Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Uttryck och rening av den mänskliga Lipid-känsliga ering kanal TRPC3 för strukturella bestämning genom Single-particle kryo-elektronmikroskopi

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58754
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 1, 1
1Van Andel Institute, 2Vollum Institute, 3Janelia Research Campus
* These authors contributed equally

Summary

Det här protokollet beskriver tekniker som används för att bestämma ion kanal strukturer av cryo-elektronmikroskopi, inklusive en baculoviridae-systemet som används för att effektivt uttrycka gener i däggdjursceller med minimal ansträngning och toxicitet, protein utvinning, rening, och kvalitet kontroll, grid provberedning och screening, samt insamling och bearbetning.

Abstract

Transient receptor potential kanaler (TRPCs) av kanoniska TRP underfamiljen är icke-selektiva ering kanaler som spelar en viktig roll i kalciumhomeostas, särskilt store manövrerade kalcium inträde, som är avgörande för att upprätthålla korrekt funktion av synaptiskt vesikelprotein release och intracellulära signalsystem. Följaktligen har TRPC kanaler varit inblandade i en rad mänskliga sjukdomar inklusive hjärt-och kärlsjukdomar såsom hjärthypertrofi, neurodegenerativa sjukdomar som Parkinsons sjukdom och neurologiska problem såsom Spinocerebellär ataxi. TRPC kanaler representerar därför en potentiell farmakologisk mål i mänskliga sjukdomar. Molekylära mekanismer för gating i dessa kanaler är dock fortfarande oklart. Svårigheten att få stora mängder stabila, homogen och renat protein har varit en begränsande faktor i struktur bestämning studier, särskilt för däggdjur membranproteiner såsom de TRPC jonkanalerna. Här presenterar vi ett protokoll av storskaliga uttryck för däggdjur ion kanal membranproteiner med en modifierad baculoviridae gen överföringssystem och rening av dessa proteiner genom samhörighet och storlek-utslagning kromatografi. Vi presenterar ytterligare ett protokoll att samla singel-particle kryo-elektron mikroskopi bilder från renat protein och att använda dessa bilder för att avgöra proteinstrukturen. Strukturbestämning är en kraftfull metod för att förstå mekanismer gating och funktion i jonkanaler.

Introduction

Kalcium är involverad i den cellulära processer inklusive signalering kaskader, transkription kontroll, neurotransmitterfrigöraren och hormon molekyl syntes1,2,3. Homeostatiska underhållet av cytosoliska fritt kalcium är avgörande för hälsa och funktion av celler. En av de stora mekanismerna av intracellulära kalcium homeostasen är store manövrerade kalcium inträde (SOCE), en process där utarmning av kalcium lagras i endoplasmatiska nätverket (ER) avtryckarna öppnandet av jonkanaler på plasmamembranet att underlätta den påfyllning av ER kalcium, som sedan kan användas i vidare signalering4,5,6. Transient receptor potential kanaler (TRPCs), som är kalcium-permeable kanaler tillhör överfamiljen TRP, har identifierats som en viktig deltagare i SOCE7,8,9 .

Bland de sju medlemmarna i familjen TRPC, TRPC3, TRPC6 och TRPC7 bildar en homologt undergrupp, och de är unika förmåga att aktiveras av den lipid sekundär budbärare diglyceridolja (DAG), en nedbrytningsprodukt av den signalering lipid fosfatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2)10,11. TRPC3 uttrycks mycket i glatt muskulatur och i cerebral och cerebellär regioner av hjärnan, där den spelar viktiga roller i Kalciumsignalering som påverkar neurotransmission och neurogenes12,13. Dysfunktion i TRPC3 har varit kopplade till störningar i centrala nervsystemet, hjärt-och kärlsjukdomar och vissa cancerformer såsom cystor adenocarcinom14,15,16. Därför håller TRPC3 löfte som farmaceutisk mål för behandling av dessa sjukdomar. Utvecklingen av riktade läkemedel verkar på TRPC3 har begränsats av en bristande förståelse av dess molekylära aktiveringen mekanismer, däribland lipid bindande platser17,18. Vi har rapporterat första Atom-upplösning struktur den mänskliga TRPC3 kanalen (hTRPC3) och dess två lipid bindningsställen i en sluten stat, som ger viktiga insikter i dessa mekanismer19.

Den viktigaste faktorn för att bestämma strukturen av ett membranprotein med hög upplösning är att få protein av hög kvalitet. Motsvarande screening av uttryck och rening villkor krävs för att uppnå hög kvalitet protein kan vara en tidskrävande och kostsamma strävan. Här presenterar vi ett protokoll som beskriver i detalj hur vi identifiera de optimala förutsättningarna för uttryck och rening av hTRPC3, som uppförde sig dåligt i våra inledande screening. Vi presenterar flera viktiga punkter på hur du felsöker och optimera protein beteendet, som lägger en solid grund för våra cryo-elektron mikroskopi (cryo-EM) studier. Vi använder en modifierad baculoviral genererar vektor (pEG), utvecklat av Gouaux och kollegor, som är optimerad för screening analyser och effektiv generering av baculoviridae i däggdjursceller20. Detta uttryck metod är lämplig för snabba och kostnadseffektiva överuttryck av proteiner i cellmembranet hos däggdjur. Vi kombinerar användandet av denna vektor med en fluorescens-detection storlek-utslagning kromatografi-baserade (FSEC) prescreening metod21. Denna metod använder ett grönt fluorescerande protein (GFP) tag smält till konstruktionen av intresse och förbättrar visualiseringen av målproteinet i små, hela-cell solubilized prover. Detta gör för screening av protein stabilitet i närvaro av olika tvättmedel och tillsatser, med thermostabilizing mutationer, och tillåter användning av ett litet antal celler från småskaliga övergående transfection. På detta sätt kan en mängd villkor snabbt säkerhetskontrolleras innan du flyttar till en storskalig protein rening. Följande uttryck, screening och rening presenterar vi ett protokoll för att erhålla och bildbearbetning från cryo-EM att generera de novo strukturella fastställande av proteinet. Vi anser att de metoder som beskrivs här kommer att fungera som ett generaliserbart protokoll för strukturella studier av TRP kanal receptorer och andra membranproteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. omvandling av DH10α behöriga celler att producera Bacmid DNA

  1. Syntetisera genen av intresse och subclone det i en modifierad version av pEG vektor innehållande en twin strep-tagg, His8-tag och GFP med en trombin klyvning webbplats vid N terminus (pFastBacI)20.
  2. Omvandla behöriga celler genom att lägga till 5 ng av plasmiden som innehåller en önskad gen i pFastBacI till 50 μL av DH10α celler i en 1,5 mL tub och inkubera i 10 min på is. Värme chock cellerna för 45 s vid 42 ° C. Tillsätt 200 μl av super optimal buljongen med katabol repressor (SOC) medium till röret och inkubera i 4-8 h vid 37 ° C i orbitalskak vid 225 rpm.
  3. Tallrik 5 μL av celler på en bacmid LB agar tallrik (50 μg/mL kanamycin, 7 μg/mL gentamicin, 10 μg/mL tetracyklin, 100 μg/mL Bluo-gal och 40 μg/mL isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside [IPTG], agar).
  4. Inkubera plattan för 48 timmar vid 37 ° C.
    Obs: Bluo-gal indikator fläckar kolonierna som fortfarande uttrycker Lindholm (vector införande misslyckade), vilket möjliggör urval av vita (framgångsrikt transformerat) kolonier.
  5. Noga välja en isolerad vita kolonin, undvika eventuella vita kolonier som är i kontakt med blå kolonier och odla cellerna övernattning i 6 mL bacmid LB medium (50 μg/mL kanamycin, 7 μg/mL gentamicin, 10 μg/mL tetracyklin) vid 37 ° C i orbitalskak vid 225 rpm.

2. bakteriell förberedelse för isolering av Bacmid DNA

  1. För att isolera bacmid DNA, snurra ner Escherichia coli celler i 10 min på 2880 x g.
  2. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 200 µL av cell resuspension lösning från miniprep kit (se Tabell för material) av pipettering. Var noga med pelleten är fullt och likartad upphängd. Över sedan cellsuspensionen i 1,5 mL rör.
  3. Tillsätt 200 µL av cell lysis lösningen från miniprep kit och mix genom att invertera röret några gånger. Inkubera i upp till 5 min i rumstemperatur (RT) att lysera celler. Tillsätt 200 µL av neutralisering lösning från miniprep kit och blanda genom att vända rör några gånger att stoppa lysis reaktionen.
  4. Snurra ner i 10 min vid 21,130 x g i en bordsskiva centrifug. Samla 600 μL av supernatanten i en 2 mL tub. Lägga till 600 μL fenol: kloroform: isoamylacetat alkohollösning (se Tabell av material) och blanda noga för att extrahera DNA från resten av cellen lysis produkterna.
    FÖRSIKTIGHET: Fenol: kloroform: isoamylacetat alkohollösning är giftigt vid inandning, hudkontakt, och förtäring. Det kan orsaka kemiska brännskador och kan vara cancerframkallande. Använd skyddshandskar och en knäppt labbrock. Arbeta i dragskåp. Avyttra detta farligt avfall på rätt sätt.
  5. Snurra röret för 10 min vid 21130 x g i en bordsskiva centrifug. Två separata flytande faser kommer att synas. Noggrant överföra 300 μL av övre vattenfasen till en ny tub. Lägga till 600 μL av 100% etanol att tvätta DNA. Vänd försiktigt i slangen för att blanda.
    Obs: Använd inte vortex, eftersom detta kan skeva bacmid DNA.
  6. Cool rören genom att placera dem i frys-20 ° C i 10 min. snurra ner i 10 min vid 21,130 x g i en bordsskiva centrifug. Avlägsna supernatanten och bevarar den DNA pelleten.
  7. Tillsätt 1 mL 70% etanol att tvätta pelleten. Vänd försiktigt i slangen för att blanda. Snurra för 10 min vid 21,130 x g i en bordsskiva centrifug. Avlägsna supernatanten och låt pelleten till luft torka i ca 5 min eller tills ingen vätska syns i röret och DNA pelleten blir genomskinlig.
  8. Återsuspendera torr pelleten i 50 µL sterilt, DNAS-fri, avjoniserat vatten. Mätning av DNA-koncentrationen.
    Obs: Får ej frysas bacmid DNA. Förvaras vid 4 ° C i upp till flera dagar.

3. transfection Sf9 insekt celler med Bacmid att producera P1 baculoviridae

  1. Utsäde 0,9 x 106 Sf9 celler per brunn i 2 mL lämpligt medium (se Tabell för material) i varje brunn 6-väl vävnadsodling platta. Inkubera cellerna vid 27 ° C i 20 min att främja fastsättning till plattan.
    Varning: Cellkulturer är en potentiell biohazard. Arbeta i en godkänd LAF med aseptisk teknik och kontrollera institutionella och statliga riktlinjer för rekommenderade skyddskläder och korrekt kassering av avfall före utför experiment.
  2. Efter fastsättning, tillsätt 8 µL transfection reagens (se Tabell för material) till 100 µL av media för varje brunn av 6 väl platta som transfekterade i ett sterilt rör. Lägga till 6 μg av bacmid DNA i 100 µL av medium i ett separat sterilt rör. Inkubera i 5 min på RT. kombinera två lösningar och inkubera i 45 min på RT.
  3. Ersätta mediet i 6 brunnarna med 2 mL färsk medium. Tillsätt blandningen från föregående steg för varje väl droppvis (200 µL per brunn). Skaka försiktigt på plattan för att säkerställa blandning av transfection lösningen till medium.
    Obs: Snurra eller skaka plattan eftersom detta kommer att orsaka cellerna att lossa inte.
  4. Inkubera cellerna för 5 d (120 h) i en 27 ° C befuktade inkubator. Kontrollera GFP fluorescens före skörd för att verifiera att virus produceras i en stor procentandel av celler; om andelen är låg, förlänga inkubationstiden som behövs (se figur 1 c).
  5. Samla in supernatanten innehållande P1 viruset (ca 2 mL från varje brunn). Filtrera det medium som innehåller P1 virus i 2 mL rör med hjälp av en 3 mL spruta och små 0,2 µm filter. Lägg till sterila fetalt bovint serum (FBS) till en slutlig koncentration av 1%.
    Obs: Detta bestånd av P1 virus ska förvaras vid 4 ° C och skyddas från ljus.

4. infektion av Sf9 insekt celler med P1 baculoviridae att producera P2 baculoviridae

  1. Förbereda 200 mL (eller önskad volym) Sf9 celler vid en koncentration på 0,8 - 0,9 x 106 celler/mL i lämpligt medium (se Tabell för material) i en platt botten Erlenmeyerkolv kultur av tillräcklig storlek.
    Obs: För suspension kultur, volymen används bör inte överstiga 40% av den totala kapaciteten av kolven.
  2. Lägg till 1: 2500 förhållande (v/v) på P1 virus lager från 3,5 till Sf9 cellkulturen suspension. Inkubera under tiden för optimal virus uttryck (oftast 48-120 h beroende på den protein bygga) vid 27 ° C i orbitalskak vid 115 rpm.
    Anmärkning: Uttrycket relativ virus kan bestämmas genom att Visa GFP fluorescensen av viruset i ett prov av kulturen.
  3. Centrifugera cellsuspensionen för 40 min vid 11,520 x g och samla supernatanten innehållande P2 viruset. Filtrera supernatanten med disponibla 0,2 µm filter. Lägg till FBS till en slutlig koncentration av 0,5%.
    Obs: Detta bestånd av P2 virus ska förvaras vid 4 ° C och skyddas från ljus.
  4. Skaffa en titer för P2 viruset med hjälp av Sf9easy celler eller en virus-räknare.

5. infektion av HEK293 däggdjursceller med P2 baculoviridae för storskaliga proteinuttryck

  1. Förbereda en önskvärd volym av HEK293 däggdjursceller suspension kultur (4-6 L rekommenderas för beredning av frusna galler) vid en koncentration på 3.5-3.8 x 106 celler/mL i uttrycket mediet (se Tabell för material) kompletteras med 1% (v / v) sterila FBS i förbryllad-botten Erlenmeyerkolven kultur kolvar av tillräcklig storlek.
    Obs: För suspension kultur, volymen används bör inte överstiga 40% av den totala volymen av kolven.
  2. Lägg till 8% (v/v) av P2 virus stamlösning från steg 4,3 till HEK293 cellkulturen suspension. Inkubera vid 37 ° C i orbitalskak vid 135 rpm.
  3. Lägga till 10 mM natrium butyrate på 12-18 h efter infektion. Inkubera under tiden för optimal proteinuttryck (oftast 36-72 h) vid 30 ° C.
  4. Skörda celler genom centrifugering för 20 min vid 2 880 x g. Tvätta cellerna av omblandning i cirka 100 mL tris-buffrad koksaltlösning (TBS) per liter celler skördas. Centrifugera igen i 20 min vid 2 880 x g och samla cellpelleten.
    Obs: Protokollet kan pausas här. Cell pellets kan snapin-frysta i flytande kväve och lagras vid-80 ° C tills rening.
    FÖRSIKTIGHET: Flytande kväve kan orsaka kryogen brännskador eller skada. Det kan orsaka köldskador. Det kan förskjuta syre och orsaka snabb kvävning. Använd kallt Isolerande handskar och ansiktsskydd.
  5. Samla små 1 mL skördar vid varierande tidpunkter och solubilize för 2 h vid 4 ° C med gunga eller omrörning i närvaro av olika rengöringsmedel och/eller tillsatser. Dessa små hela-cell solubilized prover kan klarläggas genom ultracentrifugering på 235 000 × g under 10 minuter vid 4 ° C och kör som ett 30 μL prov på en storlek-utslagning kromatografi (SEC) kolumn (se Tabell för material) för att bestämma den bästa tiden för uttryck och bästa lösbarhet villkoren.
    Obs: När det gäller hTRPC3, screening ingår olika buffertar med pH-värden från 4.0-9,5 och salt koncentrationerna på 50-500 mM. olika Joniska sammansättning (t.ex. MgCl2 eller NaCl); olika rengöringsmedel med kritiska micelle koncentration (CMC) värden på 0,1 - 20 mM. att minska tillsatser såsom Ditiotreitol, tris(2-carboxyethyl) fosfin och β-merkaptoetanol; och den kalcium-kelat additiv etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA).

6. rening av hTRPC3 Protein från cellpelleten fryst

  1. Tina pelleten i buffert innehållande 20 mM Tris (pH 8,0), 500 mM NaCl, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF), 0,8 μM aprotinin, 2 μg/mL leupeptin, 2 mM pepstatin A, och 1% digitonin, med 100 mL buffert per liter celler skördas. När tinas, säkerställa homogenitet av lösningen genom pipettering eller omrörning. Låt solubilize för 2 h vid 4 ° C i en bägare som nedsänkt i isen med en uppståndelse bar roterande.
  2. Ta bort cellfragment genom ultracentrifugering på 235 000 × g för 1 h vid 4 ° C. Kontrollera protein kvantitet genom att köra ett 30 μL prov på en SEC kolumn (se Tabell för material) av högtrycksvätskekromatografi (HPLC) och visualisera målproteinet av GFP signalutgång.
  3. Inkubera solubilized proteinet (supernatanten) med kobolt affinitet harts för 1-2 h vid 4 ° C. Verifiera proteinbindning till harts genom att köra ett 30 μL prov på en SEC kolumn.
    Obs: Om proteinbindning har inträffat, målet för GFP-märkta proteinet kommer att behållas på kolumnen inte finns i genomflöde. Därför kommer ingen GFP signal närvara vid position motsvarande mål protein storlek när genomströmmande körs på HPLC.
  4. Tvätta kådan med 10 kolumn volymer av buffert (20 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 15 mM Imidazol och 0,1% digitonin). Kontrollera om protein förlust genom att köra ett 30 μL prov på en SEC kolumn.
    Obs: Om protein förlust från kolumnen har inträffat, kommer målet för GFP-märkta protein hittas i tvättbuffert som har passerat över kolumnen. Därför kommer god Jordbrukarsed signalen att närvara vid position motsvarande mål protein storlek när tvättbuffert körs på HPLC. Om protein förlust har inträffat, kan Imidazol koncentrationen av tvättbuffert behöva sänkas för att förhindra att störa hans tag bindning till kolumnen affinitet.
  5. Eluera de hartsa-begränsar hTRPC3 med buffert (20 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol och 0,1% digitonin). Lägg till trombin på en 1:20 molar förhållandet (för att klyva taggen GFP) och tillsätt 10 mM EDTA (en hTRPC3 stabiliserande agent) eluerade och Inkubera under 3 h vid 4 ° C. Kontrollera att protein har varit eluerat genom kör 90 μl av ett prov spätt 1: 100 på en SEC kolumn och verifiera förekomsten av en god Jordbrukarsed signal vid position motsvarande mål protein storlek.
    Obs: vid denna punkt, tryptofan signalen från totalprotein i elueringen kan också ses. Endast affinitet-renat målproteinet förblir i elueringen och den god Jordbrukarsed och tryptofan signaler kommer att vara nära identiska i profil. Om målproteinet syns inte i stora mängder i elueringen men var inte förlorat i genomflöde eller tvätta, proteinet har sannolikt varit bundna till kolumnen och kan vara elueras med en högre koncentration av Imidazol i bufferten.
  6. Koncentrera sig eluatet till 500 μL eller mindre i en 15 mL 100K centrifugal filter tube (se Tabell för material) av spinning på 2 880 x g vid 4 ° C i 5 minuters steg. Återsuspendera proteinet genom pipettering lösningen upp och ner mellan spins att undvika overconcentrating.
    Obs: Centrifugera tid kan förkortas när volymen närmar sig den önskade slutliga volymen.
  7. Ladda koncentratet på en SEC kolumnen i buffert (20 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA och 0,1% digitonin). Kör.
  8. Kombinera peak fraktioner som innehåller den intakt TRPC3 tetramer, som visualiseras genom UV absorbansen signal, och koncentrera sig igen till en slutlig koncentration på minst 5 mg/mL.

7. screening av Protein med negativ-fläcken elektronmikroskopi

  1. Slå på glöd-ansvarsfrihet maskinen. Ställa in programmet för att fullgöra ett kol-belagd rutnät med argon och syre för 30 s. kör programmet att göra kol-beläggningen på koppar 400-mesh nät hydrofil före tillsats av protein lösningen.
  2. Ställa in fem 40 μl droppar sterilt vatten och två 40 μl droppar 1% uranyl formate lösning (på lab film, vax papper, eller en liknande yta, se Tabell för material). Ta rutnätet från steg 7,1 och lägga till 2,5 μl av protein prov 5 mg/mL (50-200 μM) på den mörka sidan och låt det sitta i 1 min.
  3. Efter 1 min, torka rutnätet med filterpapper. Vid inte pappersfiltret direkt till rutnätet ytan; i stället papperet till kanten av flytande droplet-programmet och låt kapillärkraft att dra vätska från rutnätet i pappersfiltret.
  4. Doppa i rutnätet i första droppe vatten. Torkas med filterpapper och upprepa med de återstående dropparna vatten och den första droppen uranyl formate. Tillåta andra släpp av uranyl formate sit för 1 min och sedan torkas med filterpapper. Låt nätet till fullt lufttorka (ca 1 min) innan lagring.
    Obs: Detta färgning protokoll kan inte vara perfekt för alla kombinationer av protein-tvättmedel. Olika koncentrationer av uranyl formate fläcken och olika lång tid för fläcken exponering bör testas om stegen ovan inte lämnar en fläck med bra kontrast.
  5. Bild gallren på ett elektronmikroskop (se Tabell för material) för att kontrollera protein partikel kvaliteten. Se till att micrographs visar många partiklar som är homogen i allmänna utseende och distribution, Visa god kontrast och matcha förväntade storleken på målproteinet.
  6. Generera preliminära, lågupplöst, tvådimensionell (2D) klassificeringar använder 50-100 micrographs (se databehandling – steg 10) att kontrollera att partiklarna representerar olika vyer av en enda enhetlig struktur.
    Obs: Micrographs och preliminära 2D klasser av tillräckligt god kvalitet, som beskrivs ovan, är en stark indikator på att protokollet tillräckligt har optimerats för protein rening. Förberedelse och screening av cryo-EM stödraster är befogad på denna punkt.

8. EM provberedning

  1. Glöd-ansvarsfrihet ett guld holey kol rutnät (se Tabell för material) som beskrivs i steg 7,1.
  2. Tillämpa 2,5 μl provets koncentrerad hTRPC3 protein (5 mg/mL) på rutnätet. Blot rutnätet för 1,5 s med en blotta kraft 1 och en väntetid på 5 s vid 100% luftfuktighet och 4 ° C, då störta rutnätet i flytande etan kyls av flytande kväve med hjälp av en förglasning maskin.
    Obs: Fuktighet, temperatur, blot-force, blot tid och väntetiden som anges här användes för författarnas hTRPC3 studie19. De kan behöva ändras för att producera optimala glaskroppen is för andra proteiner och rengöringsmedel.
  3. Skärmen fryst galler för optimala isförhållanden med kryo-EM Mikroskop (se Tabell av material) och manuellt Visa regioner av tjock is (rutor som visas mindre och mörkare), thin ice (rutor som visas större och ljusare) och medium is .
    Obs: Tjockare is rymmer ofta mer partiklar, medan tunnare is ger ofta bättre kontrast och upplösning. Använda manuell screening av bilder för att avgöra vilket is villkorar resultat i ett stort antal monodispersed partiklar med bra kontrast och upplösning. När goda förhållanden är verifierat, flytta till bildsamling på 300 kV cryo-EM Mikroskop.

9. EM datainsamling

  1. Med en automatiserad förvärv program, registrera bildstaplar i super-upplösning räkna läge med en binned pixelstorlek 1,074 Å på ett elektronmikroskop drivs 300 kV med 130.000 X nominell förstoring direkt elektron detektor.
  2. Dos-fractionate varje bild till 40 bilder med en total exponering på 8 s med 0,2 s per ram och en dos på 6,76 e− Å−2 s−1 (nominell defocus värden varierade från 1,0 till 2,5 μm i författarnas experiment).

10. EM databehandling

  1. Genomföra rörelse korrigering av sammanfattade film stackar22 och uppskatta defocus värden23 med hjälp av databehandling programvara (se Tabell för material)24.
  2. Plocka partiklar från micrographs. Använd dessa plockade partiklar för att konstruera en första referens-gratis 2D klassificering med hjälp av den programvara24. Välj perfekt 2D klass i genomsnitt för att använda som mallar för automatiserad partikel plockning för hela datauppsättningen.
  3. Kontrollera kvaliteten på auto-plockade partiklarna och ta bort dåliga partiklar manuellt. Använda flera rundor av 2D klassificering för att städa upp plockade partiklar.
  4. Generera en inledande modell25. Angående 2D plockade partiklar till tredimensionella (3D) klassificering (cirka 5 klasser) med C1 symmetri och en inledande återuppbyggnad lågpassfilter 60 Å som en förebild. Avgöra vilka klasser har högupplösta funktioner och kombinera partiklar inom sådan klass.
  5. Ytterligare förfina partiklar med hjälp av lokala förfining med C4 symmetri (vid hTRPC3) tillämpas och en högupplöst gräns för partikel anpassning till 4.5 Å26.

11. modellbygge

  1. Bygga en modell (se Tabell av material för den programvara som används). För hTRPC3, använda domänen transmembrana (TMD) av den övergående receptor potentiella melastatin 4 (TRPM4) struktur protein data bank (PDB) 5wp6 som en guide27. Använd skrymmande rester och sekundärt strukturera förutsägelse för att vägleda de novo byggnad.
  2. Angående den första modellen att verkliga rymden förfining med sekundärt strukturera begränsningar28. Manuellt granska den raffinerade modellen och remodify som behövs (se Tabell av material för den programvara som används).
  3. Tillämpa Fourier shell korrelation (FSC) kurvor för att beräkna skillnaden mellan den slutliga modellen och EM karta för validering av förfinad struktur. Utvärdera geometrier Atom modeller (se Tabell av material för den programvara som används)29,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En schematisk översikt av protokollet för uttryck och rening av hTRPC3 visas i figur 1A. En bild av hTRPC3 bacmid plattan med perfekt vita kolonier, liknande den som valts för bacmid DNA rening, visas i figur 1B. Vi hittade det 48 h är idealisk för tydliga Bluo-gal färgning bibehållen förekomsten av isolerade kolonier. Maximal produktion av P2 virus för hTRPC3, som visualiseras genom GFP fluorescens, sågs efter 4 d av infektion i Sf9 insekt celler (figur 1 c).

P2 baulovirus skördades från media, kompletteras med 1% FBS, och används för att infektera en suspension av HEK293 däggdjursceller. Natrium butyrate lades till den infekterade celler 12-18 h efter viruset att öka protein uttryck20. Cellerna var sedan inkuberas för en ytterligare 36 h vid 30 ° C. Cellerna var skördas och utsattes för löslighet och stabilitet screening av FSEC (figur 2A)21. Cellerna var solubilized med sju olika rengöringsmedel med CMC värden 0,01 - 20 mM på en tvättmedel koncentration cirka 10 gånger värdet CMC. Efter hela-cell lösbarhet, cell lysis skräp togs bort av ultracentrifugering och supernatanten innehållande solubilized protein lastades på en SEC kolumn och köra på HPLC i n-dodecyl-β-D-maltopyranoside/cholesteryl hemisuccinate (DDM/CHS) tvättmedel-innehållande buffert att jämföra absoluta löslighet och volym topplacering på hTRPC3 under olika förhållanden i förhållande till en TRPM4 kontroll (figur 2B). Vi valde att använda DDM/CHS som första kör bufferten för de prover som solubilized i olika tvättmedel eftersom DDM/CHS är de vanligaste rengöringsmedelskomponenterna när lösa strukturerna av membranproteiner. Alla olika tvättmedel-solubilized TRPC3 prover visade topp positioner på ca 11,9 mL, vilket sannolikt är alltför stor, eftersom tetrameriskt form av hTRPC3 har en mindre molekylvikt än positiva styra mänskliga TRPM4 (figur 2A och Figur 2B).

Ändå, eftersom det fanns ingen struktur av någon TRPC kanal receptorn att jämföra våra resultat att och stor molekylvikt kan orsakas av arkitekturen av TRPC3 eller andra faktorer, genomförde vi en småskalig rening av hTRPC3 med 25 mL cellerna använder DDM/CHS hela experimentet som DDM/CHS gav hTRPC3 bästa löslighet. HTRPC3 SEC profil visade en monodisperse topp men var fortfarande i en topplacering som representerar en högre molekylvikt än TRPM4 (inga data anges). Vi kollade proteinet i peak fraktionen av SEC profil genom negativ-fläcken EM, eftersom det är en snabb metod för att kontrollera proteinkvalitet och kräver en mycket liten mängd protein. I Mikrograf observerades partiklar med två transmembrana domänerna i samma partikeln. Det visade sig att två hTRPC3 partiklar dimerized i ett head-to-head sätt genom samspelet mellan två cytosoliska domäner (figur 3D). Vi ingår sedan den reducerande reagens Ditiotreitol (DTT) i rening bufferten för andra småskaliga rening, hoppas att störa dimerization av hTRPC3. Faktiskt visades en andra topp med lägre molekylvikt av SEC fraktionering. Men partiklarna verkade alltför små för att vara en intakt tetramer och visade inga funktioner av membranproteiner såsom en transmembrana domän. Det visade sig att DDM/CHS inte var ett lämpligt rengöringsmedel för rening av hTRPC3, trots att ge den bästa lösligheten för hTRPC3.

Nästa, vi försökte en mildare rengöringsmedel, digitonin, att solubilize hTRPC3, och jämfört den med proteinet solubilized i DDM/CHS. Här använde vi två olika rinnande buffertar som innehåller DDM/CHS och digitonin, respektive. Detta var viktigt eftersom det tvättmedel i rinnande bufferten bidrar ofta till protein stabilitet och att proteinet membran kan bli instabila när du ändrar tvätt från lösbarhet till FSEC. Proteinet kör i buffert innehållande digitonin visade en lovande peak förskjutning mot lägre molekylvikt när solubilized i antingen DDM/CHS eller digitonin. Proteinet solubilized av och köra i digitonin gav den högsta toppen i en rimlig ståndpunkt i förhållande till positionen för den positiva kontrollen, mänskliga TRPM4 (figur 3A). Sen flyttade vi fram genom att utföra en småskalig rening med 25 mL av celler. Även om flera breda toppar observerades av SEC (figur 3B), proteinet visade funktioner i en enda tetrameriskt hTRPC3 kanal i 2D klassificering av negativ-fläcken EM (figur 3 c och figur 3D). Vi dra slutsatsen att digitonin är en perfekt rengöringsmedel för rening av hTRPC3.

Vi skalas upp uttrycket av hTRPC3 och utfört en medelstora rening med 400 mL av celler i digitonin. Därigenom hoppades vi få tillräckligt med protein för några frusna galler utan slöseri medium och rengöringsmedel innan vi listat ut de sista villkoren för rening av hTRPC3 i stor skala. Det händer ofta att membranproteiner visar instabilitet när högkoncentrerad för beredning av frusna galler. Det rena och koncentrerat proteinet inte bara förskjutits mot en högre molekylvikt av FSEC, men visade också bullriga bakgrund i cryo-EM rutnät avbildas med ett elektronmikroskop utrustade med en elektrisk kamera. Även om vi kunde iaktta enda, intakt tetrameriskt receptorer, hTRPC3 renas i digitonin var inte idealisk för högupplösta cryo-EM studier.

För att ytterligare förbättra protein stabilitet har vi ett stort antal villkor beskrivs i protokollet steg 5. Vi valde att skärmen tillsatser utifrån fysiologiska karaktär av hTRPC3; t.ex., EDTA valdes eftersom hTRPC3 är genomsläppliga för kalcium och ta bort kalcium kan stabilisera proteinet. Av alla prover testas av FSEC som kör i digitonin-innehållande bufferten, 10 mM EDTA visade en anmärkningsvärd effekt på att stabilisera hTRPC3 i en intakt tetrameriskt peak position (figur 4A). Det ökade antalet partiklar i den cryo-EM Mikrograf också avsevärt och minskat buller i bakgrunden, som visas i figur 5.

Efter att ha identifierat de idealiska förhållandena för uttryck och rening, utfört vi en storskalig uttryck (2 L) för hTRPC3. De celler som innehåller hTRPC3 var skördas och sedan solubilized. Ultracentrifugen-klargj橬一j lysate utsattes för metall-affinitet kolumn rening genom batch-bindning med en kobolt harts följt av rening i en gravitation kolumn. Bibehållande av solubilized protein i kolumnen samt eluering av affinitet-renat protein från kolumnen kontrollerades av FPLC (figur 4B). Vi fann att för hTRPC3, en Imidazol koncentration av 15 mM i tvättbuffert var tillräckliga för att undanröja kontaminerande proteiner med ospecifik harts bindande, och 250 mM Imidazol i eluering bufferten var tillräcklig för att eluera majoriteten av solubilized hTRPC3 protein bunden till hartsen. Alla prover var kontrolleras av FSEC, och proteinet eluerade visade en skarp, monodisperse topp vid rätt peak position. Som inneboende flexibilitet mellan taggen GFP och hTRPC3 protein kan göra anpassningen av protein partiklar under bildbehandling mer utmanande, och eftersom en trombin klyvning webbplats ligger mellan GFP och hTRPC3, vi testade en liten mängd renad protein på olika klyvning gånger använder trombin proteashämmare. Med tanke på att proteinet eluerade inkuberas med trombin vid en 1:20 molar förhållandet visade rimliga stabilitet och fullständig klyvning efter 2 h vid 4 ° C, vi klyvs bort av GFP från allt det rena protein med samma förutsättningar och kontrolleras av HPLC bekräfta att GFP har varit c ompletely bort (figur 4 c). Proteinet renades ytterligare av S och klyvning av GFP kan igen visualiseras av peak position övergången mot en mindre molekylvikt (figur 4 d). En liten koncentrerad prov från den huvudsakliga peak fraktionen användes göra galler för negativ-fläcken EM. Alla fraktioner som innehåller den tetrameriska hTRPC3 var sedan kombinerat och reconcentrated till en slutkoncentration på 5 mg/mL, som användes för att förbereda rutnät för cryo-EM avbildning. Som vi har observerat att en del av proteinet fortfarande gradvis förskjutits mot en större molekylvikt, vi samlas in bara fraktioner på den rätta molekylvikten och frös rutnäten omedelbart efter protein rening. Vi avslutad vanligtvis sekvens av experiment från rening av protein till förberedelse av frysta nät inom en enda dag.

Ett 2,5 μl prov av renat hTRPC3 protein (koncentration 5 mg/mL) tillämpades på ett glöd-urladdat holey kol rutnät. En förglasning maskin användes för att förbereda rutnätet med en 1,5 s blotting tid under 100% luftfuktighet följt av ett dopp i flytande etan kyls av flytande kväve. Detta steg fryser provet i glaskroppen is för avbildning. Bilder fångades på 130.000 X nominell förstoring av en cryo elektronmikroskop drivs 300 kV. Bildstaplar registrerades i super-upplösning räknar läge med en binned pixelstorlek 1,074 Å och en nominell defocus värde allt från 1,0 till 2,5 μm med direkta elektron detektor och automatiserad förvärv programvara. Varje bild var dos-fractionated till 40 bilder med en total exponering på 8 s (0,2 s per ram) och en dos på 6,76 e− Å−2 s−1. En representativ Mikrograf från denna datamängd visas i figur 5.

Rörelse korrigering och uppskattning av oskärpa värden av de summerade film stackarna utfördes. Cirka 200 resulterande micrographs användes som källa för manuell partikel plockning och inledande referens-gratis 2D klassificering31. Nio representativa 2D klass medelvärden från denna inledande klassificeringen var väljs och används som mallar för automatiserad partikel plockning för hela datauppsättningen. En manuell kontroll av autopicked partiklar utfördes för att ta bort uppenbarligen dåliga partiklar, sedan tre rundor av 2D klassificering har använts för att förfina urvalet av autopicked partiklar (figur 5). Dessa 2D-klass valda partiklar klassificerades i fem 3D klasser med hjälp av ett low-pass-filter 60 Å som en första referensmodell. Dessa fem klasser visas endast en högupplöst funktioner (figur 5). Partiklar från denna klass utsattes ytterligare för lokala förfining med en högupplöst gräns på 4.5 Å och C4 symmetri tillämpas (figur 5)32. Den raffinerade modellen manuellt undersöktes och remodified. Raffinerad struktur validerades genom beräkning av FSC kurvor att avgöra skillnaden mellan den slutliga modellen och EM karta och utvärdering av geometrier den atom modeller33.

Inledande modellera konstruktion utfördes med hjälp av domänen TMD TRPM4 struktur (PDB 5wp6) som en guide34. De novo byggnaden av modellera av hTRPC3 styrdes främst av skrymmande rester och sekundärt strukturera förutsägelse, med de många α-spiraler i strukturen kraftigt underlätta register tilldelning. I den inledande de novo-byggd modell, ordning, längd och position av sekundära strukturella egenskaper och skrymmande restprodukter är nära överens med prognos. Under förfining hölls resolutionen att en lägre gräns än upplösningen uppskattas för den slutliga återuppbyggnaden. Tredimensionella FSC användes för att mäta normaliserade cross-korrelationskoefficienten mellan två självständigt genererade 3D-kartor (varje med hälften av datauppsättningen) över motsvarande skal i Fourier utrymme (som en funktion av spatial frekvens). Vi anställt en mjuk mask av 4.3 Å från återuppbyggnaden och en ytterligare 4.3 Å cosinus soft edge tillsammans med ett lågpassfilter 10 Å, därefter används den gyllene standarden FSC 0,143 cutoff tröskel. Detta användes för slutlig resolution rapportering.

Figure 1
Figur 1: uttryck och rening av hTRPC3 filsystemet i BacMam. (A) Schematisk förfarandet för hTRPC3 uttryck och rening. (B) Bacmid koloni urval på blå-vit indikator tallrik. Välja en isolerad vit koloni (svart pil), inte en vit koloni med en inbäddad blå koloni eller en vit koloni i kontakt med en blå koloni (röda pilar). (C), GFP fluorescens av P2 baculoviridae i Sf9 celler under 20 X förstoring. Fluorescens bör vara ljusa och finns på cellmembranet eller insidan av flertalet celler för en potent virus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: stabilitet screening av hTRPC3 av FSEC. (A) rengöringsmedel screening av hTRPC3. HTRPC3 var hela-cell solubilized i en mängd tvättmedel med en kritisk micelle koncentration på 0,01 - 20 mM och kördes i DDM/CHS-innehållande buffert. Även DDM/CHS visar hTRPC3 högsta löslighet, peak visas på fel position, för stor för att vara den tetrameriska hTRPC3 (blå spår). (B) TRPM4 kontroll, med ett tetrameriskt molekylvikt på cirka 540 kDa, solubilized och köras i DDM/CHS, hade en elutionsvolymen ca 12,9 ml, medan TRPC3, med ett tetrameriskt molekylvikt av ungefärligt 400 kDa, solubilized och kör DDM/CHS, hade en elutionsvolymen ca 11,9 ml. Med en mindre molekylvikt förväntas hTRPC3 ha en något större än TRPM4, elutionsvolymen inte något mindre, vilket tyder på att DDM/CHS inte kanske en perfekt rengöringsmedel för hTRPC3 lösbarhet och rening. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: rengöringsmedel buffer screening av hTRPC3 av FSEC. (A) löslighet och stabilitet test av hTRPC3 med digitonin. Digitonin testades både för lösbarhet och kör buffert. Observera topp placeringen av hTRPC3 protein solubilized i digitonin förskjutits mot en större elutionsvolymen jämfört med proteinet solubilized i DDM/CHS (gula spår vs blå och röda spår). Endast kombinationen med digitonin i både lösbarhet och kör buffertar visar rätt storlek av hTRPC3 av FSEC (gula spår, asterisk). (B) liknar FSEC resultaten av hela-cell solubilized hTRPC3, hTRPC3 protein affinitet renas i digitonin (röda spår, 14 mL) förskjutits mot en större elutionsvolymen jämfört med protein affinitet renade i DDM/CHS (blå peak position «««spåra, 12 mL) mätt med SEC-fraktionering. (C) negativ-fläcken EM användes för att kontrollera kvaliteten på renat protein före cryo-EM datainsamling. En idealisk fläcken bör presentera partiklar (röda cirklar) negativt färgade (förekommer vita) och omgiven av en tvättmedel ring (förekommer svart). En representant, idealisk Mikrograf där dessa partiklar är riklig, monodispersed och för närvarande i flera riktningar visas. (D) kvalitetsdata från negativ-fläcken EM bör tillhandahålla 2D klasser med en tydlig och konsekvent allmänna arkitektur och bör omfatta flera riktningar av proteinet, med genomsnitt innehöll och centrerad inom maskeringen (svart cirkel). 2D klasser från negativ-fläcken EM micrographs av hTRPC3 solubilized i DDM/CHS närvarande partiklar som verkar vara en head-to-head dimerization hTRPC3 monomerer. Däremot framgår en grov (men tydlig och konsekvent) övergripande acorn-liknande tetrameriskt struktur i 2D klasser negativ-fläcken EM micrographs av hTRPC3 solubilized i digitonin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: rening av hTRPC3. (A) stabilitet test av hTRPC3 i närvaro av EDTA. hTRPC3 var solubilized i digitonin i närvaro (röda spår) eller saknas (blå trace) 10 mM EDTA. Den förra visade en enda och smalare topp vid tetramer protein position (röda spår, asterisk), vilket indikerar att EDTA stabiliserad hTRPC3 i dess tetrameriskt konformation. (B), GFP fluorescens signalerar FSEC för hTRPC3 solubilized i digitonin och kör i digitonin buffert. Tetramer toppen observeras i det solubilized materialet innan metall affinitet kolumn rening (blå spår, asterisk). Avsaknad av denna topp i det genomströmmande bråket anger en komplett bindning av hTRPC3 protein i kolumnen affinitet (röda spår). Efter eluering av Imidazol kontrollerades fraktioner i eluering toppen av FSEC (gröna spår). Alla de fraktioner som visar intakt tetramer topp samlades för ytterligare rening. (C) Test av GFP klyvning av hTRPC3 med hjälp av trombin. Koktiden testades med hjälp av en liten mängd protein vid 4 ° C och fullständighet av matsmältning var kontrolleras av FSEC. I varje trace, toppen till vänster motsvarar hTRPC3 tetramer peak (asterisk) och topp till höger är den gratis GFP-toppen. Eftersom längden på matsmältningen ökade, minskade förhållandet mellan tetrameriskt protein till gratis GFP, vilket indikerar att GFP var som klyvs från proteinet. 2 h matsmältningen visar en fullständig klyvning av GFP. (D) s profil hTRPC3 före eller efter trombin matsmältningen i digitonin som innehåller kör buffert med 10 mM EDTA lagt till. Som förväntat, är topplacering skiftat mot mindre elutionsvolymen efter trombin matsmältningen (röda spår). Den största toppen (asterisk) representerar den tetrameriska hTRPC3. Bråk mellan röda linjer samlades för cryo-EM experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Schematisk av cryo-EM datainsamling och bearbetning av hTRPC3. Insamling av 3 660 film travar av renat hTRPC3 skedde med ett elektronmikroskop med en direkt elektron detektor. Rörelse korrigering och manuellt val tillämpades resulterar i 3,580 micrographs. Partiklar var autopicked och utsätts för 2D klassificering. 2D klasser var ytterligare förfinats av 3D klassificering. Bara en av fem 3D klasser visas högupplösta funktioner. Denna klass valdes för 3D förfining och Frealign lokala förfining, resulterar i en struktur för hTRPC3 vid 3.3 Å upplösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Strukturella bestämning av proteiner av cryo-EM har revolutionerat området för strukturbiologi i de senaste åren, tack vare utvecklingen av nya kameror och algoritmer som signifikant påskyndar strukturbestämning av proteiner som inte lätt kristall, särskilt membranproteiner. Trots alla de senaste framstegen inom cryo-EM tekniken förblir beredningen av renade proteiner tillräcklig kvalitet och kvantitet för att underlätta högkvalitativa imaging ofta tidskrävande, kostsamma och utmanande. Förmågan att snabbt express och skärmen flera gen konstruerar under en mängd rening villkor, förbättrar som beskrivs i protokollet ovan, effektiviteten i denna process genom att tillåta snabb och kostnadseffektiv produktion av hög kvalitet renat protein för användning i cryo-EM studier.

Medan den metod som beskrivs här ger ett sätt att rena stora mängder däggdjur membranproteiner till lägre kostnad än genom direkt transfection och snabbare än av generation en stabilt transfekterade cellinje, den har många steg, som alla måste optimeras till ge en hög kvalitet protein avkastning. Inom de biokemiska tekniker som används för att producera och rena hTRPC3, finns det ett antal kritiska moment och kontrollpunkter. Den första kritiska kontrollpunkten är produktionen av bacmid DNA. Som beskrivs i resultatet, är idealisk kolonin markeringen det första steget i generation av kvalitet virus för proteinuttryck. Dessutom, om koncentrationen av bacmid DNA renas från den valda kolonin är mindre än 1 μg/μL, kommer resulterande viruset inte räcka för robust proteinuttryck. Den andra kritiska kontrollpunkten är produktionen av P1 och P2 baculoviridae. Virus titer kan uppskattas av GFP fluorescens, som visas i figur 1 c eller kan mätas som beskrivs av Coleman et al. 35. Förutom viral titer, en dags kurs infektion tid göras för varje ny konstruktion att bestämma den optimala tiden för infektion för maximal proteinuttryck. Kritisk kontrollpunkt tre är löslighet och stabilitet screening visas i figur 2. Tvättmedel med en hög CMC, såsom DDM, kan ge hög löslighet, men de är inte idealisk för cryo-EM imaging eftersom de kan resultera i ett överflöd av kontaminerande miceller. Ett mildare rengöringsmedel, såsom digitonin, kan ge tillräcklig löslighet samtidigt bevara protein stabilitet. Screening av tillsatser, såsom EDTA vid hTRPC3, är viktigt för att upptäcka ett rening tillstånd som resulterar i intakt och homogen protein, förmodligen genom att ta bort kalcium från hTRPC3, vilket är genomsläppliga för kalcium. Kritisk kontrollpunkt fyra är kontrollen av specifika och effektiva protein fånga under affinitet kolumn rening och observation av en perfekt protein topp under SEC-fraktionering (figur 4). Undvikande av införandet av kontaminerande protein partiklar samtidigt behålla alla målproteinet är avgörande för att erhålla en tillräckligt hög avkastning av protein för cryo-EM avbildning. Ändring av batch-bindande tid och förhållandet mellan harts till solubilized protein kan hjälpa till att förbättra protein retention av kolumnen harts. Den övergripande kvaliteten på SEC-fraktionering peak är vår erfarenhet den bästa indikatorn, före imaging, kvaliteten på renat protein partiklar. En låg eller en bred topp under SEC-fraktionering anger möjliga problem för få protein partiklar per bild eller förekomsten av kontaminerande protein aggregation/nedbrytningsprodukter, respektive. Förändringar i affinitet taggen inom bygga själv har dessutom visat sig nödvändigt i vissa fall att säkerställa tillräcklig affinitet-tag bindande. Den sista kontrollpunkten före samlingen av cryo-EM datamängder är kontrollen av protein partikel kvalitet av negativ-fläcken EM. Även om inte absolut nödvändigt, finner vi att detta ger en utmärkt möjlighet till plats och rätt protein kvalitetsfrågor innan du investerar i tid - och kostnadsintensiv processen för insamling av uppgifter av cryo-EM.

En alternativ metod för att producera protein för cryo-EM strukturella studier är direkt rening av protein från infödda vävnad källan. Även denna metod stöter ofta på problem med protein avkastning, är det ett utmärkt alternativ för proteiner som är mycket rikligt i celler eller som finns som en del av stora multi proteinkomplex, vilket kan vara svårt att producera med en rekombinant överuttryck system36. Men för enstaka proteiner som uttrycks i måttliga eller låga belopp under fysiologiska tillstånd, uttryck och rening systemet presenteras här är en effektiv, relativt låg kostnad och hög avkastning metod för att producera renat däggdjur membranprotein för cryo-EM strukturella studier. En metod som kunde starkt komplement som presenteras här är beredning av renat protein i lipid nanodiscs före cryo-EM data collection37. Enligt denna metod, är proteinerna inbäddad i en liten skiva av lipid lipidens, förmodligen ger en native-liknande närmiljön i jämförelse med tvättmedel miceller, även om det finns inga bevis så långt som strukturerna upplöst i tvättmedel och nanodisc är olika38,39,40. Ett annat tillvägagångssätt är att utvinna protein direkt med hjälp av amfipatiska polymerer som styren maleinsyraanhydrid (SMA), som framgångsrikt har använts för bestämning av membran protein strukturer41,42.

Dessa tillvägagångssätt som beskrivs i detta manuskript har visat sig vara lätt att anpassa i vårt labb till en mängd andra däggdjur membranproteiner bortom jonkanaler. Därför anser vi detta protokoll kommer att vara ett värdefullt verktyg i de strukturella och funktionella analyser som ligger bakom hög-specificitet riktade läkemedelsdesign. Detta kommer att vara särskilt användbart i neurodegenerativa sjukdomar, hjärt-kärlsjukdom och cancer, i vilken ion kanaler är svårt men hög potential målmolekyler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar G. Zhao och X. Meng för stöd med datainsamling på David Van Andel avancerade Cryo-elektron mikroskopi Suite. Vi uppskattar det VARI High-Performance Computing teamet för computational stöd. Vi ger vår tacksamhet till N. Clemente, D. avgifter, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth och Z. Ruan för kommentarer som kraftigt förbättrat Detta manuskript. Vi tackar D. Nadziejka för redaktionellt stöd för detta manuskript. Detta arbete stöds av interna VARI finansiering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEG BacMam vector (pFastBacI) addgene 31488
DH10α cells Life Technologies 10361-012
S.O.C. media Corning 46003CR for transformation of DH10α cells for Bacmid
Bacmam culture plates Teknova L5919 for culture of transformed DH10α cells
Incubation shaker for bacterial cells Infors HT Multitron standard
Incubated orbital shaker for insect cells Thermo-Fisher SHKE8000
Reach-in CO2 incubator for mammalian cells Thermo-Fisher 3951
Table-top orbital shaker Thermo-Fisher SHKE416HP used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells
Incubator VWR 1535 for bacterial plates
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 for plasmid extraction and purification
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol Invitrogen 15593031 for DNA extraction
Sf9 cells Life Technologies 12659017 insect cells for producing virus
Sf-900 media Gibco 12658-027 insect cell media
FBS Atlanta Biologicals S11550
Cellfectin II Gibco 10362100 for transfecting insect cells
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 for transfecting mamalian cells
0.2 mm syringe filter VWR 28145-501 for filtering P1 virus
0.2 mm filter flasks 500ml resevoir Corning 430758 for filtering P2 virus
erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) Gene Mate F-5909-2000 for culturing insect cells
erlenmeyer culture flask (baffled 2L) Gene Mate F-5909-2000B for culturing mammalian cells
nanodrop 2000 spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000 for determining DNA and protein concentrations
HEK293 ATCC CRL-3022 mammalian cells for producing protein
Freestyle 293 expression Medium Gibco 1238-018 mammalian cell media for protein expression
Butyric Acid Sodium Salt Acros 263195000 to amplify protein expression
PMSF Acros 215740500 protease inhibitor
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-100MG protease inhibitor
Leupeptin hydrochloride Sigma-Aldrich 24125-16-4 protease inhibitor
pepstatin A Fisher Scientific BP2671-250 protease inhibitor
digitonin EMD Millipore 300410 detergent - to solubilize protein from membrane
imidazole Sigma 792527 to elute protein from resin column
TALON resin Clonetech 635504 for affinity purification by His-tag
superose6 incease columns GE 29091596; 29091597 for HPLC and FPLC
Prominence Modular HPLC System Shimadzu See Below
Controller Module " CBM20A
Solvent Delivery System " LC30AD
Fluorescence Detector " RF20AXS
Autosampler with Cooling " SIL20ACHT
Pure FPLC System with Fractionator Akta
thrombin (alpha) Haematologic Technologies Incorporated HCT-0020 Human alpha for cleaving GFP tag
Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube Millipore UFC910008 for concentrating protein
EDTA Fisher E478500 for stabilizing protein
400 mesh carbon-coated copper grids Ted Pella Inc. 01754-F grids for negative stain
Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) Electron Microscopy Sciences Q3100AR1.3 grids for Cryo-EM
Vitrobot Mark III FEI for preparing sample grids by liquid ethane freezing
liquid nitrogen Dura-Cyl UN1977
ethane gas Airgas UN1035
Solarus Plasma System Gatan Model 950 for cleaning grids before sample freezing
Tecnai Spirit electron microscope FEI for negative stain EM imaging
Talos Arctica electron microsocope FEI for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids
Titan Krios electron microscope FEI for high-resolution Cryo-EM imaging
Software
Gautomatch software http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ to pick particles from micrographs
Relion 2.1 software https://github.com/3dem/relion to construct 2D and 3D classification
CryoSPARC software https://cryosparc.com/ to generate an initial structure model
Frealign software http://grigoriefflab.janelia.org/frealign to refine particles
Coot software https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ to build a model
MolProbity software http://molprobity.biochem.duke.edu/ to evaluate the geometries of the atomic model
SerialEM software http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ for automated serial image stack acquisition
MortionCor2 software http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html for motion correction of summed movie stacks
GCTF software https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ for measuring defocus values in movie stacks
Phenix.real_space_refine software https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html for real space refinement of the initial 3D model

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
  2. Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
  3. Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353 (2012).
  4. Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
  5. Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
  6. Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
  7. Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
  8. Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
  9. Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
  10. Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
  11. Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
  12. Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
  13. Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
  14. Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
  15. Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
  16. Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
  17. Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
  18. Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
  19. Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
  20. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  21. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
  22. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  23. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  24. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  25. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  26. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  27. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  28. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  29. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
  30. Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
  31. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  32. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  33. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
  34. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
  35. Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
  36. Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
  37. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  38. Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
  39. Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
  40. Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
  41. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
  42. Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).

Tags

Biokemi fråga 143 jonkanal membranprotein protein rening strukturbestämning cryo-elektronmikroskopi cryo-EM baculoviridae
Uttryck och rening av den mänskliga Lipid-känsliga ering kanal TRPC3 för strukturella bestämning genom Single-particle kryo-elektronmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haley, E., Choi, W., Fan, C., Sun,… More

Haley, E., Choi, W., Fan, C., Sun, W., Du, J., Lü, W. Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e58754, doi:10.3791/58754 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter