Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Expression et Purification de l’homme sensible lipides canal de Cation TRPC3 pour la détermination de structure par particule Cryo microscopie électronique

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58754
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 1, 1
1Van Andel Institute, 2Vollum Institute, 3Janelia Research Campus
* These authors contributed equally

Summary

Ce protocole décrit les techniques utilisées pour déterminer les structures de canal d’ion par cryo microscopie électronique, y compris un système baculovirus utilisé pour exprimer efficacement gènes dans des cellules de mammifères avec le minimum d’effort et de toxicité, d’extraction de protéine, de purification, contrôle qualité, préparation des échantillons grille et dépistage, ainsi que collecte de données et traitement.

Abstract

Transient receptor potentiels chaînes (TRPCs) de la sous-famille TRP canonique sont non sélectifs cation qui jouent un rôle essentiel dans l’homéostasie calcique, entrée de calcium particulièrement exploité au magasin, qui est essentielle pour maintenir le bon fonctionnement de la libération des vésicules synaptiques et voies de signalisation intracellulaire. En conséquence, les canaux TRPC ont été impliqués dans une variété de maladies humaines, y compris les troubles cardiovasculaires tels que l’hypertrophie cardiaque, les maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson et des troubles neurologiques comme l’ataxie spinocérébelleuse. Par conséquent, les canaux TRPC représente une cible pharmacologique potentielle dans les maladies humaines. Cependant, les mécanismes moléculaires de blocage dans ces canaux sont encore peu claires. La difficulté d’obtenir de grandes quantités de protéine purifiée, homogène et stable a été un facteur limitatif dans des études de détermination de structure, notamment pour les protéines de la membrane chez les mammifères tels que les canaux d’ion TRPC. Nous présentons ici un protocole pour l’expression à grande échelle des protéines de membrane de canal ion mammifères à l’aide d’un système de transfert de gènes modifiés baculovirus et la purification de ces protéines par affinité et chromatographie d’exclusion stérique. Nous présentons également un protocole pour recueillir des images de microscopie de cryo-électron de particule de protéine purifiée et d’utiliser ces images pour déterminer la structure des protéines. Détermination de la structure est une méthode puissante pour la compréhension des mécanismes de blocage et de fonction dans les canaux ioniques.

Introduction

Calcium est impliquée dans des processus plus cellulaires, y compris la signalisation des cascades, contrôle de la transcription, la libération des neurotransmetteurs et hormones molécule synthèse1,2,3. Le maintien homéostasie du calcium libre cytosolique est crucial pour la santé et la fonction des cellules. L’un des principaux mécanismes de l’homéostasie du calcium intracellulaire est entrée magasin fonctionnant de calcium (SOCE), un processus dans lequel épuisement du calcium stocké dans le réticulum endoplasmique (re) déclenche l’ouverture des canaux ioniques sur la membrane plasmique pour faciliter la reconstitution du calcium ER, qui peut ensuite être utilisé dans la signalisation plus4,5,6. Canaux des potentiels récepteurs transitoire (TRPCs), qui sont des canaux calcium-perméable appartenant à la super-famille TRP, ont été identifiés comme un acteur majeur dans le SOCE7,8,9 .

Parmi les sept membres de la famille des TRPC, TRPC3, TRPC6 et TRPC7 forment un sous-groupe homologue, et ils sont uniques dans la capacité à être activé par le lipides messager secondaire Diacylglycérol (DAG), un produit de dégradation des lipides signalisation phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2)10,11. TRPC3 est fortement exprimée dans le muscle lisse et dans les régions de cérébrales et cérébelleuses du cerveau, où elle joue un rôle essentiel dans la signalisation calcique qui influent sur la neurotransmission et la neurogenèse12,13. Dysfonctionnement du TRPC3 a été lié à des troubles du système nerveux central, troubles cardio-vasculaires et certains cancers par exemple adénocarcinome ovarien14,15,16. Par conséquent, TRPC3 est prometteuse comme cible pharmaceutique pour le traitement de ces maladies. Le développement de médicaments ciblés agissant sur TRPC3 a été limité par un manque de compréhension de ses mécanismes moléculaires d’activation, y compris les lipides binding sites17,18. Nous avons rapporté la première structure d’atomique-résolution du canal TRPC3 humain (hTRPC3) et ses deux accepteurs lipidique dans l’état closed, fournissant des renseignements importants sur ces mécanismes19.

Le facteur clé pour déterminer la structure d’une protéine de membrane à haute résolution est d’obtenir des protéines de haute qualité. La projection correspondante d’expression et purification des conditions nécessaires à l’obtention de protéines de haute qualité peut être une démarche lente et coûteuse. Nous présentons ici un protocole décrivant en détail comment identifier les conditions optimales d’expression et purification de hTRPC3, qui se comportaient mal dans notre analyse initiale. Nous présentons plusieurs points clés sur la façon de résoudre les problèmes et d’optimiser le comportement de la protéine, qui jeter des bases solides pour nos cryo-électron études en microscopie (cryo-EM). Nous utilisons un baculoviral mis à jour le génération vector (pEG), développé par Gouaux et ses collègues, qui est optimisé pour le dépistage des dosages et génération efficace de baculovirus dans les cellules de mammifères,20. Cette méthode d’expression se trouve rapide et rentable de surexpression de protéines dans la membrane des cellules mammifères. Nous combinons l’utilisation de ce vecteur avec une taille-exclusion-la détection par fluorescence axée sur la chromatographie (FSEC) – présélection méthode21. Cette méthode utilise une balise de la protéine fluorescente verte (GFP) fusionnée à la construction d’intérêt et améliore la visualisation de la protéine cible en échantillons solubilisées petite cellule entière. Cela permet pour le dépistage de la stabilité des protéines en présence de différents détergents et les additifs, les mutations thermostabilizing et permet l’utilisation d’un petit nombre de cellules de transfection transitoire à petite échelle. De cette façon, une multitude de conditions peut subir rapidement avant de passer à une purification de la protéine à grande échelle. La suite expression, criblage et de purification, nous présentons un protocole pour l’obtention et de traitement d’images de cryo-EM pour générer une détermination structurale de novo de la protéine. Nous croyons que les approches décrites ici servira un protocole généralisable pour des études structurales de récepteurs de canal TRP et autres protéines membranaires.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. transformation de DH10α des cellules capables de produire Bacmid ADN

  1. Synthétiser le gène d’intérêt et il subclone dans une version modifiée du vecteur pEG contenant une balise double infection streptococcique, une His8-tag et GFP avec un site de clivage de la thrombine au terminus (pFastBacI) N20.
  2. Transformer des cellules compétentes en ajoutant 5 ng de plasmide contenant un gène désiré en pFastBacI à 50 μL de DH10α les cellules dans un 1,5 mL tube et incuber pendant 10 minutes sur la glace. Chaleur de choc les cellules pour 45 s à 42 ° C. Ajouter 200 μl de bouillon super optimal avec milieu de répresseur catabolique (SOC) dans le tube et laisser incuber pendant 4 à 8 heures à 37 ° C dans un agitateur orbital à 225 t/mn.
  3. Plaque de 5 μl de cellules sur une gélose bacmid LB (50 kanamycine μg/mL, gentamicine μg/mL, 10 μg/mL d’agar, 100 μg/mL Bluo-gal et à 40 μg/mL isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside [IPTG], 7).
  4. Incuber les plaques pendant 48 h à 37 ° C.
    Remarque : Les colonies de taches indicateur Bluo-gal qui expriment encore lacZ (vecteur d’insertion échoue), permettant une sélection des colonies (transformés avec succès) blancs.
  5. Sélectionner avec soin une colonie blanche isolée, en évitant toute colonies blanches qui sont en contact avec les colonies bleues et la croissance de cellules pendant la nuit dans 6 mL de milieu de bacmid LB (50 kanamycine μg/mL, 7 gentamicine μg/mL, tétracycline 10 μg/mL) à 37 ° C dans un agitateur orbital à 225 t/mn.

2. bactérienne préparation pour l’isolement de l’ADN de Bacmid

  1. Pour isoler l’ADN de la bacmid, tournez en bas des cellules d’Escherichia coli pendant 10 min à 2880 x g.
  2. Jeter le surnageant et remettre le culot dans 200 µL de solution remise en suspension cellulaire de la miniprep kit (voir Table des matières) de pipetage. Veillez à ce que la pastille est suspendue totalement et de façon homogène. Ensuite, transférer la suspension cellulaire dans des tubes de 1,5 mL.
  3. Ajouter 200 µL de la solution de lyse cellulaire de la trousse de miniprep et mélanger en retournant le tube quelques fois. Incuber pendant jusqu'à 5 min à température ambiante (RT) à lyser les cellules. Ajouter 200 µL de solution de neutralisation de la trousse de miniprep et mélanger en retournant le tube quelques fois pour arrêter la réaction de lyse.
  4. Tournez vers le bas pendant 10 min à 21 130 g dans une centrifugeuse de table-top. Recueillir 600 μL de surnageant dans un tube de 2 mL. Ajouter 600 μL solution de phénol : chloroforme : isoamylique alcool (voir Table des matières) et mélanger soigneusement pour extraire l’ADN du reste des produits la lyse cellulaire.
    Attention : Solution de phénol : chloroforme : isoamylique alcool est toxique par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion. Il peut provoquer des brûlures chimiques et peut-être être cancérigène. Porter des gants et une blouse boutonnée. Travailler sous une hotte. Disposer de ces déchets dangereux convenablement.
  5. Tourner le tube pendant 10 min à 21130 x g dans une centrifugeuse de table-top. Deux phases liquides séparés seront visibles. Transvaser avec soin 300 μL de la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube. Ajouter 600 μL d’éthanol à 100 % pour laver l’ADN. Retourner doucement le tube pour mélanger.
    Remarque : Ne pas vortex, car cela peut de cisaillement bacmid ADN.
  6. Cool tubes en les plaçant dans un congélateur à-20 ° C pendant environ 10 minutes tournent en bas pendant 10 min à 21 130 g dans une centrifugeuse de table-top. Jeter le surnageant et préserver le granule d’ADN.
  7. Ajouter 1 mL d’éthanol à 70 % pour laver le culot. Retourner doucement le tube pour mélanger. Tourner pendant 10 min à 21 130 g dans une centrifugeuse de dessus de table. Jeter le surnageant et permettre le plomb dans l’air sec pendant environ 5 min ou jusqu'à ce qu’aucun liquide n’est visible dans le tube et le culot d’ADN devienne translucide.
  8. Resuspendre le culot sèche dans 50 µL de stérile et sans DNase, de l’eau désionisée. Mesurer la concentration d’ADN.
    Remarque : Ne pas congeler l’ADN bacmid. Conserver à 4 ° C pendant plusieurs jours.

3. la transfection des cellules d’insectes avec Bacmid pour produire P1 Baculovirus Sf9

  1. Semences 0,9 x 106 Sf9 cellules/puits dans 2 mL de milieu approprié (voir la Table des matières) dans chaque puits d’une plaque de culture de tissu de 6 puits. Incuber les cellules à 27 ° C pendant 20 min pour favoriser l’attachement à la plaque.
    Attention : Les cultures cellulaires sont un danger biologique potentiel. Travailler dans une hotte à flux laminaire approuvé stérilement et vérifier les orientations institutionnelles et gouvernementales pour des vêtements de protection recommandés et l’élimination appropriée des déchets avant d’effectuer des expériences.
  2. Après fixation, ajouter 8 µL de réactif de transfection (voir Table des matières) pour 100 µL de médias pour chaque puits de la 6 sur plaque bien être transfectées dans un tube stérile. Ajouter 6 μg de bacmid ADN à 100 µL de milieu dans un tube stérile distinct. Incuber 5 min à RT. combiner les deux solutions et incuber pendant 45 min à température ambiante.
  3. Remplacer le support dans les puits de 6 avec 2 mL de milieu frais. Ajouter le mélange de l’étape précédente pour chaque bien goutte (200 µL / puits). En faisant doucement tourner la plaque pour assurer un mélange de la solution de transfection dans le milieu.
    Remarque : Ne pas agiter ou secouer la plaque car cela provoquerait des cellules détacher.
  4. Incuber pendant 5 jours (120 h), les cellules dans un incubateur humidifié à 27 ° C. Vérifier la fluorescence GFP avant la récolte afin de vérifier que le virus est produit dans un grand pourcentage des cellules ; Si le pourcentage est faible, prolonger le temps d’incubation si nécessaire (voir Figure 1).
  5. Récupérer le surnageant contenant virus de P1 (environ 2 mL de chaque puits). Le support contenant le virus P1 dans des tubes de 2 mL à l’aide d’une seringue de 3 mL et petit 0,2 µm filtre de filtration. Ajouter stérile sérum fœtal (SVF) à une concentration finale de 1 %.
    Remarque : Ce stock de virus P1 doit être conservé à 4 ° C et être protégé de la lumière.

4. l’infection de cellules d’insectes avec P1 Baculovirus pour produire P2 Baculovirus Sf9

  1. Préparer 200 mL (ou volume désiré) de cellules Sf9 à une concentration de 0,8 - 0,9 x 106 cellules/mL dans le milieu approprié (voir la Table des matières) dans un Erlenmeyer de culture fond plat d’une taille suffisante.
    Remarque : Pour la culture en suspension, le volume utilisé ne doit pas dépasser 40 % de la capacité totale du ballon.
  2. Ajouter 1:2500 ratio (v/v) des stocks de virus de P1 de 3,5 à la culture de suspension de cellules Sf9. Incuber pendant le temps d’expression optimale de virus (généralement 48 à 120 h selon la construction de protéine) à 27 ° C dans un agitateur orbital à 115 tr/min.
    Remarque : L’expression relative de virus peut être déterminée en consultant la fluorescence GFP du virus dans un échantillon de la culture.
  3. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 40 min à 11 520 x g et recueillir le surnageant contenant virus de P2. Filtrer le surnageant à l’aide de filtres jetables de µm 0,2. Ajouter FBS à une concentration finale de 0,5 %.
    Remarque : Ce stock de virus P2 doit être conservé à 4 ° C et être protégé de la lumière.
  4. Obtenir un titre pour le virus de P2 à l’aide de cellules Sf9easy ou un compteur de virus.

5. l’infection de cellules de mammifères HEK293 avec P2 Baculovirus pour l’Expression de la protéine à grande échelle

  1. Préparer un volume souhaitable HEK293 mammifères suspension de culture de cellules (4-6 L est recommandé pour la préparation de grilles de gelée) à une concentration de 3,5 à 3,8 x 106 cellules/mL dans le milieu de l’expression (voir Table des matières) additionné de 1 % (v / v) FBS stérile en erlenmeyers dérouté-fond de culture de taille suffisante.
    Remarque : Pour la culture en suspension, le volume utilisé ne doit pas dépasser 40 % du volume total du ballon.
  2. Ajouter 8 % (v/v) de solution mère de virus P2 de l’étape 4.3 à la culture de suspension de cellules HEK293. Incuber à 37 ° C dans un agitateur orbital à 135 tr/min.
  3. Ajouter le butyrate de sodium 10 mM à post-infection 12-18 h. Incuber pendant le temps de l’expression de protéines optimal (généralement de 36 à 72 h) à 30 ° C.
  4. Récolter les cellules par centrifugation pendant 20 min à 2 880 x g. Laver les cellules en resuspendant dans environ 100 mL tampon tris salin (TBS) par litre de cellules prélevées. Centrifuger à nouveau pendant 20 min à 2 880 x g et recueillir le culot cellulaire.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Boulettes de cellule peuvent être snap-congelés dans l’azote liquide et conservés à-80 ° C jusqu'à la purification.
    Attention : Azote liquide peut causer des brûlures cryogéniques ou des blessures. Il peut provoquer des gelures. Il peut déplacer l’oxygène et provoquer une asphyxie rapide. Porter des gants isolants froids et un écran facial.
  5. Recueillir des récoltes de petits de 1 mL à divers moments et solubiliser pendant 2 h à 4 ° C, avec bascule ou en remuant en présence de différents détergents et/ou additifs. Ces petits échantillons solubilisées germes entiers peuvent être clarifiées par ultracentrifugation à 235 000 × g pendant 10 min à 4 ° C et l’exécuter comme un échantillon de 30 μL sur une colonne de chromatographie d’exclusion stérique (SEC) (voir la Table des matières) pour déterminer le meilleur moment pour l’expression et les meilleures conditions de solubilisation.
    Remarque : Dans le cas de hTRPC3, cet examen comportait différents tampons avec des valeurs de pH de 4,0-9,5 et concentrations salines de 50-500 mM ; différentes compositions ioniques (par exemple MgCl2 ou NaCl) ; différents détergents avec valeurs (CMC) de concentration micellaire critique de 0, 1 - 20 mM ; réduire les additifs tels que le dithiothréitol, tris(2-carboxyethyl) phosphine et β-mercaptoéthanol ; et les chélateurs de calcium acide éthylènediaminetétraacétique additif (EDTA).

6. la purification de la protéine de hTRPC3 du culot cellulaire congelés

  1. Décongeler le culot dans un tampon contenant 20 mM Tris (pH 8,0), 500 mM NaCl, le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) de 1 mM, 0,8 μM aprotinine, 2 μg/mL leupeptine, 2 mM pepstatine A, et 1 % digitonine, à l’aide de 100 mL de tampon par litre de cellules récoltées. Une fois décongelé, garantir l’homogénéité de la solution par la pipette ou l’agitation. Permet de solubiliser pendant 2 h à 4 ° C dans un bécher, plongé dans la glace avec une rotation de bar de remuer.
  2. Enlever les débris cellulaires par ultracentrifugation à 235 000 × g pendant 1 h à 4 ° C. Vérifier la quantité de protéines en exécutant un échantillon de 30 μL sur une colonne de SEC (voir Table des matières) par chromatographie liquide haute performance (HPLC) et visualiser la protéine cible par le signal de sortie GFP.
  3. Incuber la protéine solubilisée (surnageante) avec résine cobalt pendant 1-2 h à 4 ° C. Vérifier la liaison aux protéines de la résine en exécutant un échantillon μL 30 sur une colonne de SEC.
    Remarque : Si la liaison aux protéines est produite, la cible de tagged protéine GFP est retenue sur la colonne, introuvable dans le cheminement. Par conséquent, aucun signal GFP ne sera présent à la position correspondant à la taille de protéine cible lorsque le cheminement est exécuté sur HPLC.
  4. Laver la résine avec 10 volumes de colonne d’un tampon (20 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, imidazole de 15 mM et la digitonine 0,1 %). Vérifier la perte de protéines en exécutant un échantillon μL 30 sur une colonne de SEC.
    Remarque : Si la perte de protéines de la colonne s’est produite, la cible de tagged protéine GFP trouvera dans le tampon de lavage qui s’est écoulé sur la colonne. Par conséquent, signal GFP sera présent à la position correspondant à la taille de protéine cible lorsque le tampon de lavage est exécuté sur HPLC. Si la perte de protéines s’est produite, la concentration de l’imidazole de la mémoire tampon de lavage peut doivent être réduites afin d’éviter de perturber sa liaison de balise à la colonne d’affinité.
  5. Éluer la hTRPC3 résine lié avec un tampon (20 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, imidazole de 250 mM et la digitonine 0,1 %). Ajouter la thrombine à un 01:20 rapport molaire (en conjonction avec la balise GFP) et ajouter 10 mM EDTA (un agent stabilisant hTRPC3) dans l’échantillon éluée et incuber pendant 3 h à 4 ° C. Vérifier que la protéine a été élué en exécutant 90 μL d’un échantillon dilué au 1/100 sur une colonne de SEC et de vérifier la présence d’un signal GFP à la position correspondant à la taille de protéine cible.
    Remarque : À ce stade, le signal de tryptophane de protéine totale dans l’élution peut également être consulté. Seule la protéine-cible purifiés par affinité restera dans l’élution et la GFP et tryptophane signaux seront près identique au profil. Si la protéine cible n’est pas vu en grande quantité dans l’élution mais n’a pas échappée à l’intermédiaire ou le lavage, la protéine est probablement resté liée à la colonne et peut être éluée utilisant une concentration plus élevée de l’imidazole dans la mémoire tampon.
  6. Concentrer l’éluat à 500 μL ou moins dans un filtre centrifuge 15 mL 100K tube (voir Table des matières) en tournant à 2 880 x g à 4 ° C par incréments de 5 min. Remettre en suspension les protéines en pipettant également, la solution de haut en bas entre les spins pour éviter overconcentrating.
    NOTE : Temps de centrifugation peut être raccourcie à l’approche du volume le volume final souhaité.
  7. Charger le concentré sur une colonne de la SEC dans un tampon (20 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, EDTA 1 mM et la digitonine 0,1 %). Exécutez.
  8. Combinez des fractions de pic contenant le tétramère TRPC3 intact, comme visualisées par signal d’absorbance UV et se concentrer à nouveau à une concentration finale d’au moins 5 mg/mL.

7. dépistage de protéine par microscopie électronique de coloration négative

  1. Allumez la machine de décharge luminescente. Configurer le programme pour décharger une grille enduit de carbone à l’aide d’argon et oxygène pour 30 s. exécuter le programme pour faire le revêtement en carbone sur cuivre maille 400 grilles hydrophile avant l’addition de la solution de protéines.
  2. Mis en place cinq 40 μL gouttes d’eau stérile et de gouttes deux 40 μL de solution de formiate d’uranyle de 1 % (sur film lab, papier ciré ou une surface similaire, voir Table des matières). Prenez la grille de l’étape 7.1 et ajouter 2,5 μL de protéine échantillon 5 mg/mL (50-200 μM) sur le côté obscur et laisser reposer pendant 1 min.
  3. Après 1 min, sécher la grille à l’aide de papier filtre. Ne pas toucher le papier filtre directement à la surface de la grille ; au contraire, apporter le papier jusqu’au bord de la goutte liquide et permettre l’action capillaire tirer le liquide de la grille dans le papier filtre.
  4. Tremper la grille dans la première goutte d’eau. Sécher avec du papier filtre et répéter l’opération avec les autres gouttes d’eau et de la première goutte de formiate d’uranyle. Permettre à la deuxième baisse de sit formiate d’uranyle pendant 1 min et puis sécher avec du papier filtre. Laisser entièrement sécher à l’air (environ 1 min) de la grille avant de le ranger.
    Remarque : Ce protocole de coloration n’est peut-être pas idéal pour toutes les combinaisons de protéines-détergent. Différentes concentrations de formiate d’uranyle de tachent et différentes longueurs de temps d’exposition de la tache doivent être testés si les étapes ci-dessus ne permettent pas une tache avec bon contraste.
  5. Les grilles sur un microscope électronique de l’image (voir Table des matières) pour vérifier la qualité de particules de protéines. S’assurer que les micrographies montrent de nombreuses particules qui sont homogènes dans la distribution et l’aspect général, bon contraste de l’écran et correspondre à la taille estimée de la protéine cible.
  6. Générer des préliminaires, les classifications (2D) basse résolution, deux dimensions à l’aide des micrographies de 50-100 (voir étape 10 – traitement des données) pour vérifier que les particules représentent des vues différentes d’une structure cohérente unique.
    Remarque : Les micrographies et préliminaires classes 2D de qualité suffisante, comme décrit ci-dessus, sont un bon indicateur que le protocole a été suffisamment optimisé pour la purification de la protéine. Préparation et contrôle des grilles de cryo-EM est justifiée à ce stade.

8. préparation des échantillons EM

  1. Une grille or holey carbone décharge luminescente (voir Table des matières), comme indiqué au point 7.1.
  2. Appliquer 2,5 μl de l’échantillon de protéines concentré hTRPC3 (5 mg/mL) sur la grille. Épongez la grille à 1. 5 s en utilisant une tache force 1 et un temps d’attente de 5 s à 100 % d’humidité et de 4 ° C, puis plongez la grille éthane liquide refroidie par azote liquide, à l’aide d’une machine de vitrification.
    Remarque : L’humidité, la température, blot-force, tache temps et temps d’attente énumérés ici ont été utilisés pour hTRPC3 étude19 des auteurs. Ils peuvent devoir être modifiés pour produire la glace vitreuse optimale pour d’autres protéines et détergents.
  3. Écran gelé les grilles pour les conditions de glace optimale à l’aide d’un microscope de cryo-EM (voir Table des matières) et manuellement voir régions de glace épaisse (mailles qui apparaissent plus petits et plus foncés), glace (mailles qui apparaissent plus grand et plus lumineux) mince et support de glace .
    NOTE : Glace épaisse tient souvent plus de particules, alors que la glace mince donne souvent de résolution et un meilleur contraste. Les conditions de dépistage manuel utilisation d’images pour déterminer lequel des glaces résultats dans un grand nombre de particules monodisperses avec bon contraste et une résolution. Une fois que les bonnes conditions sont vérifiées, déplacer vers la collection d’images sur un microscope de cryo-EM 300 kV.

9. collecte de données EM

  1. À l’aide d’un programme d’achat automatisé, enregistrer des piles d’image en mode comptage super-résolution avec une taille de pixel jumelées de 1.074 Å sur un microscope électronique fonctionnant à 300 kV avec un grossissement nominal de 130 000 X direct détecteur d’électrons.
  2. Dose-fractionner chaque image à 40 images avec un temps d’exposition totale de 8 s à 0,2 s par trame et un débit de dose de 6.76 e− Å s−2 −1 (valeurs de défocalisation nominal variés de 1,0 à 2,5 μm dans l’expérience des auteurs).

10. EM informatique

  1. Mise en œuvre de la proposition de correction du résumé film piles22 et estimer les valeurs de défocalisation23 en utilisant le logiciel de traitement de données (voir Table des matières)24.
  2. Ramasser les particules de la microscopie. Utilisez-les cueillies de particules pour construire une première classification exempt de référence 2D en utilisant le logiciel24. Sélectionnez classe 2D idéal en moyenne à utiliser comme modèles pour le prélèvement de particules automatisées pour l’ensemble des données.
  3. Vérifier la qualité des particules auto cueillies et enlever les mauvaises particules manuellement. Plusieurs séries de classification 2D permet de nettoyer les particules cueillies.
  4. Générer un modèle initial de25. 2D de l’objet choisi particules en trois dimensions (3D) classification (environ 5 classes), en utilisant la symétrie C1 et un filtre passe-bas de reconstruction initiale de 60 Å comme modèle de référence a. Déterminer quelles classes ont des caractéristiques de haute résolution et combinent des particules à l’intérieur d’une classe.
  5. Affiner les particules à l’aide de l’amélioration locale avec la symétrie de la C4 (dans le cas des hTRPC3) appliqué et une limite haute résolution pour l’alignement des particules fixée à 4,5 Å26.

11. modélisme

  1. Construire un modèle (voir Table des matières pour le logiciel utilisé). Pour hTRPC3, utiliser le domaine transmembranaire (TMD) de la melastatin de potentiel transient receptor 4 (TRPM4) structure protein data bank (PDB) 5wp6 comme un guide27. Utiliser les résidus encombrants et prédiction de structure secondaire pour guider la construction de novo .
  2. Exposez le modèle initial au raffinement de l’espace réel avec contraintes de structure secondaire28. Examiner le modèle raffiné et remodify si nécessaire (voir la Table des matières pour le logiciel utilisé) manuellement.
  3. Appliquer les courbes de corrélation (FSC) de coquille de Fourier pour calculer la différence entre le modèle final et le plan de l’EM pour la validation de la structure raffinée. Évaluer les géométries des modèles atomiques (voir Table des matières pour le logiciel utilisé)29,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Un aperçu schématique du protocole pour l’expression et purification de hTRPC3 est illustré dans la Figure 1 a. Une image de la plaque de bacmid de hTRPC3 avec les colonies blanches idéales, semblables à celle sélectionnée pour la purification de l’ADN de bacmid, est montrée dans la Figure 1 b. Nous avons constaté que 48 h est idéal pour une coloration claire Bluo-gal tout en maintenant la présence de colonies isolées. Pic de production de virus de P2 pour les hTRPC3, comme visualisées par fluorescence GFP, a été observée après 4 jours d’infection dans des cellules d’insecte Sf9 (Figure 1).

Baulovirus de P2 a été récolté par les médias, additionnés de 1 % FBS et utilisé pour infecter une suspension de cellules de mammifères HEK293. Le butyrate de sodium a été ajouté pour les personnes infectées cellules 12-18 h après le virus pour stimuler l' expression de protéines20. Les cellules sont ensuite incubées pendant 36 h supplémentaires à 30 ° C. Les cellules ont été récoltées et soumis à la solubilité et le dépistage de la stabilité par FSEC (Figure 2 a)21. Les cellules ont été solubilisés à l’aide de sept différents détergents avec des valeurs CMC de 0,01 - 20 mM à une concentration de détergent environ 10 fois la valeur de la CMC. Après solubilisation de cellules entières, les débris de la lyse cellulaire a été supprimé par ultracentrifugation et le surnageant contenant la protéine solubilisée a été chargé sur une colonne de SEC et exécuter sur HPLC dans n-dodécyl-β-D-maltopyranoside/cholestéryle hémisuccinate (DDM/SCO) mémoire tampon contenant un détergent comparer solubilité absolue et position de volume du pic de hTRPC3 dans des conditions différentes par rapport à un contrôle TRPM4 (Figure 2 b). Nous avons choisi d’utiliser DDM/CHS comme le tampon initial en cours d’exécution pour les échantillons solubilisées dans différents détergents car DDM/CHS est le plus couramment utilisé détergent lors de la résolution de la structure des protéines membranaires. Tous les différents solubilisée détergent TRPC3 échantillons pic a montré postes à environ 11,9 mL, ce qui est probablement trop grande, car la forme tétramérique de hTRPC3 a un poids moléculaire plus faible que le positif de contrôle humain TRPM4 (Figure 2 a et Figure 2 b).

Néanmoins, parce qu’il n’y avait pas de structure de n’importe quel récepteur de canal TRPC pour comparer nos résultats à et parce que la grande masse moléculaire peut être provoquée par l’architecture de TRPC3 ou d’autres facteurs, nous avons effectué une purification à petite échelle de hTRPC3 à l’aide de 25 mL de cellules à l’aide de DDM/CHS tout au long de l’expérience comme DDM/CHS a donné la meilleure solubilité de hTRPC3. Le profil de SEC de hTRPC3 a montré un pic monodispersés mais était encore dans une position de pointe, représentant un poids moléculaire plus élevé que TRPM4 (données non présentées). Nous avons vérifié la protéine dans la fraction du pic du profil SEC par coloration négative EM, parce que c’est une méthode rapide de vérifier la qualité de protéine et nécessite une très petite quantité de protéines. Dans la micrographie, les particules ont été observés avec deux domaines transmembranaires présents dans la même particule. Il est apparu que deux particules hTRPC3 mélanges de manière directe par le biais de l’interaction entre deux domaines cytosoliques (Figure 3D). Nous avons inclus puis le réducteur réactif dithiothréitol (DTT) dans le tampon de purification pour la seconde purification à petite échelle, dans l’espoir de perturber la dimérisation du hTRPC3. En effet, un second pic avec un poids moléculaire inférieur est apparue par le fractionnement du SEC. Cependant, les particules semblait trop petits pour être un tétramère intact et ont montré aucune caractéristique des protéines membranaires comme un domaine transmembranaire. Il s’est avéré que la DDM/CHS n’était pas un détergent approprié pour la purification de hTRPC3, malgré ce qui donne la meilleure solubilité pour hTRPC3.

Ensuite, nous avons essayé une digitonine détergente, plus douce, pour solubiliser des hTRPC3 et comparé avec la protéine solubilisée dans DDM/CHS. Ici, nous avons utilisé deux tampons en cours d’exécution différents contenant DDM/CHS et digitonine, respectivement. C’était important que le détergent dans la mémoire tampon en cours d’exécution souvent contribue à la stabilité de la protéine et la protéine membranaire susceptibles de devenir instable lorsqu’on change les détergents de solubilisation à FSEC. La protéine exécuter dans un tampon contenant la digitonine montre un déplacement prometteur de pointe vers un poids moléculaire inférieur lorsque solubilisé dans DDM/CHS ou digitonine. La protéine solubilisée par et dans la digitonine a donné le plus haut sommet dans une position raisonnable par rapport à la position du contrôle positif, TRPM4 humaine (Figure 3 a). Puis nous sommes passés vers l’avant en effectuant une purification à petite échelle à l’aide de 25 mL de cellules. Bien que multiples et grands sommets ont été observés par SEC (Figure 3 b), la protéine a montré caractéristiques d’un canal unique hTRPC3 tétramère en 2D classification par coloration négative EM (Figure 3 et Figure 3D). Nous concluons que la digitonine est un détergent idéal pour la purification de hTRPC3.

Nous intensifié l’expression de hTRPC3 et effectué une purification de moyennes à l’aide de 400 mL de cellules dans la digitonine. Ce faisant, nous espérions obtenir suffisamment de protéine pour quelques grilles congelés sans gaspiller de moyen et de détergent avant nous avons pensé les conditions finales pour la purification de hTRPC3 à grande échelle. Il arrive souvent que les protéines membranaires montrent instabilité lorsque hautement concentré pour la préparation des grilles congelés. La protéine purifiée et concentrée non seulement déplacée vers un poids moléculaire plus élevé par FSEC, mais a également montré fond bruyant dans les grilles de cryo-EM imagés à l’aide d’un microscope électronique équipé d’une caméra EMCCD. Même si nous avons pu observer seul, récepteurs tétramères intacts, hTRPC3 purifiée dans la digitonine n’était pas idéal pour des études de haute résolution cryo-EM.

Afin d’améliorer la stabilité de la protéine, nous avons projeté un grand nombre de conditions énoncées dans le protocole étape 5. Nous avons choisi d’additifs d’écran basés sur le caractère physiologique de hTRPC3 ; e.g., EDTA a été choisi parce que hTRPC3 est perméable au calcium et enlever le calcium peut stabiliser la protéine. De tous les échantillons testés par FSEC s’exécutant dans le buffer contenant la digitonine, 10 mM EDTA a montré un effet remarquable sur la stabilisation des hTRPC3 dans une position de pointe tétramère intact (Figure 4 a). Elle aussi sensiblement augmenté le nombre de particules dans la micrographie de cryo-EM et diminue le bruit en arrière-plan, comme illustré à la Figure 5.

Après avoir identifié les conditions idéales pour l’expression et purification, nous avons réalisé une expression à grande échelle (2 L) de hTRPC3. Les cellules contenant des hTRPC3 ont été récoltées et ensuite solubilisés. Ultracentrifugeuse-clarifié lysat a été soumis à purification d’affinité métal colonne par lot-liaison avec une résine de cobalt suivie de purification dans une colonne de gravité. Rétention de protéine solubilisée dans la colonne et élution de purifiés par affinité des protéines provenant de la colonne a été vérifiées par FPLC (Figure 4 b). Nous avons constaté que pour hTRPC3, une concentration d’imidazole de 15 mM dans le tampon de lavage ne suffisait pas à éliminer les protéines contaminantes avec liaison non-spécifique de résine, et imidazole de 250 mM dans le tampon d’élution suffisait éluer la majorité des hTRPC3 solubilisée protéine liée à la résine. Tous les échantillons ont été vérifiés par FSEC, et la protéine éluée a montré un pic monodispersés pointus, à la position de pointe correcte. Comme relevant de souplesse entre la balise GFP et la protéine hTRPC3 peut faire l’alignement des particules de protéines au cours de la plus difficile de traitement d’image, et parce qu’un site de clivage de la thrombine est situé entre GFP et hTRPC3, nous avons testé une petite quantité de purifiée protéine au clivage différent moments à l’aide de protéase de la thrombine. Étant donné que la protéine éluée incubés avec la thrombine à un 01:20 rapport molaire a montré une stabilité raisonnable et le clivage complet après 2 h à 4 ° C, nous avons clivé au large de la GFP de tous la protéine purifiée en utilisant les mêmes conditions et vérifié par HPLC pour confirmer que la GFP a été c ompletely retiré (Figure 4). La protéine est ensuite purifiée par S, et le clivage des GFP peut à nouveau être visualisé par le changement de position de pointe vers un plus petit poids moléculaire (Figure 4). Un petit échantillon non concentré de la fraction du pic principal servait à fabriquer des grilles pour EM de coloration négative. Toutes les fractions contenant le tétramère hTRPC3 ont été combinées et reconcentrées à une concentration finale de 5 mg/mL, ce qui a été utilisée pour préparer des grilles pour l’imagerie de cryo-EM. Comme nous l’avons observé cette partie de la protéine encore progressivement déplacé vers un plus grand poids moléculaire, nous avons récolté uniquement les fractions au poids moléculaire correcte et a gelé les grilles immédiatement après purification des protéines. Habituellement, nous avons terminé la séquence d’expériences de purification de la protéine pour la préparation des grilles congelés dans une seule journée.

Un échantillon de 2,5 μL de protéine purifiée hTRPC3 (concentration de 5 mg/mL) a été appliqué sur une grille de carbone holey lueur-déchargé. Une machine de vitrification servait à préparer la grille, à l’aide d’un 1,5 s buvard temps inférieur à 100 % humidité suivie d’un plongeon dans l’éthane liquide refroidie par azote liquide. Cette étape fige l’échantillon en glace vitrifiée pour l’imagerie. Des images ont été capturées à 130 000 X grossissement nominal par un microscope électronique à cryo fonctionné à 300 kV. Piles d’images ont été enregistrées en super-résolution mode avec une taille de pixel jumelées de 1.074 du comptage Å et une valeur nominale de défocalisation variant de 1,0 à 2,5 μm à l’aide d’un détecteur d’électrons directe et automatisée de logiciels d’acquisition. Chaque image a été dose fractionnée à 40 images avec un temps d’exposition totale de 8 s (0,2 s par trame) et un débit de dose de 6.76 e− Å−2 s−1. Une micrographie représentative de cet ensemble de données est illustré à la Figure 5.

Correction de mouvement et l’estimation des valeurs de défocalisation des piles de film somme a été réalisée. Environ 200 microphotographies qui en résultent ont été utilisés comme source pour la cueillette manuelle de particule et initial exempt de référence 2D classification31. Les moyennes de classe 2D représentant neuf de cette classification initiale ont été choisis et utilisés comme modèles pour le prélèvement de particules automatisées pour l’ensemble des données. Une vérification manuelle des particules d’autopicked a été réalisée pour enlever les particules évidemment mauvaises, puis trois séries de classification 2D ont été utilisées pour affiner la sélection des particules autopicked (Figure 5). Ces particules sélectionnés 2D-classe ont été classées en cinq classes 3D à l’aide d’un filtre passe-bas basse de 60 Å comme un modèle de référence initiale. De ces cinq classes, seule affiche haute résolution caractéristiques (Figure 5). Particules de cette classe ont été davantage soumis à raffinement local avec une limite haute résolution de 4.5 Å et C4 symétrie appliqués (Figure 5)32. Le modèle raffiné a été examiné et à nouveau modifiée manuellement. La structure raffinée a été validée par calcul des courbes FSC pour déterminer la différence entre le modèle final et carte EM et évaluation des géométries du modèles atomique33.

Construction du modèle initial a effectué un domaine TMD de la structure TRPM4 (APB 5wp6) comme un guide34. Bâtiment de novo du modèle de hTRPC3 s’est principalement inspirée de résidus encombrants et prédiction de structure secondaire, avec les nombreuses hélices α dans la structure facilite grandement l’affectation de registre. À l' initiale de novo-construit le modèle, la commande, la longueur et position des caractéristiques de structure secondaires et résidus encombrants sont en bon accord avec la prédiction. Au cours de l’affinage, la résolution a eu lieu à une limite inférieure à celle estimée pour la reconstruction finale de la résolution. FSC en trois dimensions a été utilisé pour mesurer le coefficient normalisé de corrélation croisée entre deux cartes 3D générés indépendamment (chacun en utilisant la moitié de l’ensemble de données) dans des coquilles correspondants dans l’espace de Fourier (en fonction de la fréquence spatiale). Nous avons utilisé un masque doux de 4.3 Å de la reconstruction et une 4.3 supplémentaire Å cosinus soft edge avec un filtre passe-bas de 10 Å, alors utilisé la norme FSC 0,143 seuil de coupure. Cela a été utilisé pour la résolution finale du rapport.

Figure 1
Figure 1 : Expression et purification de hTRPC3 en utilisant le système de BacMam. (A) schéma procédure pour hTRPC3 expression et purification. (B) Bacmid sélection de colonie sur plaque indicatrice de bleu-blanc. Choisir une colonie blanche isolée (flèche noire), pas une colonie blanche avec une colonie bleue ancrée ou une colonie blanche en contact avec une colonie bleue (flèches rouges). (C), à la GFP fluorescence de baculovirus P2 dans Sf9 cellules moins 20 X grossissement. Fluorescence doit être brillantes et présents sur la membrane cellulaire et/ou l’intérieur de la majorité des cellules pour un virus puissant. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : contrôle de la stabilité des hTRPC3 par FSEC. (A) détergent projection du hTRPC3. Le hTRPC3 était cellule entière solubilisée dans une variété de détergents avec une concentration micellaire critique de 0,01 - 20 mM et a été exécuté dans un tampon contenant du DDM/CHS. Bien que la DDM/SHC indique la solubilité plus élevée de hTRPC3, le pic apparaît à la mauvaise position, trop volumineux pour être le tétramère hTRPC3 (trace de bleu). (B) TRPM4 contrôle, avec un poids moléculaire tétramère d’environ 540 kDa, solubilisées et exécution en DDM/CHS, avait un volume d’élution d’environ 12,9 mL, tout en TRPC3, avec un poids moléculaire tétramère d’environ 400 kDa, solubilisées et exécuter en DDM/CHS, avaient un volume d’élution d’environ 11,9 mL. Avec un plus petit poids moléculaire, hTRPC3 devrait avoir un volume d’élution légèrement plus grand que TRPM4, pas un peu plus petit, ce qui suggère que la DDM/CHS peut ne pas être un détergent idéal pour hTRPC3 la solubilisation et la purification. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : dépistage de tampon de détergent de hTRPC3 par FSEC. (A) solubilité et la stabilité test d’hTRPC3 à l’aide de la digitonine. La digitonine a été testée pour la solubilisation et dans le tampon. Noter la position de pointe de hTRPC3 protéine solubilisée dans digitonine déplacée vers un plus grand volume d’élution par rapport à la protéine solubilisée dans DDM/CHS (trace jaune vs bleus et rouges traces). Seule la combinaison à l’aide de la digitonine dans des tampons de solubilisation et de course montre la bonne taille de hTRPC3 par FSEC (trace jaune, astérisque). (B) similaire aux résultats de la cellule entière solubilisée hTRPC3, la position de pointe de hTRPC3 affinité de protéine purifiée dans la digitonine (trace rouge, 14 mL), déplacée vers un plus grand volume d’élution en comparaison de l’affinité de la protéine purifiée dans DDM/CHS (bleu FSEC tracer, 12 mL) telle que mesurée par SEC-fractionnement. (C) négatif-tache EM a été utilisé pour vérifier la qualité de la protéine purifiée avant la collecte de données de cryo-EM. Une tache idéale devrait présenter des particules (cercles rouges) colorés négative (apparaissant en blanc) et entouré par un anneau de détergent (apparaissant en noir). Un représentant, micrographie idéal dans lequel ces particules sont abondants, léthifère et présents dans les orientations multiples s’affiche. (D) données sur la qualité de négatif-tache EM devraient fournir des classes 2D avec une architecture générale claire et cohérente et englober les orientations multiples de la protéine, avec une moyenne contenue et centré dans le masque (cercle noir). Classes 2D de micrographies EM négatif-tache de hTRPC3 solubilisé dans les particules présentes DDM/CHS qui semblent être une dimérisation tête-à-tête de monomères hTRPC3. En revanche, rugueuse (mais claire et cohérente) globalement gland structure semblable à un tétramère est apparente dans les classes 2D de micrographies EM négatif-tache de hTRPC3 solubilisée dans digitonine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Purification de hTRPC3. Test de stabilité de (A) de hTRPC3 en présence d’EDTA. hTRPC3 est solubilisée dans digitonine en présence (trace rouge) ou absence (trace bleue) de 10 mM EDTA. Le premier a montré un pic unique et plus étroit à la position de protéine tétramère (trace rouge, astérisque), indiquant que l’EDTA stabilisé hTRPC3 dans sa conformation tétramère. (B), GFP fluorescence signal FSEC pour hTRPC3 solubilisée dans digitonine et courir dans le tampon de la digitonine. Le pic de tétramère est observé dans le matériau solubilisé avant la purification d’affinité métal colonne (trace bleue, astérisque). L’absence de ce pic de la fraction intermédiaire indique une liaison complète de protéine de hTRPC3 dans la colonne d’affinité (trace rouge). Après élution de l’imidazole, les fractions dans le pic d’élution ont été vérifiées par FSEC (trace verte). Toutes les fractions montrant pic tétramère intacts ont été recueillies pour davantage de purification. (C) Test de clivage de la GFP, de hTRPC3, à l’aide de thrombine. Temps de digestion a été testé à l’aide d’une petite quantité de protéine à 4 ° C, et l’intégralité de la digestion a été vérifiée par FSEC. Dans chaque trace, la crête à gauche correspond au pic hTRPC3 tétramère (astérisque) et le sommet à droite est le pic GFP gratuit. Accroissement de la durée de la digestion, le ratio de protéine tétramère gratuit GFP a diminué, indiquant que la GFP a été étant clivée de la protéine. La digestion de 2 h montre un clivage complet de GFP. (D) s voir le profil :: hTRPC3 avant ou après digestion de thrombine dans la digitonine contenant l’exécution de tampon avec 10 mM EDTA ajouté. Comme prévu, la position du pic est décalée vers le plus petit volume d’élution après digestion de thrombine (trace rouge). Le pic principal (astérisque) représente le tétramère hTRPC3. Les fractions entre lignes rouges ont été prélevées pour des expériences de cryo-EM. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : schéma de collecte de données de cryo-EM et traitement pour hTRPC3. La collection de 3 660 piles de film de hTRPC3 purifié a été faite à l’aide d’un microscope électronique avec un détecteur d’électrons direct. Correction de mouvement et de la sélection manuelle ont été appliquées entraînant 3 580 micrographies. Les particules ont été autopicked et soumis à la classification 2D. Les classes 2D ont été affinés par classification 3D. Seule une personne sur cinq classes 3D affichent les fonctionnalités haute résolution. Cette classe a été sélectionnée pour le raffinement 3D et raffinement local Frealign, résultant en une structure pour hTRPC3 à 3.3 Å résolution. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Détermination de structure des protéines par cryo-EM a révolutionné le domaine de la biologie structurale dans quelques années, grâce au développement d’algorithmes et de nouvelles caméras qui accélère considérablement la détermination de la structure des protéines qui ne sont pas cristalliser facilement, en particulier les protéines membranaires. Malgré tous les progrès récents dans la technique de cryo-EM, la préparation de protéines purifiées suffisantes en qualité et quantité pour faciliter la qualité imagerie souvent reste fastidieux, coûteux et difficile. La capacité d’exprimer rapidement et écran multiple gène construit dans une variété de conditions de purification, comme décrit dans le protocole ci-dessus, améliore l’efficacité de ce processus en permettant la fabrication rapide et économique de haute qualité protéines purifiées devant servir à des études de cryo-EM.

Alors que la méthode décrite ici permet de purifier les grandes quantités de protéines de la membrane chez les mammifères à moindre coût que par transfection directement et plus rapidement que par la génération d’une lignée de cellules transfectées de façon stable, il a beaucoup d’étapes, dont chacune doit être optimisé pour fournir un rendement de protéine de haute qualité. Dans les techniques biochimiques utilisés pour produire et purifier hTRPC3, il y a un certain nombre d’étapes critiques et des points de contrôle. Le premier point de contrôle critique est la production de bacmid ADN. Comme décrit dans les résultats, colonie idéale est la première étape dans la génération d’un virus de qualité pour l’expression de la protéine. En outre, si la concentration de bacmid ADN purifié à partir de la colonie sélectionnée est inférieure à 1 μg/μL, le virus qui en résulte ne sera pas suffisant pour l’expression de la protéine robuste. Le deuxième point de contrôle critique est la production de baculovirus P1 et P2. Titre de virus peut être estimée par fluorescence GFP, comme illustré à la Figure 1 ou peut être mesurée comme décrit par Coleman et al. 35. en plus du titre viral, une évolution temporelle du temps d’infection devrait être effectuée pour chaque nouvelle construction déterminer l’heure optimale d’infection pour l’expression de la protéine maximale. Point de contrôle critique trois est la solubilité et la projection de stabilité illustré à la Figure 2. Détergents avec un CMC élevé, tels que les DDM, peuvent prévoir la solubilité élevée, mais ils ne sont pas idéales pour cryo-EM imagerie car ils peuvent entraîner une abondance de contaminer des micelles. Un détergent doux, comme la digitonine, peut fournir une solubilité suffisante tout en préservant la stabilité des protéines. La projection des additifs, comme l’EDTA dans le cas de hTRPC3, est importante pour découvrir une condition de purification qui se traduit par des protéines intactes et homogène, sans doute en enlevant le calcium de hTRPC3, qui est perméable au calcium. Point de contrôle critique quatre est la vérification de la capture de protéine spécifique et efficace au cours de la purification de colonne d’affinité et l’observation d’un pic de protéine idéale durant le SEC-fractionnement (Figure 4). L’évitement de l’inclusion de contamination des particules de protéines tout en conservant l’ensemble de la protéine cible est indispensable à l’obtention d’un rendement assez élevé de protéine pour l’imagerie de cryo-EM. Modification de l’heure et un ratio de résine à la protéine solubilisée liant le lot peut aider à améliorer la rétention des protéines par la colonne de résine. La qualité globale du pic SEC-fractionnement est selon notre expérience le meilleur indicateur, avant l’imagerie, de la qualité des particules de protéines purifiées. Un creux ou un pic large durant le SEC-fractionnement indique des problèmes possibles de particules trop peu de protéines par image ou la présence de produits d’agrégation/dégradation des protéines contaminantes, respectivement. En outre, modifications apportées à la balise d’affinité dans la construction elle-même s’est avérée nécessaire dans certains cas pour assurer suffisamment contraignante d’affinité-tag. Le point de contrôle final avant la collecte des ensembles de données de cryo-EM est la vérification de la qualité particule protéique par coloration négative EM. Bien que pas strictement nécessaire, nous trouvons que c’est une excellente occasion aux problèmes de qualité de protéine spot et correcte avant d’investir dans le processus de beaucoup de temps et de coût de collecte de données par cryo-EM.

Une autre méthode de production de protéines pour les études structurales de cryo-EM est la purification directe de protéines provenant de la source de tissus natifs. Bien que cette méthode rencontre souvent des problèmes avec un rendement de protéine, c’est une excellente alternative pour les protéines qui sont très abondantes dans les cellules ou qui existent dans le cadre d’un vaste complexe de plusieurs protéine, qui peut être difficile à produire en utilisant une surexpression recombinante système36. Cependant, pour unique protéines exprimées en quantités modérées ou faibles dans des conditions physiologiques, le système d’expression et purification présenté ici est un système efficace, méthode relativement faible coût et haut rendement pour produire purifié de protéine de la membrane chez les mammifères pour les études structurales de cryo-EM. Une méthode qui pourrait compléter fortement que présenté ici est la reconstitution de la protéine purifiée en lipides nanodiscs avant cryo-EM données collection37. Selon cette méthode, les protéines sont intégrés dans un petit disque de bicouche lipidique, probablement fournir un micro-environnement natif par rapport aux micelles détergents, bien qu’il n’y a aucune preuve jusqu'à présent que les structures dissous dans un détergent et nanodisc sont différentes38,39,40. Une autre approche consiste à extraire la protéine directement à l’aide de polymères amphipathiques comme anhydride maléique de styrène (SMA), qui a été utilisé avec succès pour la détermination des protéines de membrane structures41,42.

Ces approches décrites dans ce manuscrit sont révélées pour demeurer aisément adaptable dans notre laboratoire à une variété d’autres protéines de la membrane mammifères au-delà des canaux ioniques. Nous estimons donc que ce protocole sera un outil précieux pour les analyses structurelles et fonctionnelles qui sous-tendent la conception de médicaments ciblés de haute spécificité. Cela sera particulièrement utile dans les maladies neuro-dégénératives, les maladies cardiovasculaires et le cancer, dans lequel ion canaux sont cibles de médicaments difficiles mais à fort potentiel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions G. Zhao Meng X. pour le soutien à la collecte de données à la David Van Andel Advanced Cryo-Electron Microscopy Suite. Nous apprécions l’équipe VARI High-Performance Computing pour soutien informatique. Nous donnons notre gratitude à N. Clemente, cotisations D., J. Floramo, Y. Huang, Kim Y., C. Mueller, B. Roth et Z. Ruan aux observations qui ont grandement amélioré ce manuscrit. Nous remercions D. Nadziejka d’aide à la rédaction de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par VARI interne de financement.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEG BacMam vector (pFastBacI) addgene 31488
DH10α cells Life Technologies 10361-012
S.O.C. media Corning 46003CR for transformation of DH10α cells for Bacmid
Bacmam culture plates Teknova L5919 for culture of transformed DH10α cells
Incubation shaker for bacterial cells Infors HT Multitron standard
Incubated orbital shaker for insect cells Thermo-Fisher SHKE8000
Reach-in CO2 incubator for mammalian cells Thermo-Fisher 3951
Table-top orbital shaker Thermo-Fisher SHKE416HP used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells
Incubator VWR 1535 for bacterial plates
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 for plasmid extraction and purification
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol Invitrogen 15593031 for DNA extraction
Sf9 cells Life Technologies 12659017 insect cells for producing virus
Sf-900 media Gibco 12658-027 insect cell media
FBS Atlanta Biologicals S11550
Cellfectin II Gibco 10362100 for transfecting insect cells
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 for transfecting mamalian cells
0.2 mm syringe filter VWR 28145-501 for filtering P1 virus
0.2 mm filter flasks 500ml resevoir Corning 430758 for filtering P2 virus
erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) Gene Mate F-5909-2000 for culturing insect cells
erlenmeyer culture flask (baffled 2L) Gene Mate F-5909-2000B for culturing mammalian cells
nanodrop 2000 spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000 for determining DNA and protein concentrations
HEK293 ATCC CRL-3022 mammalian cells for producing protein
Freestyle 293 expression Medium Gibco 1238-018 mammalian cell media for protein expression
Butyric Acid Sodium Salt Acros 263195000 to amplify protein expression
PMSF Acros 215740500 protease inhibitor
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-100MG protease inhibitor
Leupeptin hydrochloride Sigma-Aldrich 24125-16-4 protease inhibitor
pepstatin A Fisher Scientific BP2671-250 protease inhibitor
digitonin EMD Millipore 300410 detergent - to solubilize protein from membrane
imidazole Sigma 792527 to elute protein from resin column
TALON resin Clonetech 635504 for affinity purification by His-tag
superose6 incease columns GE 29091596; 29091597 for HPLC and FPLC
Prominence Modular HPLC System Shimadzu See Below
Controller Module " CBM20A
Solvent Delivery System " LC30AD
Fluorescence Detector " RF20AXS
Autosampler with Cooling " SIL20ACHT
Pure FPLC System with Fractionator Akta
thrombin (alpha) Haematologic Technologies Incorporated HCT-0020 Human alpha for cleaving GFP tag
Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube Millipore UFC910008 for concentrating protein
EDTA Fisher E478500 for stabilizing protein
400 mesh carbon-coated copper grids Ted Pella Inc. 01754-F grids for negative stain
Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) Electron Microscopy Sciences Q3100AR1.3 grids for Cryo-EM
Vitrobot Mark III FEI for preparing sample grids by liquid ethane freezing
liquid nitrogen Dura-Cyl UN1977
ethane gas Airgas UN1035
Solarus Plasma System Gatan Model 950 for cleaning grids before sample freezing
Tecnai Spirit electron microscope FEI for negative stain EM imaging
Talos Arctica electron microsocope FEI for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids
Titan Krios electron microscope FEI for high-resolution Cryo-EM imaging
Software
Gautomatch software http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ to pick particles from micrographs
Relion 2.1 software https://github.com/3dem/relion to construct 2D and 3D classification
CryoSPARC software https://cryosparc.com/ to generate an initial structure model
Frealign software http://grigoriefflab.janelia.org/frealign to refine particles
Coot software https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ to build a model
MolProbity software http://molprobity.biochem.duke.edu/ to evaluate the geometries of the atomic model
SerialEM software http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ for automated serial image stack acquisition
MortionCor2 software http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html for motion correction of summed movie stacks
GCTF software https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ for measuring defocus values in movie stacks
Phenix.real_space_refine software https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html for real space refinement of the initial 3D model

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
  2. Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
  3. Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353 (2012).
  4. Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
  5. Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
  6. Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
  7. Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
  8. Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
  9. Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
  10. Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
  11. Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
  12. Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
  13. Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
  14. Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
  15. Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
  16. Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
  17. Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
  18. Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
  19. Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
  20. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  21. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
  22. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  23. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  24. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  25. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  26. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  27. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  28. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  29. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
  30. Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
  31. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  32. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  33. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
  34. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
  35. Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
  36. Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
  37. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  38. Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
  39. Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
  40. Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
  41. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
  42. Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).

Tags

Biochimie numéro 143 canal ionique protéine membranaire purification des protéines détermination de la structure cryo-microscopie électronique cryo-EM baculovirus
Expression et Purification de l’homme sensible lipides canal de Cation TRPC3 pour la détermination de structure par particule Cryo microscopie électronique
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haley, E., Choi, W., Fan, C., Sun,… More

Haley, E., Choi, W., Fan, C., Sun, W., Du, J., Lü, W. Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e58754, doi:10.3791/58754 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter