Summary
このプロトコルは、バキュロ ウイルス システムを効率的に最小限の労力と毒性、蛋白質の抽出、精製、哺乳類細胞の遺伝子を表現するために使用を含むクライオ電子顕微鏡によるイオン チャネルの構造を決定するために使用方法をについて説明します品質チェック、サンプル グリッドとスクリーニングと同様、データ収集と処理。
Abstract
正規の TRP 亜科の一過性受容体電位チャンネル (TRPCs) が重要な役割を果たすカルシウム恒常性、特にストア作動性カルシウム エントリの適切な機能を維持するために不可欠な非選択的陽イオン チャネルシナプス小胞の放出と細胞内シグナリング。したがって、TRPC チャネルは、さまざまな心臓肥大などの心臓血管疾患、パーキンソン病などの神経変性疾患、脊髄小脳変性症などの神経系の疾患を含む人間の病気に関与しています。したがって、TRPC チャネルは、人間の病気の潜在的な薬理学的ターゲットを表します。ただし、これらのチャネルのゲーティングの分子メカニズムはまだ明らかではありません。安定性、均一な精製されたタンパク質の大量の取得の難しさ構造決定研究、特に TRPC イオン チャネルなどの哺乳類の膜タンパク質の制限要因となっています。ここでは、親和性とサイズ排除クロマトグラフィーによって変更されたバキュロ ウイルス遺伝子の転送システムとこれらの蛋白質の精製を用いた哺乳類のイオン チャンネル膜タンパク質の大量発現のためのプロトコルを提案する.さらに浄化された蛋白質から単一粒子の低温電子顕微鏡画像を収集するために、これらの画像を使用して蛋白質の構造を確認するプロトコルを提案します。構造決定は、ゲートとイオン チャネル機能のメカニズムを理解するための強力な方法です。
Introduction
カルシウムは、ホルモン分子合成1,2,3伝達物質の放出、転写制御カスケードのシグナリングを含むほとんどの携帯電話のプロセスに関与しています。細胞内の自由なカルシウムの恒常性の維持は健康と細胞の機能に不可欠です。ストア作動性カルシウム エントリ (SOCE) カルシウムの枯渇に格納する小胞体 (ER) トリガー イオン チャンネルの開口部を容易にする膜のプロセスは、細胞内のカルシウムの恒常性の主要なメカニズムの 1 つ、さらに4,5,6のシグナル伝達に使用できます、小胞体カルシウムの補充。TRP スーパーファミリーに属するカルシウム透過チャネルである、潜在的な一過性受容体チャンネル (TRPCs) は、SOCE7,8,9の主要な参加者として識別されています。
TRPC 家族の 7 人のメンバーの間で TRPC3、TRPC6、および TRPC7 ホモログ サブグループを形成し、脂質二次メッセンジャー ジアシルグリセ ロール (DAG) シグナル伝達脂質の分解物によって活性化することで一意ホスファチジルイノシトール 4, 5-二リン酸 (PIP2)10,11。TRPC3 は、平滑筋と神経伝達と神経新生12,13に影響を与えるカルシウム シグナル伝達に重要な役割を果たしている脳の大脳と小脳の地域に強く表されます。TRPC3 の機能不全は、中枢神経系疾患、心血管疾患、卵巣腺癌14,,1516など特定の癌にリンクされています。したがって、TRPC3 は、これらの疾患の治療のための医薬品のターゲットとしての約束を保持しています。TRPC3 作用する特化した医薬品の開発は、脂質結合サイト17,18を含むその分子活性メカニズムの理解の欠如によって制限されており。我々 はこれらのメカニズムの19に重要な洞察を提供する人間 TRPC3 チャネル (hTRPC3) と閉じた状態その 2 つの脂質結合部位の最初の原子分解能の構造を報告しています。
高解像度での膜タンパク質の構造決定の重要な要因は、高品質の蛋白質を得ることです。高品質の蛋白質を得るに必要な発現と精製条件の対応するスクリーニングは、時間がかかり、高価な努力をすることができます。ここで表現と hTRPC3 は、私たちの最初のスクリーニングで不完全の浄化のための最適の条件を識別する方法を詳しく説明するプロトコルを提案する.トラブルシューティングおよび電顕 (Cryoem) 私たちの低温電子の固体基盤を築くタンパク質の動作を最適化する方法でいくつかの重要なポイントを紹介します。生成するベクトル (pEG) Gouaux と同僚が開発したスクリーニング アッセイおよび哺乳類細胞20でバキュロ ウイルスの効率的な生成のために最適化されている変更された baculoviral を使用します。この表現方法は哺乳類の細胞膜のタンパク質の発現を迅速かつコスト効果の高い適切です。ベクトルの使用この蛍光検出のサイズ排除クロマトグラフィー ベースと (FSEC) 法21の細胞診を組み合わせています。このメソッドは、興味の構造を融合した緑色蛍光タンパク質 (GFP) タグを使用して、小さな、細胞可溶化されたサンプルのターゲット蛋白質の可視化を向上させます。これは異なる洗剤や添加物、thermostabilizing の突然変異で、タンパク質の安定性のスクリーニングにより、小規模なトランスフェクション細胞の数が少ないを使用できます。このように、条件の多くを急速に大規模な蛋白質の浄化に移動する前に検査します。次の式、スクリーニング、および浄化を取得し、タンパク質のde novoの構造決定を生成する低温電子顕微鏡から画像を処理するためのプロトコルを提案する.ここで説明したアプローチ、TRP チャネル受容体および他の膜タンパク質の構造研究のための汎化可能なプロトコルとなることと考えています。
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Protocol
1. DH10α バクミド DNA を生成する有能なセルの変形
- 興味の遺伝子を合成し、N 末端 (pFastBacI)20トロンビン胸の谷間サイトとツインの連鎖球菌性タグ、His8-タグ、および GFP を含むペグ ベクトルの修正バージョンに subclone。
- 5 を追加して有能なセルを変換 DH10α 1.5 ml チューブし、氷で 10 分間インキュベートの 50 μ L を pFastBacI で目的遺伝子を含むプラスミドの ng。熱衝撃 45 セル 42 ° C で sチューブに異化リプレッサー (SOC) 中に超最適のスープの 200 μ L を追加し、225 rpm で軌道シェーカーで 37 ° C で 4-8 時間インキュベートします。
- (50 μ g/mL カナマイシン、7 μ g/mL ゲンタマイシン、10 μ g/mL テトラサイクリン、100 μ g/mL、黄色 gal、40 μ g/mL イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside [IPTG] 寒天) バクミド LB 寒天培地プレート上のセルの 5 μ L をプレートします。
- 37 ° C で 48 h 用プレートを孵化させなさい
注: まだ lacZ (ベクター挿入失敗) を表現している黄色ギャル インジケーター汚れの植民地白人 (正常にトランス フォーム) が植民地を選択できます。 - 青いコロニーと接触するいると一晩で 225 rpm で軌道シェーカー 37 ° C バクミド LB 培地 (50 μ g/mL カナマイシン、7 μ g/mL ゲンタマイシン、テトラサイクリン 10 μ g/mL) の 6 mL のセルを育てる白人の植民地を避け、白い植民地の分離を慎重に選択します。
2. 細菌に備えてバクミド DNA の分離
- バクミドの DNA を分離するには、2880 × gで 10 分間の大腸菌細胞をスピンします。
- 上澄みと、miniprep からセル再懸濁溶液 200 μ L にペレットを再懸濁しますを (材料表参照) キット ピペッティングにより破棄。ペレットが完全にゆく中断を必ずです。その後、1.5 mL チューブに細胞懸濁液を転送します。
- Miniprep キットとミックスから細胞溶解液 200 μ L を追加するには、数回チューブを反転します。常温 (RT)、細胞を溶解するまで 5 分間インキュベートします。数回チューブを反転して miniprep キットとミックスから中和溶液 200 μ L を追加溶解反応を停止します。
- テーブル トップ遠心分離機で 21,130 x gで 10 分の間回しなさい。2 mL チューブに上清の 600 μ L を収集します。600 μ L フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール溶液を追加 (材料の表を参照してください)、セル換散の製品の残りの部分から DNA を抽出する徹底的にミックス。
注意: フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール溶液は皮膚との接触、吸入すると有毒と飲み込んだ場合。それは化学やけどを引き起こすことができ、発癌性がある可能性があります。手袋とケリの白衣を着用します。発煙のフードで働いてください。この有害廃棄物を適切に破棄します。 - テーブル トップ遠心分離機で 21130 x gで 10 分間のチューブをスピンします。液体フェーズの 2 つが表示されます。慎重に上部の水相の 300 μ L を新しいチューブに転送します。600 μ L の DNA を洗浄し、100% エタノールを追加します。やさしくミックス チューブを転倒させます。
注: は、バクミド DNA をせん断することができますこのようない渦をしないでください。 - 10 分-20 ° C のフリーザーにそれらを置くことによってクール チューブはテーブル トップ遠心分離機で 21,130 x gで 10 分間回しなさい。上澄みを廃棄し、DNA の餌を保持します。
- ペレットを洗浄する 70% エタノール 1 mL を加えます。やさしくミックス チューブを転倒させます。テーブル トップ遠心分離機で 21,130 x gで 10 分間のスピンします。上澄みを廃棄し、液体が管に表示されていない DNA の餌が半透明になるまで約 5 分、または乾燥空気にペレットを許可します。
- 50 μ L の滅菌、DNase 自由で乾燥ペレットを再懸濁します、脱イオン水。DNA 濃度を測定します。
注: は、バクミド DNA を凍結しないでください。数日まで 4 ° C で保存します。
3. P1 バキュロ ウイルスを生成するバクミドと Sf9 昆虫細胞のトランスフェクション
- シード 0.9 x 106適切な培地 2 mL に Sf9 細胞/ウェル (材料の表を参照してください) 6 ウェル培養プレートの各ウェルに。プレートへの愛着を促進するために 20 分の 27 ° C でセルを孵化させなさい。
注意: 培養細胞は、潜在的なバイオハザードです。無菌技術を使用して承認された層流フードの動作推奨の防護服と実験を実行する前に廃棄物の適切な処分の制度や政府のガイドラインを確認してください。 - 取付後のトランスフェクション試薬の 8 μ L を追加 (材料の表を参照してください)、6 のためのメディアの 100 μ L をウェル プレート生殖不能の管に導入されています。バクミド DNA の 6 μ g を別の生殖不能の管の中の 100 μ L に追加します。結合した 2 つのソリューションで 5 分間インキュベートし、室温 45 分間インキュベート
- 6 井戸の中を新鮮な培地 2 mL に置き換えます。前の手順からそれぞれの混合物を滴下も追加 (200 μ L/ウェル)。トランスフェクション ソリューションの培地に混合できるようにプレートがみ合います。
注: いない旋回かデタッチする細胞が生じるために、プレートを振る。 - 5 d (120 h) のセルを 27 ° C の加湿インキュベーターで孵化させなさい。そのウイルスは細胞の大きな割合で生産されていることを確認するために収穫前に GFP 蛍光を確認します。割合が低い場合は、必要に応じてインキュベーション時間を延長 (図 1を参照)。
- 上清含む P1 ウイルス (各ウェルから約 2 mL) を収集します。3 mL シリンジと小さな 0.2 μ m フィルターを用いた 2 mL チューブに培 P1 ウイルスをフィルター処理します。1% の最終的な集中に滅菌ウシ胎児血清 (FBS) を追加します。
注: この株式 P1 ウイルスの 4 ° C で保存する必要があります、光から保護します。
4. Sf9 昆虫細胞 P2 バキュロ ウイルスを生成する P1 バキュロ ウイルスの感染
- 準備 200 mL (または音量) Sf9 細胞濃度 0.8 - 適切な培地に 10 の6セル/mL x 0.9 (材料の表を参照してください) に十分なサイズの底が平らな三角培養フラスコで。
注: 懸濁培養の使用量を超えないフラスコの総容量の 40%。 - 懸濁培養細胞 Sf9 に 3.5 から P1 ウイルス ストックのデジタルラ スター比率 (v/v) を追加します。最適なウイルス発現 (タンパク質構造に応じて通常 48 120 h) 時 27 ° c 115 rpm で軌道シェーカーで孵化させなさい。
注: 相対ウイルス表現は文化のサンプルでウイルスの GFP 蛍光を表示することによって決定できます。 - 11,520 x gで 40 分の細胞懸濁液を遠心分離し、上清含む P2 ウイルスを収集します。使い捨て 0.2 μ m フィルターを使用して上清をフィルター処理します。FBS を最終濃度 0.5% に追加します。
注: この株式 P2 ウイルスの 4 ° C で保存する必要があります、光から保護します。 - Sf9easy 細胞またはウイルス カウンターを用いた P2 ウイルスの力価を取得します。
5. HEK293 細胞大規模タンパク質発現の P2 バキュロ ウイルスの感染
- HEK293 哺乳類の細胞懸濁培養 (4-6 L 冷凍グリッドの準備のために推奨) 3.5 3.8 x の濃度での望ましい量を準備 106セル/mL 表現媒体 (材料の表を参照) 1% を添加した (v/v) 滅菌 FB 困惑下部エルレンマイヤーの文化に十分なサイズのフラスコ。
注: 懸濁培養の使用量を超えないフラスコの容量の 40%。 - HEK293 細胞懸濁培養にステップ 4.3 から P2 ウイルス原液の 8% (v/v) を追加します。37 ° c で 135 回転軌道シェーカーで孵化させなさい。
- 感染後 12-18 h で 10 mM 酪を追加します。最適な蛋白質の表現 (通常 36 72 h) 30 ° C での時間インキュベートします。
- 2,880 × gで 20 分間遠心分離によって細胞を収穫します。約 100 mL 含有トリス緩衝生理食塩水 (TBS) 細胞収穫の 1 リットル当たりの再によって細胞を洗います。再び 2,880 × gで 20 分間遠心し、細胞ペレットを収集します。
注: プロトコルはここで一時停止可能性があります。細胞ペレットをスナップ液体窒素で凍結し、浄化まで-80 ° C で保存できます。
注意: 低温やけどや怪我、液体窒素する場合があります。それは凍傷を起こすことがあります。それは酸素を追い出して、急速な窒息を引き起こすことがあります。冷たい絶縁手袋、顔面シールドを着用します。 - 様々 な時点で 1 mL の小さな収穫を収集し、揺動するか別の洗剤や添加剤の存在下で攪拌、4 ° C で 2 時間可溶化します。サイズ排除クロマトグラフィ (SEC) カラムに 30 μ L のサンプルとして 4 ° C および実行で 10 分の 235,000 × gで遠心によってこれらの小さい細胞可溶化されたサンプルを明らかに (材料の表を参照) に最適な時間を決定するには式は、最適な可溶化条件。
注: hTRPC3、場合このスクリーニング含ま 4.0 9.5 50-500 mM の塩濃度からの pH 値の異なるバッファー別のイオン組成 (MgCl2 NaCl など)。0.1 ~ 20 mM の臨界ミセル濃度 (CMC) 値と異なる洗剤ジチオトレイトールなど添加物を減らし tris(2-carboxyethyl) 燐化水素と β-メルカプトエタノール;カルシウム キレートと添加物のエチレンジアミン四酢酸 (EDTA)。
6. 凍結細胞ペレット hTRPC3 タンパク質の精製
- 500 mM の NaCl、1 mM 特異フッ化物 (PMSF)、0.8 μ M アプロチニン、2 μ g/mL leupeptin、2 mM ペプスタチン A、20 mM トリス (pH 8.0) を含むバッファーのペレットを解凍し、100 mL の 1 リットルあたりのセルのバッファーを使用して、1% ジギトニン収穫します。解凍後、ピペット、攪拌によりソリューションの均一性を確保します。攪拌バー回転氷に没頭してビーカーの 4 ° C で 2 時間可溶化することができます。
- 4 ° C で 1 時間 235,000 × gで遠心して細胞の残骸を削除します。SEC の列に 30 μ L のサンプルを実行することによって蛋白質の量を確認 (材料の表を参照してください) 高速液体クロマトグラフィー (HPLC) による可視化する標的タンパク質 GFP 信号出力と。
- 4 ° C で 1-2 時間のコバルトの親和性の樹脂の可溶化されたタンパク質 (清) を孵化させなさい樹脂に結合する蛋白質を確認するには、秒の列に 30 μ L のサンプルを実行します。
注意: 蛋白質の結合が発生した場合、フロー ・ スルーで見つからなかったカラムの GFP タグ付きタンパク質ターゲットが保持されます。したがって、GFP シグナルされません現在流れを介して高速液体クロマトグラフィーで実行するとき、ターゲット蛋白質のサイズに対応する位置にあります。 - 10 列 (20 mM トリス、pH 8.0、500 mM の NaCl、15 mM のイミダゾールおよび 0.1% ジギトニン) バッファー量の樹脂を洗浄します。SEC の列に 30 μ L のサンプルを実行することによって蛋白質の損失を確認します。
注: 列からの蛋白質の損失が発生した場合 GFP タグ付きタンパク質ターゲットは列以上経過した洗浄バッファーで見つかりましたが。したがって、GFP の信号は高速液体クロマトグラフィーで洗浄バッファーを実行するとき、ターゲット蛋白質のサイズに対応する位置に存在します。蛋白質の損失が発生した場合は、洗浄バッファーのイミダゾールの集中をアフィニ ティー ・ カラムに彼のタグのバインディングを中断することを防ぐために低下する必要があります。 - バッファー (20 mM トリス、pH 8.0、500 mM の NaCl、250 mM のイミダゾールと 0.1% ジギトニン) と樹脂連結 hTRPC3 を溶出します。1:20 にトロンビンを追加 (GFP タグを切断) をモル比溶出サンプルに 10 mM EDTA (hTRPC3 の安定化剤) を追加し、4 ° C で 3 時間インキュベートSEC の列にサンプル希釈 1: 100 の 90 μ L を実行してターゲット蛋白質のサイズに対応する位置に gfp の有無確認タンパク質が溶出されてことを確認します。
注: この時点で、溶出の総蛋白質からトリプトファンの信号も表示できます。プロファイルで同一の近くにのみターゲット アフィニ ティー精製タンパク質が溶出し、GFP に残ります、トリプトファンの信号になります。標的タンパク質が溶出で大量では見られない、フロースルーまたは洗浄を失っていた場合蛋白質は列にバインド可能性が残っているし、イミダゾールの高濃度を使用して、バッファーで溶出することができます。 - 500 μ L に溶出液を集中または 2,880 × gで 5 分刻みで 4 ° C で回して (材料の表を参照) をチューブ 15 mL 100 K 遠心フィルターで少ない。Overconcentrating を避けるためにスピン間ソリューションを上下にピペッティングしてタンパク質を再懸濁します。
注: ボリューム希望最終巻に近づくにつれて遠心時間が短くなります。 - (20 mM トリス、pH 8.0、500 mM の NaCl、1 mM EDTA および 0.1% ジギトニン) バッファーの秒列に集中をロードします。実行します。
- UV 吸光度信号によって可視化として、そのまま TRPC3 テトラマーを含有するピーク画分を組み合わせるし、少なくとも 5 mg/mL の最終的な集中に再び集中。
7. 負染色電子顕微鏡によるタンパク質のスクリーニング
- グロー放電マシンをオンにします。タンパク質溶液の添加する前に親水性銅 400 メッシュ グリッドのカーボン被覆を作るプログラム 30 s. 実行のアルゴンと酸素を使用してカーボン コーティングのグリッドを放電するためのプログラムを設定します。
- 設定 5 40 μ L 滅菌水滴と 2 つ 40 μ L 1% ウラニル ギ酸溶液の滴 (ラボ映画、ワックス ペーパー、または同様な表面で、材料の表を参照してください)。手順 7.1 からグリッドを取るとダークサイドに蛋白質の 2.5 μ L サンプル 5 mg/mL (50-200 μ M) を追加し、1 分に座ってみましょう。
- 1 分後、ろ紙を使用してグリッドを乾かしてください。グリッド表面に直接フィルター ペーパーに触れないで代わりに、液体の液滴の端に用紙を持っていき、フィルター ペーパーにグリッドから液体を引っ張って、毛管作用を許可します。
- グリッドを最初の一滴の水に浸し。ろ紙を乾燥し、水の残りの滴とギ酸ウラニルの最初のドロップを繰り返します。ウラニル ギ酸 1 分座っているの 2 番目のドロップを許可し、ろ紙を乾燥します。保存する前に完全に乾燥空気に (約 1 分) グリッドを許可します。
注: この汚損のプロトコルは、すべてのタンパク質洗剤の組み合わせに最適なできない場合があります。ウラニル ギ酸濃度の異なる染色、上記の手順は、良好なコントラストの汚れを提供しない場合汚れ露出時間の異なる長さをテストする必要があります。 - イメージの電子顕微鏡にグリッド (テーブルの材料を参照) 蛋白質粒子の品質をチェックします。均一分布と一般的な外観は、多数の粒子を顕微鏡写真に示すように、良いコントラストを表示およびターゲット蛋白質の予測サイズに合わせてください。
- 予備を生成、低解像度、二次元 (2 D) 分類チェックする粒子 50-100 の顕微鏡写真 (データ処理-手順 10 を参照) を使用して単一の一貫性のある構造の異なるビューを表します。
注: 顕微鏡写真と、上記プロトコルが蛋白質の浄化のため十分に最適化されているという強力な指標としての十分な品質の予備の 2 D クラス。準備と Cryoem グリッドのスクリーニングはこの時点で保証されます。
8. EM 試料
- グロー放電金ホーリーファイバー カーボン グリッド (テーブルの材料を参照) 手順 7.1 で説明しました。
- グリッド上に集中している hTRPC3 蛋白質のサンプル (5 mg/mL) の 2.5 μ L を適用します。1.5 のグリッドをしみしみを使用して s を強制的に 1 と 5 の待機時間の湿度 100%、4 ° C で s は、ガラス固化機を使用して液体窒素で冷却された液体のエタンにグリッドを突入します。
注: 湿度、温度、しみ力、しみ時間、および待機時間のここに記載されては、著者の hTRPC3 研究19使用されました。彼らは、他の蛋白質および洗剤用最適なガラス質の氷を生成する変更する必要があります。 - 画面がフリーズ Cryoem 顕微鏡を用いた最適な氷の条件のためのグリッド (材料の表を参照) と手動で氷の表示領域 (グリッドの正方形より小さいと暗く表示される)、氷の厚さの薄い氷 (グリッドの正方形より大きいと明るく表示される)、および媒体.
注: さらに厚い氷の中には薄い氷はしばしばより良いコントラストと解像度を期待しながら多くの場合より粒子を保持します。氷を決定する画像の使用マニュアル スクリーニング条件良好なコントラストと解像度単分散粒子の多数の結果です。良い条件を検証すると、300 kV の低温電子顕微鏡顕微鏡画像コレクションに移動します。
9. EM データ コレクション
- 1.074 のビン分割ピクセル サイズで超解像カウント モードで画像のスタックを記録自動収集プログラムを使用して、Å 電子顕微鏡を 300 で 130,000 X の名目倍率で kV 直接電子検出器。
- 8 の総露光時間と 40 フレームにすべての画像を線量分別 0.2 s フレームと 6.76 e− − 2 Å s− 1 (筆者らの実験では 2.5 μ m 1.0 から様々 な名目のデフォーカス値) の線量率毎秒。
10. EM データ処理
- 動きの補正合計映画スタック22を実装し、デフォーカス23データ処理ソフトウェアを使用しての値の推定 (材料の表を参照)24。
- 粒子の顕微鏡写真からを選択します。粒子を選んだこれらを使用して、ソフトウェア24を使用して初期参照無料 2 D 分類を構築します。選択した理想的な 2 D クラスは、データ セット全体の自動化された粒子ピッキングのテンプレートとして使用する平均します。
- 手動で自動ピックアップ粒子の品質をチェックし、悪い粒子を削除します。2D の分類を複数回を使用すると、選んだ粒子をクリーンアップします。
- 初期モデル25を生成します。件名 2 D は、参照モデルとして C1 対称性と 60 Å の初期復興低域通過フィルターを用いた三次元 (3 D) 分類 (約 5 クラス) に粒子を選んだ。どのクラス高解像度機能を持っているし、そのようなクラス内の粒子を組み合わせて決定します。
- C4 対称性 (hTRPC3) の場合適用局所細分割を使用して粒子をさらに絞り込むし、粒子の配向の高解像度制限 4.5 Å の26に設定します。
11 モデルの構築
- モデルを構築する (使用しているソフトウェアの材料表を参照)。HTRPC3 の一時的な受容器の潜在的な melastatin 4 (TRPM4) の膜貫通ドメイン (TMD) を使用して、構造蛋白質のデータ ・ バンク (PDB) 5wp6 ガイド27として。かさばる残基と二次構造予測を使用して、 de novo建物を進めます。
- 二次構造拘束28で実空間洗練された初期モデルを対象します。手動で洗練されたモデルを調べて、remodify (使用しているソフトウェアの材料表を参照) を必要に応じて。
- 最終的なモデルと洗練された構造の検証 EM 地図の違いを計算するフーリエ シェル (FSC) の相関曲線を適用します。(使用しているソフトウェアの材料表を参照) 原子モデルのジオメトリを評価29,30。
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Representative Results
表現のプロトコルの概要と hTRPC3 の精製は、図 1 aに表示されます。理想的な白人植民地、バクミド DNA 精製のために選択のような hTRPC3 バクミド板のイメージは図 1 bに表示されます。わかったその 48 h は明確な黄色 gal は、隔離されたコロニーの存在を維持しながらの染色に最適です。P2 hTRPC3 GFP 蛍光で可視化としてのウイルスの生産ピークは感染 Sf9 昆虫細胞 (図 1) の 4 d の後見られました。
P2 baulovirus 1% を添加したメディアから収穫された FBS、HEK293 細胞の懸濁液に感染するために使用します。酪酸ナトリウムが追加されたタンパク質式20を後押しするウイルスに感染した細胞 12 18 h。セル、30 ° C で、さらに 36 時間培養しセルは、収穫され、FSEC (図 2 a)21による溶解性と安定性の審査を受けます。セルは、CMC 値 0.01 - 洗剤濃度 CMC 値の約 10 倍で 20 mM と 7 つの異なる洗剤を使用して可溶化しました。全細胞可溶化後細胞換散の残骸遠心により除去し、可溶性蛋白質を含む上清が秒の列に読み込まれ n-ドデシル-β-D-maltopyranoside/コレステリル hemisuccinate (DDM/CHS) の高速液体クロマトグラフィーで実行絶対溶解度と TRPM4 コントロール (図 2 b) に関連して異なる条件下での hTRPC3 のピーク ボリューム位置を比較する洗剤を含むバッファー。DDM/CHS は最も一般的ので別洗剤の可溶化サンプル洗剤を使用は、膜タンパク質の構造を解決するとき、初期実行バッファーとして DDM/CHS を使用しました。異なる洗剤可溶化 TRPC3 サンプル示したピーク位置の hTRPC3 の 4 量体の形が正より分子量の小さい方には大きすぎる可能性が高い約 11.9 mL ですべての人間の TRPM4 制御 (図 2 aおよび図 2B)。
それにもかかわらず、私たちの結果を比較する任意の TRPC チャネルの受容体の構造がなかったので、大きい分子量は TRPC3 やその他の要因のアーキテクチャによって引き起こされるかもしれないので、我々 は 25 mL を使用して hTRPC3 の小規模浄化を実施DDM/CHS として実験を通して DDM/CHS を使用してセルは、hTRPC3 の最高の容解性を与えた。HTRPC3 の秒プロファイル径ピークを示したが、TRPM4 より高い分子量を表すピーク位置にまだあった (データは示されていない)。我々 は、蛋白質の品質を確認するための迅速な方法は、蛋白質の非常に小さい量を必要とするため負染色 EM による秒プロファイルのピーク画分タンパク質をチェックしました。、顕微鏡写真で同じ粒子内に存在 2 つの膜貫通ドメインを持つ粒子が観察されました。それは 2 つの hTRPC3 粒子が (図 3 D) ゾル性細胞質の 2 つのドメイン間の相互作用を頭に二量化登場。我々 は、2 番目の小規模な浄化用浄化バッファーの hTRPC3 の二量化を妨害することを望んで還元試薬ジチオトレイトール (DTT) を含め。確かに、秒分画によって低分子量の第 2 ピークが登場しました。しかし、粒子は小さすぎてそのまま四量体が登場、膜貫通ドメインなどの膜蛋白質の機能を示した。DDM/CHS は適した洗剤 hTRPC3 の最高の容解性を与えるにもかかわらず、hTRPC3 を浄化するためではなかったことが判明しました。
次に、我々 は hTRPC3、可溶化、穏やかな洗剤、ジギトニンを試み、DDM/CHS における可溶性蛋白質と比較しています。ここで DDM/CHS とジギトニンをそれぞれ含む 2 つの異なる実行バッファーを使用しました。これは重要だったことを考えると実行中のバッファーで洗剤はしばしばタンパク質の安定性に貢献する、可溶化から洗剤を FSEC に変更するとき膜タンパク質が不安定になることがあります。タンパク質は、DDM/CHS またはジギトニンで可溶化と低分子量に向けて有望なピークのシフトを示したジギトニンを格納するバッファーで実行されます。タンパク質の可溶化し、ジギトニンで実行をもたらした肯定的な制御、人間 TRPM4 の位置を基準にして合理的な位置の最高峰 (図 3 a)。その後、我々 は細胞の 25 mL を使用して小規模な浄化を実行することで前方に移動します。ただし、複数広いピークはタンパク質は負染色 EM (図 3および図 3 D) による 2 D の分類で 4 量体 hTRPC3 の単一チャネルの機能を示した秒 (図 3 b) で観察しました。そのジギトニンは hTRPC3 を浄化するための理想的な洗剤と結論付けます。
スケール アップ hTRPC3 の式を行い、ジギトニン細胞の 400 mL を使用して中規模の浄化。により、我々 は我々 は大規模な hTRPC3 を浄化するための最終的な条件を考え出したする前に媒体と洗剤を無駄なく冷凍グリッドのいくつかの十分な蛋白質を得ることを望みます。それは頻繁に起こるとき冷凍グリッドの準備のため高濃度の不安定性を示す膜タンパク質。精製と濃縮のタンパク質だけでなく FSEC、によってより高い分子量にシフト、また Cryoem グリッド EMCCD カメラを搭載した電子顕微鏡を使ってイメージ化でノイズの多い背景を示した。にもかかわらず、1 つを観察することができました、そのまま 4 量体受容体、ジギトニンで精製 hTRPC3 でした高分解能低温電子顕微鏡研究に最適。
タンパク質の安定性をさらに改善するには、偉大ないくつかのプロトコルの手順 5 で説明した条件で仕切った。HTRPC3; の生理的特性に基づいて画面の添加物を使用しました例えば。、EDTA が hTRPC3 はカルシウム透過性とタンパク質を安定させる可能性がありますカルシウムを削除するために選択されました。FSEC ジギトニン含むバッファーで実行されているテスト サンプルの 10 ミリメートルの EDTA はそのまま 4 量体ピーク位置 (図 4 a) で hTRPC3 を安定させる顕著な効果を示した。それはまた大幅 Cryoem 顕微鏡で粒子の数を増加し、図 5に示すように、バック グラウンドのノイズを減少します。
表現そして浄化のための理想的な条件を特定した後、hTRPC3 の大量発現 (2 L) を行った。HTRPC3 を含むセルは収穫され、可溶化します。超遠心機明らかにライセートを受けた金属アフィニ ティー ・ カラム精製バッチ バインディングによって重力列における浄化続くコバルト樹脂。列内の可溶性タンパク質の保持列からのアフィニ ティー精製タンパク質の溶出は、FPLC (図 4 b) によって確認されました。我々 が見つかりました、hTRPC3、洗浄バッファーの 15 mM のイミダゾールの集中された非特異的樹脂バインディングでは、汚染タンパク質を削除するための十分な 250 mM のイミダゾール溶出バッファーで可溶化された hTRPC3 の大半を溶出するのに十分だったタンパク質は樹脂にバインドされています。FSEC、チェックされたすべてのサンプルを示し、正しいピーク位置でのシャープ、単分散ピークが溶出蛋白質を表す。GFP タグと hTRPC3 蛋白質間の柔軟性は、画像処理より困難の中にタンパク質の粒子の配向をすることができるし、我々 は少量のテスト トロンビン胸の谷間サイトは GFP と hTRPC3 の間に位置しているので、本質的な精製トロンビン プロテアーゼを使用して異なる胸の谷間でタンパク質。溶出蛋白質は、1:20 モル比が 4 ° C で 2 時間後合理的な安定性と完全な胸の谷間を見せたでトロンビンで培養した、ことを考える私たちは同じ条件を使用してすべての浄化された蛋白質から、GFP を切断し、GFP が c をされていることを確認するための高速液体クロマトグラフィーによるチェックレジンの削除 (図 4)。蛋白質 s、精製した、GFP の胸の谷間は、分子量の小さい方 (図 4) に向かってピーク位置のシフトによって再び視覚化できます。主なピーク画分から小さな未濃縮サンプルは、負染色 EM の格子を作るに使用されました。4 量体 hTRPC3 を含むすべての画分、結合され最終濃度 5 mg/mL、低温電子顕微鏡イメージング用グリッドを準備に使用された reconcentrated。我々 はまだ徐々 に蛋白質の部分を観察するいると大きい分子量シフト我々 で正しい分子量分画のみを収集、凍結したグリッド蛋白質の浄化の直後後。通常、1 日内に固定されたグリッドを準備するタンパク質の精製から実験のシーケンスを完成しました。
浄化された hTRPC3 タンパク質の 2.5 μ L サンプル (濃度 5 mg/mL) グロー放電ホーリーファイバー カーボン グリッドに適用されました。ガラス固化機は 1.5 を使用して、グリッドの準備に使用された s 未満 100% 湿度は、液体エタンに暴落が続く時間をしみが付くことは液体窒素によって冷却されます。この手順は、イメージングのためのガラス質の氷にサンプルをフリーズします。画像は 300 でクライオ電子顕微鏡による公称倍率 × 130,000 で捕獲された kV。画像のスタックは、集録ソフトウェアを自動カウント モード 1.074 のビン分割ピクセル サイズと å の公称デフォーカス値を 1.0 から直接電子検出器を用いた 2.5 μ m に至るまで超解像度で記録されました。各画像は 8 の総露光時間と 40 フレームに線量分画した s (0.2 フレーム毎秒) と 6.76 e− Å−2の−1の線量率。このデータ セットから代表的な顕微鏡写真を図 5に示します。
動き補正と合計映画スタックのデフォーカスの値の推定を行った。約 200 の生じる顕微鏡写真は、手動粒子ピッキングの初期参照無料 2 D 分類31ソースとして使用されました。この初期の分類から 9 つの代表的な 2 D クラス平均とデータ セット全体の自動化された粒子選択するためのテンプレートとして使用しました。明らかに悪い粒子を除去する autopicked 粒子の手動チェックを行ったし、2 D の分類の 3 つのラウンドは、autopicked 粒子 (図 5) の選択を絞り込むに適用されました。これらの 2D クラス選択した粒子は 60 の低域フィルターを使用して 3 D の 5 つのクラスに分類された Å 最初の参照モデルとして。これらの 5 つのクラスの 1 つだけには高解像度機能 (図 5) が表示されます。このクラスから粒子はさらに 4.5 の高解像度制限と局所細分割にさらされた Å、C4 の対称性 (図 5)32の適用。洗練されたモデルは手動で検討、remodified されました。洗練された構造は、最終的なモデルとマップの違いを決定する FSC 曲線の計算、原子モデル33のジオメトリの評価検証されました。
TRPM4 構造 (PDB 5wp6) の TMD ドメイン ガイド34として使用初期モデルの構築を行った。HTRPC3 のモデルのde novoの建物は、かさばる残渣、二次構造予測、レジスタ割り当てが容易構造多くの α ヘリックスによって導かれた主に。初期のde novoの-モデルを構築するには、順序、長さ、およびセカンダリの構造的特徴とかさばる残基の位置が予測とよく一致します。洗練された中、解像度下限推定最終的な再建のための解像度より開催されました。三次元 FSC (空間周波数の関数) としてフーリエ空間で対応するシェルで (各半分を使用してデータ セットの) 2 つの独立して生成された 3 D マップの正規化相互相関係数の測定に使用されました。4.3 の柔らかなマスクを用いて Å Å、その 10 の低域通過フィルターと一緒に Å コサイン ソフト エッジの復興と追加 4.3 から FSC 0.143 のゴールド スタンダードを使用カットオフのしきい値。これは、最終的な解決を報告するために使用されました。
図 1: 発現・精製 hTRPC3 BacMam システムを使用しています。(A) hTRPC3 の表現そして浄化のための概略プロシージャ。(B) 青白インジケーター プレート バクミド植民地選択。隔離された白いコロニー (黒矢印)、ない埋め込まれた青いコロニー白コロニーまたは青いコロニー (赤矢印) と接触して白いコロニーを選択します。Sf9 の P2 バキュロ ウイルスの (C) GFP 蛍光細胞下 20 倍の倍率です。蛍光は、明るく、強力なウイルスの細胞膜や細胞の大部分の内部に存在する必要があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: FSEC による hTRPC3 の安定性スクリーニングします。(A) 洗剤 hTRPC3 のスクリーニングします。HTRPC3 全体セル各種臨界ミセル濃度 0.01 - 20 mM の洗剤の可溶化し、DDM/CHS を含むバッファーで実行されました。DDM/CHS が hTRPC3 の最も高い溶解度を示すピークが大きすぎて 4 量体 hTRPC3、間違った位置に表示されます (青のトレース)。(B) TRPM4 コントロール、4 量体, 可溶化および実行の DDM/CHS、約 540 kDa の分子量が約 400 kDa、可溶化、実行の 4 量体分子量約 12.9 mL、TRPC3 中の溶出DDM/CHS における約 11.9 mL の溶出容量を持っていた。小さい分子量の hTRPC3 は、TRPM4、若干溶出しない小さめ、DDM/CHS が hTRPC3 可溶化そして浄化のための理想的な洗剤ではないかもしれないことを示唆しているに期待。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: FSEC によって hTRPC3 の洗剤バッファー スクリーニングします。(A) 溶解性と安定性のテスト hTRPC3 ジギトニンを使用します。ジギトニンは調べたの可溶化と連続したバッファーの両方です。DDM/CHS (黄色と青と赤トレース) の可溶化蛋白質と比較して溶出量が多いシフト ジギトニンで可溶化 hTRPC3 タンパク質のピーク位置に注意してください。可溶化、実行の両方のバッファーのジギトニンを使用してのみの組み合わせは、FSEC (黄色のトレース、アスタリスク) によって hTRPC3 の正しいサイズを示しています。(B) と同様に全細胞可溶化された hTRPC3、DDM/CHS (青で精製したタンパク質親和性と比較して溶出量が多いシフト ジギトニン (赤のトレース、14 mL) で精製 hTRPC3 タンパク質親和性のピーク位置の FSEC 結果トレース、12 mL) 秒分別によって測定されます。(C) 負染色 EM Cryoem データ収集前に浄化された蛋白質の品質を確認する使用されました。理想的な汚れの微粒子 (赤丸) ネガティブ染色 (白) を示すべきである (黒表示) 洗剤のリングに囲まれて。代表、これらの粒子が多い理想的な顕微鏡写真、単分散、現在では複数方向が表示されます。(D) 陰性染色 EM から品質データ明確で一貫した全般的なアーキテクチャを持つ 2D クラスを提供する必要があります、平均に含まれているし、マスク (黒丸) 内の中央に蛋白質の複数の向きをまとめる必要があります。HTRPC3 hTRPC3 モノマーの頭二量体化のように見える DDM/CHS 存在粒子の可溶化の否定的な汚れの EM の顕微鏡写真から 2 D クラス。対照的に、大まかな (しかし、明確で一貫した) の全体的なドングリのような 4 次構造 2 D クラス ジギトニンで可溶化 hTRPC3 のネガティブ染色 EM 顕微鏡写真から感じ取ることが。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: hTRPC3 の精製します。(A) の安定性は、EDTA の存在下での hTRPC3 のテストします。hTRPC3 (赤のトレース) の存在か不在 (ブルー トレース) 10 mm EDTA でジギトニンで可溶化します。前者四量体蛋白質の位置 (赤いトレース, アスタリスク)、1 つと狭いピーク EDTA 安定の 4 量体構造の hTRPC3 であることを示します。(B) GFP 蛍光 hTRPC3 ジギトニンで可溶化における信号の FSEC ジギトニン バッファーで実行してください。金属アフィニ ティー ・ カラム精製 (青のトレース、アスタリスク) 前に可溶化された材料の四量体のピークが観察されます。フロー ・ スルー画でこのピークの不在は、アフィニ ティー ・ カラム (赤のトレース) の hTRPC3 蛋白質の完全なバインドを示します。イミダゾールによる溶出後 FSEC (緑トレース) 溶出ピーク画分にチェックされました。そのまま四量体のピークを示すすべての画分は、更なる精製のため収集されました。(C) GFP 谷間 hTRPC3 のトロンビンを使用してのテスト。消化時間は、4 ° c、タンパク質の少量を使用してテストされ、FSEC によって消化の完全性がチェックされました。各トレースで hTRPC3 テトラマー ピーク (アスタリスク) に対応する左側のピークと右側のピークは無料の GFP のピーク。消化の長さが増加し、GFP を無料 4 量体タンパク質の比率減少、GFP は蛋白質から裂かれてことを示します。2 h 消化は、GFP の完全な胸の谷間を示しています。10 mM でバッファーを実行する前に、または後トロンビン消化ジギトニン含有 hTRPC3 の秒 (D) プロファイル EDTA が追加されます。予想通り、トロンビン消化 (赤いトレース) 後でより小さい体積は溶出に向かってピーク位置は移った。主峰 (アスタリスク) は、4 量体 hTRPC3 を表します。赤い線の間の分数は、Cryoem 実験で収集されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: Cryoem データ収集と hTRPC3 の処理の概略図。精製 hTRPC3 の 3,660 映画スタックのコレクションが行われていた直接電子検出器を用いた電子顕微鏡。モーション補正と手動の選択は、3,580 顕微鏡の結果を適用しました。粒子 autopicked と 2 D の分類を受けます。2 D クラスが 3 D の分類で絞り込む。唯一の 5 人のうち 1 人 3 D クラスには、高解像度の機能が表示されます。このクラスは、3 D の絞り込みと 3.3 Å の分解能で hTRPC3 の構造に終って Frealign 局所細分割に選ばれました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
低温電子顕微鏡による蛋白質の構造決定はしない蛋白質の構造決定を大きく短縮新しいカメラやアルゴリズムの開発のおかげで、過去数年間で構造生物学の分野に革命をもたらしました容易に、特に膜タンパク質結晶化します。すべての低温電子顕微鏡技術の最近の進歩にもかかわらず、高画質頻繁化を容易にするために十分な質と量で浄化された蛋白質の準備の時間がかかり、高コスト、かつ挑戦的なままです。プロトコルを上で説明するよう迅速かつコスト効果の高い高品質の生産を許可することでこのプロセスの効率を改善する急速に表現する能力、複数の遺伝子をさまざまな精製条件の下で構築画面Cryoem 研究の使用のための浄化された蛋白質。
ここで説明したメソッドによって直接よりも少ないコストで哺乳類の膜タンパク質の大量を浄化するための方法を提供しますより迅速により固定して transfected セル行の生成、多くの手順がある、それぞれの最適化する必要がするには高品質の蛋白質収量を提供します。内で生産し、hTRPC3 を浄化するために使用する生化学的手法、重要なステップとチェックポイントの数があります。最初の重要なチェックポイントは、バクミド DNA の生産です。前述の結果に、理想的な植民地選択は、世代品質ウイルスの蛋白質の表現のための最初のステップと。さらに、選択したコロニーから精製バクミド DNA の濃度は、未満 1 μ g/μ L は、結果として得られるウイルスは堅牢な蛋白質の表現のための十分ななります。2 番目の重要なチェックポイントは、P1 と P2 のバキュロ ウイルスの生産です。ウイルス力価は図 1に示すように、GFP 蛍光で推定できるまたはコールマンらによって記述することができます。35です。 ウイルス力価に加え感染時間の経過を最大の蛋白質の表現のため感染症の最適な時間を決定する各の新しい構成要素の実施必要があります。重要なチェックポイント 3、溶解度と図 2に示す安定性スクリーニングです。Ddm™ などの高い CMC と洗剤は、高溶解性を提供することが、彼らは Cryoem イメージング彼らはミセルを汚染することの豊かさにつながるので最適ではありません。ジギトニンなど、穏やかな洗剤は、タンパク質の安定性を維持しながら十分な溶解性を提供できます。場合 hTRPC3、EDTA などの添加剤のスクリーニングはカルシウム透過性である hTRPC3 からのカルシウムを除去することによっておそらく影響を受けず、均一なタンパク質の結果精製条件を発見するために重要です。重要なチェックポイント 4 は具体的かつ効率的なタンパク質親和性カラム精製中にキャプチャの検証や秒分別 (図 4) の中に理想的なタンパク質のピークの観察。ターゲット蛋白質のすべてを維持しながらタンパク質粒子の汚染介在物の回避は低温電子顕微鏡イメージングのための蛋白質の十分に高い収量を得ることが重要です。バッチ バインディング時間とレジンの可溶性タンパク質の比率の変化は樹脂カラムによるタンパク質の保持を向上させることができます。秒分別ピークの全体的な品質は最良の指標は、イメージング、浄化された蛋白質の粒子の質の前に我々 の経験では。低または秒分別ピークの広範な汚染タンパク質凝集/劣化等の画像あたり少なすぎるタンパク質の問題有無をそれぞれ示します。さらに、コンス トラクター自体に親和性タグへの変更は場合によっては十分な親和性タグ結合を確保するために必要な実証されています。Cryoem データ セットのコレクションの前に最後のチェックポイントは、否定的な汚れの EM による粒子品質検査です。必須ではありませんが、我々 は見つける Cryoem によってデータの収集の時間とコストのかかるプロセスに投資する前にスポットと正しい蛋白質品質問題に絶好の機会は、これ。
低温電子顕微鏡構造研究のための蛋白質の生産の 1 つの代替方法は、ネイティブの組織の源からの蛋白質の直接浄化です。このメソッドが多くの場合蛋白質収量の問題を検出、それは細胞の非常に豊富なまたは多蛋白質の複合体が大きい、組換え発現を使用して生成することは困難の一部として存在する蛋白質のための優れた代替手段システム36。しかし、生理学的な条件の下で中程度または低量で表される単一蛋白質のためここで紹介する表現そして浄化システム、効率的な比較的低コスト、高収率の製造方法は哺乳類膜タンパク質を精製しました。低温電子顕微鏡構造研究。ここで紹介が強く補完する 1 つの方法は、脂質 nanodiscs Cryoem データ コレクション37前に浄化された蛋白質の溶解です。この方法の下で蛋白質は構造が洗剤に溶解、ナノディスクところの証拠はないがおそらく洗剤のミセルと比較するとネイティブのような微小環境を提供する、脂質二重膜の小さなディスクに埋め込まれます。異なる38,,3940。別のアプローチは、スチレン無水マレイン酸 (SMA) による膜タンパク質構造41,42正常に使用されているような両親媒性ポリマーを使用して直接蛋白質を抽出することです。
本稿で説明したこれらのアプローチは、イオン チャネルを越えて他の哺乳類の膜蛋白質の様々 な研究室に容易に適応可能であると証明しました。したがって、このプロトコルは特異性の高い標的薬剤設計の根底にある構造的・機能的解析で貴重なツールになると考えています。これは、神経変性疾患、心血管疾患、がん、イオン チャンネルは難しいですが、高電位の創薬ターゲットの特に役に立つでしょう。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
デビッドのヴァン アンデル高度なクライオ電子顕微鏡スイートでデータ収集をサポート、G. 趙と X. 孟に感謝します。バリ ハイ パフォーマンス コンピューティング チーム計算サポートのお願い申し上げます。我々 はこの原稿を大幅改善コメント (名) ・ クレメンテ、D. 会費、j. Floramo、雄黄、Y のキム c. ミューラー、B. Roth、Z. ルアンに感謝の意を与えます。D. Nadziejka は、この原稿の編集サポートを感謝いたします。この仕事は、内部のバリによって支えられた資金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEG BacMam vector (pFastBacI) | addgene | 31488 | |
| DH10α cells | Life Technologies | 10361-012 | |
| S.O.C. media | Corning | 46003CR | for transformation of DH10α cells for Bacmid |
| Bacmam culture plates | Teknova | L5919 | for culture of transformed DH10α cells |
| Incubation shaker for bacterial cells | Infors HT | Multitron standard | |
| Incubated orbital shaker for insect cells | Thermo-Fisher | SHKE8000 | |
| Reach-in CO2 incubator for mammalian cells | Thermo-Fisher | 3951 | |
| Table-top orbital shaker | Thermo-Fisher | SHKE416HP | used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells |
| Incubator | VWR | 1535 | for bacterial plates |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | for plasmid extraction and purification |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol | Invitrogen | 15593031 | for DNA extraction |
| Sf9 cells | Life Technologies | 12659017 | insect cells for producing virus |
| Sf-900 media | Gibco | 12658-027 | insect cell media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cellfectin II | Gibco | 10362100 | for transfecting insect cells |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | for transfecting mamalian cells |
| 0.2 mm syringe filter | VWR | 28145-501 | for filtering P1 virus |
| 0.2 mm filter flasks 500ml resevoir | Corning | 430758 | for filtering P2 virus |
| erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) | Gene Mate | F-5909-2000 | for culturing insect cells |
| erlenmeyer culture flask (baffled 2L) | Gene Mate | F-5909-2000B | for culturing mammalian cells |
| nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | for determining DNA and protein concentrations |
| HEK293 | ATCC | CRL-3022 | mammalian cells for producing protein |
| Freestyle 293 expression Medium | Gibco | 1238-018 | mammalian cell media for protein expression |
| Butyric Acid Sodium Salt | Acros | 263195000 | to amplify protein expression |
| PMSF | Acros | 215740500 | protease inhibitor |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-100MG | protease inhibitor |
| Leupeptin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 24125-16-4 | protease inhibitor |
| pepstatin A | Fisher Scientific | BP2671-250 | protease inhibitor |
| digitonin | EMD Millipore | 300410 | detergent - to solubilize protein from membrane |
| imidazole | Sigma | 792527 | to elute protein from resin column |
| TALON resin | Clonetech | 635504 | for affinity purification by His-tag |
| superose6 incease columns | GE | 29091596; 29091597 | for HPLC and FPLC |
| Prominence Modular HPLC System | Shimadzu | See Below | |
| Controller Module | " | CBM20A | |
| Solvent Delivery System | " | LC30AD | |
| Fluorescence Detector | " | RF20AXS | |
| Autosampler with Cooling | " | SIL20ACHT | |
| Pure FPLC System with Fractionator | Akta | ||
| thrombin (alpha) | Haematologic Technologies Incorporated | HCT-0020 Human alpha | for cleaving GFP tag |
| Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube | Millipore | UFC910008 | for concentrating protein |
| EDTA | Fisher | E478500 | for stabilizing protein |
| 400 mesh carbon-coated copper grids | Ted Pella Inc. | 01754-F | grids for negative stain |
| Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | grids for Cryo-EM |
| Vitrobot Mark III | FEI | for preparing sample grids by liquid ethane freezing | |
| liquid nitrogen | Dura-Cyl | UN1977 | |
| ethane gas | Airgas | UN1035 | |
| Solarus Plasma System | Gatan | Model 950 | for cleaning grids before sample freezing |
| Tecnai Spirit electron microscope | FEI | for negative stain EM imaging | |
| Talos Arctica electron microsocope | FEI | for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids | |
| Titan Krios electron microscope | FEI | for high-resolution Cryo-EM imaging | |
| Software | |||
| Gautomatch software | http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ | to pick particles from micrographs | |
| Relion 2.1 software | https://github.com/3dem/relion | to construct 2D and 3D classification | |
| CryoSPARC software | https://cryosparc.com/ | to generate an initial structure model | |
| Frealign software | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | to refine particles | |
| Coot software | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | to build a model | |
| MolProbity software | http://molprobity.biochem.duke.edu/ | to evaluate the geometries of the atomic model | |
| SerialEM software | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | for automated serial image stack acquisition | |
| MortionCor2 software | http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html | for motion correction of summed movie stacks | |
| GCTF software | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | for measuring defocus values in movie stacks | |
| Phenix.real_space_refine software | https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html | for real space refinement of the initial 3D model |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
- Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353 (2012).
- Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
- Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
- Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
- Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
- Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
- Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
- Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
- Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
- Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
- Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
- Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
- Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
- Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
- Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
- Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
- Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
- Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
- Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
- Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
- Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
- Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
- Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
- Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
- Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
- Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
- Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).
