Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Proteinekspression og -oprensning af menneskelige Lipid-følsomme kation kanal TRPC3 for Strukturbestemmelse af enkelt-partikel kryo-elektronmikroskopi

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58754
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 1, 1
1Van Andel Institute, 2Vollum Institute, 3Janelia Research Campus
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver teknikker, der anvendes til at bestemme ion-kanal strukturer af kryo-elektronmikroskopi, herunder en baculovirus, der anvendes til effektivt express gener i pattedyrceller med minimalt besvær og toksicitet, protein udvinding, rensning, og kvalitet kontrol, gitter forberedelse af prøver og screening, samt indsamling af data og forarbejdning.

Abstract

Forbigående receptor potentielle kanaler (TRPCs) af de kanoniske TRP underfamilie er nonselective kation kanaler, der spiller en afgørende rolle i calcium homeostase, især butik-drevet calcium indrejse, der er afgørende for at opretholde ordentlig funktion af Synaptic vesikel frigivelse og intracellulær signalering veje. Derfor har TRPC kanaler været impliceret i en bred vifte af menneskelige sygdomme, herunder hjerte-kar-lidelser som Hjertehypertrofi, neurodegenerative sygdomme som Parkinsons sygdom og neurologiske sygdomme såsom spinocerebellar ataksi. Derfor repræsenterer TRPC kanaler et potentielle farmakologiske mål i menneskelige sygdomme. De molekylære mekanismer af gating i disse kanaler er dog stadig uklart. Er svært at opnå store mængder af stabile, homogene og renset protein har været en begrænsende faktor i struktur bestemmelse undersøgelser, især for pattedyr Membranproteiner såsom TRPC Ionkanaler. Vi præsenterer her, en protokol for den store udtryk for pattedyr ion-kanal Membranproteiner ved hjælp af en modificeret baculovirus gen transfersystemet og rensning af disse proteiner af affinitet og størrelse-udelukkelse kromatografi. Yderligere præsenterer vi en protokol til at indsamle enkelt-partikel cryo-Elektron Mikroskopi billeder fra oprenset protein og bruge disse billeder til at bestemme protein struktur. Struktur bestemmelse er en kraftfuld metode til at forstå mekanismerne af gating og funktion i Ionkanaler.

Introduction

Calcium er involveret i de fleste cellulære processer herunder signalering cascades, transskription kontrol, neurotransmitter frigivelse og hormon molekyle syntese1,2,3. Det homeostatiske vedligeholdelse af cytosole gratis calcium er afgørende for sundhed og funktion af celler. En af de vigtigste mekanismer af intracellulære calcium homeostase er butik-drevet calcium post (SOCE), en proces, hvori opbevares nedbrydning af calcium i det endoplasmatiske reticulum (ER) udløser åbning af Ionkanaler på plasma membran til at lette de genbestilling af ER calcium, som derefter kan bruges i yderligere signalering4,5,6. Forbigående receptor potentielle kanaler (TRPCs), som er calcium-gennemtrængelige kanaler tilhører TRP superfamilien, er blevet identificeret som en vigtig deltager i SOCE7,8,9 .

Blandt de syv medlemmer i familien TRPC, TRPC3, TRPC6 og TRPC7 udgør en homolog undergruppe, og de er unikke evne til at blive aktiveret af lipid sekundære messenger diacylglycerol (DAG), en nedbrydning produkt af den signaling lipid phosphatidylinositol 4,5-bisfosfat (PIP2)10,11. TRPC3 er stærkt udtrykt i glatte muskulatur og i de cerebrale og cerebellare regioner af hjernen, hvor det spiller afgørende roller i calcium signalering, der påvirker neurotransmission og neurogenese12,13. Dysfunktion af TRPC3 har været knyttet til central nervesystemet, hjerte-kar-lidelser og visse kræftformer såsom æggestokkene adenocarcinom14,15,16. Derfor holder TRPC3 løfte som farmaceutiske mål for behandling af disse sygdomme. Udvikling af specielt målrettet narkotika handler på TRPC3 har været begrænset af mangel på forståelse af dens molekylære aktivering mekanismer, herunder lipid bindende websteder17,18. Vi har rapporteret første atomic-opløsning strukturen af den menneskelige TRPC3 kanal (hTRPC3) og dens to lipid bindingssteder i lukket tilstand, give vigtig indsigt i disse mekanismer19.

Den vigtigste faktor til at bestemme strukturen af en membran proteiner med høj opløsning er at få protein af høj kvalitet. Tilsvarende screening af proteinekspression og -oprensning betingelser for at opnå høj kvalitet protein kan være en tidskrævende og dyre bestræbelse. Her præsenterer vi en protokol, der beskriver i detaljer hvordan vi identificere de optimale betingelser for den proteinekspression og -oprensning af hTRPC3, som opførte sig dårligt i vores indledende screening. Vi præsenterer flere vigtige punkter om, hvordan fejlfinding og optimere protein adfærd, som lå et solidt fundament for vores cryo-Elektron Mikroskopi (cryo-EM) undersøgelser. Vi bruger en modificeret baculoviral generere vektor (pind), udviklet af Gouaux og kolleger, som er optimeret til screening-assays og effektiv generation af baculovirus i pattedyrceller20. Dette udtryk metode er velegnet til hurtig og omkostningseffektiv overekspression af proteiner i pattedyr cellemembranen. Vi kombinerer brugen af denne vektor med en registrering af fluorescens størrelse-udelukkelse kromatografi-baseret (FSEC) prescreening metode21. Denne metode bruger et grønt fluorescerende proteiner (NGL) tag smeltet til konstruktionen af interesse og forbedrer visualisering af target proteinet i små, hele-celle solubilized prøver. Dette giver mulighed for screening af protein stabilitet i overværelse af forskellige vaskemidler og tilsætningsstoffer, med thermostabilizing mutationer, og tillader brug af et lille antal celler fra små forbigående Transfektion. På denne måde, kan en lang række betingelser screenes hurtigt før du flytter til en storstilet protein oprensning. Efter udtryk, screening og rensning præsenterer vi en protokol for at opnå og behandling af billeder fra cryo-EM til at generere en de novo Strukturbestemmelse af proteiner. Vi mener, at metoderne beskrevet her vil tjene som et generaliserbart protokol for strukturelle undersøgelser af TRP kanal receptorer og andre Membranproteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forvandling af DH10α kompetente celler til at producere Bacmid DNA

  1. Syntetisere gen af interesse og subclone det i en modificeret udgave af den pind vektor indeholdende en twin strep-tag, His8-tag og normal god landbrugspraksis med en thrombin kavalergang site på N terminus (pFastBacI)20.
  2. Omdanne kompetente celler ved at tilføje 5 ng af plasmid indeholder et ønskede gen i pFastBacI til 50 μl DH10α celler i en 1,5 mL tube og inkuberes i 10 min. på køl. Heat shock celler for 45 s på 42 ° C. Tilføje 200 μl af super optimal bouillon med kataboliske repressor (SOC) medium til røret, og der inkuberes i 4-8 timer ved 37 ° C i en orbitalryster på 225 rpm.
  3. Plade 5 μl af celler på en bacmid LB-agar plade (50 μg/mL kanamycin, 7 μg/mL gentamicin, 10 μg/mL tetracyclin, 100 μg/mL Bluo-gal og 40 μg/mL isopropylalkohol β-D-1-thiogalactopyranoside [IPTG], agar).
  4. Inkuber plade i 48 timer ved 37 ° C.
    Bemærk: Bluo-gal indikator pletter kolonier, der stadig udtrykker lacZ (vektor indsættelse mislykket), giver mulighed for valg af hvid (med held omdannes) kolonier.
  5. Omhyggeligt vælge en isoleret hvid koloni, undgå eventuelle hvide kolonier, der er i kontakt med blå kolonier, og dyrke celler overnatning i 6 mL af bacmid LB medium (50 μg/mL kanamycin, 7 μg/mL gentamicin, 10 μg/mL tetracyclin) ved 37 ° C i en orbitalryster på 225 rpm.

2. Bakteriers forberedelse til Isolation af Bacmid DNA

  1. For at isolere bacmid DNA, spin ned Escherichia coli celler i 10 min på 2880 x g.
  2. Fjern supernatanten og resuspend pellet i 200 µL af celle resuspension løsning fra miniprep kit (Se Tabel af materialer) af pipettering. Sørg for pelleten afbrydes helt og homogen måde. Derefter, overføre cellesuspension til 1,5 mL rør.
  3. Tilføje 200 µL af celle lysis løsning fra miniprep kit og bland ved at vende røret et par gange. Der inkuberes i op til 5 min ved stuetemperatur (RT) til lyse celler. Tilføje 200 µL af neutralisering løsning fra miniprep kit og mix af invertere rør et par gange at stoppe lysis reaktion.
  4. Spin ned til 10 min på 21,130 x g i en tabel-top centrifuge. Indsamle 600 μl af supernatanten i et 2 mL tube. Tilføje 600 μl phenol: chloroform: isoamyl alkoholopløsning (Se Tabel af materialer) og blandes grundigt at udtrække DNA fra resten af cellen lysis produkter.
    Forsigtig: Phenol: chloroform: isoamyl alkoholopløsning er giftigt ved indånding, ved hudkontakt, og ved indtagelse. Det kan forårsage kemiske forbrændinger og kan være kræftfremkaldende. Bære handsker og en knappet laboratoriekittel. Arbejde i et stinkskab. Bortskaffe dette affald korrekt.
  5. Spin-røret i 10 min på 21130 x g i en tabel-top centrifuge. To separate flydende faser vil være synlige. Omhyggeligt overføre 300 μL af øvre vandig fase til en ny tube. Tilføje 600 μl af 100% ethanol til at vaske DNA. Forsigtigt vendes i røret til mix.
    Bemærk: Du må ikke vortex, som dette kan vride bacmid DNA.
  6. Cool rør ved at placere dem i en-20 ° C fryser i 10 min. Spin ned til 10 min på 21,130 x g i en tabel-top centrifuge. Supernatanten og bevare DNA pellet.
  7. Der tilsættes 1 mL af 70% ethanol til at vaske pelleten. Forsigtigt vendes i røret til mix. Spin i 10 min på 21,130 x g i en bordplade centrifuge. Supernatanten og tillade pellet til luft tørre i ca 5 min eller indtil ingen væske er synlige i røret og DNA pellet bliver gennemsigtig.
  8. Resuspenderes tør i 50 µL sterilt, DNase-frit, deioniseret vand. Måle DNA-koncentrationen.
    Bemærk: Ikke fryse bacmid DNA. Opbevares ved 4 ° C i op til flere dage.

3. Transfektion af Sf9 insekt celler med Bacmid til at producere P1 Baculovirus

  1. Frø 0,9 x 106 Sf9 celler/brønd i 2 mL af passende medium (Se Tabel af materialer) i hver brønd med en 6-godt vævskultur plade. Inkuber celler på 27 ° C i 20 min. til at fremme tilknytning til pladen.
    Forsigtig: Cellekulturer er en potentiel biohazard. Arbejde i en godkendt laminar flow hætte med aseptisk teknik og kontrollere institutionelle og statslige retningslinjer for anbefalede beskyttende tøj og korrekt bortskaffelse af affald forud for udførelse af eksperimenter.
  2. Efter vedhæftet fil, tilføje 8 µL Transfektion reagens (Se Tabel af materialer) til 100 µL af medier til hver brønd med 6 godt plade er transfekteret i en steril tube. Tilføje 6 μg af bacmid DNA til 100 µL af medium i et separat sterile rør. Inkuber 5 min på RT. kombinere to løsninger og Inkuber i 45 min. ved RT.
  3. Erstatte medium i 6 brøndene med 2 mL frisk medium. Tilføj blandingen fra forrige trin til hver godt dråbevis (200 µL pr. brønd). Forsigtigt rock plade for at sikre blanding af Transfektion løsning til mediet.
    Bemærk: Ikke swirl eller ryste pladen, fordi dette vil medføre celler til at løsne.
  4. Inkuber celler til 5 d (120 h) i en 27 ° C befugtet inkubator. Check normal god landbrugspraksis fluorescens før høsten for at kontrollere, at virus bliver produceret i en stor procentdel af celler; Hvis procentdelen er lav, udvide inkubationstiden efter behov (Se figur 1 c).
  5. Indsamle supernatanten indeholdende P1 virus (ca. 2 mL fra hver brønd). Filtrere det medium, der indeholder P1 virus ind i 2-mL-rør ved hjælp af en 3 mL sprøjte og små 0,2 µm filter. Tilføje sterile føtal bovint serum (FBS) til en endelig koncentration på 1%.
    Bemærk: Denne bestand af P1 virus skal opbevares ved 4 ° C og beskyttes mod lys.

4. infektion af Sf9 insekt celler med P1 Baculovirus at producere P2 Baculovirus

  1. Forberede 200 mL (eller ønskede volumen) af Sf9 celler i en koncentration på 0,8 - 0,9 x 106 celler/mL i passende medium (Se Tabel af materialer) i en flad bund kultur Erlenmeyerkolben af tilstrækkelig størrelse.
    Bemærk: For suspension kultur, forbrugte volumen bør ikke overstige 40% af den samlede kapacitet på kolben.
  2. Tilføje 1: 2500 ratio (v/v) af P1 virus bestand fra 3,5 til Sf9 celle suspension kultur. Inkuber i tidspunktet for optimal virus udtryk (normalt 48-120 h afhængigt af protein konstruktion) på 27 ° C i en orbitalryster på 115 rpm.
    Bemærk: Relative virus udtrykket kan bestemmes ved visning af normal god landbrugspraksis fluorescens af virus i en stikprøve af kultur.
  3. Centrifugeres cellesuspension til 40 min. ved 11,520 x g og indsamle supernatanten indeholdende P2 virus. Filtrer supernatanten ved hjælp af engangs 0,2 µm filtre. Tilføje FBS til en endelig koncentration på 0,5%.
    Bemærk: Denne bestand af P2 virus skal opbevares ved 4 ° C og beskyttes mod lys.
  4. Opnå en titer for P2 virus ved hjælp af Sf9easy celler eller en virus counter.

5. infektion af HEK293 pattedyrceller med P2 Baculovirus for storstilet Protein udtryk

  1. Forberede en ønskelig volumen af HEK293 pattedyr celle suspension kultur (4-6 L anbefales til forberedelse af frosne gitre) ved en koncentration på 3,5-3,8 x 106 celler/mL i udtryk medium (Se Tabel af materialer) suppleret med 1% (v / v) sterile FBS i forbløffet bunden Erlenmeyerkolben kultur kolber af tilstrækkelig størrelse.
    Bemærk: For suspension kultur, forbrugte volumen bør ikke overstige 40% af den samlede mængde af kolben.
  2. Tilføje 8% (v/v) af P2 virus stamopløsning fra trin 4.3 til HEK293 celle suspension kultur. Der inkuberes ved 37 ° C i en orbitalryster på 135 rpm.
  3. Tilføje 10 mM natrium butyrat på 12-18 h efter infektionen. Inkuber i tidspunktet for optimal protein udtryk (normalt 36-72 h) på 30 ° C.
  4. Høste celler ved centrifugering i 20 min. på 2,880 x g. Vaske cellerne ved resuspending i ca 100 mL tris-bufferet saltvand (TBS) pr. liter af celler høstet. Centrifugeres igen i 20 min ved 2,880 x g og indsamle celle pellet.
    Bemærk: Protokollen kan midlertidigt her. Celle pellets kan snap-frosset i flydende nitrogen og opbevares ved-80 ° C indtil rensning.
    Forsigtig: Flydende kvælstof kan forårsage kryogene forbrændinger eller skade. Det kan forårsage forfrysninger. Det kan fortrænge ilt og forårsage hurtige kvælning. Bære kold isolerende handsker og ansigtsskærm.
  5. Indsamle små 1 mL høst på varierende tidspunkter og solubilize i 2 timer ved 4 ° C med rokkende eller omrøring i overværelse af forskellige rengøringsmidler og/eller tilsætningsstoffer. Disse små hele-celle solubilized prøver kan afklares af ultracentrifugering ved 235,000 × g i 10 min. ved 4 ° C og Kør som en 30 μL prøve på en størrelse-udelukkelse kromatografi (SEC) kolonne (Se Tabel af materialer) til at bestemme den bedste tid for udtryk og de bedste betingelser, oploesning.
    Bemærk: I tilfælde af hTRPC3, denne screening omfattede forskellige buffere med pH-værdier fra 4.0-9.5 og salt koncentrationer på 50-500 mM; forskellige ionisk kompositioner (f.eks. MgCl2 eller NaCl); forskellige vaskemidler med kritiske micelle koncentration (CMC) værdier af 0,1 - 20 mM; at reducere tilsætningsstoffer som dithiothreitol, tris(2-carboxyethyl) phosphine og β-mercaptoethanol; og calcium-chelaterende tilsætningsstof ethylendiamintetra syre (EDTA).

6. rensning af hTRPC3 Protein fra den frosne celle Pellet

  1. Tø pellet i buffer, som indeholder 20 mM Tris (pH 8.0), 500 mM NaCl, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF), 0,8 μM aprotinin, 2 μg/mL leupeptin, 2 mM pepstatin A, og 1% digitonin, ved hjælp af 100 mL buffer pr. liter af celler høstet. Når optøet, sikre ensartethed af løsningen af pipettering eller omrøring. Gør det muligt for at solubilize i 2 timer ved 4 ° C i et bægerglas, nedsænket i isen med en røre bar roterende.
  2. Fjern celle debris ved ultracentrifugering ved 235,000 × g i 1 time ved 4 ° C. Kontrollere protein mængde ved at køre en 30 μL prøve på et sekund kolonne (Se Tabel af materialer) ved højtryksvæskekromatografi (HPLC) og visualisere target proteinet ved normal god landbrugspraksis signaludgang.
  3. Inkuber solubilized protein (supernatanten) med kobolt affinitet harpiks i 1-2 timer ved 4 ° C. Kontrollere protein binding til harpiks, der er ved at køre en 30 μL prøve på et sekund kolonne.
    Bemærk: Hvis protein binding er opstået, normal god landbrugspraksis tagged protein mål vil blive bevaret på kolonnen, blev ikke fundet i gennemstrømnings. Derfor vil ingen normal god landbrugspraksis signal være til stede på positionen svarende til protein Målstørrelse når gennemstrømnings-køres på HPLC.
  4. Vask harpiks med 10 kolonne mængder af buffer (20 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 15 mM imidazol og 0,1% digitonin). Check for protein tab ved at køre en 30 μL prøve på et sekund kolonne.
    Bemærk: Hvis protein tab fra kolonnen, der er opstået, normal god landbrugspraksis tagged protein mål vil blive fundet i wash buffer, der er gået hen over tekstkolonnen. Derfor vil normal god landbrugspraksis signal være til stede på positionen svarende til protein Målstørrelse når wash buffer er kører på HPLC. Hvis protein tab der er opstået, kan imidazol koncentrationen af wash buffer skal sænkes til at forhindre, at forstyrre hans tag binding til kolonnen affinitet.
  5. Elueres harpiks-bundet hTRPC3 med buffer (20 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 250 mM imidazol og 0,1% digitonin). Tilføje thrombin på 1:20 molære forhold (at kløve koden normal god landbrugspraksis) og tilsættes 10 mM EDTA (en hTRPC3 stabilisator) eluted prøven og der inkuberes i 3 timer ved 4 ° C. Kontroller, at protein har været elueres ved at køre 90 μL af en prøven fortyndes 1: 100 for en kolonne i SEK og kontrol af indholdet af en normal god landbrugspraksis signal på positionen svarende til protein Målstørrelse.
    Bemærk: på dette tidspunkt, tryptophan signalet fra total protein i eluering kan også ses. Kun target affinity-renset protein vil forblive i eluering og normal god landbrugspraksis og tryptophan signaler vil være nær identiske i profil. Hvis målet protein ses ikke i stor mængde i eluering men var ikke tabt i gennemstrømnings- eller vask, proteinet har sandsynligvis været bundet til kolonnen og kan være elueres ved hjælp af en højere koncentration af imidazol i bufferen.
  6. Koncentrere eluatet til 500 μL eller mindre i en 15 mL 100K centrifugal filter tube (Se Tabel af materialer) fra spinning på 2,880 x g ved 4 ° C i 5 min. intervaller. Resuspend protein af pipettering løsningen op og ned mellem spins at undgå overconcentrating.
    Bemærk: Centrifuge tid kan forkortes, som diskenheden nærmer sig den ønskede endelige rumfang.
  7. Indlæse koncentrat et sekund kolonne i buffer (20 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA og 0,1% digitonin). Køre.
  8. Kombinere peak fraktioner der indeholder den intakte TRPC3 tetramer, som visualiseret ved UV absorbans signal, og koncentrere sig igen til en endelig koncentration på mindst 5 mg/mL.

7. screening af Protein ved negativ-pletten elektronmikroskopi

  1. Drej på glow-decharge-maskine. Indstille programmet for udførelsen af en carbon-belagt gitteret ved hjælp af argon og ilt for 30 s. køre programmet for at gøre carbon-belægning på kobber 400-mesh Grid hydrofile før tilsætning af protein løsning.
  2. Oprettet fem 40 μL dråber sterilt vand og to 40 μL dråber 1% uranyl formate løsning (på lab film, bagepapir eller en lignende overflade, se Tabel af materialer). Tage gitter fra trin 7.1 og tilføje 2,5 μL af protein prøve 5 mg/mL (50-200 μM) på den mørke side og lad det sidde i 1 min.
  3. Efter 1 min, tørre gitteret ved hjælp af filtrerpapir. Rør ikke filtrerpapir direkte til gitter overflade; i stedet bringe papiret til kanten af en flydende droplet og tillade kapillaritet at trække væske fra gitteret i filteret papir.
  4. Dyp gitteret i første dråbe vand. Tør med filtrerpapir og Gentag med de resterende dråber af vand og den første dråbe uranyl formate. Tillader den anden drop af uranyl formate sidde i 1 min. og derefter tørre med filtrerpapir. Tillad gitter til fuldt luft tørre (ca. 1 min) før opbevaring.
    Bemærk: Denne farvning protokol kan være ideel for alle kombinationer af protein-vaskemiddel. Forskellige koncentrationer af uranyl formate pletten og forskellige længder af tid for pletten eksponering bør testes, hvis ovenstående trin ikke giver en plet med god kontrast.
  5. Billede gitre på en elektron mikroskop (Se Tabel af materialer) at kontrollere protein partikel kvalitet. Sikre at micrographs viser mange partikler, der er ensartet i udseende og distribution, vise god kontrast og matche den forventede størrelse af target proteinet.
  6. Generere foreløbige, lav opløsning, todimensionale (2D) klassifikationer ved hjælp af 50-100 micrographs (Se databehandling – trin 10) til at kontrollere, at partiklerne repræsenterer forskellige visninger af en enkelt ensartet struktur.
    Bemærk: Micrographs og foreløbige 2D klasser af tilstrækkelig god kvalitet, som beskrevet ovenfor, er en stærk indikator for at protokollen er tilstrækkelig optimeret til protein oprensning. Forberedelse og screening af cryo-EM gitre er begrundet på dette punkt.

8. EM prøveforberedelse

  1. Glød-udledning en guld holey carbon gitter (Se Tabel af materialer) som beskrevet i trin 7.1.
  2. Anvende 2,5 μL af koncentreret hTRPC3 protein prøven (5 mg/mL) på nettet. DUP gitteret for 1,5 s ved hjælp af en skamplet ikrafttræden 1 og en ventetid på 5 s ved 100% luftfugtighed og 4 ° C, derefter styrte gitteret i flydende Ethan afkøles med flydende kvælstof ved hjælp af en vitrifikation maskine.
    Bemærk: Fugtighed, temperatur, skamplet-kraft, skamplet tid og ventetid opført her blev brugt til forfatternes hTRPC3 undersøgelse19. De skal måske ændres til at producere optimale glasagtige is til andre proteiner og rengøringsmidler.
  3. Skærm frosset gitre til optimal isforholdene ved hjælp af en cryo-EM mikroskop (Se Tabel af materialer) og manuelt Se regioner af tyk is (gitter firkanter, der vises mindre og mørkere), tynd is (gitter firkanter, der vises større og lysere) og medium is .
    Bemærk: Tykkere is ofte holder flere partikler, mens tyndere is ofte giver bedre kontrast og opløsning. Brug manuelle screening af billeder til at bestemme, hvilke is betingelser resultater i et stort antal monodispersed partikler med god kontrast og opløsning. Når gode betingelser er verificeret, flytte til billedsamling på 300 kV cryo-EM mikroskop.

9. EM dataindsamling

  1. Ved hjælp af en automatiseret erhvervelse program, optage billedstakke i Super-resolution optælling mode med en arkiveret lodret pixelstørrelse af 1.074 Å på en elektron mikroskop drives på 300 kV med en nominel forstørrelse af 130.000 X direkte elektron detektor.
  2. Dosis-fractionate hvert billede til 40 rammer med en samlet eksponeringstid 8 s, med 0,2 s pr ramme og en dosering af 6.76 e− Å−2 s1 (nominel defocus værdier varierede fra 1,0 til 2,5 μm i forfatternes eksperiment).

10. EM databehandling

  1. Gennemføre motion korrektion af opsummerede film stakke22 og anslå defocus værdier23 ved hjælp af edb-software (Se Tabel af materialer)24.
  2. Vælge partikler fra micrographs. Brug disse plukket partikler til at konstruere en indledende reference-gratis 2D tarifering software24. Vælg ideel 2D klasse i gennemsnit skal bruges som skabeloner til automatiseret partiklen plukke for hele datasættet.
  3. Manuelt kontrollere kvaliteten af de auto-plukket partikler og fjerne dårlige partikler. Bruge flere runder af 2D klassificering til at rydde op plukkede partikler.
  4. Generere en indledende model25. Emnet 2D plukket partikler til tredimensionale (3D) klassificering (ca. 5 klasser) bruger C1 symmetri og en indledende genopbygning low-pass filter 60 Å som en referencemodel. Bestemme hvilke klasser har høj opløsning funktioner og kombinere partikler i sådan en klasse.
  5. Yderligere forfine partikler med C4 symmetri (for hTRPC3) anvendes den lokale raffinement og en høj opløsning grænse for partikel justering angivet til 4.5 Å26.

11. model bygning

  1. Opbygge en model (Se Tabel af materialer til den anvendte software). For hTRPC3, brug den transmembrane domæne (TMD) af forbigående receptor potentielle melastatin 4 (TRPM4) struktur protein data bank (FBF) 5wp6 som en guide27. Brug storskrald restkoncentrationer og sekundær struktur forudsigelse til at guide de novo bygning.
  2. Emnet den oprindelige model til reelle rum raffinement med sekundær struktur begrænsninger28. Manuelt undersøge den raffinerede model og remodify efter behov (Se Tabel af materialer til den anvendte software).
  3. Anvende Fourier shell korrelation (FSC) kurver for at beregne forskellen mellem den endelige model og EM kort til validering af den raffinerede struktur. Evaluere geometrier atomic modeller (Se Tabel af materialer til den anvendte software)29,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En skematisk oversigt over protokollen for udtryk og rensning af hTRPC3 er vist i figur 1A. Et billede af hTRPC3 bacmid pladen med ideelle hvide kolonier, ligner den en udvalgt til bacmid DNA oprensning, er vist i figur 1B. Vi fandt, at 48 h er ideel til klare Bluo-gal farvning fastholdes tilstedeværelsen af isolerede kolonier. Peak produktion af P2 virus for hTRPC3, som visualiseret ved normal god landbrugspraksis fluorescens, blev set efter 4 d af infektion i Sf9 insekt celler (figur 1 c).

P2 baulovirus blev høstet fra medierne, suppleret med 1% FBS, og bruges til at inficere en suspension af HEK293 pattedyrsceller. Natrium butyrat blev tilføjet til den inficerede celler 12-18 h efter virus at øge protein udtryk20. Celler blev derefter inkuberes i en yderligere 36 timer ved 30 ° C. Cellerne blev høstet og udsat for opløselighed og stabilitet screening af FSEC (figur 2A)21. Cellerne var oploeses ved hjælp af syv forskellige vaskemidler med CMC værdier af 0,01 - 20 mM på et vaskemiddel koncentrationen ca 10 gange værdien CMC. Efter hele-celle oploesning, celle lysis debris blev fjernet af ultracentrifugering og supernatanten solubilized proteinholdige blev indlæst på et sekund kolonne og køre på HPLC i n-dodecyl-β-D-maltopyranoside/cholesteryl hemisuccinate (Bettinas/CHS) vaskemiddel-holdige buffer til at sammenligne absolutte opløselighed og peak volumen position af hTRPC3 under forskellige betingelser i forhold til en TRPM4 kontrol (figur 2B). Vi valgte at bruge Bettinas/CHS som den første kører buffer for prøverne oploeses i forskellige rengøringsmidler, fordi Bettinas/CHS er de mest almindeligt anvendte vaskemiddelingredienser når løse strukturer af membranproteiner. Alle de forskellige vaskemiddel-solubilized TRPC3 prøver viste top stillinger ved omkring 11,9 mL, som er sandsynligvis for stor, fordi den tetramert form for hTRPC3 har en mindre molekylvægt end positivt kontrol menneskelige TRPM4 (figur 2A og Figur 2B).

Ikke desto mindre, fordi der ikke var nogen struktur af enhver TRPC kanal receptor at sammenligne vores resultater, og fordi den store Molekylær vægt kan være forårsaget af arkitekturen i TRPC3 eller andre faktorer, vi foretog en mindre rensning af hTRPC3 ved hjælp af 25 mL celler ved hjælp af Bettinas/CHS hele eksperimentet som Bettinas/CHS gav den bedste opløseligheden af hTRPC3. SEC-profil af hTRPC3 viste en monodisperse peak, men var stadig i top stand repræsenterer en højere molekylvægt end TRPM4 (data ikke vist). Vi tjekkede protein i peak brøkdel af SEC profil af negativ-pletten EM, fordi det er en hurtig metode til kontrol af protein kvalitet og kræver en meget lille mængde af protein. I Mikrograf, blev partikler observeret med to transmembrane domæner i den samme partikel. Det viste sig, at to hTRPC3 partikler dimerized i et head-to-head måde gennem samspillet mellem to cytosole domæner (figur 3D). Vi indgår derefter den reducerende reagens dithiothreitol (DTT) i rensning buffer til anden små rensning, i håb om at forstyrre dimerization af hTRPC3. Faktisk syntes et andet højdepunkt med lavere molekylvægt af SEC fraktionering. Men partiklerne syntes alt for lille til at være en intakt tetramer og viste ingen funktioner af membranproteiner som en transmembrane domæne. Det viste sig, at Bettinas/CHS ikke var et egnet rengøringsmiddel til rensning hTRPC3, på trods af at give den bedste opløselighed for hTRPC3.

Næste, vi prøvede en mildere vaskemiddel, digitonin, for at solubilize hTRPC3, og sammenlignede det med proteinet oploeses i Bettinas/CHS. Her brugte vi to forskellige kører buffere indeholdende Bettinas/CHS og digitonin, henholdsvis. Dette var vigtigt da vaskemiddel i den kørende buffer ofte bidrager til protein stabilitet, og at membran protein kan blive ustabilt, når du ændrer rengøringsmidler fra oploesning til FSEC. Proteinet kører i buffer indeholdende digitonin viste en lovende peak skift i retning af et lavere molekylvægt når oploeses i enten Bettinas/CHS eller digitonin. Protein oploeses ved og køre i digitonin viste det højeste punkt i en rimelig holdning i forhold til placeringen af den positive kontrol, menneskelige TRPM4 (figur 3A). Derefter flyttede vi fremad ved at udføre en mindre renseanlæg med 25 mL af celler. Selv om flere og bred toppe blev observeret af SEC (figur 3B), proteinet viste funktioner i et enkelt tetramert hTRPC3 kanal i 2D klassificering af negativ-pletten EM (figur 3 c og figur 3D). Vi konkludere, at digitonin er en ideel vaskemiddel til rensning af hTRPC3.

Vi skaleres op udtryk af hTRPC3 og udført en mellemstore rensning med 400 mL af celler i digitonin. Dermed, håbede vi at få tilstrækkeligt protein for et par frosne gitre uden spilde medium og vaskemiddel, før vi regnede ud de endelige betingelser for rensning af hTRPC3 i stor skala. Det sker ofte at Membranproteiner Vis ustabilitet når stærkt koncentreret til fremstilling af frosne gitre. Den renset og koncentreret protein ikke kun flyttet mod en højere molekylvægt af FSEC, men viste også støjende baggrund i cryo-EM gitre afbildet ved hjælp af en elektron mikroskop udstyret med en EMCCD kamera. Selv om vi var i stand til at observere enkelt, intakt tetramert receptorer, hTRPC3 renset i digitonin ikke var ideel til høj opløsning cryo-EM undersøgelser.

Yderligere at forbedre protein stabilitet, screenet vi et stort antal betingelser beskrevet i protokollen trin 5. Vi valgte at skærmen tilsætningsstoffer baseret på fysiologiske karakter af hTRPC3; fx., EDTA blev valgt fordi hTRPC3 er gennemtrængelig for calcium og fjerner calcium kan stabilisere proteinet. Af alle prøverne testet af FSEC kører i den digitonin-holdige buffer, 10 mM EDTA viste en bemærkelsesværdig effekt på stabiliserende hTRPC3 i en intakt tetramert peak position (figur 4A). Det også væsentligt øget antallet af partikler i cryo-EM Mikrograf og reduceret støj i baggrunden, som vist i figur 5.

Efter at have identificeret de ideelle betingelser for proteinekspression og -oprensning, udførte vi en storstilet udtryk (2 L) af hTRPC3. De celler, der indeholder hTRPC3 blev høstet og derefter solubilized. Ultracentrifuge-afklares lysate blev udsat for metal-affinitet kolonne rensning af batch-bindende med en kobolt harpiks efterfulgt af rensning i en tyngdekraft kolonne. Fastholdelse af solubilized protein i kolonnen og eluering af affinitet-renset protein fra kolonnen blev bekræftet ved FPLC (figur 4B). Vi fandt, at for hTRPC3, en imidazol koncentration på 15 mM i wash buffer var tilstrækkelige til at fjerne forurenende proteiner med uspecifikke harpiks bindende, og 250 mM imidazol i eluering buffer var tilstrækkeligt at eluere størstedelen af solubilized hTRPC3 protein bundet til harpiks. Alle prøver blev kontrolleret af FSEC, og den eluted protein viste en skarp, monodisperse top startposition korrekte peak. Som iboende fleksibilitet mellem normal god landbrugspraksis tag og hTRPC3 protein kan gøre tilpasningen af protein partikler under billedbehandling mere udfordrende, og fordi en thrombin kavalergang websted er placeret mellem normal god landbrugspraksis og hTRPC3, vi har testet en lille mængde renset protein ved forskellige kavalergang gange benytter thrombin protease. I betragtning af at den eluted protein inkuberes med thrombin på 1:20 molære forhold viste rimelig stabilitet og fuldstændig spaltning efter 2 h ved 4 ° C, vi kløvet off normal god landbrugspraksis fra alle oprenset protein ved hjælp af de samme betingelser og kontrolleret af HPLC til at bekræfte, at normal god landbrugspraksis er c ompletely fjernet (figur 4 c). Proteinet blev yderligere renset af S, og kløvningen af normal god landbrugspraksis kan igen visualiseres ved peak position Skift mod en mindre molekylvægt (figur 4D). En lille koncentreret udsnit fra den vigtigste peak fraktion blev brugt til at gøre gitre for negativ-pletten EM. Alle fraktioner der indeholder den tetramert hTRPC3 blev derefter kombineret og reconcentrated til en endelig koncentration på 5 mg/mL, som blev brugt til at forberede cryo-EM imaging gitre. Som vi har observeret at en del af proteinet stadig gradvist flyttet mod en større molekylvægt, vi indsamlet kun fraktioner på den korrekte molekylvægt og frøs gitrene umiddelbart efter protein oprensning. Vi afsluttet normalt sekvens af eksperimenter fra rensning af protein til forberedelse af frosne gitre inden for en enkelt dag.

En 2,5 μL prøve af renset hTRPC3 protein (koncentration 5 mg/mL) blev anvendt på en glød-udledes holey carbon gitter. En vitrifikation maskine blev brugt til at forberede gitteret, ved hjælp af en 1,5 s blotting tid under 100% luftfugtighed efterfulgt af en dukkert i flydende Ethan afkøles med flydende kvælstof. Dette trin fryser prøven i glaslegemet ice til billedbehandling. Billeder blev taget til fange på 130.000 X nominelle forstørrelse af cryo elektron mikroskop drives på 300 kV. Billedstakke blev registreret i Super-resolution optælling mode med en arkiveret lodret pixelstørrelse af 1.074 Å og en nominel defocus værdi spænder fra 1,0 til 2,5 μm ved hjælp af en direkte elektron detektor og automatiserede erhvervelse software. Hvert billede blev dosis-fraktioneret til 40 rammer med en samlet eksponeringstid 8 s (0,2 s pr. ramme) og en dosering af 6.76 e− Å−2 s−1. En repræsentativ Mikrograf fra dette datasæt er vist i figur 5.

Motion korrektion og estimering af defocus værdier for de summerede film stakke blev udført. Ca. 200 resulterende micrographs blev brugt som kilde til manuel partiklen plukke og indledende reference-gratis 2D klassificering31. Ni repræsentative 2D klasse gennemsnit fra denne oprindelige klassifikation blev valgt og bruges som skabeloner til automatiseret partikel pluk for hele datasættet. En manuel kontrol af autopicked partikler blev udført for at fjerne naturligvis dårlige partikler, så tre runder af 2D klassifikation blev anvendt til at indsnævre udvælgelsen af autopicked partikler (figur 5). Disse 2D-klasse valgte partikler blev inddeles i fem 3D klasser ved hjælp af et low-pass-filter 60 Å som en indledende referencemodel. Af disse fem klasser vises kun en høj opløsning funktioner (figur 5). Partikler fra denne klasse blev yderligere udsat for lokale raffinement med en høj opløsning grænse på 4,5 Å og C4 symmetri anvendes (figur 5)32. Den raffinerede model var manuelt undersøgt og remodified. Den raffinerede struktur blev valideret ved beregning af FSC kurver til at bestemme forskellen mellem den endelige model og EM kort og evaluering af geometrier atomic modeller33.

Oprindelige model konstruktion blev udført ved hjælp af TMD domain i strukturen TRPM4 (FBF 5wp6) som en vejledning34. De novo opbygning af model af hTRPC3 blev hovedsageligt styret af pladskrævende restkoncentrationer og sekundær struktur forudsigelse, med de mange α helices i høj grad lette register tildeling-strukturen. I den indledende de novo-bygget model, rækkefølge, længde og placeringen af sekundære strukturelle træk og voluminøse rester er i tæt aftale med forudsigelse. Under raffinement, blev beslutningen holdt til en lavere grænse end den opløsning, anslået til den endelige genopbygning. Tre-dimensionelle FSC blev brugt til at måle normaliseret cross-korrelationskoefficienten mellem to uafhængigt genereret 3D maps (hver med halvdelen af datasættet) over tilsvarende skaller i Fourier rummet (som en funktion af rumlige frekvens). Vi ansat en blød maske af 4.3 Å fra genopbygningen og en yderligere 4.3 Å cosinus soft edge sammen med en lav-pass filter 10 Å, da brugt guldstandarden FSC 0.143 cutoff tærskel. Det blev brugt til rapportering af endelige beslutning.

Figure 1
Figur 1: proteinekspression og -oprensning af hTRPC3 ved hjælp af BacMam systemet. (A) skematiske procedure for hTRPC3 proteinekspression og -oprensning. (B) Bacmid koloni udvalg på blå-hvid indikator plade. Vælg en isoleret hvid koloni (sort pil), ikke en hvid koloni med en indlejret blå koloni eller en hvid koloni i kontakt med en blå koloni (røde pile). (C) NGL fluorescens af P2 baculovirus i Sf9 celler under 20 X forstørrelse. Fluorescens bør være lyse og nuværende på cellemembranen og/eller indvendige af fleste celler for en potent virus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: stabilitet screening af hTRPC3 af FSEC. (A) vaskemiddel screening af hTRPC3. HTRPC3 var hele-celle oploeses i en lang række rengøringsmidler med en kritisk micelle koncentration i 0,01 - 20 mM og blev kørt i Bettinas/CHS-holdige buffer. Selvom Bettinas/CHS viser den højeste opløseligheden af hTRPC3, peak vises på den forkerte holdning, for stor til at være den tetramert hTRPC3 (blå trace). (B) TRPM4 control, med en tetramert molekylvægt af cirka 540 kDa, solubilized og køre i Bettinas/CHS, havde en eluering volumen ca 12.9 ml, mens TRPC3, med en tetramert molekylvægt af ca. 400 kDa, solubilized og køre i Bettinas/CHS, havde en eluering volumen ca 11,9 ml. Med en mindre molekylvægt, ville hTRPC3 forventes at have en eluering volumen lidt større end TRPM4, ikke lidt mindre, tyder på, at Bettinas/CHS ikke kan være en ideel vaskemiddel til hTRPC3 oploesning og rensning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: vaskemiddel buffer screening af hTRPC3 af FSEC. (A) Opløselighed og stabilitet test af hTRPC3 ved hjælp af digitonin. Digitonin blev testet både til oploesning og i kører buffer. Bemærk peak position af hTRPC3 protein oploeses i digitonin flyttet mod en større eluering volumen i forhold til protein oploeses i Bettinas/CHS (gul spor vs blå og røde spor). Kun kombinationen ved hjælp af digitonin i både oploesning og kører buffere viser den korrekte størrelse af hTRPC3 af FSEC (gul spor, asterisk). (B) svarende til FSEC resultater af hele-celle solubilized hTRPC3, peak position af hTRPC3 protein affinitet renset i digitonin (røde spor, 14 mL) flyttet mod en større eluering volumen i forhold til protein affinitet renset i Bettinas/CHS (blå spore, 12 mL) som målt ved sek-fraktionering. (C) Negative-pletten EM blev brugt til at kontrollere kvaliteten af oprenset protein før indsamling af cryo-EM. En ideel pletten bør forelægge partikler (røde cirkler) negativt farvet (der vises hvide) og omgivet af et vaskemiddel ring (optræder sort). En repræsentant, ideel Mikrograf hvor disse partikler er rigelige, monodispersed og er til stede i flere retninger er vist. (D) kvalitetsdata fra negativ-pletten EM bør give 2D klasser med en klar og sammenhængende generelle arkitektur og bør omfatte flere retningslinjer for protein, med gennemsnit indeholdt og centreret inden for maske (sort cirkel). 2D klasser fra negativ-pletten EM micrographs af hTRPC3 oploeses i Bettinas/CHS nuværende partikler, der synes at være en head-to-head dimerization af hTRPC3 monomerer. Derimod er en ru (men klare og konsekvente) samlede agern-lignende tetramert struktur 2D klasser fremgår af negativ-pletten EM micrographs af hTRPC3 oploeses i digitonin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: rensning af hTRPC3. (A) stabilitet test af hTRPC3 i nærværelse af EDTA. hTRPC3 var oploeses i digitonin i (røde spor) eller ej (blå trace) af 10 mM EDTA. Den tidligere viste en enkelt og smallere peak på tetramer protein position (røde spor, asterisk), der angiver, at EDTA stabiliseret hTRPC3 i sin tetramert kropsbygning. (B) NGL fluorescens signal FSEC for hTRPC3 oploeses i digitonin og køre i digitonin buffer. Tetramer peak er observeret i solubilized materialet før metal-affinitet kolonne rensning (blå spor, asterisk). Fraværet af denne peak i gennemstrømnings-fraktion angiver en komplet binding af hTRPC3 protein i kolonnen affinitet (røde spor). Efter eluering af imidazol, blev brøker i eluering højdepunkt kontrolleret af FSEC (grøn trace). Alle fraktioner viser intakt tetramer peak blev indsamlet til yderligere rensning. (C) Test af normal god landbrugspraksis spaltning af hTRPC3 ved hjælp af thrombin. Fordøjelsestid blev testet ved hjælp af en lille mængde af protein ved 4 ° C, og fuldstændigheden af fordøjelsen blev kontrolleret af FSEC. I hvert spor, peak på venstre svarer til hTRPC3 tetramer peak (asterisk) og peak til højre er den gratis normal god landbrugspraksis. Som længden af fordøjelsen steg, faldt forholdet mellem tetramert protein til gratis normal god landbrugspraksis, der angiver, at normal god landbrugspraksis var at være kløvet fra protein. 2 h fordøjelsen viser en fuldstændig spaltning af normal god landbrugspraksis. (D) SEK profil af hTRPC3 før eller efter thrombin fordøjelsen i digitonin indeholdende kører buffer med 10 mM EDTA tilføjet. Som forventet, er peak holdning flyttet mod de mindre eluering volumen efter thrombin fordøjelsen (røde spor). De vigtigste peak (asterisk) repræsenterer den tetramert hTRPC3. Brøker mellem røde linjer blev indsamlet til cryo-EM eksperimenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: skematisk af cryo-EM dataindsamling og -behandling for hTRPC3. Samlingen af 3,660 film stakke af renset hTRPC3 blev gjort ved hjælp af en elektron mikroskop med en direkte elektron detektor. Motion korrektion og manuel udvælgelse blev anvendt, hvilket resulterer i 3,580 micrographs. Partikler blev autopicked og underkastes 2D klassificering. 2D klasser blev yderligere raffineres af 3D klassificering. Kun en ud af fem 3D klasser vises med høj opløsning funktioner. Denne klasse blev valgt til 3D raffinement og Frealign lokale raffinement, hvilket resulterer i en struktur for hTRPC3 på 3,3 Å opløsning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Strukturbestemmelse af proteiner af cryo-EM har revolutioneret inden for strukturel biologi i de sidste par år, takket være udviklingen af nye kameraer og algoritmer, der markant øger hastigheden struktur bestemmelse af proteiner, der ikke let crystalize, især Membranproteiner. På trods af de seneste fremskridt i cryo-EM teknik forbliver forberedelse af renset proteiner tilstrækkelig kvalitet og mængde til at lette høj kvalitet billeddannelse ofte tidskrævende, dyrt og udfordrende. Evnen til hurtigt express og skærmen flere gen konstruktioner under en række betingelser, rensning, forbedrer som beskrevet i protokollen ovenfor, effektiviteten af denne proces ved at give hurtig og omkostningseffektiv produktion af høj kvalitet oprenset protein til brug i cryo-EM undersøgelser.

Mens metoden beskrevet her giver en måde at rense store mængder af pattedyr Membranproteiner med færre omkostninger end ved direkte Transfektion og hurtigere end af generation af et stabilt transfekteret cellelinie, det har mange trin, hvoraf hver skal optimeres til levere en høj kvalitet protein udbytte. Inden for de biokemiske teknikker, der anvendes til at producere og rense hTRPC3, er der en række kritiske trin og checkpoints. Den første kritiske checkpoint er produktionen af bacmid DNA. Som beskrevet i resultaterne, er ideel koloni udvælgelse det første skridt i generation af en kvalitet virus for protein udtryk. Desuden, hvis koncentrationen af bacmid DNA renset fra den valgte koloni er mindre end 1 μg/μL, vil de resulterende virus ikke være tilstrækkeligt for robust protein udtryk. Den anden kritisk kontrolpunkt er produktionen af P1 og P2 baculovirus. Virus titer kan estimeres ved normal god landbrugspraksis fluorescens, som vist i figur 1 c eller kan måles som beskrevet af Coleman et al. 35. ud over viral titer, et tidsforløb infektion tid bør gennemføres for hver ny konstruktion til at bestemme det optimale tidspunkt for infektion for maksimal protein udtryk. Kritisk kontrolpunkt tre er opløselighed og stabilitet screening vist i figur 2. Rengøringsmidler med et højt CMC, såsom Bettinas, kan give høj opløselighed, men de er ikke ideel til cryo-EM imaging fordi de kan resultere i en overflod af forurenende micelles. En mildere vaskemiddel, såsom digitonin, kan give tilstrækkelig opløselighed samtidig bevare protein stabilitet. Screening af tilsætningsstoffer, som EDTA i forbindelse med hTRPC3, er vigtige for at opdage en rensning tilstand, der resulterer i intakt og homogen protein, sandsynligvis ved at fjerne calcium fra hTRPC3, der er gennemtrængelig for calcium. Kritisk kontrolpunkt fire er verifikation af specifikke og effektiv protein fange under affinitet kolonne rensning og observation af en ideel protein peak under sek-fraktionering (figur 4). Undgåelse af optagelse af kontaminerende protein partikler samtidig bevare alle target proteinet er afgørende for at opnå en høj nok udbytte af protein for cryo-EM billeddannelse. Ændring af batch-bindende tid og forholdet mellem harpiks til solubilized protein kan hjælpe med at forbedre protein fastholdelse af kolonnen harpiks. Den overordnede kvalitet af SEK-fraktionering peak er efter vores erfaring den bedste indikator, før imaging, kvaliteten af oprenset protein partikler. Et lavt eller en bred peak under sek-fraktionering angiver mulige problemer med for få protein partikler pr. billede eller tilstedeværelsen af kontaminerende protein sammenlægning/nedbrydningsprodukter, henholdsvis. Derudover har ændringer til koden affinitet i konstruktionen, selv bevist nødvendig i nogle tilfælde at sikre tilstrækkelig affinitet-tag bindende. Den sidste checkpoint inden indsamling af cryo-EM datasæt er kontrol af protein partikel kvalitet af negativ-pletten EM. Mens ikke strengt nødvendigt, finder vi, at det giver en glimrende lejlighed til spot og korrekte protein kvalitetsspørgsmål før du investerer i tid - og omkostningskrævende processen med at indsamle data af cryo-EM.

En alternativ metode til at producere protein til cryo-EM strukturelle undersøgelser er direkte rensning af protein fra den oprindelige væv kilde. Mens denne metode ofte møder problemer med protein udbytte, er det et fremragende alternativ for proteiner, er meget rigelige i celler eller der findes som en del af et stort multi protein kompleks, hvilket kan være vanskeligt at producere ved hjælp af en rekombinant overekspression system36. Men for enkelt proteiner udtrykt i moderat eller lav beløb fysiologiske betingelser, proteinekspression og -oprensning systemet præsenteres her er en effektiv, relativt billig og højtydende metode til produktion af renset pattedyr membran protein til cryo-EM strukturelle undersøgelser. En metode, der kunne kraftigt supplement, der præsenteres her er rekonstituering af oprenset protein i lipid nanodiscs før cryo-EM data indsamling37. Under denne metode, er at proteiner indlejret i en lille disk af lipid tolagede, sandsynligvis giver en indfødt-lignende mikromiljø i forhold til vaskemiddel micelles, selv om der er ingen beviser hidtil, at strukturerne opløst i opvaskemiddel og nanodisc er forskellige38,39,40. En anden metode er at udvinde protein direkte ved hjælp af amphipathic polymerer som styren maleinsyreanhydrid (SMA), hvor held har været anvendt til bestemmelse af membran protein strukturer41,42.

Disse tilgange, der er beskrevet i dette manuskript har vist sig for at være let tilpasses i vores lab til en lang række andre pattedyr Membranproteiner ud over Ionkanaler. Derfor, vi mener, at denne protokol vil være et værdifuldt værktøj i de strukturelle og funktionelle analyser, der ligger til grund for høj specificitet målrettede stof design. Dette vil være særlig nyttig i neurodegenerative sygdomme, hjerte-kar-sygdom og kræft, som ion kanaler er vanskelig, men stort potentiale drug mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker G. Zhao og X. Meng for støtte med dataindsamling hos David Van Andel avanceret Cryo-Elektron Mikroskopi Suite. Vi værdsætter VARI High-Performance Computing teamet for computational støtte. Vi giver vores taknemmelighed til N. Clemente, D. afgifter, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth og Z. Ruan for kommentarer, der i høj grad forbedret dette håndskrift. Vi takke D. Nadziejka for redaktionelle støtte til dette håndskrift. Dette arbejde blev støttet af indre VARI finansiering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEG BacMam vector (pFastBacI) addgene 31488
DH10α cells Life Technologies 10361-012
S.O.C. media Corning 46003CR for transformation of DH10α cells for Bacmid
Bacmam culture plates Teknova L5919 for culture of transformed DH10α cells
Incubation shaker for bacterial cells Infors HT Multitron standard
Incubated orbital shaker for insect cells Thermo-Fisher SHKE8000
Reach-in CO2 incubator for mammalian cells Thermo-Fisher 3951
Table-top orbital shaker Thermo-Fisher SHKE416HP used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells
Incubator VWR 1535 for bacterial plates
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 for plasmid extraction and purification
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol Invitrogen 15593031 for DNA extraction
Sf9 cells Life Technologies 12659017 insect cells for producing virus
Sf-900 media Gibco 12658-027 insect cell media
FBS Atlanta Biologicals S11550
Cellfectin II Gibco 10362100 for transfecting insect cells
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 for transfecting mamalian cells
0.2 mm syringe filter VWR 28145-501 for filtering P1 virus
0.2 mm filter flasks 500ml resevoir Corning 430758 for filtering P2 virus
erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) Gene Mate F-5909-2000 for culturing insect cells
erlenmeyer culture flask (baffled 2L) Gene Mate F-5909-2000B for culturing mammalian cells
nanodrop 2000 spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000 for determining DNA and protein concentrations
HEK293 ATCC CRL-3022 mammalian cells for producing protein
Freestyle 293 expression Medium Gibco 1238-018 mammalian cell media for protein expression
Butyric Acid Sodium Salt Acros 263195000 to amplify protein expression
PMSF Acros 215740500 protease inhibitor
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-100MG protease inhibitor
Leupeptin hydrochloride Sigma-Aldrich 24125-16-4 protease inhibitor
pepstatin A Fisher Scientific BP2671-250 protease inhibitor
digitonin EMD Millipore 300410 detergent - to solubilize protein from membrane
imidazole Sigma 792527 to elute protein from resin column
TALON resin Clonetech 635504 for affinity purification by His-tag
superose6 incease columns GE 29091596; 29091597 for HPLC and FPLC
Prominence Modular HPLC System Shimadzu See Below
Controller Module " CBM20A
Solvent Delivery System " LC30AD
Fluorescence Detector " RF20AXS
Autosampler with Cooling " SIL20ACHT
Pure FPLC System with Fractionator Akta
thrombin (alpha) Haematologic Technologies Incorporated HCT-0020 Human alpha for cleaving GFP tag
Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube Millipore UFC910008 for concentrating protein
EDTA Fisher E478500 for stabilizing protein
400 mesh carbon-coated copper grids Ted Pella Inc. 01754-F grids for negative stain
Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) Electron Microscopy Sciences Q3100AR1.3 grids for Cryo-EM
Vitrobot Mark III FEI for preparing sample grids by liquid ethane freezing
liquid nitrogen Dura-Cyl UN1977
ethane gas Airgas UN1035
Solarus Plasma System Gatan Model 950 for cleaning grids before sample freezing
Tecnai Spirit electron microscope FEI for negative stain EM imaging
Talos Arctica electron microsocope FEI for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids
Titan Krios electron microscope FEI for high-resolution Cryo-EM imaging
Software
Gautomatch software http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ to pick particles from micrographs
Relion 2.1 software https://github.com/3dem/relion to construct 2D and 3D classification
CryoSPARC software https://cryosparc.com/ to generate an initial structure model
Frealign software http://grigoriefflab.janelia.org/frealign to refine particles
Coot software https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ to build a model
MolProbity software http://molprobity.biochem.duke.edu/ to evaluate the geometries of the atomic model
SerialEM software http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ for automated serial image stack acquisition
MortionCor2 software http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html for motion correction of summed movie stacks
GCTF software https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ for measuring defocus values in movie stacks
Phenix.real_space_refine software https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html for real space refinement of the initial 3D model

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
  2. Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
  3. Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353 (2012).
  4. Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
  5. Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
  6. Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
  7. Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
  8. Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
  9. Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
  10. Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
  11. Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
  12. Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
  13. Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
  14. Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
  15. Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
  16. Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
  17. Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
  18. Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
  19. Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
  20. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  21. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
  22. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  23. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  24. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  25. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  26. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  27. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  28. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  29. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
  30. Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
  31. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  32. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  33. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
  34. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
  35. Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
  36. Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
  37. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  38. Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
  39. Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
  40. Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
  41. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
  42. Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).

Tags

Biokemi spørgsmålet 143 Ion-kanal membran protein protein oprensning struktur beslutsomhed kryo-elektronmikroskopi cryo-EM baculovirus
Proteinekspression og -oprensning af menneskelige Lipid-følsomme kation kanal TRPC3 for Strukturbestemmelse af enkelt-partikel kryo-elektronmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haley, E., Choi, W., Fan, C., Sun,… More

Haley, E., Choi, W., Fan, C., Sun, W., Du, J., Lü, W. Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e58754, doi:10.3791/58754 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter