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Biochemistry

Expressão e purificação de TRPC3 os humanos sensíveis lipídico cação canal para determinação estrutural por microscopia de Single-particle Cryo-elétron

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58754
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 1, 1
1Van Andel Institute, 2Vollum Institute, 3Janelia Research Campus
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo descreve técnicas utilizadas para determinar as estruturas do canal de íon pela microscopia cryo-elétron, incluindo um sistema de baculovirus usado eficientemente expressar genes em células de mamíferos, com esforço mínimo e toxicidade, extração de proteínas, purificação, e verificação de qualidade, preparação da amostra grade e triagem, bem como coleta de dados e processamento.

Abstract

Transiente do receptor potencial canais (TRPCs) da subfamília TRP canônica são canais de cátion não seletivo que desempenham um papel essencial na homeostase do cálcio, entrada de cálcio particularmente operada a loja, que é fundamental para manter a função adequada de lançamento da vesícula sináptica e vias de sinalização intracelulares. Por conseguinte, canais TRPC têm sido implicados em uma variedade de doenças humanas, incluindo distúrbios cardiovasculares, tais como hipertrofia cardíaca, doenças neurodegenerativas como a doença de Parkinson e distúrbios neurológicos como ataxia espinocerebelar. Portanto, canais TRPC representam um potencial alvo farmacológico em doenças humanas. No entanto, os mecanismos moleculares de gating nesses canais são ainda pouco claras. A dificuldade na obtenção de grandes quantidades de proteína purificada, homogênea e estável tem sido um fator limitante em estudos de determinação de estrutura, particularmente para proteínas de membrana de mamíferos como os canais de íon TRPC. Aqui, apresentamos um protocolo para a expressão em larga escala de proteínas de membrana de canal íon mamíferos usando um sistema de transferência do gene de baculovirus modificados e a purificação destas proteínas por afinidade e cromatografia de exclusão de tamanho. Apresentamos mais um protocolo para coletar imagens de microscopia cryo-elétron da único-partícula de proteína purificada e usar estas imagens para determinar a estrutura da proteína. Determinação da estrutura é um método poderoso para compreender os mecanismos de retenção e função em canais iônicos.

Introduction

Cálcio está envolvido em processos mais celulares, incluindo a sinalização, cascatas, controle de transcrição, liberação de neurotransmissor e hormônio molécula síntese1,2,3. A manutenção homeostática do cálcio citosólico livre é crucial para a saúde e a função das células. Um dos principais mecanismos de homeostase de cálcio intracelular é operada a loja cálcio entrada (SOCE), um processo no qual depleção de cálcio armazenado em disparadores o retículo endoplasmático (ER) a abertura de canais iônicos na membrana plasmática, para facilitar a reposição de cálcio ER, que pode ser usado na sinalização mais4,5,6. Canais potencial receptor transitória (TRPCs), que são canais de cálcio-permeável pertencentes à Superfamília TRP, identificaram-se como um participante importante em SOCE7,8,9 .

Entre os sete membros da família TRPC, TRPC3, TRPC6 e TRPC7 formam um subgrupo homólogo, e eles são únicos na habilidade de ser ativado pelo Mensageiro secundário lipídico diacilglicerol (DAG), um produto de degradação de lipídios a sinalização fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2)10,11. TRPC3 é altamente expresso no músculo liso e nas regiões do cérebro, onde ele tem um papel essencial na sinalização de cálcio que afetam a neurotransmissão e neurogênese12,13cerebrais e cerebelares. Disfunção de TRPC3 tem sido associada a distúrbios do sistema nervoso central, distúrbios cardiovasculares e certos tipos de câncer como adenocarcinoma ovariano14,15,16. Portanto, TRPC3 é uma promessa como um destino de farmacêutico para o tratamento destas doenças. Desenvolvimento de fármacos direcionados especificamente atuando na TRPC3 tem sido limitado pela falta de compreensão de seus mecanismos de ativação molecular, incluindo lipídios vinculação sites17,18. Informamos a primeira estrutura atômica-resolução do canal de TRPC3 humano (hTRPC3) e os seus sítios de ligação de lipídios dois em um estado fechado, proporcionando insights importantes sobre esses mecanismos de19.

O fator chave para determinar a estrutura de uma proteína de membrana em alta resolução é obter proteína de alta qualidade. O rastreio correspondente de expressão e purificação de condições necessárias para obter a proteína de alta qualidade pode ser uma tarefa demorada e dispendiosa. Aqui nós apresentamos um protocolo descrevendo em detalhe como identificamos as condições ideais para a expressão e purificação de hTRPC3, que se comportou mal na nossa seleção inicial. Apresentamos vários pontos-chave sobre como solucionar problemas e otimizar o comportamento da proteína, que colocam uma base sólida para nossa cryo-elétron estudos de microscopia (cryo-EM). Nós usamos um baculoviral modificado gerando vetor (pEG), desenvolvido pela Gouaux e colegas, que é otimizado para a seleção de ensaios e eficiente geração de baculovirus em células de mamíferos,20. Este método de expressão é apropriado para rápida e econômica a superexpressão de proteínas na membrana celular dos mamíferos. Podemos combinar o uso deste vetor com uma tamanho de fluorescência-deteção-exclusão baseada em cromatografia (FSEC) prescreening método21. Esse método usa uma tag de proteína verde fluorescente (GFP) fundida-se para a construção de interesse e melhora a visualização da proteína alvo em amostras pequenas, células inteiras de solubilizado. Isto permite a análise de estabilidade de proteína na presença de diferentes detergentes e aditivos, com mutações thermostabilizing e permite o uso de um pequeno número de células de transfecção transiente em pequena escala. Desta forma, uma infinidade de condições pode ser rastreada rapidamente antes de se mudar para uma purificação de proteínas em larga escala. Após a triagem, expressão e purificação, apresentamos um protocolo para obtenção e processamento de imagens de cryo-EM gerar uma determinação estrutural de novo da proteína. Acreditamos que as abordagens descritas aqui vão servir como um protocolo generalizável para estudos estruturais de receptores de canal TRP e outras proteínas de membrana.

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Protocol

1. transformação de células competentes de DH10α para produzir Bacmid DNA

  1. Sintetizar o gene de interesse e subclone-lo em uma versão modificada do vetor pEG contendo uma gêmeo estreptococos-marca, uma marca His8 e GFP com um local de clivagem de trombina nas N terminal (pFastBacI)20.
  2. Transformar células competentes adicionando 5 ng do plasmídeo contendo o gene desejado em pFastBacI de 50 μL de DH10α células em um 1,5 mL tubo e incubam durante 10 min no gelo. Choque de calor das células para 45 s a 42 ° C. Adicionar 200 µ l de caldo super ideal com meio repressor catabólicos (SOC) ao tubo e incubar durante 4-8 h a 37 ° C em um agitador orbital a 225 rpm.
  3. Placa de 5 μL de células numa placa de ágar bacmid LB (50 canamicina μg/mL, 7 gentamicina μg/mL, ágar de tetraciclina, 100 μg/mL Bluo-gal e 40 μg/mL isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside [IPTG], de 10 μg/mL).
  4. Incubar a placa por 48 h a 37 ° C.
    Nota: As colônias de manchas de indicador de Bluo-gal que ainda estão expressando lacZ (vetor inserção malsucedida), permitindo a seleção das colônias (transformadas com êxito) brancas.
  5. Selecione cuidadosamente uma colônia branca isolada, evitando qualquer colônias brancas que estão em contacto com as colónias azuis e desenvolvem-se células durante a noite em 6 mL de meio de bacmid LB (50 canamicina μg/mL, 7 gentamicina μg/mL, tetraciclina 10 μg/mL) a 37 ° C em um agitador orbital a 225 rpm.

2. bacteriana preparação para isolamento de Bacmid DNA

  1. Para isolar o DNA bacmid, spin para baixo de células de Escherichia coli por 10 min a 2880 x g.
  2. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 µ l de solução de ressuspensão celular a partir do miniprep kit (ver Tabela de materiais) por pipetagem. Certifique-se de que a pelota é homogênea e totalmente suspenso. Em seguida, transferi a suspensão de eritrócitos para tubos de 1,5 mL.
  3. Adicione 200 µ l da solução de lise celular de miniprep kit e misture por inversão do tubo algumas vezes. Incube durante até 5 min. à temperatura ambiente (RT) para lisar as células. Adicione 200 µ l de solução de neutralização do kit de miniprep e mistura por inversão do tubo algumas vezes para parar a reação de Lise.
  4. Spin para baixo por 10 min a 21.130 x g em uma centrífuga de mesa. Colete 600 μL do sobrenadante em um tubo de 2 mL. Adicionar a solução-600 μL de fenol: clorofórmio: isoamílico álcool (ver Tabela de materiais) e misture bem para extrair o DNA do restante dos produtos da lise celular.
    Atenção: A solução de fenol: clorofórmio: isoamílico álcool é tóxica por inalação, em contacto com a pele e se ingerido. Ele pode causar queimaduras químicas e pode ser cancerígeno. Use luvas e avental abotoado. Trabalho em uma coifa. Descarte de resíduos perigosos devidamente.
  5. Gire o tubo para 10 min a 21130 x g em uma centrífuga de mesa. Duas fases líquidas separadas será visíveis. Transferi com cuidado, 300 µ l da fase aquosa superior para um novo tubo. Adicione 600 μL de etanol 100% para lavar o DNA. Inverta suavemente o tubo para misturar.
    Nota: Fazer não vórtice, como isto pode distorcer o DNA bacmid.
  6. Tubos de legais, colocando-os no congelador-20 ° C durante 10 min. Spin para baixo por 10 min a 21.130 x g em uma centrífuga de mesa. Desprezar o sobrenadante e preservar a pelota do ADN.
  7. Adicione 1 mL de etanol a 70% para lavar o sedimento. Inverta suavemente o tubo para misturar. Girar para 10 min a 21.130 x g em uma centrífuga de mesa. Desprezar o sobrenadante e permitir que a pelota para o ar seco por aproximadamente 5 minutos ou até que o líquido não é visível no tubo e o pellet de DNA torna-se translúcido.
  8. Resuspenda o pellet seco em 50 µ l de estéril, livre de DNase, água desionizada. Medir a concentração de DNA.
    Nota: Não congele bacmid DNA. Armazenar a 4 ° C por até vários dias.

3. transfecção de células de inseto Sf9 com Bacmid para produzir Baculovirus P1

  1. Semente 0,9 x 106 células/poço de Sf9 em 2 mL de meio apropriado (consulte a Tabela de materiais) em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 6-poços. Incube as células a 27 ° C por 20 min promover a ligação com a placa.
    Cuidado: As culturas celulares são um risco biológico potencial. Trabalhar em um capô aprovado fluxo laminar com técnicas assépticas e verifique as orientações institucionais e governamentais para roupas de proteção recomendada e destinação adequada de resíduos antes de realizar experimentos.
  2. Após a fixação, adicionar 8 µ l de reagente de transfeccao (ver Tabela de materiais) para 100 µ l de mídia para cada poço dos 6 placa bem sendo transfectadas em um tubo estéril. Adicione 100 µ l de meio em um tubo estéril separado 6 μg de bacmid DNA. Incubar a 5 min à RT. Combine as duas soluções e incubar durante 45 min à RT
  3. Substitua o medium em 6 poços com 2 mL de meio fresco. Adicione a mistura da etapa anterior para cada um bem gota a gota (200 µ l por alvéolo). Agitar suavemente a placa para garantir a mistura da solução do transfection no meio de.
    Nota: Não agite ou agitar a placa porque isso fará com que as células desanexar.
  4. Incube as células para a 5D (120 h) numa incubadora umidificado de 27 ° C. Verifique a fluorescência de GFP antes da colheita para verificar que o vírus está sendo produzido em uma grande porcentagem de células; se a porcentagem é baixa, estender o tempo de incubação, se necessário (ver Figura 1).
  5. Recolha o sobrenadante contendo vírus de P1 (cerca de 2 mL de cada poço). Filtre o meio contendo vírus P1 para tubos de 2 mL, usando uma seringa de 3 mL e pequeno filtro de 0,2 µm. Adicione estéreis de soro fetal bovino (FBS) a uma concentração final de 1%.
    Nota: Este estoque de vírus P1 deve ser armazenada a 4 ° C e ser protegido da luz.

4. infecção das células de inseto Sf9 com Baculovirus P1 para produzir Baculovirus P2

  1. Preparar 200 mL (ou volume desejado) de células Sf9 em uma concentração de 0,8 - 0,9 x 106 células/mL em meio adequado (ver Tabela de materiais) em um Erlenmeyer de cultura inferior plana de tamanho suficiente.
    Nota: Para a cultura de suspensão, a quantidade utilizada não deve ultrapassar 40% da capacidade total do frasco.
  2. Adicione 1:2500 ratio (v/v) de estoque de vírus P1 do 3.5 para a cultura de suspensão celular Sf9. Incube durante o tempo de expressão ideal vírus (geralmente 48-120 h dependendo a construção de proteínas) a 27 ° C em um agitador orbital a 115 rpm.
    Nota: A expressão vírus relativo pode ser determinada através da visualização da fluorescência de GFP do vírus em uma amostra da cultura.
  3. Centrifugar a suspensão de eritrócitos por 40 min a 11.520 x g e recolher o sobrenadante contendo vírus de P2. Filtre o sobrenadante usando filtros descartáveis de 0,2 µm. Adicione FBS para uma concentração final de 0,5%.
    Nota: Este estoque de vírus P2 deve ser armazenado a 4 ° C e ser protegido da luz.
  4. Obter um título para o P2 vírus usando células Sf9easy ou um contador de vírus.

5. infecção das células de mamíferos HEK293 com Baculovirus P2 na expressão de proteínas em larga escala

  1. Preparar um volume desejável de HEK293 suspensão cultura de pilha mamífera (4-6 L é recomendado para preparação de grades congelados) com uma concentração de 3,5-3,8 x 106 células/mL em meio de expressão (veja a Tabela de materiais) suplementado com 1% (v / v) FBS estéril em perplexo-fundo cultura Erlenmeyers de tamanho suficiente.
    Nota: Para a cultura de suspensão, o volume utilizado não deve exceder 40% do volume total do frasco.
  2. Adicione 8% (v/v) de solução-mãe de vírus P2 da etapa 4.3 para a cultura de suspensão de células HEK293. Incube a 37 ° C em um agitador orbital a 135 rpm.
  3. Adicione o butirato de sódio de 10 mM a pós-infecção 12-18 h. Incubar durante o tempo da expressão da proteína ideal (geralmente 36-72 h) a 30 ° C.
  4. Recolher as células por centrifugação por 20 min a 2.880 x g. Lave as células por resuspending em aproximadamente 100 mL salino tris (TBS) por litro de células colhidas. Centrifugue novamente por 20 min a 2.880 x g e coletar o centrifugado.
    Nota: O protocolo pode ser uma pausa aqui. Pelotas de célula podem ser snap-congelado em nitrogênio líquido e armazenadas a-80 ° C até a purificação.
    Cuidado: Nitrogênio líquido pode causar queimaduras criogênicas ou lesão. Pode causar queimaduras. Pode deslocar o oxigênio e causar sufocamento rápido. Use luvas isolantes frias e protetor facial.
  5. Colheitas de pequenas 1 mL em diferentes pontos do tempo de recolher e solubilizar durante 2 h a 4 ° C, com o balanço ou mexendo na presença de detergentes diferentes e/ou aditivos. Estas pequenas amostras solubilized de células inteiras podem ser esclarecidas por ultracentrifugação a 235.000 × g por 10 min a 4 ° C e executar como uma amostra de 30 μL em uma coluna de cromatografia de exclusão-tamanho (SEC) (consulte a Tabela de materiais) para determinar o melhor momento para expressão e as melhores condições de solubilização.
    Nota: No caso de hTRPC3, esta seleção incluía buffers diferentes com valores de pH de 4.0-9,5 e concentrações de sal de 50-500 mM; diferentes composições iónicas (como MgCl2 ou NaCl); detergentes diferentes com valores de concentração (CMC) micelle crítico de 0.1 - 20 mM; redução de aditivos tais como ditiotreitol, tris(2-carboxyethyl) fosfina e β-Mercaptoetanol; e os quelantes de cálcio ácido aditivo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).

6. purificação da proteína de hTRPC3 do centrifugado congelado

  1. Descongelar a pelota em tampão contendo 20 mM Tris (pH 8.0), 500 mM de NaCl, fluoreto de phenylmethylsulfonyl de 1 mM (PMSF) 0,8 μM aprotinina, 2 μg/mL leupeptin, pepstatin 2mm A, e 1% de digitonin, usando 100 mL de tampão por litro de células colhidas. Uma vez descongelado, assegure a homogeneidade da solução por pipetagem ou mexendo. Permita para solubilizar durante 2 h a 4 ° C em um béquer imergido no gelo com uma celeuma barra rotativa.
  2. Remover os resíduos de célula por ultracentrifugação a 235.000 × g durante 1 h a 4 ° C. Verifique a quantidade de proteína executando uma amostra de 30 μL em uma coluna da SEC (ver Tabela de materiais) por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e visualizar a proteína alvo pela saída de sinal de GFP.
  3. Incubar a proteína solubilized (sobrenadante) com resina de afinidade de cobalto para 1-2 h a 4 ° C. Verifique se o emperramento da proteína à resina executando uma amostra de 30 μL em uma coluna do SEC.
    Nota: Se tiver ocorrido a ligação às proteínas, o alvo de etiquetado proteína GFP será retido na coluna, não consta a passagem. Portanto, nenhum sinal GFP estará presente na posição correspondente ao tamanho da proteína alvo quando o escoamento é executado em HPLC.
  4. Lave a resina com 10 volumes de coluna do buffer (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM de NaCl, imidazol 15 mM e 0,1% digitonin). Verificar a perda de proteína executando uma amostra de 30 μL em uma coluna do SEC.
    Nota: Se tiver ocorrido a perda de proteína da coluna, o alvo de etiquetado proteína GFP se encontrarão no tampão de lavagem que tem passado sobre a coluna. Portanto, sinal GFP estará presente na posição correspondente ao tamanho da proteína alvo quando o tampão de lavagem é executado em HPLC. Se ocorreu a perda de proteína, a concentração de imidazole do tampão de lavagem pode precisar ser reduzido para evitar perturbar sua vinculação de marca para a coluna de afinidade.
  5. Eluir o limite a resina hTRPC3 com buffer (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM de NaCl, imidazol 250 mM e 0,1% digitonin). Adicionar a trombina em um 01:20 razão molar (para cravar a marca GFP) e adicionar 10 mM EDTA (um agente estabilizador de hTRPC3) para a amostra eluted e incubar durante 3 h a 4 ° C. Verifica que a proteína tem sido eluída executando 90 μL de uma amostra diluída 1: 100 em uma coluna de SEC e verificação da presença de um sinal GFP na posição correspondente ao tamanho da proteína alvo.
    Nota: neste ponto, o sinal de triptofano da proteína total na eluição pode também ser visto. Somente a proteína alvo de afinidade-purified permanecerão na eluição e o GFP e triptofano sinais serão perto de idêntico no perfil. Se a proteína do alvo não é vista em grande quantidade na eluição, mas não foi perdida no escoamento ou lavagem, a proteína provavelmente manteve-se ligado à coluna e pode ser eluída usando uma concentração mais elevada de imidazol no buffer.
  6. Concentrar-se o eluato de 500 µ l ou menos em um filtro de centrífuga de 15 mL 100K tubo (ver Tabela de materiais) por fiação a 2.880 x g a 4 ° C, em incrementos de 5 min. Resuspenda as proteínas pipetando a solução acima e para baixo entre spins para evitar overconcentrating.
    Nota: Tempo de centrifugação pode ser encurtado, como o volume aproxima-se o volume final desejado.
  7. Carrega o concentrado em uma coluna da SEC em buffer (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM de NaCl, 1 mM EDTA e 0,1% digitonin). Execute.
  8. Combinar as frações de pico contendo o tetrâmero TRPC3 intacto, como visualizado pelo sinal de absorbância UV e concentrar-se novamente para uma concentração final de pelo menos 5 mg/mL.

7. a despistagem da proteína por microscopia de elétron negativo-mancha

  1. Liga a máquina brilho da descarga. Defina o programa para descarregar uma grade de carbono revestido usando argônio e oxigênio por 30 s. executar o programa para fazer o revestimento de carbono nas grades de 400-malha cobre hidrofílico antes da adição da solução da proteína.
  2. Configurar μL de cinco 40 gotas de água estéril e gotas duas 40 μL de solução de formiato de uranilo 1% (no filme de laboratório, papel de cera ou uma superfície similar, consulte Tabela de materiais). Tirar a grade da etapa 7.1 e adicionar 2,5 μL de proteína da amostra 5 mg/mL (50-200 μM) sobre o lado escuro e deixe descansar por 1 min.
  3. Depois de 1 min, seque a grade usando papel de filtro. Não toque o filtro de papel diretamente para a superfície da grade; em vez disso, levar o papel para a borda da gota líquida e permitem a ação capilar puxar o líquido da grade para o papel de filtro.
  4. Mergulhe a grade na primeira gota de água. Seque com papel de filtro e repita com as restante de gotas de água e a primeira gota de formiato de uranilo. Permitir que a segunda gota de uranilo formiato sentar-se por 1 min e depois seque com papel de filtro. Permitir que a grade de ar seco (cerca de 1 min) antes de guardar.
    Nota: Este protocolo de coloração pode não ser ideal para todas as combinações de proteína-detergente. Diferentes concentrações de formiato de uranilo mancham e diferentes comprimentos de tempo para exposição de mancha devem ser testados se os passos acima não fornecem uma mancha com bom contraste.
  5. As grades em um microscópio eletrônico de imagem (consulte a Tabela de materiais) para verificar a qualidade de partícula de proteína. Certifique-se de que o micrografias mostram inúmeras partículas que são homogêneas na distribuição e no aspecto geral, exibir bom contraste e igualar o tamanho previsto da proteína alvo.
  6. Gerar preliminar, baixa resolução, bidimensionais (2D) classificações usando micrografias de 50-100 (veja processamento de dados – etapa 10) para verificar que as partículas representam diferentes pontos de vista de uma única estrutura consistente.
    Nota: Micrografias e classes 2D preliminares de qualidade suficiente, como descrito acima, são um forte indicador de que o protocolo foi suficientemente otimizado para purificação de proteínas. Preparação e triagem de grades EM crio-se justifica neste momento.

8. preparação da amostra EM

  1. Brilho da descarga-uma grade de ouro holey carbono (ver Tabela de materiais), conforme descrito no passo 7.1.
  2. Aplica 2,5 μL da amostra proteína concentrada hTRPC3 (5 mg/mL) para o grid. Borre a grade para 1.5 s usando uma mancha forçar de 1 e um tempo de espera de 5 s a 100% de umidade e 4 ° C, em seguida mergulhe a grade etano líquido refrigerado por nitrogênio líquido, usando uma máquina de vitrificação.
    Nota: A umidade, temperatura, força-borrão, borrão tempo e tempo de espera listados aqui foram usados para hTRPC3 de estudo19 dos autores. Eles talvez precise ser alterado para produzir gelo vítreo ideal para detergentes e outras proteínas.
  3. Tela congelada grades para condições de gelo ideal usando um microscópio de cryo-EM (ver Tabela de materiais) e manualmente vista fina de regiões de gelo grosso (quadrados de grade que aparecem menores e mais escuras), gelo (quadrados de grade que aparecem maiores e mais brilhantes) e meio de gelo .
    Nota: Gelo mais grosso, muitas vezes tem mais partículas, enquanto o gelo mais fino muitas vezes produz a resolução e melhor contraste. Triagem manual de uso de imagens para determinar qual gelo condições resulta em um grande número de partículas monodispersas com bom contraste e resolução. Uma vez que boas condições são verificadas, mova a coleção de imagem em um microscópio de cryo-EM 300 kV.

9. coleta de dados EM

  1. Usando um programa de aquisição automatizada, gravar pilhas de imagem no modo de contagem de super-resolução com um tamanho de pixel binned de 1.074 Å em um microscópio eletrônico operado em 300 kV com uma ampliação nominal de 130.000 X direto detector de elétrons.
  2. Dose-fractionate cada imagem a 40 quadros com um tempo total de exposição de 8 s, com 0.2 s por frame e uma taxa de dose de 6,76 e− Å s− 2 − 1 (valores nominais desfocagem variadas de 1,0 a 2,5 μm na experiência dos autores).

10. EM informática

  1. Implementar o movimento de correção de resumiu filme pilhas22 e estimar valores de desfocagem23 usando o software de processamento de dados (ver Tabela de materiais)24.
  2. Partículas das micrografias de escolher. Estas partículas de escolheu use para construir uma classificação inicial livre de referência 2D usando o software24. Médias de selecionar classe 2D ideal para usar como modelos para a colheita de partículas automatizado para todo o conjunto de dados.
  3. Verificar a qualidade das partículas autoescolheu e remover partículas maus manualmente. Use várias rodadas de classificação 2D para limpar partículas escolhidas.
  4. Gere um modelo inicial de25. Objecto 2D escolheu partículas tridimensionais (3D) classificação (cerca de 5 classes) usando simetria C1 e um filtro passa-baixas de reconstrução inicial de 60 Å como um modelo de referência. Determine quais classes têm características de alta resolução e combinam as partículas dentro de uma classe.
  5. Refinar as partículas usando o refinamento local com simetria do C4 (no caso hTRPC3) aplicada e um limite de alta resolução para alinhamento de partícula definido para 4.5 Å26.

11. modelo de edifício

  1. Construir um modelo (consulte a Tabela de materiais para o software utilizado). Para hTRPC3, use o domínio transmembrana (DTM) do transiente do receptor potencial melastatin 4 (TRPM4) 5wp6 de banco de dados (PDB) de proteína de estrutura como um guia de27. Utilização de resíduos volumosos e predição da estrutura secundária para guiar de novo edifício.
  2. O modelo inicial para refinamento do espaço real com estrutura secundária restrições28de assunto. Examine o modelo refinado e remodify conforme necessário (ver Tabela de materiais para o software utilizado) manualmente.
  3. Aplicam-se curvas de correlação (FSC) de casca de Fourier para calcular a diferença entre o modelo final e o mapa EM para validação da estrutura refinada. Avaliar as geometrias dos modelos atômicos (consulte Tabela de materiais para o software utilizado)29,30.

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Representative Results

Uma visão esquemática do protocolo para a expressão e purificação de hTRPC3 são mostrados na figura 1A. Uma imagem da placa de bacmid de hTRPC3 com colônias brancas ideais, semelhantes àquele selecionado para a purificação de DNA de bacmid, é mostrada na figura 1B. Descobrimos que 48 h é ideal para coloração de Bluo-gal clara, mantendo a presença de colônias isoladas. Picos de produção de vírus de P2 para hTRPC3, como visualizado por fluorescência de GFP, viu-se após a 4D da infecção em células de inseto Sf9 (Figura 1).

P2 baulovirus colhido da mídia, suplementada com 1% FBS e usado para infectar uma suspensão de células de mamíferos HEK293. Butirato de sódio foi adicionado para o infectado as células 12-18 h após o vírus para aumentar a proteína expressão20. As células foram então incubadas durante um adicional h 36 a 30 ° C. As células foram colhidas e submetidas a solubilidade e estabilidade triagem FSEC (Figura 2A)21. As células foram solubilizadas usando sete diferentes detergentes com valores CMC de 0,01 - 20 mM em uma concentração de detergente aproximadamente 10 vezes o valor CMC. Após solubilização de células inteiras, os detritos de lise celular foi removido por ultracentrifugação e o sobrenadante contendo proteína solubilizada foi carregado em uma coluna de SEC e executado em HPLC em n-dodecil-β-D-maltopyranoside/colesterol hemisuccinate (DDM/CHS) buffer contendo detergente para comparar a solubilidade de absoluta e posição de volume de pico de hTRPC3 em condições diferentes em relação a um controle de TRPM4 (Figura 2B). Nós escolhemos usar DDM/CHS como o buffer de execução inicial para as amostras solubilizadas em detergentes diferentes porque DDM/CHS é o mais comumente utilizado detergente quando resolvendo as estruturas das proteínas de membrana. Todas as diferentes detergente-solubilizado TRPC3 amostras apresentaram pico posições em cerca de 11,9 mL, o que provavelmente é muito grande, porque a forma tetramérica de hTRPC3 tem um peso molecular menor do que o positivo controlam humano TRPM4 (Figura 2A e Figura 2B).

No entanto, porque não havia nenhuma estrutura de qualquer receptor de canal TRPC comparar nossos resultados e porque o grande peso molecular pode ser causado pela arquitetura de TRPC3 ou outros fatores, realizamos uma purificação em pequena escala de hTRPC3, usando 25 mL de células usando DDM/CHS durante todo o experimento como DDM/CHS deram a melhor solubilidade do hTRPC3. O perfil do SEC de hTRPC3 mostrou um pico monodisperso mas ainda estava em uma posição de pico, representando um peso molecular maior do que TRPM4 (dados não mostrados). Verificamos a proteína na fração de pico de perfil SEC por EM negativo-mancha, porque é um método rápido de verificação da qualidade da proteína e requer uma quantidade muito pequena de proteína. Na Micrografia, partículas foram observadas com dois domínios transmembranares presentes na mesma partícula. Verificou-se que duas partículas de hTRPC3 dimerized de forma frente a frente, através da interação entre dois domínios citosólico (Figura 3D). Em seguida incluímos o redutor reagente ditiotreitol (DTT) no buffer de purificação para a segunda purificação em pequena escala, na esperança de interromper a dimerização do hTRPC3. Na verdade, um segundo pico com peso molecular inferior apareceu pelo fracionamento do SEC. No entanto, as partículas apareceram muito pequenas para ser um tetrâmero intacto e mostraram sem características de proteínas da membrana como um domínio transmembrana. Acontece que o DDM/CHS não era um detergente adequado para a hTRPC3, apesar de dar a melhor solubilidade para hTRPC3 de purificação.

Em seguida, tentou um digitonin detergente, mais suave, para solubilizar o hTRPC3 e comparou-o com a proteína solubilizada na DDM/CHS. Aqui usamos dois buffers de execução diferentes contendo DDM/CHS e digitonin, respectivamente. Isto era importante, dado que o detergente no buffer de execução muitas vezes contribui para a estabilidade da proteína, e que a proteína de membrana pode tornar-se instável quando se muda os detergentes de solubilização de FSEC. A proteína executar em tampão contendo digitonin mostrou uma mudança de pico promissor para um menor peso molecular quando solubilizado em DDM/CHS ou digitonin. A proteína solubilizado por e correr em digitonin rendeu o pico mais alto em uma posição razoável em relação à posição do controle positivo, TRPM4 humana (Figura 3A). Então nos mudamos para a frente, realizando uma purificação em pequena escala, usando 25 mL de células. Embora vários e grandes picos foram observados pela SEC (Figura 3B), a proteína mostrou características de um canal único hTRPC3 tetramérica em 2D classificação por EM negativo-mancha (Figura 3 e Figura 3D). Conclui-se que digitonin é um detergente ideal para hTRPC3 de purificação.

Nós ampliados a expressão de hTRPC3 e executada uma purificação de média dimensão com 400 mL de células em digitonin. Fazendo assim, esperávamos obter proteína suficiente para umas redes congeladas sem desperdício médio e detergente antes de descobrimos as condições finais para a hTRPC3 em grande escala de purificação. Acontece frequentemente que as proteínas de membrana mostram instabilidade quando altamente concentrado para a preparação de grades congelados. A proteína purificada e concentrada não só deslocada na direção de maior peso molecular por FSEC, mas também mostrou barulhento fundo nas grades de cryo-EM cuja imagens usando um microscópio eletrônico, equipado com uma câmera EMCCD. Mesmo que fomos capazes de observar único, receptores tetraméricas intactos, hTRPC3 purificada em digitonin não era ideal para estudos de cryo-EM alta resolução.

Para melhorar ainda mais a estabilidade da proteína, nós selecionados um grande número de condições descritas no protocolo passo 5. Optou-se por aditivos de tela baseados no personagem fisiológica de hTRPC3; ex., EDTA foi selecionado porque hTRPC3 é permeável ao cálcio e remover o cálcio pode estabilizar a proteína. De todas as amostras testadas por FSEC executando no buffer contendo digitonin, EDTA 10 mM mostrou um efeito notável sobre estabilização hTRPC3 em uma posição de pico tetramérica intacto (Figura 4A). Também significativamente aumentou o número de partículas em Micrografia cryo-EM e diminuiu o ruído de fundo, como mostrado na Figura 5.

Tendo identificado as condições ideais para a expressão e purificação, realizamos uma expressão em grande escala (2 L) de hTRPC3. As células que contêm hTRPC3 foram colhidas e então solubilizadas. Esclareceu-se lisado foi submetido a purificação da coluna de afinidade de metal por lote-ligação com uma resina de cobalto, seguida de depuração em uma coluna de gravidade. Retenção de proteína solubilizada dentro da coluna e eluição das proteínas afinidade-purified da coluna foi verificados por FPLC (Figura 4B). Descobrimos que, para hTRPC3, uma concentração de imidazole de 15 mM no tampão de lavagem foi suficiente para remover contaminantes proteínas com ligação inespecífica de resina, e imidazol 250 mM no buffer de eluição foi suficiente para eluir a maioria dos hTRPC3 solubilizado proteína ligada à resina. Todas as amostras foram verificadas por FSEC, e a proteína eluted mostrou um pico monodisperso afiada, na posição correta de pico. Purificados como intrínseco flexibilidade entre a tag GFP e a proteína de hTRPC3 pode fazer o alinhamento de partículas de proteína durante mais desafiador de processamento de imagem, e porque um local de clivagem de trombina está localizado entre as boas práticas agrícolas e hTRPC3, nós testamos uma pequena quantidade de proteína em diferente clivagem vezes usando protease trombina. Dado que a proteína eluted incubada com trombina a um 01:20 razão molar mostrou razoável estabilidade e clivagem completa após 2 h a 4 ° C, nós clivada fora o GFP de toda a proteína purificada usando as mesmas condições e verificado por HPLC para confirmar que a GFP tem sido c inteiramente removido (Figura 4). A proteína foi adicional por S, e a clivagem da GFP novamente pode ser visualizada com a mudança de posição de pico para um menor peso molecular (Figura 4). Uma pequena amostra não concentrada da fracção pico principal foi usada para fazer grades para EM negativo-mancha. Todas as frações contendo o hTRPC3 tetramérica foram então combinadas e reconcentrated a uma concentração final de 5 mg/mL, que foi usado para preparar grades para a imagem latente de cryo-EM. Como temos observado essa parte da proteína ainda gradualmente deslocada na direção de maior peso molecular, recolhidos apenas as frações com o peso molecular correta e congelou as grelhas imediatamente após a purificação de proteínas. Geralmente concluímos a sequência de experiências a partir da purificação da proteína para preparação de grades congelados dentro de um único dia.

Uma amostra de 2,5 μL da proteína purificada hTRPC3 (concentração de 5 mg/mL) foi aplicado para um grid de carbono holey brilho-alta. Uma máquina de vitrificação foi usada para preparar a grade, usando um 1.5 s mancha tempo abaixo dos 100% umidade seguida de um mergulho em etano líquido refrigerado por nitrogênio líquido. Esta etapa congela a amostra em gelo vítreo para a imagem latente. Imagens foram capturadas em 130.000 X ampliação nominal por um microscópio de elétron de cryo operado em 300 kV. Pilhas de imagem foram gravadas em Super-resolução contando modo com um tamanho de pixel binned de 1.074 Å e um valor nominal de desfocagem variando de 1,0 a 2,5 μm com um detector de elétrons direto e automatizada de software de aquisição. Cada imagem foi dose fracionada de 40 quadros com um tempo total de exposição de 8 s (0.2 s por quadro) e uma taxa de dose de 6,76 e− Å−2 s−1. Uma representante Micrografia deste conjunto de dados é mostrada na Figura 5.

Realizou-se a correção do movimento e a estimativa dos valores de desfocagem de pilhas de filme somados. Aproximadamente 200 micrografias resultantes foram usadas como a fonte para colheita manual partícula e inicial de classificação livre de referência 2D31. Nove médias representativas classe 2D desta classificação inicial foram selecionadas e utilizadas como modelos para a colheita de partículas automatizado para todo o conjunto de dados. Foi realizada uma verificação manual de partículas autopicked para remover partículas podres e, em seguida, três rodadas de classificação 2D foram aplicadas para refinar a seleção de partículas autopicked (Figura 5). Estas partículas selecionadas de 2D-classe foram classificadas em cinco classes 3D usando um filtro de baixa-passagem de 60 Å como um modelo de referência inicial. Dessas cinco classes, único exibido características de alta resolução (Figura 5). Partículas a partir dessa classe mais foram submetidas a refinamento local com um limite de alta resolução de 4.5 Å e C4 simetria aplicada (Figura 5)32. O modelo refinado manualmente foi examinado e remodificado. A estrutura requintada foi validada pelo cálculo das curvas do FSC para determinar a diferença entre o modelo final e EM mapa e pela avaliação das geometrias do modelos atômico33.

Construção do modelo inicial foi realizada usando o domínio de DTM da estrutura TRPM4 (PDB 5wp6) como um guia34. De novo edifício do modelo de hTRPC3 principalmente foi guiado por resíduos volumosos e predição da estrutura secundária, com as hélices α muitos na estrutura extremamente facilitando a atribuição de registo. No inicial de novo-construído o modelo, a ordem, comprimento e posição de características estruturais secundárias e resíduos volumosos estão perto de acordo com a previsão. Durante o refinamento, realizou-se a resolução de um limite mais baixo do que a resolução estimado para a reconstrução final. FSC tridimensional foi usado para medir o coeficiente de correlação cruzada normalizado entre dois mapas 3D gerados independentemente (cada usando metade do conjunto de dados) sobre conchas correspondentes no espaço de Fourier (em função da frequência espacial). Foi utilizada uma máscara macia de 4.3 Å de reconstrução e um adicional 4.3 Å macio cosseno de borda juntamente com um filtro passa-baixo de 10 Å, então utilizado o padrão-ouro FSC 0.143 limite de corte. Isto foi usado para relatórios de resolução final.

Figure 1
Figura 1: expressão e purificação de hTRPC3 usando o sistema de BacMam. (A) procedimento esquemático para hTRPC3 expressão e purificação. (B) seleção de colônia Bacmid na placa indicadora azul e branco. Escolha uma colônia branca isolada (seta preta), não uma colônia branca com uma colônia azul encaixada ou uma colônia branca em contacto com uma colônia azul (setas vermelhas). (C) GFP fluorescência de baculovirus P2 em Sf9 células abaixo dos 20 ampliação de X. Fluorescência deve ser brilhante e presente na membrana celular e/ou o interior da maioria das células de um vírus potente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: análise de estabilidade de hTRPC3 por FSEC. (A) detergente triagem de hTRPC3. O hTRPC3 foi solubilizada em uma variedade de detergentes com uma concentração crítica micelle de 0,01 - 20mm célula inteira e foi executado em buffer DDM/CHS-contendo. Embora DDM/CHS mostra a maior solubilidade do hTRPC3, o pico aparece na posição errada, muito grande para ser o hTRPC3 tetramérica (rastreamento de azul). (B) controle de TRPM4, com um peso molecular tetramérica de aproximadamente 540 kDa, solubilizado e execução no DDM/CHS, teve um volume de eluição de aproximadamente 12,9 mL, enquanto TRPC3, com um peso molecular tetramérica de aproximadamente 400 kDa, solubilizado e executar no DDM/CHS, teve um volume de eluição de cerca de 11,9 mL. Com menor peso molecular, hTRPC3 se esperaria ter um volume de eluição ligeiramente maior do que TRPM4, não um pouco menor, sugerindo que a DDM/CHS pode não ser um detergente ideal para solubilização de hTRPC3 e purificação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: triagem de tampão de detergente de hTRPC3 por FSEC. (A) solubilidade e estabilidade teste de hTRPC3 usando digitonin. Digitonin foi testado para solubilização e em reserva de marcha. Observe a posição do pico de hTRPC3 proteína solubilizada em digitonin deslocada na direção de um maior volume de eluição em comparação com a proteína solubilizado na DDM/CHS (traço amarelo vs azul e vermelho vestígios). Apenas a combinação usando digitonin em buffers tanto solubilização e execução mostra o tamanho correto de hTRPC3 por FSEC (traço amarelo, asterisco). (B) semelhante aos resultados da célula inteira solubilizado hTRPC3, a posição de pico do hTRPC3 afinidade de proteína purificada em digitonin (traço vermelho, 14 mL) deslocada na direção de um maior volume de eluição em comparação com a afinidade da proteína purificada na DDM/CHS (azul FSEC Trace, 12ml) medida pelo SEC-fracionamento. (C) negativo-mancha EM foi utilizado para verificar a qualidade da proteína purificada antes da coleta de dados de cryo-EM. Uma mancha ideal deve apresentar partículas (círculos vermelhos) negativamente coradas (aparecendo em branco) e rodeado por um anel de detergente (aparecendo preto). É mostrado um representante, Micrografia ideal em que estas partículas são abundantes, monodispersas e presente em várias orientações. (D) dados de qualidade do negativo-mancha EM deve fornecer classes 2D com uma arquitetura geral clara e consistente e deverá abranger várias orientações da proteína, com médias contidas e centralizado dentro da máscara (círculo preto). 2D classes de micrografias de EM negativo-mancha de hTRPC3 solubilizado em partículas presentes de DDM/CHS que parecem ser uma dimerização frente a frente de monômeros de hTRPC3. Em contraste, uma áspera (mas clara e consistente) global bolota tetramérica estrutura decorre em classes 2D micrografias de EM negativo-mancha de hTRPC3 solubilizado em digitonin. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: purificação de hTRPC3. Teste de estabilidade (A) de hTRPC3 em presença de EDTA. hTRPC3 foi solubilizado em digitonin em presença (traço vermelho) ou ausência (traço azul) de 10 mM de EDTA. O anterior mostrou um pico único e mais estreito na posição de proteína tetrâmero (traço vermelho, asterisco), indicando que o EDTA estabilizado hTRPC3 em sua conformação tetramérica. (B) GFP fluorescência sinal FSEC para hTRPC3 solubilizado em digitonin e executar no buffer digitonin. O pico de tetrâmero é observado no material solubilized antes da purificação de coluna de afinidade de metal (traço azul, asterisco). A ausência deste pico na fração de escoamento indica uma ligação completa da proteína de hTRPC3 na coluna de afinidade (traço vermelho). Após eluição por imidazol, verificaram-se as frações no pico da eluição por FSEC (sinal verde). Todas as frações mostrando tetrâmero intacto pico foram coletadas para purificação ainda mais. (C) teste de clivagem da GFP, de hTRPC3, usando a trombina. Tempo de digestão foi testado usando uma pequena quantidade de proteína a 4 ° C, e a completude da digestão foi verificada por FSEC. Em cada traço, o pico da esquerda corresponde ao pico de tetrâmero de hTRPC3 (asterisco) e o pico da direita é o pico GFP livre. Como o comprimento da digestão aumentou, a proporção de proteína tetramérica libertar GFP diminuiu, indicando que GFP foi ser clivada da proteína. A digestão 2 h mostra uma clivagem completa da GFP. (D), SEC perfil de hTRPC3 antes ou depois da digestão de trombina em digitonin contendo tampão em execução com 10 mM de EDTA adicionado. Como esperado, a posição de pico é deslocada na direção do menor volume de eluição após digestão trombina (traço vermelho). O pico principal (asterisco) representa o tetramérica hTRPC3. As frações entre linhas vermelhas foram coletadas para experimentos de cryo-EM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: esquemático de cryo-EM dados de coleta e processamento para hTRPC3. A coleção de 3.660 pilhas de filme de hTRPC3 purificado foi feita usando um microscópio eletrônico com um detector de elétrons direto. Correção de movimento e seleção manual foram aplicados resultando em 3.580 micrografias. As partículas foram autopicked e sujeitos a classificação 2D. 2D classes foram ainda mais refinadas pela classificação 3D. Somente uma de cinco classes 3D exibido características de alta resolução. Essa classe foi selecionada para 3D requinte e refinamento local Frealign, resultando em uma estrutura para hTRPC3 em 3,3 Å resolução. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Determinação estrutural de proteínas por cryo-EM tem revolucionado o campo da biologia estrutural nos últimos anos, graças ao desenvolvimento de novas câmeras e algoritmos que acelera significativamente a determinação da estrutura das proteínas que não prontamente crystalize, particularmente as proteínas da membrana. Apesar de todos os avanços recentes na técnica de cryo-EM, a preparação de proteínas purified em qualidade e quantidade suficiente para facilitar a alta qualidade de imagem muitas vezes continua a ser demorado, caro e desafiador. A capacidade de rapidamente express e tela vários gene constrói sob uma variedade de condições de purificação, conforme descrito no protocolo acima, melhora a eficiência deste processo, permitindo que a produção rápida e econômica de alta qualidade proteína purificada para uso em estudos de cryo-EM.

Enquanto o método descrito aqui fornece uma maneira para purificar grandes quantidades de proteínas de membrana mamíferos com menos custos do que por transfecção direta e mais rapidamente do que pela geração de uma linhagem de células transfectadas estàvel, ele tem muitas etapas, cada uma das quais deve ser otimizada para proporcionar um rendimento de proteína de alta qualidade. Dentro das técnicas bioquímicas para produzir e purificar hTRPC3, há uma série de passos críticos e pontos de verificação. O primeiro ponto de referência fundamental é a produção de bacmid DNA. Conforme descrito nos resultados, seleção de colônia ideal é o primeiro passo na geração de um vírus de qualidade na expressão de proteínas. Além disso, se a concentração de bacmid DNA purificado da colônia selecionada é menos de 1 μg/μL, o vírus resultante não será suficiente para a expressão da proteína robusto. O segundo posto de controlo crítico é a produção de baculovirus P1 e P2. Título do vírus pode ser estimado por fluorescência de GFP, conforme mostrado na Figura 1 , ou pode ser medido conforme descrito por Coleman et al . 35. título viral, além de um curso de tempo de tempo de infecção deve ser realizado para cada nova construção determinar o momento ideal para a expressão da proteína máxima da infecção. Ponto crítico de controle três é a solubilidade e rastreio de estabilidade, mostrado na Figura 2. Detergentes com um CMC alta, tais como DDM, podem fornecer alta solubilidade, mas não são ideais para a cryo-EM imagem porque podem resultar em uma abundância de contaminar micelas. Um detergente suave, tais como digitonin, pode fornecer suficiente solubilidade, preservando a estabilidade da proteína. A seleção de aditivos, tais como EDTA no caso hTRPC3, é importante para descobrir uma condição de purificação que resulta na proteína intacta e homogénea, provavelmente, removendo o cálcio do hTRPC3, que é permeável ao cálcio. Ponto crítico de controle quatro é a verificação da proteína específica e eficiente de captura durante a purificação da coluna de afinidade e a observação de um pico de proteína ideal durante o SEC-fracionamento (Figura 4). Evitar a inclusão de contaminação de partículas de proteína mantendo toda a proteína alvo é crucial para a obtenção de um rendimento suficiente de proteína para a imagem latente de cryo-EM. Alteração do tempo de ligação de lote e proporção de resina para proteína solubilizada pode ajudar a melhorar a retenção de proteína pela coluna de resina. A qualidade geral do pico do SEC-fracionamento é, em nossa experiência, o melhor indicador, antes da imagem, da qualidade das partículas de proteína purificada. Um baixo ou um amplo pico durante SEC-fracionamento indica possíveis problemas de muito poucas partículas de proteína por imagem ou a presença de contaminantes produtos de agregação/degradação de proteína, respectivamente. Além disso, as alterações para a marca de afinidade dentro a construção em si provou necessário em alguns casos para garantir a ligação de afinidade-marca suficientes. O ponto de verificação final antes da coleção de cryo-EM conjuntos de dados é a verificação da qualidade de partícula de proteína por EM negativo-mancha. Enquanto não é estritamente necessário, achamos que isto oferece uma excelente oportunidade para problemas de qualidade de proteína pontual e correto antes de investir no processo de coleta de dados pela cryo-EM tempo - e onerosos.

Um método alternativo de produção de proteínas para estudos estruturais de cryo-EM é a purificação direta da proteína da fonte de tecido nativo. Enquanto este método muitas vezes encontra problemas com o rendimento de proteína, é uma excelente alternativa para proteínas que são altamente abundante em células ou que existem como parte de um grande complexo de multi-proteína, que pode ser difícil de produzir usando uma superexpressão recombinante sistema de36. No entanto, para única proteínas expressas em quantidades moderadas ou baixas sob condições fisiológicas, o sistema de expressão e purificação apresentado aqui é um eficiente, método relativamente de baixo custo e alto rendimento para produzir purificado da membrana dos mamíferos para estudos estruturais de cryo-EM. Um método que poderia fortemente complementar que aqui apresentado é a reconstituição da proteína purificada em lipídios nanodiscs antes de coleta de dados de cryo-EM37. Sob este método, as proteínas são embutidas em um pequeno disco de bicamada lipídica, provavelmente, fornecendo um microambiente como de um nativo em comparação com detergentes micelas, embora não haja nenhuma evidência até agora que as estruturas dissolvido em detergente e nanodisc são diferentes38,39,40. Outra abordagem é para extrair a proteína diretamente usando polímeros anfifílicos como estireno maleico (SMA), que tem sido usado com sucesso para determinação da proteína de membrana estruturas41,42.

Estas abordagens descritas neste manuscrito provaram para ser facilmente adaptável em nosso laboratório para uma variedade de outras proteínas de membrana mamíferos, além de canais iônicos. Portanto, acreditamos que este protocolo será um instrumento valioso nas análises estruturais e funcionais que sustentam a concepção de alta especificidade droga alvo. Isto será particularmente útil em doenças neurodegenerativas, doenças cardiovasculares e câncer, no qual íon canais são alvos de drogas de alto potencial, mas difícil.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos G. Zhao e X. Meng o apoio com coleta de dados para o David Van Andel Cryo-elétron microscopia conjunto avançado. Agradecemos a equipe VARI de computação de alto desempenho para suporte computacional. Nós damos nossa gratidão a s. Clemente, D. dívidas, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth e Ruan z para comentários que melhoraram muito este manuscrito. Agradecemos a D. Nadziejka de apoio editorial para este manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela VARI interno financiamento.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEG BacMam vector (pFastBacI) addgene 31488
DH10α cells Life Technologies 10361-012
S.O.C. media Corning 46003CR for transformation of DH10α cells for Bacmid
Bacmam culture plates Teknova L5919 for culture of transformed DH10α cells
Incubation shaker for bacterial cells Infors HT Multitron standard
Incubated orbital shaker for insect cells Thermo-Fisher SHKE8000
Reach-in CO2 incubator for mammalian cells Thermo-Fisher 3951
Table-top orbital shaker Thermo-Fisher SHKE416HP used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells
Incubator VWR 1535 for bacterial plates
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 for plasmid extraction and purification
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol Invitrogen 15593031 for DNA extraction
Sf9 cells Life Technologies 12659017 insect cells for producing virus
Sf-900 media Gibco 12658-027 insect cell media
FBS Atlanta Biologicals S11550
Cellfectin II Gibco 10362100 for transfecting insect cells
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 for transfecting mamalian cells
0.2 mm syringe filter VWR 28145-501 for filtering P1 virus
0.2 mm filter flasks 500ml resevoir Corning 430758 for filtering P2 virus
erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) Gene Mate F-5909-2000 for culturing insect cells
erlenmeyer culture flask (baffled 2L) Gene Mate F-5909-2000B for culturing mammalian cells
nanodrop 2000 spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000 for determining DNA and protein concentrations
HEK293 ATCC CRL-3022 mammalian cells for producing protein
Freestyle 293 expression Medium Gibco 1238-018 mammalian cell media for protein expression
Butyric Acid Sodium Salt Acros 263195000 to amplify protein expression
PMSF Acros 215740500 protease inhibitor
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-100MG protease inhibitor
Leupeptin hydrochloride Sigma-Aldrich 24125-16-4 protease inhibitor
pepstatin A Fisher Scientific BP2671-250 protease inhibitor
digitonin EMD Millipore 300410 detergent - to solubilize protein from membrane
imidazole Sigma 792527 to elute protein from resin column
TALON resin Clonetech 635504 for affinity purification by His-tag
superose6 incease columns GE 29091596; 29091597 for HPLC and FPLC
Prominence Modular HPLC System Shimadzu See Below
Controller Module " CBM20A
Solvent Delivery System " LC30AD
Fluorescence Detector " RF20AXS
Autosampler with Cooling " SIL20ACHT
Pure FPLC System with Fractionator Akta
thrombin (alpha) Haematologic Technologies Incorporated HCT-0020 Human alpha for cleaving GFP tag
Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube Millipore UFC910008 for concentrating protein
EDTA Fisher E478500 for stabilizing protein
400 mesh carbon-coated copper grids Ted Pella Inc. 01754-F grids for negative stain
Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) Electron Microscopy Sciences Q3100AR1.3 grids for Cryo-EM
Vitrobot Mark III FEI for preparing sample grids by liquid ethane freezing
liquid nitrogen Dura-Cyl UN1977
ethane gas Airgas UN1035
Solarus Plasma System Gatan Model 950 for cleaning grids before sample freezing
Tecnai Spirit electron microscope FEI for negative stain EM imaging
Talos Arctica electron microsocope FEI for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids
Titan Krios electron microscope FEI for high-resolution Cryo-EM imaging
Software
Gautomatch software http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ to pick particles from micrographs
Relion 2.1 software https://github.com/3dem/relion to construct 2D and 3D classification
CryoSPARC software https://cryosparc.com/ to generate an initial structure model
Frealign software http://grigoriefflab.janelia.org/frealign to refine particles
Coot software https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ to build a model
MolProbity software http://molprobity.biochem.duke.edu/ to evaluate the geometries of the atomic model
SerialEM software http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ for automated serial image stack acquisition
MortionCor2 software http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html for motion correction of summed movie stacks
GCTF software https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ for measuring defocus values in movie stacks
Phenix.real_space_refine software https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html for real space refinement of the initial 3D model

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References

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Haley, E., Choi, W., Fan, C., Sun, W., Du, J., Lü, W. Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e58754, doi:10.3791/58754 (2019).

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