 7个细胞)。在 37°c, 5% co 2 孵化器中孵育 1小时.
- 每口用500μl 的冷 pbs 轻轻清洗 3x-5x, 以冲洗出非内化细菌。
- 在室温下将 pbs 中4% 的甲醛加氢30分钟。
- 用 pbs (500μl/well) 清洗固定单元3x。
- 加入200μl 的方体素633荧光染料共轭工作溶液 (见材料表) 来染色 f-肌动蛋白。在室温下存放在阴凉潮湿的地方 (60%-80%) 60分钟, 用 pbs (500μl· well) 冲洗细胞 3x, 去除多余的乳素。通过染色 f-肌动蛋白, 细胞质可以勾勒出, 并有助于区分内化细菌。
- 加入 200μl dapi (4 ', 6 '-二胺-2-苯丁酯) 工作溶液 (1μg/ml), 在室温下在黑暗潮湿的地方染色细胞核并孵育5分钟。用 pbs (500μl/well) 冲洗 1x, 用相同体积的蒸馏水冲洗1x。然后, 这些细胞将在倒置荧光显微镜下进行观察。
4. 流式细胞仪检测巨噬细胞吞噬
- 为了最大限度地减少实验误差并对结果进行正确的解释, 请为实验设置组和控制管, 如表 2所示。
- 对于将放在冰上的对照组 (表 2中第4组), 从6孔板上取出培养基, 用 pbs 清洗1x。然后, 在井中加入1毫升 70 mm 冷 edta, 将细胞分离并转移到流式细胞仪管中。将50μl 的细菌悬浮液加入试管, 并将其放在冰上1小时。
- 对于其他组, 删除区域性。在每口井中加入1毫升新鲜培养基。如表 2所示, 根据组设置, 在井中加入50μl 的细菌悬浮液。然后, 将6孔板放置在 37°c, 5% co2孵化器中1小时。
- 为了抑制非内化大肠杆菌的荧光, 在井中加入200μl 的0.8% 的结晶紫罗兰色 (cv) 水溶液, 并快速晃动, 从而避免 egfp 表达大肠杆菌与大肠杆菌表面结合的错误阳性结果。巨噬细胞, 但没有内化。用 pbs 清洗细胞 3倍, 去除任何残留的 cv。
- 然后, 在井中加入1毫升 70 mm 冷 edta, 将细胞分离并转移到流式细胞仪管中。
- 以 400 x g离心管 5分钟, 并丢弃上清液。
- 加入100μl 的 pbs, 重新悬浮细胞。根据组的设置, 将5μl 的 f400-pe 共轭抗体 (一种在小鼠巨噬细胞上表达的表面抗原) 添加到试管中, 或使用 igg2a-pe 同型。旋涡短暂, 在黑暗中在冰上孵育样品5-10。
- 在每个管和离心机中加入1毫升 pbs, 每次 400 x g , 5分钟。用200-300μl 的 pbs 重新使用细胞颗粒进行流式细胞仪分析。运行每个管并获取 F4/80+细胞至少 10, 000个事件的数据。
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Representative Results
pET-SUMO 载体利用一种类似于泛素的小改性剂, 允许在大肠杆菌中表达原生蛋白质。sumo 融合可以显著提高 egfp 的溶解度, 使其易于检测。如果用乳糖成功诱导 egfp 表达, 则可以在黑暗中观察到绿色菌落 (图 1a)。绿色圆点代表 egfp 表达大肠杆菌, 可以在荧光显微镜下使用40x 物镜观察到 (图 1b)。
显微镜分析显示了来自年轻和老年群体的腹腔巨噬细胞荧光图像 (图 1c)。图 1c显示了 f-肌动蛋白的红色荧光、egfp 表达大肠杆菌的绿色荧光、dapi 核染色的蓝色荧光以及所有三个荧光通道的合并图像。这些被认为是老年老鼠的16个月大的老鼠相当于60岁至65岁的人类。这些图像表明, 小鼠的巨噬细胞比衰老小鼠的巨噬细胞具有更强的吞噬能力。
流式细胞术 (图 2) 用于量化和比较年轻和老年组的巨噬细胞吞噬。图 2a显示了对年轻人、老年人和对照组的典型流式细胞术分析。采用 f40-pe 抗体对巨噬细胞进行鉴定和检测, egfp 阳性信号表明巨噬细胞吞噬大肠杆菌。F4/80+和 egfp + 细胞的比例表明巨噬细胞的吞噬能力。年轻组的结果 (图 2b) 为 62.7%±5.1% (平均±sem), 明显高于老年组的35.2% ±2.9% (平均±sem)。这些结果与荧光显微镜结果的趋势是一致的。
图 1* 表达 egfp大肠杆菌及其巨噬细胞吞噬作用.(a) 表达大肠杆菌菌落的egfp 。将 pet-sumo-egfp 质粒转化为 BL21(DE) 细胞;细菌接种在 LB-kanamycin (100μgml) 板上。以 lb 板表面 0.5 mmol 乳糖涂层为诱导剂, 得到 egfp 的表达。如果 egfp 被成功表达, 黄绿色菌落被观察使用紫外线在黑暗中。(b) 表达 egfp 的大肠杆菌的荧光显微镜。绿色信号代表表达 egfp 的大肠杆菌。标度棒 = 50μm. (c) 吞噬大肠杆菌的巨噬细胞多道荧光图像。细胞用 egfp 表达大肠杆菌 (绿色) 孵育 1小时, 然后用 pbs 清洗, 用4% 的甲醛固定, 用 phalloidin 633 共轭工作溶液 (红色) 和 dapi (蓝色) 染色 f-肌动蛋白。刻度栏 = 100μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 流式细胞术结果.(a) 对年轻、老年和对照组进行代表性流式细胞术分析。用 f400-pe 与 gfp 表达大肠杆菌共培养后对腹腔巨噬细胞进行染色。在阴性对照组 (第4组: 冰上年轻组) 中, F4/80+和 egfp+ 细胞是罕见的。年轻和老年流式细胞仪分别代表第5组和第6组。(b) 对年轻和老年群体进行流式细胞术分析的结果。用曼恩-惠特尼测试来检查这两组之间的差异。幼体中 f480+和 egfp+ 细胞的比例明显高于老年组 (*p < 0.05)。误差线表示平均值 (sem) 的标准误差。请点击这里查看此图的较大版本.
| 组 | 名字 | 细胞 | 大肠杆菌 | 共同孵化时间 |
| 1 | 年轻 | 2 x 105 | 2 x 107 | 1小时 |
| 2 | 老年 | 2 x 105 | 2 x 107 | 1小时 |
表 1: 荧光显微镜的组设置.两组, 即年龄组 (16个月 c57bl6, n = 3) 和年轻组 (8周龄 c57bl6, n = 3),用于制备腹腔巨噬细胞。将每只小鼠的腹腔巨噬细胞添加到分离的井中。每口井中加入约 2 x 105个体积为100μl 的细胞;然后, 在每口井中加入约 2 x 10 7 表达 egfp 的大肠杆菌细胞, 并在37°c 下共同孵育1小时。
| 组 | 名称和条件 | 细胞 | egfp | F4/80-PE | PE 同位素 |
| 大肠杆菌 | |||||
| 1 | 37°C 的同型控制 | 2 x 106 | — | — | 加入5μl |
| 2 | pe 37°C 的正控 | 2 x 106 | — | 加入5μl | — |
| 3个 | 37°C 的积极控制 | 2 x 106 | 1 x 108 | — | — |
| 4个 | 在冰上的年轻小组 | 2 x 106 | 1 x 108 | 加入5μl | — |
| 5 | 37°C 的青年团体 | 2 x 106 | 1 x 108 | 加入5μl | — |
| 6 | 37°C 年龄组 | 2 x 106 | 1 x 108 | 加入5μl | — |
表 2: 流式细胞术的组设置.将幼鼠和老年小鼠的主要腹腔巨噬细胞分为六组。第1组设置为同型对照;第2组和第3组分别被设置为 pe 或 egfp 通道的单一正控制。为确保内化荧光是特定于吞噬作用的, 第4组在冰上孵育。由于低温, 冰上停止了吞噬。所有组的孵化时间为1小时。
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Discussion
此协议中的步骤非常简单和直接。其中一个关键的步骤是诱导 egfp 在大肠杆菌上的表达。通常, 当一个来自真核生物的基因, 如 egfp, 计划用原核生物表达像大肠杆菌, 有风险的蛋白质将形成不活跃的聚集物 (包涵体), 这改变了蛋白质的原生结构和活性。利用 pet-sumo 载体构造 pet-sumo-egfp 质粒, 成功表达了 egfp-sumo 融合蛋白, 光信号强到足以被荧光显微镜和流式细胞仪检测。
另一个关键的步骤是抑制巨噬细胞没有内化的细菌的荧光。虽然色氨酸蓝已被证明可以扑灭荧光荧光荧光荧光荧光荧光荧光的荧光荧光的荧光----标记为热杀灭的细菌, 但它对活大肠杆菌并不起作用。使用0.8% 的结晶紫罗兰水溶液可以淬火大部分在细胞表面结合的大肠杆菌的荧光。一些文献表明, 用抗生素而不是 trypan 蓝清洗可能有助于抑制荧光, 但这在这个实验中并不有效。
细胞密度可能会限制这项技术。由于细胞由淋巴细胞和巨噬细胞组成, 巨噬细胞在从小鼠腹腔中取出细胞时, 通常低于血细胞仪计算的细胞密度, 这可能导致数量不足流式细胞仪和荧光显微镜。在巨噬细胞数量不足的情况下, 同一组中的2到3只小鼠的细胞可能混合进行吞噬试验。当这一技术应用于巨噬细胞系, 如 raw264.7, 细胞丢失可能是一个值得关注的问题, 因为这些细胞是相对不粘附的;因此, 细胞可能会在清洗过程中丢失。轻轻清洗或使用经过细胞处理表面的培养板, 这可能会增加细胞的粘附。
有许多其他方法来评估吞噬能力。鸡红细胞或染色细胞作为吞噬的标志物, 是典型的方法之一。这些方法的灵敏度受到结果相当大的变化的限制。另一种检测吞噬作用的替代方法是使用感染细菌的细胞数小时, 然后在37°c 下将细胞与 triton x-100 和板在 lb 琼脂培养皿中过夜。吞噬能力是通过计算菌落形成单位 (cfu)的数量来确定的。该方法需要长达2天的时间才能获得 cfu 数据, 由于细胞裂解液被稀释了几次, 计数数的方差很大。然后, 引入了 fitc 标记的珠子7或大肠杆菌的吞噬试验 8。由于这些珠子缺乏特定的表面抗原, 因此需要额外的预氧化才能获得最佳吸收。此外, 使用 fitc 标记的细菌的方法可能会阻碍吞噬, 因为 fitc 损害了细菌的毒力9。
另一种新引入的方法是使用商业化染料, 这些染料对 ph 敏感, 一旦进入酸性溶酶体, 才会发光, 从而消除淬火步骤 10。然而, 商业化的试剂盒的成本可能高得令人望而却步。一旦构建了表达 egfp的大肠杆菌菌株, 细菌就很容易繁殖, 荧光稳定数周, 使该方法简单、经济。由于 egfp 具有很强的荧光, 这种方法也可以修改为高通量荧光技术, 以评估巨噬细胞吞噬, 这可以在一个不透明的96孔板11执行.
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
中国国家自然科学基金 (第3180046号) 和辽宁省自然科学基金 (20170540262) 对这项工作给予了支持。这项工作是在大连医科大学第二医院科研中心的实验室完成的。作者要感谢桑小林对流式细胞术的协助, 感谢博曲和杨东川在制作视频方面的协助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | - | |
| Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Protein Expression system | Invitrogen | K300-01 | |
| Custom Gene Synthesis Service | Takara Biotech. | - | |
| DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher | D1306 | |
| F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Inverted Microscope | Leica Microsystems | - | |
| PE Rat IgG2a, κ-isotype control | Biolegend | Cat400507 | |
| Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Thioglycollate medium | Sigma-Aldrich | T9032 |
References
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. Journal of Visualized Experiments. 98, e52749 (2015).
- Iskander, K. N., et al. Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding. Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).
- Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management. Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).
- Bicker, H., et al. A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria. Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).
- Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. Universal TA cloning. Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).
- Chen, Q., et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Weingart, C. L., et al. Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils. Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).
- Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species. Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).
- Ninkovic, J., Roy, S. High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization. Journal of Visualized Experiments. (93), e52195 (2014).
