Summary
该协议描述了用低温电子显微镜测定离子通道结构的技术, 包括用于以最小的努力和毒性在哺乳动物细胞中有效表达基因的杆菌病毒系统, 蛋白质提取、纯化、和质量检查, 样品网格的制备和筛选, 以及数据的收集和处理。
Abstract
典型 trp 亚家族的瞬态受体电位通道 (trpc) 是非选择性阳离子通道, 在钙稳态中发挥着至关重要的作用, 特别是在商店操作的钙进入, 这对于保持钙的适当功能至关重要。突触囊泡释放和细胞内信号通路。因此, trpc 渠道与各种人类疾病有关, 包括心血管疾病, 如心肌肥大, 神经退行性疾病, 如帕金森病, 和神经疾病, 如脊柱小脑共济失调。因此, trpc 通道是人类疾病中潜在的药理靶点。然而, 在这些通道中门控的分子机制仍不清楚。在结构测定研究中, 特别是对于哺乳动物膜蛋白, 如 trpc 离子通道, 获得大量稳定、均匀和纯化蛋白的困难一直是一个限制因素。在这里, 我们提出了一个协议, 大规模表达哺乳动物离子通道膜蛋白使用一个修改后的巴库氏病毒基因转移系统和纯化这些蛋白质的亲和力和大小排除色谱。我们进一步提出了一个协议, 收集单粒子冷冻电子显微镜图像从纯化的蛋白质, 并使用这些图像来确定蛋白质的结构。结构确定是了解离子通道中门控和功能机制的有力方法。
Introduction
钙参与大多数细胞过程, 包括信号级联, 转录控制, 神经递质释放, 和激素分子合成1,2,3。细胞质游离钙的稳态维持对细胞的健康和功能至关重要。细胞内钙稳态的主要机制之一是储存钙进入 (sace), 在这个过程中, 储存在内质网 (er) 中的钙的耗尽会触发质膜上离子通道的打开, 以促进er 钙的补充, 然后可以在进一步信号4,5,6中使用。瞬态受体电位通道 (trpc) 是属于 trp 超家族的透钙通道, 已被确定为 soce7、8、9的主要参与者。
在 trpc 家族的7名成员中, trpc3、trpc6 和 trpc7 构成了同源亚群, 它们在被脂质二级信使二丙烯酸酯 (dag) 激活的能力上是独一无二的, 而二维信使二丙烯酸甘油是脂质信号的降解产物磷脂酰肌醇 4, 5-双磷酸 (pip2)10,11。trpc3 在平滑肌和大脑的大脑和小脑区域中高度表达, 在这些区域中, 它在影响神经传递和神经发生的钙信号中发挥着至关重要的作用。trpc3 功能障碍与中枢神经系统疾病、心血管疾病和某些癌症 (如卵巢腺癌14、15、16) 有关。因此, trpc3 有望成为治疗这些疾病的药物目标。由于对其分子激活机制, 包括脂质结合位点 17、18缺乏了解, 开发针对 trpc3 的有针对性的药物受到限制。我们报告了人类 trpc3 通道 (htrpc3) 及其两个处于封闭状态的脂质结合位点的第一个原子分辨率结构, 为这些机制提供了重要的见解19。
高分辨率膜蛋白结构的关键因素是获得高质量的蛋白质。相应的表达筛选和纯化条件的必要, 以获得高质量的蛋白质可能是一个耗时和昂贵的努力。在这里, 我们提出了一个协议, 详细描述了我们如何确定 htrpc3 的表达和纯化的最佳条件, 它在我们的初始筛选中表现不佳。我们就如何排除故障和优化蛋白质行为提出了几个要点, 为我们的低温电子显微镜 (低温 em) 研究奠定了坚实的基础。我们使用了由 gouaux 和他的同事开发的改良的杆菌病毒产生载体 (peg), 该载体经过优化, 用于在哺乳动物细胞20 中筛选检测和高效生成巴库索病毒。这种表达方法适用于哺乳动物细胞膜中蛋白质的快速和具有成本效益的过度表达。我们将此向量的使用与基于荧光检测大小排除色谱 (fsec) 预置方法21结合起来。该方法采用绿色荧光蛋白 (gfp) 标记融合到感兴趣的结构中, 并提高了目标蛋白在小的全细胞溶解性样品中的可视化。这样就可以在不同的洗涤剂和添加剂的存在下筛选蛋白质稳定性, 并具有稳定的热稳定性突变, 并允许使用少量细胞进行小规模瞬态转染。通过这种方式, 在进入大规模蛋白质纯化之前, 可以快速筛选多种条件。在表达、筛选和纯化之后, 我们提出了一种从低温 em 中获取和处理图像的协议, 以生成蛋白质的新结构测定。我们相信, 这里描述的方法将作为一个通用的协议, 用于 trp 通道受体和其他膜蛋白的结构研究。
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Protocol
1. dh10α组成细胞转化为 bacm中 dna
- 合成感兴趣的基因, 并将其亚化为一个修改版本的 peg 向量, 其中包含一个双链球标记、一个 his8 标记和 gfp, 在 n 终点 (pfastbaci) 20 处有凝血酶裂解部位。
- 通过在 1.5 ml 管中加入5纳克含有所需基因的质粒, 在 pFastBacI 中加入50μl 的 dh10α细胞, 并在冰上孵育 10分钟, 从而转化合格的细胞。在42°c 下, 热冲击细胞45秒。在管中加入200μl 的超最优肉汤, 并在37°c 时在225转/分的轨道振动台孵育4-8小时。
- 在 bacme/lb 琼脂板上的细胞板 5μl (50μgml 卡那霉素, 7μgml 庆大霉素、10μgml 四环素、100μgml blu-gal 和40μgml 异丙基β-d-1-硫代卡醇 [iptg]、琼脂)。
- 在37°c 下将板材培育48小时。
注: 蓝加仑指示染色, 仍表示 lz (矢量插入不成功), 允许选择白色 (成功转换) 菌落。 - 仔细选择一个孤立的白色群体, 避免任何与蓝色菌落接触的白色菌落, 并在225rpm 的轨道振动台的37°c 下, 在6毫升的 bacml b 中长出细胞 (50μgl 卡那霉素, 7μgl 庆那霉素, 10μgml 四环素)。
2. 分离 bacm中 dna 的细菌制剂
- 要分离杆菌 dna, 在 2880 x g 的情况下, 将大肠杆菌细胞转至大肠杆菌细胞 10分钟。
- 从微型制备试剂盒 (见材料表) 中移液中丢弃上清液并重新悬浮细胞再悬浮液中的颗粒。确保颗粒完全和均匀地悬浮。然后, 将细胞悬浮液转移到 1.5 ml 管中。
- 从微型制备试剂盒中加入200μl 的细胞裂解溶液, 并通过倒置管几次进行混合。在室温下孵化 5分钟 (rt), 使细胞裂解。从微型制备试剂盒中加入200μl 的中和溶液, 通过倒置管混合几次, 以阻止裂解反应。
- 在桌面离心机中, 在 21, 130 x g处旋转10分钟。在2毫升管中收集600μl 的上清液。加入600μl 苯酚: 氯仿: 异戊醇溶液 (见材料表), 并彻底混合, 从细胞裂解产物的剩余部分中提取 dna。
注意: 苯酚: 氯仿: 异戊醇溶液是有毒的吸入, 与皮肤接触, 如果吞咽。它可以引起化学烧伤, 并可能致癌。戴上手套, 穿上带纽扣的实验室外套。在通风柜里工作。适当处置这些危险废物。 - 在 21130 x g 的桌面离心机中旋转管10分钟。两个独立的液相将是可见的。小心地将上水相的300μl 转移到新的管中。加入600μl 的100% 乙醇来清洗 dna。轻轻倒置管混合。
注: 不要涡流, 因为这可以剪切 bacm体 dna。 - 将其放入-20°c 的冰柜中 10分钟, 在桌面离心机中向下旋转 10分钟, 在 21, 130 x g 。丢弃上清液并保存 dna 颗粒。
- 加入1毫升的70% 乙醇来清洗颗粒。轻轻倒置管混合。在桌面离心机中旋转 10分钟, 21, 130 x g 。丢弃上清液, 让颗粒干燥约 5分钟, 或直到管中看不到液体, dna 颗粒变为半透明。
- 将干颗粒重新注入50μl 的无菌、无 dnase、去离子水中。测量 dna 浓度。
注: 不要冻结 bacmacm待 dna。在4°c 下存放长达数天。
3. bacid 对 Transfection 昆虫细胞的转染, 以生产 p1 杆状病毒
- 种子 0.9 x 10 6 sf9 细胞/在2毫升的适当培养基 (见材料表) 在6孔组织培养板的每口井。在27°c 下培养细胞 20分钟, 以促进与板材的附着。
注意: 细胞培养是一种潜在的生物危害。使用无菌技术在经批准的层流罩中工作, 并在进行实验之前检查机构和政府的建议防护服和适当处置废物的准则。 - 连接后, 为在无菌管内转染的6个井板的每一口井加入8μl 转染试剂 (见材料表) 100μl 介质。在单独的无菌管中加入6μg 的 bacm中 dna, 加入100μl 培养基。在 rt 孵育 5分钟, 将两种溶液结合起来, 在 rt 孵育45分钟。
- 将6口井中的介质更换为2毫升的新鲜培养基。将上一步的混合物加入到每个井 (每口井 200μl) 中。轻轻摇晃板, 以确保转染溶液混合到介质中。
注: 不要旋转或摇晃板, 因为这会导致细胞分离。 - 在27°c 加湿孵化器中孵育细胞 5 d (120小时)。在收获前检查 gfp 荧光, 以验证病毒在很大比例的细胞中产生;如果百分比较低, 请根据需要延长孵育时间 (参见图 1c)。
- 收集含有 p1 病毒的上清液 (每口井约2毫升)。使用3毫升注射器和小0.2μm 过滤器将含有 p1 病毒的培养基过滤到2毫升管中。添加不育的胎儿牛血清 (fbs) 的最终浓度为1%。
注: 此 p1 病毒库存应存储在 4°c, 并防止光线照射。
4. sf9 昆虫细胞感染 p1 杆状病毒产生 p2 杆状病毒
- 在适当的培养基中 (见材料表), 在足够大的扁平底部 erlenmeyer 培养瓶中, 以 0.8-0.9 x10 6 细胞的浓度制备 200 ml (或所需体积) 的 sf9 细胞。
注: 对于悬浮培养, 使用的体积不应超过烧瓶总容量的40%。 - 加入 1:2500 p1 病毒库存比例 (v/v), 从3.5 到 sf9 细胞悬浮培养。在115个小时的轨道振动台中, 在115级的轨道振动台中进行最佳病毒表达 (通常为 48-120小时, 取决于蛋白质结构)。
注: 相对病毒表达可以通过查看培养物样本中病毒的 gfp 荧光来确定。 - 在 1 1 520 x g处离心细胞悬浮液 40分钟, 并收集含有 p2 病毒的上清液。使用一次性0.2μm 过滤器过滤上清液。将 fbs 添加到0.5% 的最终浓度。
注: 这种 p2 病毒的库存应储存在 4°c, 并防止光线。 - 使用 sf9 简易细胞或病毒计数器获得 p2 病毒的滴度。
5. hek293 哺乳动物细胞与 p2 杆状病毒对大规模蛋白表达的感染
- 在表达培养基中, 以 3.5-3.8 x 10 6 细胞/ml 的浓度 (见材料表) 中的浓度为 3.5-3.8 x 10 6 细胞/ml,并以 1% ( v/b)的浓度, 准备一个理想的 hk293 哺乳动物细胞悬浮培养量 (建议为 4-6 l)v) 无菌 fbs 在挡板底部 erlenmeyer 培养瓶足够的大小。
注: 对于悬浮培养, 使用的体积不应超过烧瓶总体积的40%。 - 从步骤4.3 到 hek293 细胞悬浮培养, 加入8% 的 p2 病毒库存溶液。在37°c 时在135转/分的轨道振动台中进行孵化。
- 在感染后12-18 小时加入 10 mm 丁酸钠。在30°c 下培育最佳蛋白表达时间 (通常为 36-72小时)。
- 在 2 880 x g 的情况下离心20分钟收获细胞. 每公升收获的细胞, 通过在大约100毫升的三缓冲盐水 (tbs) 中重新悬浮清洗细胞。在 2, 880 x g处再次离心 20分钟, 并收集细胞颗粒。
注: 协议可能会在此处暂停。细胞颗粒可在液氮中进行冷冻, 并在-80°c 下储存至纯化。
注意: 液氮可能会导致低温烧伤或伤害。它可能会导致冻伤。它可能会取代氧气并导致快速窒息。戴冷绝缘手套和面罩。 - 在不同的时间点收集小的1毫升收获, 并在4°c 时溶解 2小时, 在不同的洗涤剂和/或添加剂的存在下摇晃或搅拌。这些小的全细胞溶解性样品可以通过在 235xg的超离心澄清, 在4°c 下 10分钟, 并在大小排除色谱柱 (sec) 柱 (见材料表) 上作为30μl 样本运行, 以确定最佳时间。表达式和最佳的增溶条件。
注: 就 htrpc3 而言, 这种筛选包括 ph 值为4.0-9.5 和盐浓度为 50-500 mm 的不同缓冲液;不同的离子成分 (如 mgcl2或氯化钠);临界胶束浓度 (cmc) 值为 0.1-20 mm 的不同洗涤剂;还原添加剂, 如二硫醇、tris(2 羧基) 磷化氢和β-硫醇;和钙螯合添加剂乙二胺四乙酸 (edta)。
6. 冷冻细胞颗粒中 htrpc3 蛋白的纯化
- 解冻含有 20 mm tris (ph 值 8.0) 的缓冲液中的颗粒, 500 mm 氯化钠、1 mm 苯基甲基磺酰氟 (pmsf)、0.8 微米的前列腺素、2μml 利妥芬酸、2 m 肽 a 和1% 的数宁, 每收获细胞100毫升缓冲液。解冻后, 通过移液或搅拌确保溶液的均匀性。允许在4°c 的烧杯中溶解 2小时, 浸泡在冰中, 搅拌杆旋转。
- 在235.00xg 的超离心下, 在4°c 下, 以1小时的速度清除细胞碎片. 通过高效液相色谱 (hplc) 在 sec 色谱 (参见材料表) 上运行30μl 样本来验证蛋白质数量, 并通过 gfp 信号输出来可视化目标蛋白。
- 在4°c 条件下, 用钴亲和性树脂将溶解性蛋白质 (上清液) 培养1-2小时。通过在 sec 色谱柱上运行30μl 样品来验证蛋白质与树脂的结合。
注: 如果发生了蛋白质结合, gfp 标记的蛋白质靶标将保留在列上, 在流经中找不到。因此, 当流动在高效液相色谱法上运行时, 在与目标蛋白大小相对应的位置不会出现 gfp 信号。 - 用10个柱体积的缓冲液 (20 mm tris、ph 值8.0、500 mm n运输l、15 mm 咪唑和0.1% 的数字素) 清洗树脂。通过在 sec 色谱柱上运行30μl 样本来检查蛋白质损失。
注: 如果发生了列的蛋白质损失, gfp 标记的蛋白质目标将被发现在洗涤缓冲液已通过列。因此, 当洗涤缓冲液在高效液相色谱上运行时, gfp 信号将出现在与目标蛋白大小相对应的位置。如果发生蛋白质丢失, 可能需要降低洗涤缓冲液的咪唑浓度, 以防止干扰他的标签结合到亲和力柱。 - 用缓冲液 (20 mm tris, ph 值 8.0, 500 mm ncl, 250 mm 咪唑, 0.1% digitonin)。以1:20 摩尔比添加凝血酶 (将 gfp 标记切割), 并在洗脱样品中添加 10 mm edta (htrpc3 稳定剂), 在4°c 下孵育3小时。检查蛋白质是否已被洗脱, 方法是在 sec 列中运行90μl 稀释的样品 1:100, 并验证 gfp 信号在与目标蛋白质大小相对应的位置是否存在。
注: 此时, 还可以查看洗脱中总蛋白的色氨酸信号。只有目标亲和力纯化的蛋白质将保留在洗脱中, gfp 和色氨酸信号在剖面上几乎相同。如果目标蛋白在洗脱中没有大量出现, 但在流动或洗涤中没有丢失, 则该蛋白很可能仍与色谱柱结合, 并可在缓冲液中使用浓度较高的咪唑进行洗脱。 - 将洗脱液浓缩到 15ml 100k 离心过滤管 (见材料表) 中500μl 或更低, 方法是在4°c 下以5分钟的增量以 2 880 x g的速度旋转。通过在旋转之间上下移液来重新释放蛋白质, 以避免过度浓缩。
注: 随着体积接近所需的最终体积, 离心机时间可能会缩短。 - 将精矿加载到 sec 柱的缓冲液 (20 mm tris、ph 值8.0、500 mm ncl、1 mm edta 和0.1% 的数码) 上。运行。
- 结合含有完整的 trpc3 四聚体的峰值分数, 通过紫外线吸收信号进行可视化, 并再次浓缩到至少 5 mg/ml 的最终浓度。
7. 用否定染色电子显微镜筛选蛋白质
- 打开发光放电机。设置使用氩和氧气放电碳涂层栅格的程序, 在添加蛋白质溶液之前, 运行该程序, 使铜400目网格亲水的碳涂层。
- 设置 5个40μl 滴的无菌水和 2个40μl 滴1% 的甲酸铀酯溶液 (在实验室薄膜、蜡纸或类似表面, 请参见材料表)。从步骤7.1 中取出栅格, 在黑暗面上加入2.5μl 的蛋白质样本 5 mg/ml (50-200μm), 让它坐1分钟。
- 1分钟后, 用滤纸擦干网格。不要将滤纸直接触摸到网格表面;相反, 将纸张带到液滴边缘, 并允许毛细管作用将液体从网格拉入滤纸。
- 将网格浸入第一滴水。用滤纸擦干, 用剩余的水滴和第一滴甲酸的乌兰尼酯重复干燥。让第二滴甲酸铀的水, 然后用滤纸干燥, 然后再坐1分钟。在储存前, 让电网完全干燥 (约 1分钟)。
注: 此染色协议可能不适合所有蛋白质洗涤剂组合。如果上述步骤不能提供具有良好对比度的染色, 则应测试不同浓度的甲酸铀染色和不同的染色时间。 - 在电子显微镜上对网格进行成像 (见材料表), 以检查蛋白质颗粒质量。确保显微图像显示大量粒子在一般外观和分布上是均匀的, 显示良好的对比度, 并与目标蛋白的预测大小相匹配。
- 使用50-100 个微图 (参见数据处理–步骤 10) 生成初步的低分辨率二维 (2d) 分类, 以检查粒子是否代表单一一致结构的不同视图。
注: 如上所述, 微图和足够质量的初步2d 类是一个强有力的指标, 表明该协议已充分优化为蛋白质纯化。在这一点上, 有必要对低温电磁网进行准备和筛选。
8. em 样品制备
- 如步骤7.1 所述, 发光排放一个金洞碳网格 (见材料表)。
- 将浓度为 htrpc3 的蛋白样品 (5mg/ml) 应用于栅格。在100% 湿度和4°c 下, 使用1的模糊力和5秒的等待时间将栅格降至 1.5秒, 然后使用玻璃化机将栅格浸入液氮冷却的液态乙烷中。
注: 此处列出的湿度、温度、斑点力、印迹时间和等待时间用于作者的 htrpc3 研究19。它们可能需要改变, 以产生其他蛋白质和洗涤剂的最佳玻璃化冰。 - 使用低温-em 显微镜 (见材料表) 和手动查看厚冰 (看起来更小、更暗的网格方块)、薄冰 (看起来更大、更亮的网格方块) 和中等冰的区域, 筛选冻结的网格以获得最佳的冰条件.
注: 较厚的冰通常含有更多的颗粒, 而较薄的冰通常会产生更好的对比度和分辨率。使用手动筛选图像, 以确定哪些冰条件导致大量具有良好对比度和分辨率的单分散颗粒。一旦验证了良好的条件, 就转移到300kv 低温 em 显微镜上的图像采集。
9. em 数据收集
- 电子显微镜上的电子显微镜以300千伏的名义放大倍率为 130, 000x 直接电子探测器, 采用自动采集程序, 在超分辨率计数模式下记录图像堆栈。
- 将每个图像的剂量分割为40帧, 总曝光时间为 8秒, 每帧 0.2秒, 剂量率为 6.76 e- --- -------- ------------------------------------------------------------------------
10. em 数据处理
- 使用数据处理软件 (见材料表) 24 实现对求和电影堆栈22的运动校正, 并估计取消对焦值23 .
- 从微图中选取粒子。使用这些选取的粒子使用软件24构造一个初始无参考的2d 分类。选择理想的2d 类平均值, 作为整个数据集的自动粒子拾取模板。
- 手动检查自动拾取的颗粒的质量, 并去除不良颗粒。使用多轮二维分类来清理拾取的粒子。
- 生成初始模型25。研究对象二维选取粒子进行三维 (三维) 分类 (约5类), 采用 c1 对称性和初始重建低通滤波器60为参考模型。确定哪些类具有高分辨率特征, 并将粒子组合到此类中。
- 进一步细化粒子使用局部细化与 c4 对称性 (在 htrpc3 的情况下) 应用和高分辨率极限为粒子对齐设置为 4.5 26。
11. 模型建筑
- 构建模型 (请参阅所使用软件的材料表)。对于 htrpc3, 使用瞬态受体电位甜瓜抑素 4 (trpm4) 结构蛋白数据库 (pdb) 5wp6 的跨膜域 (tmd) 作为指南27。利用笨重的残留物和二级结构预测来指导新的建筑。
- 将初始模型服从于二级结构约束的真实空间细化 28。手动检查改进后的模型, 并根据需要重新修改 (请参阅所使用软件的材料表)。
- 应用傅里叶壳相关 (fsc) 曲线计算最终模型与 em 映射之间的差异, 以验证细化结构。评估原子模型的几何形状 (请参阅所用软件的材料表)29、30。
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Representative Results
图 1a 显示了 htrpc3 表达和纯化协议的示意图。图 1b 显示了 htrpc3 带理想白色菌落的图像, 类似于为 bacmacmt dna 纯化选择的基板。我们发现, 48小时是理想的明确蓝甲染色, 同时保持孤立的殖民地的存在。Sf9 荧光显示, htrpc3 p2 病毒的峰值产量是在 sf9 昆虫细胞感染 4 d 后出现的 (图 1c)。
从培养基中提取 p2 鲍鲁索病毒, 辅以1% 的 fbs, 用于感染 hek293 哺乳动物细胞的悬浮液。在病毒发生12-18小时后, 丁酸钠被添加到受感染的细胞中, 以促进蛋白质表达20。然后在30°c 下对细胞进行额外的36小时孵育。fsec (图 2a) 21 对这些细胞进行了收获和溶解性和稳定性筛选。在洗涤剂浓度约为 cmc 值10倍的洗涤剂中, 使用 cmc 值为 0.01-20 mm 的7种不同洗涤剂对细胞进行溶解。全细胞增溶后, 用超离心去除细胞裂解碎片, 并将含有溶解性蛋白质的上清液加载到 sec 柱上, 在正十二烷基β-d-maltopseisiseisey-maltoseidalicciccicinate (ddmschs) 中运行含有洗涤剂的缓冲液, 用于比较与 trpm4 控制相比不同条件下 htrpc3 的绝对溶解度和峰值体积位置 (图 2b)。我们选择使用 ddm\ chs 作为样品在不同洗涤剂中溶解的初始运行缓冲液, 因为 ddm\ chs 是求解膜蛋白结构时最常用的洗涤剂。所有不同的洗涤剂溶解性 trpc3 样品显示峰值位置约为11.9 毫升, 这可能太大, 因为 htrpc3 的四美式分子量小于积极控制人 trpm4 (图 2a和图 2 b)。
然而, 由于没有任何 trpc 通道受体的结构来比较我们的结果, 而且由于大分子量可能是由 trpc3 的结构或其他因素引起的, 我们使用25毫升进行了 htrpc3 的小规模纯化。在整个实验过程中使用 ddmm chs 的细胞, 作为 ddm chs 提供了 hTRPC3 的最佳溶解度。美国证交会对 htrpc3 的轮廓显示出单分散峰, 但仍处于峰值位置, 代表的分子量高于 trpm4 (未显示数据)。我们用负染色 em 检查了 sec 剖面峰值部分的蛋白质, 因为它是一种快速的方法来验证蛋白质质量, 并且需要非常少量的蛋白质。在微观图中, 观察到的粒子有两个跨膜域存在于同一粒子中。看来, 两个 htrpc3 粒子通过两个细胞质域之间的相互作用, 以正面的方式进行二聚体化 (图 3d)。然后, 我们将还原试剂二硫醇 (dtt) 纳入第二次小规模纯化的净化缓冲液中, 希望能破坏 htrpc3 的二聚化。事实上, 美国证交会分馏出现了分子量较低的第二个峰值。然而, 这些颗粒显得太小, 不可能是一个完整的四聚体, 并且没有膜蛋白的特征, 如跨膜域。事实证明, ddmsch 虽然为 htrpc3 提供了最佳的溶解性, 但它并不是一种合适的净化 htrpc3 的洗涤剂。
接下来, 我们尝试了一种更温和的洗涤剂, 数宁, 溶解 htrpc3, 并将其与 ddm/chs 中的蛋白质溶解性进行了比较。在这里, 我们使用了两个不同的运行缓冲区, 分别包含 ddmmss 和 digitonin。这一点很重要, 因为运行缓冲液中的洗涤剂往往有助于蛋白质的稳定性, 而在将洗涤剂从增溶转变为 fsec 时, 膜蛋白可能会变得不稳定。在含有数字素的缓冲液中运行的蛋白质显示出一个有希望的峰值转移到一个较低的分子量时, 溶解在 ddm/chs 或数宁。在相对于阳性对照人体 trpm4 (图 3a) 的合理位置上, 由数字蛋白溶解并运行的蛋白质产生了最高峰值。然后, 我们通过使用25毫升的细胞进行小规模的纯化向前推进。尽管 sec 观察到多个广泛的峰值 (图 3b), 但该蛋白质在二维分类中显示了一个由负染色 em 分类的单四态 htrpc3 通道的特征 (图 3B和图 3B)。我们的结论是, 数字素是一种理想的洗涤剂, 净化 htrpc3。
我们扩大了 htrpc3 的表达, 并在数字素中使用400毫升的细胞进行了中等规模的纯化。通过这样做, 我们希望在找出大规模净化 htrpc3 的最终条件之前, 能够为几个冷冻电网获得足够的蛋白质, 而不浪费介质和洗涤剂。膜蛋白在高度集中用于冷冻网格的制备时表现出不稳定的情况时, 经常会发生这种情况。纯化和浓缩的蛋白质不仅由 fsec 向更高的分子量转移, 而且还显示了在低温电磁网中使用配备 emccd 摄像机的电子显微镜成像的嘈杂背景。尽管我们能够观察到单个的、完整的四态受体, 但在数字素中纯化的 htrpc3 并不理想于高分辨率的低温 em 研究。
为了进一步提高蛋白质的稳定性, 我们筛选了《议定书》步骤5中描述的大量条件。根据 htrpc3 的生理特性, 选择筛选添加剂;例如, 选择 edta 是因为 htrpc3 对钙具有渗透性, 去除钙可以稳定蛋白质。在 fsec 测试的所有样本中, 含有数字素的 befi 10mm edta 在稳定 htrpc3 的最大日向位置方面发挥了显著作用 (图 4 a)。它还显著增加了低温-em 显微镜中的粒子数量, 减少了背景中的噪音, 如图 5所示。
在确定了理想的表达和纯化条件后, 我们对 htrpc3 进行了大规模的表达 (2l)。对含有 htrpc3 的细胞进行了收获, 然后将其溶解。超离心澄清溶乳酸经过金属亲和柱的净化, 用钴树脂进行批量生产, 然后在重力柱中进行纯化。用 fplc (图 4b) 验证了该色谱柱内溶解蛋白的保留和亲和纯化蛋白的洗脱。我们发现, 对于 htrpc3, 洗涤缓冲液中 15 mm 的咪唑浓度 15 mm 足以去除非特异性树脂结合的污染蛋白, 而在洗液缓冲液中的 250 mm 咪唑足以洗脱大多数溶解性的 htrpc3与树脂结合的蛋白质。所有样本均由 fsec 进行检测, 洗脱后的蛋白质在正确的峰值位置呈尖锐的单分散峰值。由于 gfp 标记和 htrpc3 蛋白之间的内在灵活性可能会使图像处理过程中蛋白质颗粒的对齐更具挑战性, 而且由于凝血酶裂解部位位于 gfp 和 htrpc3 之间, 我们测试了少量纯化使用凝血酶在不同裂解时间的蛋白质。考虑到在4°c 条件下, 用凝血酶孵育的凝血酶孵育蛋白在1:20 摩尔比下表现出合理的稳定性和2小时后的完全裂解, 我们用相同的条件从所有纯化的蛋白质中分离出 gfp, 并经 hplc 进行检查, 以确认 gfp 已达到 c(图 4c)。蛋白质通过 s 进一步纯化, gfp 的裂解可以通过峰值位置向较小的分子量转移来再次显示 (图 4d)。利用主峰分数的小非集中样品制作负染色 em 网格。然后将所有含有四美式 htrpc3 的组分结合起来, 重新浓缩到 5 mg/ml 的最终浓度, 用于制备用于低温电磁成像的网格。正如我们已经观察到, 部分蛋白质仍然逐渐转向更大的分子量, 我们只收集了正确分子量的分数, 并冻结了蛋白质纯化后的网格。我们通常在一天内完成从纯化蛋白质到准备冷冻网格的一系列实验。
将纯化的 htrpc3 蛋白 (浓度为 5 mg/ml) 的2.5μl 样品应用于发光的霍利碳网格上。利用玻璃化机制备网格, 在100% 湿度下使用 1.5 s 的印迹时间, 然后浸入液氮冷却的液态乙烷中。这一步将样品冻结为玻璃冰进行成像。用300千伏的冷冻电子显微镜拍摄到的图像具有 130, 000x 的名义放大倍率。利用直接电子探测器和自动采集软件, 以双径像素大小为1.04 的超分辨率计数模式记录图像堆栈, 标称脱焦值从1.0 到2.5μm 不等。每张图像的剂量分割为40帧, 总曝光时间为 8秒 (每帧 0.2秒), 剂量率为 6.76 e- --------------------- -----------------------------------------------------------图 5显示了此数据集中具有代表性的微图。
对总结电影堆栈的去焦值进行了运动校正和估计。大约200个得到的微图被用作手动采摘粒子和初始无参考二维分类31的来源.从这一初始分类中选择了9个具有代表性的2d 类平均值, 并将其用作整个数据集的自动粒子拾取模板。对自动定影粒子进行了人工检测, 去除了明显的坏颗粒, 并采用了三轮二维分类来细化自动驾驶仪颗粒的选择 (图 5)。这些二维类选定粒子被分为五个三维类, 使用60的低通滤波器作为初始参考模型。在这五个类中, 只有一个显示了高分辨率要素 (图 5)。此类的粒子进一步受到局部细化的影响, 高分辨率限制为 4.5, c4 对称性应用 (图 5)32。对改进后的模型进行了人工检查和修改。通过对 fsc 曲线的计算, 确定了最终模型与 em 图之间的差异, 并通过对原子模型33的几何形状进行了评价, 验证了该结构的有效性。
以 trpm4 结构 (pdb 5wp6) 的 tmd 域为指导34, 进行了初始模型构建。htrpc3 模型的新建场主要以体积残基和二级结构预测为指导, 结构中的许多α螺旋极大地方便了寄存器的分配。在初始新建立的模型中, 二次结构特征和块状残留物的顺序、长度和位置与预测密切相关。在完善过程中, 该决议的限制低于最后重建的估计决议。三维 fsc 用于测量傅里叶空间中相应外壳上两个独立生成的三维映射 (每个映射使用数据集的一半) 之间的归一化相关系数 (作为空间频率的函数)。我们采用了4.3 的软掩模和另外4.3 余弦软边以及10的低通滤波器, 然后使用了黄金标准 fsc 0.143 截止阈值。这被用于最后的决议报告。
图 1: 使用 bacmam 系统表达和纯化 htrpc3.(a) htrpc3 表达和纯化示意图。(b) 蓝白指示板上的芽孢菌落选择。选择一个孤立的白色群体 (黑色箭头), 而不是一个嵌入蓝色殖民地或与蓝色群体 (红色箭头) 接触的白色群体。(c) 20x 放大倍率下 sf9 细胞中 p2 baculovirus 的 Sf9 荧光。荧光应该是明亮的, 并存在于细胞膜和 (或大多数细胞的内部) 的强效病毒。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: fsec 对 htrpc3 进行稳定性筛选.(a) 对 htrpc3 进行洗涤剂筛选。htrpc3 在各种洗涤剂中溶解, 临界胶束浓度为 0.01-20 mm, 并在含有 ddmschs 的缓冲液中运行。虽然 ddm/chs 显示出最高的溶解度 htrpc3, 高峰出现在错误的位置, 太大, 无法成为四美洲 htrpc3 (蓝色痕迹)。(b) trpm4 控制, 四系分子量约 540 kda, 在 ddm/chs 中溶解并运行, 洗脱体积约为12.9 毫升, 而 trpc3, 四核分子量约为 400 kda, 溶解和运行在 ddm/chs 中, 洗脱体积约为11.9 毫升。在分子量较小的情况下, htrpc3 的洗脱体积预计将略高于 trpm4, 而不是稍小, 这表明 ddmsm-chs 可能不是 htrpc3 增溶和纯化的理想洗涤剂。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: fsec 对 htrpc3 进行洗涤剂缓冲筛选.(a) 使用数字素对 htrpc3 进行溶解度和稳定性试验。对 digitinin 进行了增溶和运行缓冲液的测试。请注意, 与 ddm/chs 中的蛋白质溶解性 (黄色痕量与蓝色和红色痕迹) 相比, 在数字素中溶解的 htrpc3 蛋白的峰值位置向更大的洗脱体积转变。只有在增溶和运行缓冲区中使用数字素的组合显示 fsec (黄色痕迹, 星号) 的 htrpc3 的正确大小。(b) 与 fsec 的结果一样, 全细胞溶解性 hTRPC3,the 的结果是, 在数宁 (红色痕量, 14ml) 中纯化的 hTRPC3,the 蛋白亲和力的峰值位置与 ddmmcs 中纯化的蛋白亲和力 (蓝色) 相比, 转向了更大的洗脱量以 sec-fac-fact馏测量的轨迹, 12 毫升)。(c) 在低温-em 数据收集之前, 采用负染色 em 验证纯化蛋白的质量。一个理想的污点应该存在微粒 (红色圈子) 消极地染色 (出现白色) 和由洗涤剂圆环围拢 (出现黑)。给出了一种具有代表性的、理想的微图, 其中这些粒子丰富、单分散, 并存在于多个方向。(d) 负染色 em 的高质量数据应为2d 类提供清晰和一致的一般结构, 并应包含蛋白质的多个方向, 平均值包含在掩模 (黑圈) 内。来自 hTRPC3 的负染色 em 显微镜图的2d 类在 ddm/chs 中溶解, 这些粒子似乎是 htrpc3 单体的面对面的二聚化。相反, 一个粗糙 (但清晰和一致) 整体中高象亚美异构异构结构是明显的2d 类负染色 em 显微图像 htrpc3 溶解在数字素。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: htrpc3 的纯化.(a) 在 edta 存在的情况下, 对 htrpc3 进行稳定性试验。在 10 mm edta 存在 (红色痕迹) 或不存在 (蓝色轨迹) 的情况下, htrpc3 在数字素中溶解。前者在四聚体蛋白位置 (红色痕量、星号) 呈单峰和窄峰, 表明 edta 在其四态构象中稳定了 htrpc3。(b) gfp 荧光信号 fsec 用于 htrpc3 溶解在数字素中, 并在数字素缓冲液中运行。在金属亲和柱纯化 (蓝色痕量、星号) 之前, 在溶解性物质中观察到四聚体峰。在流动分数中没有这个峰值, 这表明 htrpc3 蛋白在亲和柱 (红色痕迹) 中完全结合在一起。用咪唑洗脱后, 用 fsec (绿色痕迹) 对洗脱峰中的分数进行检测。收集所有显示完整的四聚体峰的分数, 以便进一步纯化。(c) 用凝血酶检测 htrpc3 的 gfp 裂解。在4°c 下使用少量蛋白质测试消化时间, 并由 fsec 检查消化的完整性。在每个轨迹中, 左侧的峰值对应于 htrpc3 四聚体峰值 (星号), 右侧的峰值为免费 gfp 峰。随着消化时间的增加, 四态蛋白与游离 gfp 的比例下降, 表明 gfp 正被从蛋白质中裂解。2小时的消化显示 gfp 的完全裂解。(d) 在含有 10 mm edta 的流沙苷运行缓冲液中, 在凝血酶消化之前或之后, sec 配置文件 htrpc3。正如预期的那样, 在凝血酶消化 (红色痕迹) 后, 峰值位置会转移到较小的洗脱体积。主峰 (星号) 表示四美式 htrpc3。收集红线间的分数进行低温 em 实验。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: htrpc3 的低温-em 数据收集和处理示意图.利用电子显微镜和直接电子探测器收集了3660电影, 其中纯化的 htrpc3。应用了运动校正和手动选择, 产生了 3 580部缩微图像。对粒子进行了自动分解, 并进行了二维分类。通过3d 分类进一步细化了2d 类。只有五分之一的3d 类显示高分辨率功能。这个类被选择为3d 细化和重新调整局部细化, 导致了一个结构的 htrpc3 在3.3 分辨率。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在过去几年里, 由于开发了新的摄像机和算法, 显著加快了蛋白质的结构测定, 而这些相机和算法并没有显著加快蛋白质的结构测定, 因此, 用低温 em 对蛋白质进行结构测定已经给结构生物学领域带来了革命性的变化。容易结晶, 特别是膜蛋白。尽管冷冻-em 技术最近取得了所有进展, 但在质量和数量上足以促进高质量成像的纯化蛋白的制备通常仍然是耗时、昂贵和具有挑战性的。如上述协议所述, 能够在各种纯化条件下快速表达和筛选多个基因结构, 从而通过快速、经济高效地生产高质量产品, 提高了这一过程的效率纯化蛋白, 用于低温-em 研究。
虽然这里描述的方法提供了一种方法, 以更低的成本净化大量的哺乳动物膜蛋白比通过直接转染和更快的速度比生成一个稳定转染的细胞系, 它有许多步骤, 每个步骤都必须优化提供高质量的蛋白质产量。在用于生产和纯化 htrpc3 的生化技术中, 有许多关键的步骤和检查点。第一个关键检查点是生产 bacmacmt dna。正如结果中所描述的, 理想的群体选择是产生高质量的蛋白质表达病毒的第一步。此外, 如果从所选择的菌落中纯化的杆菌 dna 浓度小于 1μgμl, 则产生的病毒将不足以实现粘力蛋白表达。第二个关键检查点是生产 p1 和 p2 杆菌病毒。病毒滴度可以用 gfp 荧光估计, 如图 1 c 所示, 也可以测量 coleman 等人所述.35. 除了病毒滴度外, 还应对每一个新的结构进行感染时间的过程, 以确定最佳的感染时间, 从而最大限度地表达蛋白质。关键检查点三是溶解度和稳定性筛选, 如图2所示。具有高 cmc 的洗涤剂 (如 ddm) 可能会提供较高的溶解度, 但它们不适合低温成像, 因为它们会导致大量污染胶束。温和的洗涤剂, 如数宁, 可以提供足够的溶解度, 同时保持蛋白质的稳定性。在 htrpc3 的情况下, 对添加剂 (如 edta) 进行筛选对于发现一种净化条件非常重要, 这种条件会产生完整和均匀的蛋白质, 可能是通过从 htrpc3 中去除钙来实现的, 而 htrpc3 对钙具有渗透性。关键检查点四是在亲和柱纯化过程中验证特异性和有效的蛋白质捕获, 并在 sec分馏过程中观察理想的蛋白质峰值 (图 4)。避免在保留所有目标蛋白的同时加入污染蛋白质颗粒对于获得足够高的蛋白质产量以进行低温 em 成像至关重要。改变糊结合时间和树脂与溶解蛋白的比例有助于提高树脂柱的蛋白质保留率。在我们的经验中, sec-分馏峰的整体质量是纯化蛋白质颗粒质量的最佳指标, 在成像之前。在 sec-futac-sparit化过程中的低或宽峰值表明, 每个图像的蛋白质颗粒太少或存在污染的蛋白质聚集/降解产物, 这可能是一个问题。此外, 在某些情况下, 对构造本身中的关联标记进行更改已被证明是必要的, 以确保足够的亲和力标记绑定。在收集低温-em 数据集之前的最后一个检查点是用负染色 em 验证蛋白质颗粒质量。虽然不是绝对必要的, 但我们发现, 这提供了一个很好的机会, 在投资通过低温 em 收集数据的时间和成本密集型过程之前, 可以发现和纠正蛋白质质量问题。
用于低温 em 结构研究的蛋白质的另一种替代方法是直接纯化来自原生组织源的蛋白质。虽然这种方法经常遇到蛋白质产量的问题, 但对于细胞中非常丰富的蛋白质或作为大型多蛋白质复合体存在的蛋白质来说, 它是一个很好的替代方法, 使用重组的过度表达很难产生系统36。然而, 对于生理条件下中、低量表达的单一蛋白质, 本文提出的表达和纯化系统是生产纯化哺乳动物膜蛋白的一种有效、相对低成本和高产的方法。用于低温-em 结构研究。其中一种方法可以有力地补充这里提出的方法是在低温 em 数据收集37之前将纯化的蛋白质重组为脂质纳米盘。在这种方法下, 蛋白质被嵌入到一个小盘脂质双层, 可能提供了一个本土式的微环境相比, 洗涤剂胶束, 虽然目前还没有证据表明溶解在洗涤剂和纳米盘的结构不同的 38,39,40。另一种方法是直接提取蛋白质, 如马来酸酐 (sma), 这已成功地用于测定膜蛋白结构41,42。
本手稿中描述的这些方法已被证明很容易适应我们的实验室中的各种其他哺乳动物膜蛋白超越离子通道。因此, 我们相信该协议将是一个有价值的工具, 在结构和功能分析的基础上高度特异性有针对性的药物设计。这将在神经退行性疾病、心血管疾病和癌症中特别有用, 在这些疾病中, 离子通道是困难但潜力大的药物靶点。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢赵先生和孟先生在大卫·范安德尔高级冷冻电子显微镜套房的数据收集方面给予的支持。我们感谢 vari 高性能计算团队提供的计算支持。我们感谢 n. clemente、d. dues、j. floramo、y. 黄、y. kim、c. mueller、b. roth 和 z. ruan 提出的意见, 这些评论大大改进了这份手稿。我们感谢 d. nadziejka 对这份手稿的编辑支持。这项工作得到了 vari 内部资金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEG BacMam vector (pFastBacI) | addgene | 31488 | |
| DH10α cells | Life Technologies | 10361-012 | |
| S.O.C. media | Corning | 46003CR | for transformation of DH10α cells for Bacmid |
| Bacmam culture plates | Teknova | L5919 | for culture of transformed DH10α cells |
| Incubation shaker for bacterial cells | Infors HT | Multitron standard | |
| Incubated orbital shaker for insect cells | Thermo-Fisher | SHKE8000 | |
| Reach-in CO2 incubator for mammalian cells | Thermo-Fisher | 3951 | |
| Table-top orbital shaker | Thermo-Fisher | SHKE416HP | used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells |
| Incubator | VWR | 1535 | for bacterial plates |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | for plasmid extraction and purification |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol | Invitrogen | 15593031 | for DNA extraction |
| Sf9 cells | Life Technologies | 12659017 | insect cells for producing virus |
| Sf-900 media | Gibco | 12658-027 | insect cell media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cellfectin II | Gibco | 10362100 | for transfecting insect cells |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | for transfecting mamalian cells |
| 0.2 mm syringe filter | VWR | 28145-501 | for filtering P1 virus |
| 0.2 mm filter flasks 500ml resevoir | Corning | 430758 | for filtering P2 virus |
| erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) | Gene Mate | F-5909-2000 | for culturing insect cells |
| erlenmeyer culture flask (baffled 2L) | Gene Mate | F-5909-2000B | for culturing mammalian cells |
| nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | for determining DNA and protein concentrations |
| HEK293 | ATCC | CRL-3022 | mammalian cells for producing protein |
| Freestyle 293 expression Medium | Gibco | 1238-018 | mammalian cell media for protein expression |
| Butyric Acid Sodium Salt | Acros | 263195000 | to amplify protein expression |
| PMSF | Acros | 215740500 | protease inhibitor |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-100MG | protease inhibitor |
| Leupeptin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 24125-16-4 | protease inhibitor |
| pepstatin A | Fisher Scientific | BP2671-250 | protease inhibitor |
| digitonin | EMD Millipore | 300410 | detergent - to solubilize protein from membrane |
| imidazole | Sigma | 792527 | to elute protein from resin column |
| TALON resin | Clonetech | 635504 | for affinity purification by His-tag |
| superose6 incease columns | GE | 29091596; 29091597 | for HPLC and FPLC |
| Prominence Modular HPLC System | Shimadzu | See Below | |
| Controller Module | " | CBM20A | |
| Solvent Delivery System | " | LC30AD | |
| Fluorescence Detector | " | RF20AXS | |
| Autosampler with Cooling | " | SIL20ACHT | |
| Pure FPLC System with Fractionator | Akta | ||
| thrombin (alpha) | Haematologic Technologies Incorporated | HCT-0020 Human alpha | for cleaving GFP tag |
| Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube | Millipore | UFC910008 | for concentrating protein |
| EDTA | Fisher | E478500 | for stabilizing protein |
| 400 mesh carbon-coated copper grids | Ted Pella Inc. | 01754-F | grids for negative stain |
| Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | grids for Cryo-EM |
| Vitrobot Mark III | FEI | for preparing sample grids by liquid ethane freezing | |
| liquid nitrogen | Dura-Cyl | UN1977 | |
| ethane gas | Airgas | UN1035 | |
| Solarus Plasma System | Gatan | Model 950 | for cleaning grids before sample freezing |
| Tecnai Spirit electron microscope | FEI | for negative stain EM imaging | |
| Talos Arctica electron microsocope | FEI | for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids | |
| Titan Krios electron microscope | FEI | for high-resolution Cryo-EM imaging | |
| Software | |||
| Gautomatch software | http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ | to pick particles from micrographs | |
| Relion 2.1 software | https://github.com/3dem/relion | to construct 2D and 3D classification | |
| CryoSPARC software | https://cryosparc.com/ | to generate an initial structure model | |
| Frealign software | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | to refine particles | |
| Coot software | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | to build a model | |
| MolProbity software | http://molprobity.biochem.duke.edu/ | to evaluate the geometries of the atomic model | |
| SerialEM software | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | for automated serial image stack acquisition | |
| MortionCor2 software | http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html | for motion correction of summed movie stacks | |
| GCTF software | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | for measuring defocus values in movie stacks | |
| Phenix.real_space_refine software | https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html | for real space refinement of the initial 3D model |
References
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