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Biochemistry

Expresión y purificación de los humanos sensibles a lípido catiónico canal TRPC3 para la determinación estructural por microscopia del Cryo-electrón de solo-partícula

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58754
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 1, 1
1Van Andel Institute, 2Vollum Institute, 3Janelia Research Campus
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo describe las técnicas utilizadas para determinar las estructuras de canal de iones por microscopia del cryo-electrón, incluyendo un sistema de baculovirus para expresar eficientemente genes en células de mamíferos con el mínimo esfuerzo y toxicidad, extracción de proteínas, purificación, y comprobación de la calidad, preparación de la red muestra y proyección, así como recopilación de datos y procesamiento.

Abstract

Canales de potencial receptor transitorio (TRPCs) de la subfamilia TRP canónica son canales de cationes no selectivos que juegan un papel esencial en la homeostasis del calcio, entrada de calcio particularmente tienda que funciona, que es fundamental para mantener el funcionamiento adecuado del liberación de la vesícula sináptica y vías de señalización intracelular. Por consiguiente, los canales TRPC han sido implicados en una variedad de enfermedades incluyendo las enfermedades cardiovasculares como la hipertrofia cardiaca, trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Parkinson y trastornos neurológicos como la ataxia espinocerebelosa. Por lo tanto, canales TRPC representan una diana potencial farmacológica en las enfermedades humanas. Sin embargo, los mecanismos moleculares de bloquear estos canales aún no están claros. La dificultad en la obtención de grandes cantidades de proteína purificada, homogénea y estable ha sido un factor limitante en los estudios de determinación de estructura, particularmente para las proteínas de membrana mamíferos como los canales de ion TRPC. Aquí, presentamos un protocolo para la expresión a gran escala de proteínas de la membrana del canal de ion mamíferos utilizando un sistema de transferencia de genes de baculovirus modificados y la purificación de estas proteínas por afinidad y cromatografía por exclusión de tamaño. Además, presentamos un protocolo para recoger imágenes de microscopia del cryo-electrón de solo-partícula de proteína purificada y utilizar estas imágenes para determinar la estructura de la proteína. Determinación de la estructura es un método eficaz para la comprensión de los mecanismos de control y función de canales iónicos.

Introduction

Calcio está implicado en procesos celulares más que incluyen señalización cascadas, control de la transcripción, liberación de neurotransmisor y hormona molécula síntesis1,2,3. El mantenimiento homeostático del calcio libre citosólico es crucial para la salud y la función de las células. Uno de los principales mecanismos de homeostasis del calcio intracelular es la entrada de la tienda que funciona de calcio (SOCE), un proceso en el que agotamiento de calcio almacenado en los provocadores de la retículo endoplásmico (ER) la apertura de canales iónicos en la membrana plasmática para facilitar la reposición de calcio ER, que puede utilizarse en la señalización más4,5,6. Canales potencial receptor transitorio (TRPCs), que son permeables al calcio canales pertenecientes a la superfamilia TRP, se han identificado como un importante participante en SOCE7,8,9 .

Entre los siete miembros de la familia TRPC, TRPC3, TRPC6 y TRPC7 forman un subgrupo de homólogo, y son únicos en la capacidad de ser activado por el lípido secundaria mensajero diacilglicerol (DAG), un producto de degradación de los lípidos señalización fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato (PIP2)10,11. TRPC3 es altamente expresada en el músculo liso y en las regiones cerebrales y cerebelosas del cerebro, donde desempeña funciones esenciales en la señalización de calcio que afectan a la neurotransmisión y neurogénesis12,13. Disfunción de TRPC3 se ha relacionado con trastornos del sistema nervioso central, enfermedades cardiovasculares y ciertos cánceres como el adenocarcinoma ovárico14,15,16. Por lo tanto, TRPC3 es prometedor como objetivo farmacéutico para el tratamiento de estas enfermedades. El desarrollo de fármacos específicamente dirigidos en TRPC3 ha sido limitado por la falta de comprensión de sus mecanismos de activación molecular, incluyendo lípidos vinculante sitios17,18. Hemos reportado la primera estructura de la atómico-resolución del humano TRPC3 canal (hTRPC3) y sus sitios de unión de lípidos dos en un estado cerrado, proporciona penetraciones importantes en estos mecanismos19.

El factor clave para determinar la estructura de una proteína de membrana de alta resolución es obtener proteína de alta calidad. La proyección correspondiente de la expresión y purificación de las condiciones necesarias para obtener proteína de alta calidad puede ser un esfuerzo costoso y desperdiciador de tiempo. Aquí presentamos un protocolo que describe en detalle cómo identificar las condiciones óptimas para la expresión y purificación de hTRPC3, que se comportaron mal en nuestro análisis inicial. Presentamos varios puntos claves acerca de cómo solucionar problemas y optimizar el comportamiento de la proteína, que pone una fundación sólida para la cryo-electrón de estudios de la microscopia (cryo-EM). Utilizamos un baculovirales modificada generación de vectores (pEG), desarrollado por Gouaux y colegas, que se ha optimizado para la detección del análisis y eficiente generación de baculovirus en células de mamífero de20. Este método de expresión es apropiado para la rápida y rentable la sobreexpresión de proteínas en la membrana de la célula mamífera. Combinamos el uso de este vector con una tamaño-exclusión de fluorescencia-detección basada en cromatografía (FSEC) preselección método21. Este método utiliza una etiqueta de la proteína verde fluorescente (GFP) sobre el constructo de interés y mejora la visualización de la proteína objetivo en pequeños celulares solubilizadas las muestras. Esto permite la proyección de la estabilidad de la proteína en presencia de diferentes detergentes y aditivos, con mutaciones de thermostabilizing y permite el uso de un pequeño número de células de transfección transitoria en pequeña escala. De esta manera, una multitud de condiciones puede someterse rápidamente antes de pasar a una purificación de proteínas a gran escala. Expresión, detección y purificación, presentamos un protocolo de obtención y procesamiento de imágenes de cryo-EM para generar una determinación estructural de novo de la proteína. Creemos que los enfoques descritos aquí servirá como un protocolo generalizable para estudios estructurales de TRP canales receptores y otras proteínas de membrana.

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Protocol

1. transformación de células competentes DH10α para producir Bacmid ADN

  1. Sintetizar el gen de interés y subclone en una versión modificada del vector pEG que contiene un doble strep-tag, etiqueta His8 y GFP con un sitio de la hendidura de la trombina en el N terminal (pFastBacI)20.
  2. Transformar células competentes mediante la adición de 5 ng de plásmido que contiene un gen deseado en pFastBacI a 50 μL de DH10α células de 1,5 mL del tubo e incuban por 10 min en hielo. Calor del choque las células para 45 s a 42 ° C. Añadir 200 μL de caldo super óptima con medio represor catabólico (SOC) en el tubo e incubar durante 4-8 h a 37 ° C en un agitador orbital a 225 rpm.
  3. La placa 5 μL de las células en una placa de agar bacmid LB (50 kanamicina μg/mL, 7 μg/mL gentamicina, agar tetraciclina, Bluo-gal de 100 μg/mL y 40 μg/mL isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido [IPTG], 10 μg/mL).
  4. Incube la placa durante 48 h a 37 ° C.
    Nota: Las colonias de manchas de indicador de Bluo-gal que todavía expresan lacZ (inserción del vector sin éxito), que permite selección de colonias blancas (transformadas con éxito).
  5. Seleccione cuidadosamente una colonia blanca aislada, evitando cualquier colonias blancas que están en contacto con las colonias azules y crecen las células durante la noche en 6 mL de medio de bacmid LB (50 kanamicina μg/mL, 7 μg/mL gentamicina, tetraciclina de 10 μg/mL) a 37 ° C en un agitador orbital a 225 rpm.

2. bacterias preparación para aislamiento de DNA de Bacmid

  1. Para aislar el ADN bacmid, desactivación de células de Escherichia coli durante 10 min a x 2880 g.
  2. Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 μL de solución de resuspensión celular de la miniprep kit (véase Tabla de materiales) por pipeteo. Asegúrese de que el sedimento se suspende completamente y de forma homogénea. Entonces, transfiera la suspensión celular en tubos de 1,5 mL.
  3. Añadir 200 μL de la solución de lisis celular de la miniprep kit y mezclar invirtiendo el tubo varias veces. Incubar hasta 5 min a temperatura ambiente (RT) para lisar las células. Añadir 200 μL de solución de neutralización de la miniprep kit y mezclar invirtiendo el tubo varias veces para detener la reacción de lisis.
  4. Desactivación durante 10 min a 21.130 x g en una centrífuga de mesa. Recoger 600 μL de sobrenadante en un tubo de 2 mL. Añadir 600 μL fenol: cloroformo: isoamílico solución de alcohol (véase Tabla de materiales) y mezcla bien para extraer el ADN del resto de los productos de la lisis de la célula.
    PRECAUCIÓN: Solución de fenol: cloroformo: isoamílico alcohol es tóxico por inhalación, contacto con la piel y si se ingiere. Puede causar quemaduras químicas y pueden ser cancerígeno. Use guantes y una bata abotonada. Trabajar en una campana de humos. Disponer adecuadamente de estos residuos peligrosos.
  5. Girar el tubo por 10 min a 21130 x g en una centrífuga de mesa. Aparecerán dos fases líquidas separadas. Cuidadosamente transferir 300 μL de la fase acuosa superior a un tubo nuevo. Añadir 600 μL de etanol al 100% para lavar el DNA. Invierta suavemente el tubo para mezclar.
    Nota: No no agitar con vortex, ya que esto puede distorsionar bacmid ADN.
  6. Tubos frescos colocándolos en un congelador de-20 ° C durante 10 minutos giran por 10 min a 21.130 x g en una centrífuga de mesa. Deseche el sobrenadante y mantener el pellet de DNA.
  7. Añadir 1 mL de etanol al 70% para lavar el pellet. Invierta suavemente el tubo para mezclar. Centrifugado por 10 min a 21.130 x g en una centrífuga de mesa. Deseche el sobrenadante y seque el precipitado al aire durante aproximadamente 5 minutos o hasta que el líquido no es visible en el tubo y el pellet de DNA se convierte en traslúcido.
  8. Resuspender el precipitado seco en 50 μl de estéril, libre de ADNasa, agua desionizada. Medir la concentración de ADN.
    Nota: No congelar ADN bacmid. Almacenar a 4 ° C durante hasta varios días.

3. transfección de células de insecto Sf9 con Bacmid para producir Baculovirus P1

  1. Semilla 0.9 x 106 células Sf9/pozo en 2 mL de medio apropiado (véase Tabla de materiales) en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos bien 6. Incube las células a 27 ° C por 20 min promover el apego a la placa.
    PRECAUCIÓN: Los cultivos celulares son un peligro biológico. Trabajar en una campana de flujo laminar aprobadas utilizando condiciones asépticas y compruebe las directrices institucionales y gubernamentales para ropa de protección recomendada y correcta eliminación de los residuos antes de realizar los experimentos.
  2. Después de la fijación, añadir 8 μl de reactivo de transfección (véase Tabla de materiales) a 100 μl de los medios de comunicación para cada pocillo de la 6 placa bien ser transfectadas en un tubo estéril. Añadir 6 μg de bacmid ADN a 100 μl de medio en un tubo estéril separado. Incubar 5 min a RT. combinar las dos soluciones e incubar durante 45 min a TA.
  3. Vuelva a colocar el medio en los 6 pozos con 2 mL de medio fresco. Añadir la mezcla del paso anterior a cada uno bien gota a gota (200 μL por pozo). Muévalo suavemente la placa para asegurar una mezcla de la solución de la transfección en el medio.
    Nota: No agitar ni agitar la placa porque esto puede causar que las células separar.
  4. Incube las células durante 5 días (120 h) en una incubadora humidificada de 27 ° C. Comprobar la fluorescencia de GFP antes de la cosecha para comprobar que el virus se está produciendo en un gran porcentaje de las células; el porcentaje es bajo, aumenta el tiempo de incubación según sea necesario (ver figura 1).
  5. Recoger el sobrenadante que contiene virus del P1 (aproximadamente 2 mL de cada pozo). El medio que contiene virus de P1 en tubos de 2 mL con una jeringa de 3 mL y pequeño 0,2 μm filtro del filtro. Añadir estéril de suero bovino fetal (FBS) a una concentración final de 1%.
    Nota: Esta acción de virus P1 debe almacenarse a 4 ° C y protegerse de la luz.

4. infección de células de insecto Sf9 con Baculovirus P1 para producir Baculovirus P2

  1. Preparar 200 mL (o volumen) de las células Sf9 en una concentración de 0.8 - 0.9 x 106 células/mL en medio apropiado (véase Tabla de materiales) en un erlenmeyer cultura de fondo plano de tamaño suficiente.
    Nota: Para la cultura de la suspensión, el volumen utilizado no debe exceder 40% de la capacidad total del matraz.
  2. Añadir 1:2500 relación (v/v) de la acción de virus P1 de 3,5 a la cultura de suspensión de células Sf9. Incubar durante el tiempo de expresión del virus óptima (generalmente 48-120 h dependiendo de la construcción de proteínas) a 27 ° C en un agitador orbital a 115 rpm.
    Nota: La expresión de virus relativa puede determinarse mediante la visualización de la fluorescencia de GFP del virus en una muestra de la cultura.
  3. Centrifugar la suspensión celular por 40 min a 11.520 x g y recoger el sobrenadante que contiene virus de P2. Filtrar el sobrenadante utilizando desechables 0,2 μm filtros. Añadir equipos a una concentración final de 0,5%.
    Nota: Este virus P2 deben almacenarse a 4 ° C y protegido de la luz.
  4. Obtener un título para el virus P2 utilizando células de Sf9easy o un contador de virus.

5. infección de células mamíferas HEK293 con Baculovirus P2 para expresión de proteínas a gran escala

  1. Preparar un volumen conveniente de HEK293 mamíferos suspensión cultivo celular (4-6 L se recomienda para la preparación de redes congelados) en una concentración de 3.5-3.8 x 106 células/mL en el medio de expresión (véase Tabla de materiales) suplementado con 1% (v / v) FBS estéril en frascos de cultivo de Erlenmeyer inferior desconcertado de tamaño suficiente.
    Nota: Para la cultura de la suspensión, el volumen utilizado no debe exceder 40% del volumen total del matraz.
  2. Agregar 8% (v/v) de la solución madre de virus P2 de paso 4.3 a la cultura de suspensión de células HEK293. Incubar a 37 ° C en un agitador orbital a 135 rpm.
  3. Añadir butirato de 10 mM en post-infección 12-18 h. Incubar durante el tiempo de expresión de la proteína óptimo (generalmente 36-72 h) a 30 ° C.
  4. Recoger las células por centrifugación durante 20 min a 2.880 x g. Lavar las células a resuspender en aproximadamente 100 mL tris-buffer salino (TBS) por litro de células cosechadas. Centrifugar nuevamente por 20 min a 2.880 x g y recoger el precipitado de células.
    Nota: El protocolo se puede detener aquí. Gránulos de la célula pueden ser snap-congelado en nitrógeno líquido y almacenadas a-80 ° C hasta purificación.
    PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido puede causar lesiones o quemaduras criogénicas. Puede causar quemaduras por congelación. Puede desplazar el oxígeno y causar asfixia rápida. Use guantes aislantes de frío y careta protectora.
  5. Recoger cosechas pequeñas 1 mL en diferentes puntos del tiempo y solubilizar por 2 h a 4 ° C con oscilación o agitación en presencia de diferentes detergentes y aditivos. Estas pequeñas muestras solubilizadas de celulares pueden ser clarificadas por ultracentrifugación a 235.000 × g por 10 min a 4 ° C y correr como una muestra de 30 μL en una columna de cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) (véase Tabla de materiales) para determinar el mejor momento para expresión y las mejores condiciones de solubilización.
    Nota: En el caso de hTRPC3, esta proyección incluye buffers diferentes con valores de pH de 4.0-9.5 y concentraciones de sal de 50-500 mM; diferentes composiciones iónicas (como MgCl2 o NaCl); detergentes diferentes con valores de (CMC) de la concentración micelar crítica de 0.1 - 20 mM; reducción de aditivos tales como el Ditiotreitol, tris(2-carboxyethyl) fosfina y β-mercaptoetanol; y los quelantes del calcio ácido añadido etilendiaminotetracético (EDTA).

6. purificación de la proteína hTRPC3 del precipitado de células congeladas

  1. Descongelar el precipitado en tampón que contiene 20 mM Tris (pH 8.0), 500 mM NaCl, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF), 0,8 μM aprotinina, 2 μg/mL leupeptin, pepstatin 2 m m A, y digitonin 1%, utilizando 100 mL de buffer por cada litro de las células cosechadas. Una vez descongelado, asegurar la homogeneidad de la solución por pipeteo o agitación. Permiten para solubilizar por 2 h a 4 ° C en un matraz sumergido en hielo con un stir bar giratorio.
  2. Eliminar restos celulares por ultracentrifugación a 235.000 × g durante 1 h a 4 ° C. Verificar la cantidad de proteína mediante la ejecución de una muestra de 30 μL en una columna de s (véase Tabla de materiales) por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y visualizar la proteína diana de la GFP señal de salida.
  3. Incubar la proteína solubles (sobrenadante) con resina de afinidad de cobalto de 1-2 h a 4 ° C. Verificar proteínas de unión a la resina ejecutando una 30 muestra μL en una columna de seg.
    Nota: Si se ha producido la Unión a proteínas, el objetivo del etiquetado proteína GFP se conservarán en la columna, que no se encuentran en el flujo a través. Por lo tanto, no hay señal GFP estará presente en la posición correspondiente al tamaño de la proteína objetivo cuando el flujo a través de HPLC.
  4. Lavar la resina con 10 volúmenes de columna de búfer (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, imidazol de 15 mM y 0.1% digitonin). Si hay pérdida de la proteína ejecutando una 30 muestra μL en una columna de seg.
    Nota: Si se ha producido pérdida de la proteína de la columna, el objetivo del etiquetado proteína GFP se encontrará en el tampón de lavado que ha pasado sobre la columna. Por lo tanto, la señal GFP estará presente en la posición correspondiente al tamaño de la proteína objetivo cuando el tampón de lavado se ejecuta en HPLC. Si se ha producido pérdida de la proteína, la concentración del imidazol el tampón de lavado deba reducirse para evitar perturbar su enlace de la etiqueta a la columna de afinidad.
  5. Eluir la resina hTRPC3 con tampón (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, imidazol de 250 mM y 0.1% digitonin). Añadir trombina en una 1:20 fracción molar (para hender la etiqueta GFP) y añadir 10 mM EDTA (un agente estabilizador de hTRPC3) a la muestra eluída e incubar durante 3 h a 4 ° C. Comprobar que la proteína ha sido eluida ejecutando 90 μL de una muestra diluida 1: 100 en una columna de segundos y verificar la presencia de una señal GFP en la posición correspondiente al tamaño de la proteína objetivo.
    Nota: en este punto, la señal de triptófano de las proteínas totales en la elución puede también verse. Sólo la proteína de purificados por afinidad de objetivos permanecerá en la elución y la GFP y triptófano señales serán cerca de idéntico perfil. Si la proteína diana no se ve en gran cantidad en la elución pero no se perdió en el flujo o el lavado, la proteína probablemente ha permanecido ligada a la columna y puede eluyó con una mayor concentración de imidazol en el búfer.
  6. Concentrar el efluente a 500 μL o menos en un filtro centrífuga de 15 mL 100K tubo (véase Tabla de materiales) por giro a 2.880 x g a 4 ° C en incrementos de 5 minutos. Resuspender las proteínas transfiriendo la solución hacia arriba y hacia abajo entre giros para evitar overconcentrating.
    Nota: Centrífuga tiempo puede ser acortado como aproxima el volumen el volumen final deseado.
  7. Cargar el concentrado en una columna de SEC en tampón (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA y 0,1% digitonin). Ejecutar.
  8. Combinar fracciones de pico que contiene el tetrámero TRPC3 intacto, como visualizado por la señal de absorbancia de UV y se concentran otra vez a una concentración final de al menos 5 mg/mL.

7. detección de proteínas por microscopía Tinción negativa

  1. Encienda la máquina de la descarga del resplandor. Configurar el programa para la descarga de una cuadrícula recubiertas de carbón utilizando argón y oxígeno para 30 s. ejecutar el programa para hacer la capa de carbón en rejillas de malla 400 cobre hidrofílico antes de la adición de la solución de proteína.
  2. Crear gotas cinco 40 μL de agua estéril y gotas de dos 40 μL de solución de formato de uranilo de 1% (en la película de laboratorio, papel de cera o una superficie similar, véase Tabla de materiales). Tome la rejilla de paso 7.1 y añadir 2,5 μL de proteína de 5 mg/mL (50-200 μM) la muestra en el lado oscuro y déjelo reposar 1 minuto.
  3. Después de 1 min, secar la rejilla usando papel de filtro. No toque el papel de filtro directamente a la superficie de la rejilla; en cambio, llevar el papel al borde de la gota líquida y permita que la acción capilar extraer el líquido de la red en el papel de filtro.
  4. Sumerja la rejilla en primera gota de agua. Secar con papel de filtro y repetir con las gotas restantes de agua y la primera gota de formato de uranilo. Permite la segunda gota de sit formato de uranilo durante 1 minuto y luego secar con papel de filtro. Permita que la rejilla de aire seco (1 min.) antes de almacenar.
    Nota: Este protocolo de tinción puede no ser ideal para todas las combinaciones de proteína-detergente. Diferentes concentraciones de formato de uranilo manchan y longitudes diferentes de tiempo para la exposición de la mancha deben analizarse si los pasos anteriores no proporcionan una mancha con buen contraste.
  5. Las rejillas en un microscopio electrónico de la imagen (véase Tabla de materiales) para comprobar la calidad de la partícula de proteína. Asegurar que las fotografías muestran numerosas partículas que son homogéneas en la distribución y apariencia general, mostrar buen contraste y coincide con el tamaño previsto de la proteína diana.
  6. Generar preliminar, baja resolución, de dos dimensiones (2D) clasificaciones con 50-100 fotografías (ver procesamiento de datos, paso 10) para comprobar las partículas representan diferentes puntos de vista de una sola estructura coherente.
    Nota: Micrografías y clases 2D preliminares de suficiente calidad, como se describe anteriormente, son un fuerte indicador de que el protocolo ha sido lo suficientemente optimizado para purificación de proteínas. Preparación y proyección de las redes de cryo-EM está garantizada en este punto.

8. preparación de la muestra EM

  1. Una rejilla de oro carbón perforado de descarga del resplandor (véase Tabla de materiales) como se describe en el paso 7.1.
  2. Aplicar 2.5 μL de la muestra de proteína de concentrado hTRPC3 (5 mg/mL) en la red. Secar la rejilla para 1.5 s utilizando una mancha de la fuerza de 1 y un tiempo de espera de 5 s en el 100% de humedad y 4 ° C, luego sumir la rejilla en etano líquido refrigerado por nitrógeno líquido utilizando una máquina de vitrificación.
    Nota: La humedad, temperatura, fuerza de blot, blot tiempo y aparece aquí el tiempo de espera fueron utilizados por hTRPC3 estudio19 los autores. Que necesiten ser cambiado para producir hielo vítreo óptimo para otras proteínas y detergentes.
  3. Pantalla congelada rejillas para condiciones de hielo óptimo utilizando un microscopio de cryo-EM (véase Tabla de materiales) y manualmente ver regiones de hielo (grid los cuadrados que aparecen más pequeños y más oscuros), thin ice (cuadrados de rejilla que aparecen más grandes y más brillantes) y medio de hielo .
    Nota: Hielo más grueso a menudo tiene más partículas, mientras que el hielo más delgado a menudo da mejor contraste y resolución. Investigación manual de uso de imágenes para determinar que hielo condiciones resultados en un número grande de partículas monodispersados con buen contraste y resolución. Una vez que se haya verificado la buenas condiciones, mover a la colección de imágenes en un microscopio de cryo-EM 300 kV.

9. recolección de datos EM

  1. Utilizando un programa de adquisición automatizada, grabar montones de imágenes en modo cuenta de súper-resolución con un tamaño de pixel desechado de 1,074 Å en un microscopio electrónico funciona a 300 kV con un aumento nominal de 130.000 X directo detector de electrones.
  2. Fraccionar dosis de cada imagen a 40 marcos con un tiempo total de exposición de 8 s, con 0,2 s por marco y una dosis de 6.76 e− Å s−2 −1 (valores de desenfoque nominal variados de 1.0 a 2.5 μm en el experimento de los autores).

10. EM informática

  1. Aplicar movimiento corrección de Resumen película pilas22 y estimar valores de desenfoque23 utilizando el software de procesamiento de datos (véase Tabla de materiales)24.
  2. Recoger las partículas de los micrográfos. Utilice estos recogido partículas para construir una clasificación libre de referencia 2D inicial usando el software24. Promedios de seleccionar clase 2D ideal para usar como plantillas para recoger partículas automatizada para el conjunto de datos.
  3. Compruebe la calidad de las partículas recogidas de auto y particulas mal manualmente. Utilizar múltiples rondas de clasificación 2D para limpiar las partículas cogidas.
  4. Generar un modelo inicial de25. Tema 2D recogido partículas tridimensionales (3D) clasificación (5 clases) usando simetría C1 y un filtro de paso bajo de reconstrucción inicial de 60 Å como un modelo de referencia. Determinar qué clases tienen características de alta resolución y combinan partículas dentro de dicha clase.
  5. Refinar aún más las partículas con el refinamiento local C4 simetría (en el caso de hTRPC3) aplicada y un límite de alta resolución para la alineación de la partícula a 4.5 Å26.

11. modelo de edificio

  1. Construir un modelo (véase Tabla de materiales para el software utilizado). Para hTRPC3, utilice el dominio transmembrana (TMD) del melastatin potencial transitorio del receptor 4 (TRPM4) 5wp6 de banco de datos (PDB) de proteínas de estructura como una guía27. Utilice los residuos voluminosos y la predicción de estructura secundaria guía de novo edificio.
  2. Tema del modelo inicial al refinamiento del espacio real con restricciones de estructura secundaria28. Examinar el modelo refinado y remodify según sea necesario (véase Tabla de materiales para el software utilizado) manualmente.
  3. Aplicar curvas de correlación (FSC) de cáscara de Fourier para calcular la diferencia entre el modelo final y el mapa de EM para la validación de la estructura refinada. Evaluar la geometría de los modelos atómicos (véase Tabla de materiales para el software utilizado)29,30.

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Representative Results

En la figura 1Ase muestran un Resumen esquemático del protocolo para la expresión y purificación de hTRPC3. Una imagen de la placa de bacmid de hTRPC3 con colonias blancas ideal, similares a la seleccionada para la purificación de la DNA del bacmid, se muestra en la figura 1B. Se encontró que 48 h es ideal para la tinción de Bluo gal claro manteniendo la presencia de colonias aisladas. Pico de producción de virus P2 para hTRPC3, como visualizada por fluorescencia de GFP, fue considerada después de 4 días de la infección en células de insecto Sf9 (figura 1).

Baulovirus P2 fue cosechado de los medios de comunicación, suplementado con 1% FBS y utilizado para infectar a una suspensión de células de mamífero HEK293. Butirato de sodio se añadió a los enfermos las células 12-18 h después el virus para impulsar la expresión de proteína20. Las células luego se incubaron durante un adicional 36 h a 30 ° C. Las células fueron cosechadas y sometidas a la solubilidad y la proyección de estabilidad FSEC (figura 2A)21. Las células fueron solubilizadas con siete diferentes detergentes con valores CMC de 0.01 - 20 mM en una concentración de detergente aproximadamente 10 veces el valor de la CMC. Después de la solubilización de células enteras, los restos de lisis de células fue quitado por ultracentrifugación y el sobrenadante que contiene proteínas solubles fue cargado en una columna de segundos y ejecutar en HPLC en n-dodecil-β-D-maltopyranoside/colesterilo hemisuccinato (DDM/CHS) buffer que contiene detergente para comparar la solubilidad absoluta y la posición de máximo volumen de hTRPC3 bajo diferentes condiciones con respecto a un control de TRPM4 (figura 2B). Optamos por utilizar DDM/CHS como el buffer corriente inicial para las muestras solubilizadas en diferentes detergentes porque DDM/CHS es el más comúnmente utilizan detergente cuando resuelven las estructuras de proteínas de membrana. Todo el detergente solubilizado TRPC3 muestras pico mostraron posiciones diferentes unos 11,9 ml, que probablemente es demasiado grande, porque la forma tetramérica de hTRPC3 tiene un peso molecular más pequeño que el positivo control de TRPM4 humano (figura 2A y Figura 2B).

Sin embargo, porque no había ninguna estructura de cualquier receptor de canal TRPC para comparar nuestros resultados y porque el gran peso molecular puedan ser causado por la arquitectura de TRPC3 u otros factores, se llevó a cabo una purificación en pequeña escala del hTRPC3 con 25 mL de células con DDM/CHS durante todo el experimento como DDM/CHS dieron la mejor solubilidad de hTRPC3. El perfil de la seg de hTRPC3 mostró un pico monodispersa pero todavía estaba en una posición de pico que representa un mayor peso molecular que TRPM4 (datos no mostrados). Comprobamos la proteína en la fracción máxima de perfil SEC por tinción negativa EM, ya que es un método rápido de comprobación de la calidad de la proteína y requiere una cantidad muy pequeña de la proteína. En la micrografía, se observaron partículas con dos dominios transmembrana presentes en la misma partícula. Parecía que dos partículas de hTRPC3 dimerized en forma directa a través de la interacción entre dos dominios citosólicas (figura 3D). Luego incluimos el reductor reactivo dithiothreitol (DTT) en el buffer de purificación para la segunda purificación en pequeña escala, con la esperanza de interrumpir la dimerización de hTRPC3. De hecho, un segundo pico de bajo peso molecular apareció por fraccionamiento de seg. Sin embargo, las partículas parecía demasiado pequeñas para ser un tetrámero intacto y no demostraron características de proteínas de membrana como un dominio de transmembrana. Resultó que DDM/CHS no era un detergente adecuado para purificar el hTRPC3, a pesar de dar la mejor solubilidad de hTRPC3.

A continuación, intentó una digitonin detergente, más suave, para solubilizar hTRPC3 y Comparado con la proteína solubilizada en DDM/CHS. Aquí utilizamos dos tampones corrientes diferentes que contienen DDM/CHS y digitonin, respectivamente. Esto era importante ya que el detergente en el buffer corriente a menudo contribuye a la estabilidad de la proteína y la proteína de la membrana puede llegar a ser inestable al cambiar los detergentes de solubilización a FSEC. La proteína de funcionar en tampón que contiene digitonin demostró un cambio prometedor de pico hacia un peso molecular más bajo cuando solubilizado en DDM/CHS o digitonin. La proteína solubilizada por y en digitonin produjo el pico más alto en una posición razonable en relación con la posición del control positivo, humano TRPM4 (Figura 3A). Luego nos trasladamos hacia adelante realizando una purificación en pequeña escala utilizando 25 mL de células. Aunque múltiples y amplios picos fueron observados por seg (figura 3B), la proteína demostró características de un canal de solo hTRPC3 tetramérica en 2D clasificación por tinción negativa EM (figura 3 y figura 3D). Concluimos que digitonin es un detergente ideal para purificar el hTRPC3.

Ampliar la expresión de hTRPC3 y realiza una purificación de mediana escala con 400 mL de células en digitonin. Al hacerlo, esperamos obtener suficiente proteína para unas rejillas congeladas sin perder medio y detergente antes de que descifraron las condiciones finales de purificación de hTRPC3 a gran escala. Sucede a menudo que las proteínas de membrana muestran inestabilidad cuando altamente concentrado para la preparación de redes congeladas. La proteína purificada y concentrada no sólo cambió de puesto hacia un más alto peso molecular por FSEC, pero también demostró fondo ruidoso en cuadrículas de cryo-EM fotografiadas con un microscopio equipado con una cámara EMCCD. A pesar de que hemos podido observar solo, receptores tetramérica intactos, hTRPC3 purificada en digitonin no era ideal para estudios de alta resolución cryo-EM.

Para mejorar aún más la estabilidad de la proteína, defendimos a un gran número de condiciones que se describen en el Protocolo de paso 5. Elegimos a los aditivos de pantalla basados en el carácter fisiológico de hTRPC3; por ej., EDTA fue seleccionado porque hTRPC3 es permeable al calcio y quitando el calcio puede estabilizar la proteína. De todas las muestras probadas por FSEC en el búfer que contiene el digitonin, 10 mM EDTA mostró un notable efecto en la estabilización de hTRPC3 en una posición de máxima tetramérica intacto (Figura 4A). También significativamente había incrementado el número de partículas en la micrografía de cryo-EM y disminuye el ruido de fondo, como se muestra en la figura 5.

Habiendo identificado las condiciones ideales para la expresión y purificación, se realizó una expresión a gran escala (2 L) de hTRPC3. Las células que contienen hTRPC3 se cosecha y luego solubilizadas. Ultracentrífuga aclaró lisado se sometió a la purificación de la columna de afinidad de metal lote-atando con una resina de cobalto seguida de purificación en una columna de gravedad. Retención de proteínas solubles dentro de la columna y elución de la proteína purificada por afinidad de la columna se verificó mediante FPLC (Figura 4B). Se encontró que para hTRPC3, una concentración de imidazol de 15 mM en el tampón de lavado era suficiente para eliminar proteínas contaminantes con el atascamiento no específico de la resina, e imidazol de 250 mM en el tampón de elución fue suficiente para eluir a la mayoría de los hTRPC3 solubles proteína unida a la resina. Todas las muestras fueron comprobadas por FSEC y proteínas eluídas mostraron un pico monodispersa sharp, en la posición correcta del pico. Purificada como intrínseca a la flexibilidad entre la etiqueta de la GFP y la proteína de hTRPC3 puede hacer la alineación de las partículas de proteína durante el tratamiento más difícil de la imagen, y debido a un sitio de la hendidura de la trombina se encuentra entre GFP y hTRPC3, probamos una pequeña cantidad de proteína en escote diferentes tiempos por proteasa trombina. Dado que las proteínas eluídas se incubaron con trombina a una 1:20 fracción molar demostró estabilidad razonable y hendidura completa después de 2 h a 4 ° C, troceados apagado la GFP de toda la proteína purificada usando las mismas condiciones y revisado por HPLC para confirmar que el GFP ha sido c completamente eliminado (figura 4). La proteína adicional se purificó por S, y el escote de GFP puede visualizarse otra vez por el cambio de posición de pico hacia un peso molecular más pequeño (figura 4). Una pequeña muestra no concentrada de la fracción de pico principal fue utilizada para hacer parrillas para tinción negativa EM. Todas aquellas fracciones que contiene el hTRPC3 tetramérica fueron combinados y reconcentró a una concentración final de 5 mg/mL, que se utiliza para preparar rejillas para proyección de imagen de cryo-EM. Como hemos observado parte de la proteína todavía gradualmente cambió de puesto hacia un mayor peso molecular, se recogieron sólo las fracciones con el peso molecular correcto y congelaron las redes inmediatamente después de la purificación de proteínas. Generalmente hemos completado la secuencia de experimentos de la purificación de la proteína para preparación de rejillas congeladas dentro de un solo día.

Una muestra de 2.5 μL de proteína purificada hTRPC3 (concentración 5 mg/mL) se aplicó sobre una rejilla de carbón perforado descargada de resplandor. Una máquina de vitrificación se utiliza para preparar a la parrilla, con un 1.5 s borrar tiempo debajo del 100% humedad, seguida de un descenso en etano líquido refrigerado por nitrógeno líquido. Este paso congela la muestra en hielo vítreo para la proyección de imagen. Imágenes fueron capturadas en 130.000 X magnificación nominal por un microscopio electrónico de crio a 300 kV. Pilas de imágenes se registraron en súper resolución contando modo con un tamaño de pixel desechado de 1,074 Å y un valor de desenfoque nominales oscilan entre 1.0 y 2.5 μm utilizando un detector de electrones directo y automatizado de software de adquisición. Cada imagen fue fraccionada en dosis a los 40 marcos con un tiempo total de exposición de 8 s (0,2 s por marco) y una dosis de 6.76 e− Å−2 s−1. Una micrografía representativo de este conjunto de datos se muestra en la figura 5.

Se realizó corrección de movimiento y estimación de valores de desenfoque de las pilas de película sumados. Aproximadamente 200 fotografías resultantes fueron utilizadas como fuente para picking manual de partículas y clasificación libre de referencia 2D inicial31. Nueve medias clase 2D representativo de esta clasificación inicial fueron seleccionados y utilizados como plantillas para recoger partículas automatizada para el conjunto de datos. Una comprobación manual de partículas de autopicked fue realizada para quitar partículas obviamente malas, luego se aplicaron tres rondas de clasificación 2D para afinar la selección de autopicked partículas (figura 5). Estas partículas las 2D-clase fueron clasificadas en cinco clases 3D utilizando un filtro de bajo paso de 60 Å como un modelo de referencia inicial. De estas cinco clases, sólo uno muestra características de alta resolución (figura 5). Las partículas de esta clase más fueron objeto de refinamiento local con un límite de alta resolución de 4.5 Å y C4 simetría aplicado (figura 5)32. El modelo refinado fue examinado y remodificar manualmente. La estructura refinada fue validada por el cálculo de curvas FSC para determinar la diferencia entre el modelo final y mapa de EM y por la evaluación de las geometrías de los modelos atómicos33.

Construcción del modelo inicial se realizó mediante el dominio TMD de la estructura de TRPM4 (PDB 5wp6) como una guía34. Edificio de novo del modelo de hTRPC3 fue guiado principalmente por residuos voluminosos y predicción de estructura secundaria, con las muchas hélices α en la estructura enormemente facilitando el registro de asignación. En la inicial de novo-construido el modelo, el orden, la longitud y la posición de características estructurales secundarias y residuos voluminosos están muy de acuerdo con la predicción. Durante el refinamiento, la resolución se llevó a cabo a un límite más bajo que el estimado para la reconstrucción final de resolución. FSC tridimensional se utilizó para medir el coeficiente de correlación cruzada normalizado entre dos mapas en 3D generados independientemente (cada uno utilizando la mitad del conjunto de datos) sobre granadas correspondientes en el espacio de Fourier (en función de frecuencia espacial). Empleamos una suave máscara de 4.3 Å de la reconstrucción y una adicional 4.3 Å coseno suave borde junto con un filtro de paso bajo de 10 Å, entonces utiliza el estándar FSC 0.143 umbral de corte. Esto fue utilizada para la notificación de la resolución final.

Figure 1
Figura 1: expresión y purificación de hTRPC3 utilizando el sistema de BacMam. (A) procedimiento esquemático para la expresión de hTRPC3 y purificación. (B) Bacmid selección de Colonia en la placa indicadora de color blanco. Elegir una colonia blanca aislada (flecha negra), no una colonia blanca con una colonia azul incrustada o una colonia blanca en contacto con una colonia azul (flechas rojas). (C) GFP fluorescencia de baculovirus P2 en Sf9 células menos de 20 aumentos. La fluorescencia debe ser brillante y presente en la membrana de la célula o el interior de la mayoría de las células de un virus potente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: proyección de la estabilidad de la hTRPC3 por FSEC. Detergente (A) detección de hTRPC3. El hTRPC3 era celulares solubilizado en una variedad de detergentes con una concentración micelar crítica de 0.01 - 20 mM y se ejecutó en DDM/CHS-que contiene tampón. Aunque DDM/CHS muestra la solubilidad más alta de hTRPC3, el pico aparece en la posición correcta, demasiado grande para ser hTRPC3 tetramérica (azul del rastro). (B) control de TRPM4, con un peso molecular tetramérica de aproximadamente 540 kDa, solubilizado y en DDM/CHS, tenía un volumen de elución de aproximadamente 12,9 mL, mientras que TRPC3, con un peso molecular tetramérica de aproximadamente 400 kDa, solubilizado y ejecutar en DDM/CHS, tenía un volumen de elución de 11,9 mL aproximadamente. Con un peso molecular más pequeño, hTRPC3 se espera tener un volumen de elución ligeramente más grande que TRPM4, no un poco más pequeña, lo que sugiere que DDM/CHS no puede ser un detergente ideal para solubilización de hTRPC3 y purificación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: proyección de búfer de detergente de hTRPC3 por FSEC. (A) solubilidad y estabilidad de la prueba de hTRPC3 con digitonin. Digitonin fue probado para la solubilización y en buffer de corriente. Observe la posición del pico de hTRPC3 proteína solubilizada en digitonin cambiado de puesto hacia un mayor volumen de elución en comparación con la proteína solubilizada en DDM/CHS (rastro amarillo vs azul y rojo rastros). Solamente la combinación con digitonin en buffers de solubilización y funcionamiento muestra el tamaño correcto de hTRPC3 por FSEC (rastro amarillo, asterisk). (B) Similar a los resultados de la FSEC de hTRPC3 solubles de células completas, la posición del pico de hTRPC3 afinidad de proteína purificada en digitonin (rastro rojo, 14 mL) cambiado de puesto hacia un mayor volumen de elución en comparación con la afinidad de la proteína purificada en DDM/CHS (azul seguimiento, de 12 mL) medida por fraccionamiento de seg. (C) mancha negativa EM se utilizó para verificar la calidad de la proteína purificada antes de la recogida de datos de cryo-EM. Una mancha ideal debe presentar partículas (círculos rojos) negativamente manchadas (que aparecen en blanco) y rodeado por un anillo de detergente (parece negro). Se muestra un representante ideal micrografía en la que estas partículas son abundantes, generación y presente en múltiples orientaciones. (D) datos de calidad de tinción negativa EM debe ofrecer clases 2D con una arquitectura general clara y coherente y deben abarcar múltiples orientaciones de la proteína, con promedios de contenidos y centrado dentro de la máscara (círculo negro). Clases 2D de micrografías de EM mancha negativa de hTRPC3 solubilizados en partículas presente DDM/CHS que parecen ser un cara a cara dimerización de monómeros de hTRPC3. Por el contrario, una áspera (pero clara y consistente) general bellota tetramérica estructura es evidente en clases 2D de micrografías de EM mancha negativa de hTRPC3 solubilizados en digitonin. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: purificación del hTRPC3. Prueba de estabilidad del (A) de hTRPC3 en presencia de EDTA. hTRPC3 fue solubilizada en digitonin en la presencia (trazo rojo) o ausencia (trazo azul) de 10 mM, EDTA. El primero mostró un pico único y más estrecho en la posición de la proteína del tetrámero (rastro rojo, asterisco), que indica que el EDTA estabiliza hTRPC3 en su conformación tetramérica. Fluorescencia (B) GFP señal FSEC para hTRPC3 solubilizados en digitonin y en digitonin buffer. El pico del tetrámero se observa en el material solubilizado antes de purificación de la columna de afinidad de metal (rastro azul, asterisk). La ausencia de este pico en la fracción de flujo indica una Unión completa de la proteína hTRPC3 en la columna de afinidad (trazo rojo). Después de la elución por imidazol, las fracciones en el pico de elución fueron comprobadas por FSEC (trazo verde). Se recogieron todas las fracciones que muestran pico tetrámero intacto para la posterior purificación. (C) prueba de la hendidura de la GFP de hTRPC3 con trombina. Tiempo de digestión se evaluó mediante una pequeña cantidad de proteína a 4 ° C, y la integridad de la digestión se comprobó por FSEC. En cada rastro, el pico de la izquierda corresponde al pico de tetrámero hTRPC3 (asterisco) y el pico de la derecha es el pico GFP gratis. A medida que aumenta la duración de la digestión, disminuye la proporción de proteína tetramérica a GFP, indicando que GFP fue ser hendida de la proteína. La digestión 2 h muestra una hendidura completa de GFP. Perfil (D) SEC de hTRPC3 antes o después de la digestión de la trombina en digitonin que contienen corriente buffer con 10 mM EDTA añadido. Como era de esperar, la posición del pico es cambiado de puesto hacia el volumen de elución más pequeños después de la digestión de la trombina (trazo rojo). El pico principal (asterisco) representa el hTRPC3 tetramérica. Se recolectaron las fracciones entre líneas rojas para los experimentos de cryo-EM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: esquema de cryo-EM recopilación y procesamiento de hTRPC3. La colección de 3.660 montones de películas de hTRPC3 purificada se realizó usando un microscopio electrónico con un detector de electrones directo. Corrección de movimiento y selección manual se aplicaron en 3.580 micrografías. Las partículas fueron autopicked y sometidos a clasificación 2D. Clases 2D fueron perfeccionadas por clasificación de 3D. Sólo uno de cada cinco clases 3D muestran características de alta resolución. Esta clase fue seleccionada por refinamiento 3D y refinamiento local Frealign, dando por resultado una estructura hTRPC3 en 3.3 Å de resolución. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Determinación estructural de proteínas por cryo-EM ha revolucionado el campo de la biología estructural en los últimos años, gracias al desarrollo de nuevas cámaras y algoritmos que acelera significativamente la determinación de la estructura de las proteínas que no cristalizar fácilmente, particularmente las proteínas de la membrana. A pesar de los avances recientes en la técnica de cryo-EM, la preparación de proteínas purificadas en calidad y cantidad suficiente para facilitar la calidad de imagen a menudo sigue siendo desperdiciador de tiempo, costoso y difícil. La capacidad de expresar rápidamente y pantalla múltiples gene construye bajo una variedad de condiciones de purificación, como se describe en el protocolo anterior, mejora la eficiencia de este proceso que permite la producción rápida y rentable de alta calidad proteico purificado para uso en estudios de cryo-EM.

Mientras que el método descrito aquí proporciona una manera para purificar grandes cantidades de proteínas de membrana mamíferos a menos costo que la transfección directa y más rápidamente que por la generación de una línea celular estable transfected, tiene muchos pasos, cada uno de ellos debe ser optimizado para proporcionar un rendimiento de proteína de alta calidad. Dentro de las técnicas bioquímicas utilizadas para producir y purificar hTRPC3, hay una serie de pasos críticos y puntos de control. El primer punto de control crítico es la producción de bacmid ADN. Como se describe en los resultados, selección de Colonia ideal es el primer paso en la generación de un virus de calidad para la expresión de la proteína. Además, si la concentración de bacmid ADN purificado de la Colonia seleccionada es inferior a 1 μg/μL, el virus resultante no será suficiente para la expresión de la proteína sólida. El segundo punto de control crítico es la producción de baculovirus P1 y P2. Titulación de virus puede estimarse por la fluorescencia de GFP, como se muestra en la figura 1 o puede medirse según lo descrito por Coleman et al. 35. Además de título viral, debe realizarse un curso de tiempo de tiempo de infección para que cada construcción nueva determinar el momento óptimo de la infección para la expresión de la proteína máxima. Punto de control crítico tres es la solubilidad y la proyección de estabilidad que se muestra en la figura 2. Detergentes con una CMC alta, como DDM, pueden proporcionar alta solubilidad, pero no son ideales para cryo-EM la proyección de imagen porque puede producir una gran cantidad de contaminantes micelas. Un detergente suave, como digitonin, puede proporcionar suficiente solubilidad preservando la estabilidad de la proteína. La selección de aditivos, como el EDTA en el caso de hTRPC3, es importante para descubrir una condición de purificación que se traduce en proteína intacta y homogénea, probablemente al quitar el calcio de hTRPC3, que es permeable al calcio. Punto de control crítico 4 es la verificación de la captura de la proteína específica y eficiente durante la purificación de la columna de afinidad y la observación de un pico de proteína ideal en SEC-fraccionamiento (figura 4). Evitar la inclusión de contaminantes las partículas de proteína conservando toda la proteína Diana es crucial para obtener una producción suficiente de proteína para la proyección de imagen de cryo-EM. Alteración del tiempo y proporción de resina para proteínas solubles de Unión lote puede ayudar a mejorar la retención de proteína por la columna de resina. La calidad general del pico SEC-fraccionamiento es en nuestra experiencia el mejor indicador, antes de la proyección de imagen, de la calidad de las partículas de proteína purificada. Un bajo o un amplio pico durante el fraccionamiento seg indica posibles problemas de muy pocas partículas de proteína por imagen o la presencia de contaminantes productos de agregación/degradación de la proteína, respectivamente. Además, cambios a la etiqueta de afinidad en la construcción de sí mismo ha demostrado ser necesaria en algunos casos para asegurar suficiente atar afinidad-tag. El punto de control final antes de la recogida de datos cryo-EM es la verificación de la calidad de la partícula de proteína por tinción negativa EM. Aunque no es estrictamente necesario, nos encontramos con que esto proporciona una oportunidad excelente para problemas de calidad de la proteína de punto y correcto antes de invertir en el proceso mucho tiempo y coste de la recogida de datos por cryo-EM.

Un método alternativo de producir proteína para estudios estructurales cryo-EM es la purificación directa de la proteína de la fuente de tejido propio. Si bien este método a menudo encuentra con problemas con el rendimiento de proteína, es una excelente alternativa para las proteínas que existen como parte de un gran complejo de múltiples proteína, que puede ser difícil de producir con una sobreexpresión recombinante o que son muy abundantes en las células sistema36. Sin embargo, solo proteínas expresadas en cantidades moderadas o bajo condiciones fisiológicas, el sistema de expresión y purificación presentado aquí es un eficiente método de relativamente bajo costo y alto rendimiento para producir purificado, proteína mamífera de la membrana estudios estructurales de cryo-EM. Un método que podría complementar fuertemente que presentamos es la reconstitución de proteínas purificadas en lípidos nanodiscs antes de cryo-EM datos colección37. Bajo este método, las proteínas están incrustadas en un pequeño disco de bicapa lipídica, probablemente proporciona un microambiente nativo en comparación con micelas de detergente, aunque no hay pruebas hasta ahora que las estructuras disuelven detergente y nanodisc diferentes38,39,40. Otro enfoque es extraer la proteína directamente usando polímeros anfipáticos como anhídrido maleico de estireno (SMA), que se ha utilizado con éxito para la determinación de proteínas de membrana las estructuras41,42.

Estos enfoques descritos en este manuscrito han demostrado para ser fácilmente adaptable en nuestro laboratorio para una variedad de otras proteínas de membrana mamíferos más allá de canales iónicos. Por lo tanto, creemos que este Protocolo será una herramienta valiosa en los análisis estructurales y funcionales que sustentan el diseño de fármacos específicos de alta especificidad. Esto será especialmente útil en enfermedades neurodegenerativas, enfermedades cardiovasculares y cáncer, en que ion canales son objetivos difíciles pero alto potencial droga.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Zhao G. y X. Meng por el apoyo con la recopilación de datos en David Van Andel avanzado Cryo-Electrón microscopia Suite. Agradecemos el equipo VARI High-Performance Computing para soporte computacional. Damos nuestro agradecimiento a Floramo de J. Clemente, cuotas de D., N. Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth y Z. Ruan por comentarios que mejoraron grandemente este manuscrito. Agradecemos a D. Nadziejka de apoyo editorial para este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por VARI interna financiación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEG BacMam vector (pFastBacI) addgene 31488
DH10α cells Life Technologies 10361-012
S.O.C. media Corning 46003CR for transformation of DH10α cells for Bacmid
Bacmam culture plates Teknova L5919 for culture of transformed DH10α cells
Incubation shaker for bacterial cells Infors HT Multitron standard
Incubated orbital shaker for insect cells Thermo-Fisher SHKE8000
Reach-in CO2 incubator for mammalian cells Thermo-Fisher 3951
Table-top orbital shaker Thermo-Fisher SHKE416HP used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells
Incubator VWR 1535 for bacterial plates
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 for plasmid extraction and purification
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol Invitrogen 15593031 for DNA extraction
Sf9 cells Life Technologies 12659017 insect cells for producing virus
Sf-900 media Gibco 12658-027 insect cell media
FBS Atlanta Biologicals S11550
Cellfectin II Gibco 10362100 for transfecting insect cells
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 for transfecting mamalian cells
0.2 mm syringe filter VWR 28145-501 for filtering P1 virus
0.2 mm filter flasks 500ml resevoir Corning 430758 for filtering P2 virus
erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) Gene Mate F-5909-2000 for culturing insect cells
erlenmeyer culture flask (baffled 2L) Gene Mate F-5909-2000B for culturing mammalian cells
nanodrop 2000 spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000 for determining DNA and protein concentrations
HEK293 ATCC CRL-3022 mammalian cells for producing protein
Freestyle 293 expression Medium Gibco 1238-018 mammalian cell media for protein expression
Butyric Acid Sodium Salt Acros 263195000 to amplify protein expression
PMSF Acros 215740500 protease inhibitor
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-100MG protease inhibitor
Leupeptin hydrochloride Sigma-Aldrich 24125-16-4 protease inhibitor
pepstatin A Fisher Scientific BP2671-250 protease inhibitor
digitonin EMD Millipore 300410 detergent - to solubilize protein from membrane
imidazole Sigma 792527 to elute protein from resin column
TALON resin Clonetech 635504 for affinity purification by His-tag
superose6 incease columns GE 29091596; 29091597 for HPLC and FPLC
Prominence Modular HPLC System Shimadzu See Below
Controller Module " CBM20A
Solvent Delivery System " LC30AD
Fluorescence Detector " RF20AXS
Autosampler with Cooling " SIL20ACHT
Pure FPLC System with Fractionator Akta
thrombin (alpha) Haematologic Technologies Incorporated HCT-0020 Human alpha for cleaving GFP tag
Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube Millipore UFC910008 for concentrating protein
EDTA Fisher E478500 for stabilizing protein
400 mesh carbon-coated copper grids Ted Pella Inc. 01754-F grids for negative stain
Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) Electron Microscopy Sciences Q3100AR1.3 grids for Cryo-EM
Vitrobot Mark III FEI for preparing sample grids by liquid ethane freezing
liquid nitrogen Dura-Cyl UN1977
ethane gas Airgas UN1035
Solarus Plasma System Gatan Model 950 for cleaning grids before sample freezing
Tecnai Spirit electron microscope FEI for negative stain EM imaging
Talos Arctica electron microsocope FEI for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids
Titan Krios electron microscope FEI for high-resolution Cryo-EM imaging
Software
Gautomatch software http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ to pick particles from micrographs
Relion 2.1 software https://github.com/3dem/relion to construct 2D and 3D classification
CryoSPARC software https://cryosparc.com/ to generate an initial structure model
Frealign software http://grigoriefflab.janelia.org/frealign to refine particles
Coot software https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ to build a model
MolProbity software http://molprobity.biochem.duke.edu/ to evaluate the geometries of the atomic model
SerialEM software http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ for automated serial image stack acquisition
MortionCor2 software http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html for motion correction of summed movie stacks
GCTF software https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ for measuring defocus values in movie stacks
Phenix.real_space_refine software https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html for real space refinement of the initial 3D model

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References

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Expresión y purificación de los humanos sensibles a lípido catiónico canal TRPC3 para la determinación estructural por microscopia del Cryo-electrón de solo-partícula
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Haley, E., Choi, W., Fan, C., Sun, W., Du, J., Lü, W. Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e58754, doi:10.3791/58754 (2019).

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